EA024621B1 - Пентаспецифические антитела, способы их получения и применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к пентаспецифическому антителу, обладающему широкой специфичностью. В частности, антитело по настоящему изобретению связывается (перекрестно взаимодействует) с IL-8, Gro-альфа, Gro-бета, Gro-гамма и ENA-78 человека.

Description

Настоящее изобретение относится к антителу, обладающему широкой специфичностью. В частности, антитело по настоящему изобретению связывается (перекрестно взаимодействует) с Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕΝΑ-78 человека.

Уровень техники

Опубликованные данные и отчеты свидетельствуют о том, что в целом ряде заболеваний имеют место повышенные уровни членов надсемейства ЕЬРСХС хемокинов СХСЬ. Семейство СХСЬ насчитывает в общей сложности 16 членов. Как сообщалось в научной литературе, уровни хемокинов повышены в целом ряде воспалительных заболеваний, включая СОРЭ, в котором СХСЬ 1-3, 5 и 8 известны также как Сго-α, -β, -γ (НаккШ, 8., е! а1. Ргос. №И. Асай. 8сЦ 1990; 87, 7732-7736), ΕΝΑ-78 (№ап§, Ό. апй РюЬтопй, А., СуЮкте РеГегепсе. ОррепНеип, 1.1. апй Ре1йтап, М. ей., Асайетк Ргекк, Ьопйоп, 1023-1027, Ро\\егт С.А. е! а1. Сепе., 1994: 151, 333-334) и Ш-8 (ГОака, Н. апй Ма15икЫта, К., Су1окте РеГегепсе. ОррепНепп, 1.1. апй Ре1йтап, М. ей., Асайетк Ргекк, Ьопйоп, 1061-1067, МайщЫта, К. е! е1., 1. Ехр. Мей. 1988: 167, 1883-1893) (Ат. 1. РекрШ Сгк Саге Мей., 163: 349-355, 2001, Ат. 1. РекрШ Сгк Саге Мей., 168:968-975, 2003, ТЬогах, 57: 590-595, 2002). Теоретически обосновано, что продолжительная и повышенная экспрессия указанных хемокинов может вызывать развитие таких заболеваний, как СОРИ, остеоартрит, ревматоидный артрит, эрозивный артрит, астма, атеросклероз, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, отторжение трансплантата, подагра, рак, острое поражение легких, острое заболевание легких, сепсис, АРЭ8, заболевание периферических артерий, системный склероз, респираторный дистресс-синдром у новорожденных, обострение астмы и СОРИ, муковисцидоз, диффузный панбронхиолит, поражение, вызванное реперфузией, или эндометриоз. Указанные хемокины СХС, как известно, стимулируют хемотаксис нейтрофилов в результате привлечения и активации рецепторов СХСР1 и/или СХСР2. Таким образом, ингибирование указанных хемокинов может препятствовать инфильтрации клеток воспалительного инфильтрата в ткань легких и, следовательно, предотвращать поражение ткани. Целью настоящего изобретения является ингибирование активации рецепторов СХСР1 и СХСР2 при помощи антитела, способного связываться с Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека, т.е. пентаспецифического антитела.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу (иммуноглобулину), которое обладает широкой специфичностью, заключающейся в одном иммуноглобулине. В частности, антитело по настоящему изобретению связывается (перекрестно взаимодействует) с Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека.

Одним объектом настоящего изобретения является выделенное антитело, обладающее широкой специфичностью (или перекрестно взаимодействующее) к Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека, поэтому антитело по настоящему изобретению было определено как пентаспецифическое (или пан-ЕЬР) антитело. Указанное определение антитела включает антигенсвязывающую часть (или фрагмент) антитела, которая связывается с Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека. Пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению предпочтительно является мышиным моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом. Во избежание неясности следует отметить, что пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению не обязательно связывается только с антигенами Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека, оно может также связываться с другими родственными белками (такими как ССР-2 человека, или может даже связываться с отличными от человеческих ортологами Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма, ΕNΑ-78 и ССР-2); другими словами, пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению, как минимум, связывается с Ш8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека.

Пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению предпочтительно связывается с каждым из Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека при значениях константы равновесия КО менее 10⁷ М, более предпочтительно менее 10^-8 М и еще более предпочтительно менее 10^-9 М, определяемых путем измерения поверхностного плазмонного резонанса. Измерение поверхностного плазмонного резонанса обычно выполняют в соответствии с приведенным ниже описанием.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу уменьшения хемотаксиса нейтрофилов путем ингибирования активации рецепторов СХСР1 и СХСР2 в результате нейтрализации Ш-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма, ССР-2 и ΕNΑ-78 человека пентаспецифическим антителом по настоящему изобретению.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу уменьшения хемотаксиса нейтрофилов у пациента путем введения пентаспецифического антитела по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело связывается с эпитопом КК1.РСС)С1КТ¥8КР (81Т) ГО ^:54) в Ш-8 человека.

- 1 024621

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению получают способом по протоколу ΚΙΜΜ (Кбрабтск, К.Е., е! а1. НуЪпбота. 1997: 16, 381), используя смесь (коктейль) 1Ь-8, Ото-альфа, Ото-бета, Ото-гамма и ΕΝΑ-78 человека вместе с набором из пяти множественных антигенных пептидов (ΜΑΡ), в которых каждое звено содержит одну отдельную последовательность из полипептидов с ГО N0:49-53.

ЬАТЕЬКЗОбЬОТЬСС £Ξ<2 ΙΌ МО: 49 ЗАКЕЬКЗО51КТУ5К ЗЕО Ю N0:50 ЬЕЕЬК.ЗУЗЬ0ТТ0О ЗЕО Ю N0:51 3ΡΟΡΗ5Α0ΤΕνΐΑΤ ЗЕО Ю N0:52 Ε5ΟΡΗ3ΑΝΤΕΙΐνΚ ЗЕО Ю N0:53

Не ограничиваясь какой-либо теорией, следует отметить, что ΜΑΡ выполняют две функции в протоколе иммунизации. Во-первых, ΜΑΡ обеспечивают селективное множественное представление известной аминокислотной последовательности-мишени иммунной системе хозяина. Во-вторых, вызывают увеличение массы благодаря многочисленным копиям данной последовательности, связанным ядром, таким как лизин, но не ограничиваясь им, что повышает иммуногенность последовательности по сравнению с отдельными пептидами (Ртаишз, ΤΡ., е! а1., 1ттиио1оду, 1991: 73; 249, 8сЬо!!, Μ.Ε., е! а1., Се11. 1ттипо. 1996: 174: 199-209, Тат, ΙΡ. Ргос. №!1. Асаб. δοΐ. 1988: 85; 5409-5413).

ΜΑΡ, используемые в настоящем изобретении, состоят из многочисленных копий консервативных последовательностей-мишеней (например, 8ЕЦ ГО N0:49-53), обнаруженных в областях ЕЬКСХС и ОΡНСΑ и рядом с указанными областями хемокинов-мишеней.

Типичный набор ΜΑΡ показан на фиг. 1.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие соответственно аминокислотные последовательности СГОК 8ΙΤ) ГО N0:13, 14 и 15 и 8ΙΤ) ГО N0:16, 17 и 18.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к экспрессирующему вектору, включающему нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой или легкой цепи пентаспецифического антитела, содержащую соответственно последовательности СГОК δΙΤ) ГО N0:13, 14 и 15 или δΙΤ) ГО N0:16, 17 и 18.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело имеет тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:48, 60, 62 или 64.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело имеет тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:48.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело имеет тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:60.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело имеет тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:62.

В одном варианте осуществления изобретения пентаспецифическое антитело имеет тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:64.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к рекомбинантной эукариотической или прокариотической клетке-хозяину, продуцирующей пентаспецифическое антитело, имеющее тяжелую или легкую цепь, включающую соответственно аминокислотную последовательность δΙΤ) ГО N0:46 или δΙΤ) ГО N0:48, 60, 62 или 64.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к рекомбинантной эукариотической или прокариотической клетке-хозяину, продуцирующей пентаспецифическое антитело, имеющее тяжелую и легкую цепи, включающие соответственно аминокислотные последовательности δΙΤ) ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:48, 60, 62 или 64.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотидные последовательности, кодирующие пентаспецифическое антитело, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие соответственно аминокислотные последовательности δΙΤ) ГО N0:46 и δΙΤ) ГО N0:48, 60, 62 или 64.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к экспрессирующему вектору, включающему полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:46, 48, 60, 62 или 64.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу продуцирования пентаспецифического антитела (иммуноглобулина) в единичной клетке-хозяине, который включает следующие стадии:

- 2 024621 (ί) трансформацию указанной единичной клетки-хозяина первой последовательностью ДНК, кодирующей, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, включающую области СЭР 8ЕО ГО N0:13, 14 и 15; и второй последовательностью ДНК, кодирующей, по меньшей мере, вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, включающую области СОК 8Е0 ГО N0:16, 17 и 18; и (ίί) экспрессию указанной первой последовательности ДНК и указанной второй последовательности ДНК, в результате которой указанные тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина получают в виде отдельных молекул в указанной трансформированной единичной клетке-хозяине, причем этот способ может быть выполнен таким образом, что указанные первая и вторая последовательности ДНК присутствуют в разных векторах или указанные первая и вторая последовательности ДНК присутствуют в одном векторе.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, которое полностью или частично блокирует связывание любого из вышеуказанных пентаспецифических антител с ГО-8, Ого-альфа, Ого-бета, Ого-гамма, ΕΝΑ-78 и ОСР-2 человека при выполнении иммуноанализа, такого как анализ ЕЫ8А. В одном варианте осуществления изобретения частичное блокирование происходит тогда, когда антитело блокирует связывание пентаспецифического антитела более чем на 10, 20, 40 или 50%.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, которое конкурирует за связывание с любым из вышеуказанных пентаспецифических антител с ГО-8, Ого-альфа, Ого-бета, Ого-гамма, ΕΝΑ-78 и ОСР-2 человека.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, которое полностью или частично блокирует связывание любого из вышеуказанных пентаспецифических антител с эпитопом 1<ЕЕРС.’0СП<ТУ81<Р (8Е0 ГО N0:54) в ГО-8 человека при выполнении иммуноанализа, такого как анализ ЕЫ8А. В одном варианте осуществления изобретения частичное блокирование происходит тогда, когда антитело блокирует связывание пентаспецифического антитела более чем на 10, 20, 40 или 50%.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, которое конкурирует с любым из вышеуказанных пентаспецифических антител за связывание с эпитопом КЕЕРС0С1КТУ8КР (8Е0 ГО N0:54) в ГО-8 человека.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, включающей вышеуказанное пентаспецифическое антитело и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления изобретения вышеуказанным млекопитающим является человек. Описание чертежей

На фиг. 1 показан типичный набор МАР, используемый для создания пентаспецифического антитела. Во избежание неясности изображены пять пептидных звеньев МАР. Каждое звено содержит одну идентичную аминокислотную последовательность, выбранную из линейных пептидов 8Е0 ГО N0:49-53.

На фиг. 2 приведены данные проточной цитометрии, позволяющие сравнивать нейтрофилы, присутствующие в образцах бронхоальвеолярного лаважа (ВАЬ). Представлены исследования 1, 2 и 3. Столбцы черного цвета показывают исходные данные, полученные за 5 дней до стимуляции ЬР8. Столбцы серого цвета показывают данные ВАЬ, полученные через 6 ч после стимуляции ЬР8. Введение химерного антитела (НсЬе) значительно и в зависимости от дозы ингибировало инфильтрацию нейтрофилов.

Заштрихованные столбцы серого цвета показывают данные, полученные через 24 ч (п=6, *р<0,05, 1р<0,01, планки погрешностей представляют стандартное отклонение).

На фиг. 3 показан гематологический анализ всех циркулирующих в крови нейтрофилов (подсчет клеток).

Внутривенная инъекция 1 мг/кг (незакрашенные квадраты, □) и 10 мг/кг (закрашенные кружки, ·) химерного антитела (НсЬс) предотвращала стимуляцию ЬР8 циркулирующих в крови нейтрофилов путем ингаляции. Введение как 1 мг/кг, так и 10 мг/кг вызывает значительное уменьшение симптомов по сравнению с наполнителем NНР (I) / и введение 10 мг/кг также вызывает значительное уменьшение по сравнению с дозой, равной 1 мг/кг (*). Данные представлены в виде общего подсчета клеток в 1 мкл крови (п=6, *р<0,05 по сравнению с 1 мг/кг, 1р<0,01 по сравнению с наполнителем, планки погрешностей представляют стандартное отклонение).

На фиг. 4 показано ингибирование активации нейтрофилов, стимулированных ГО-8 человека (повышенная поверхностная экспрессия СГО11Ь). Гуманизированные пентаспецифические антитела предварительно инкубировали в разных концентрациях с 10 нМ ЫЬ-8 до добавления к очищенным нейтрофилам человека. Данные выражены в виде средних значений для 4 разных доноров (п=4). Планки представляют стандартную ошибку. Все образцы сравнивали с очищенными нейтрофилами, стимулированными только ЫЬ-8 (отсутствие моноклонального антитела до добавления к очищенным нейтрофилам). Гуманизированные конструкции Н0Ь10 и Н0М0 более эффективно ингибируют поверхностную экспрессию СО11Ь, стимулированную ЫЬ-8.

На фиг. 5А показано связывание моноклонального антитела 656.35 с хемокинами-мишенями человека.

- 3 024621

На фиг. 5В показано связывание химерного моноклонального антитела (НсЬс) с хемокинамимишенями человека.

На фиг. 5С показано связывание гуманизированных моноклональных антител с хемокинамимишенями человека.

Подробное описание изобретения

Термин выделенное пентаспецифическое антитело или просто пентаспецифическое антитело в значении, использованном в настоящем описании изобретения, означает антитело, которое связывается и, следовательно, перекрестно взаимодействует с 1Ь-8, Сто-альфа, Сто-бета, Сто-гамма и ΕΝΑ-78 человека, по существу, не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью, и имеет моносостав. Во избежание неясности следует отметить, что пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению не обязательно связывается только с антигенами 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕΝΑ-78 человека, оно может также связываться с другими родственными белками, такими как ССР-2 человека, или даже может связываться с отличными от человеческих ортологами 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма, ΕΝΑ-78 и ССР-2; другими словами, пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению, как минимум, связывается с 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕΝΑ-78 человека. Кроме того, выделенное пентаспецифическое антитело, по существу, не содержит других клеточных и/или химических веществ. Пентаспецифическое антитело в значении, использованном в данном контексте, включает также антигенсвязывающие фрагменты и/или производные, обладающие характеристиками связывания родительского пентаспецифического антитела. Пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению может включать две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, образующие типичную билатерально симметричную молекулу иммуноглобулина, состоящую из двух гетеродимеров, каждый из которых включает тяжелую цепь и легкую цепь. Таким образом, пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению может включать две копии одного антигенсвязывающего домена, образованного в результате ассоциации одной тяжелой цепи с одной легкой цепью. Пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению, несмотря на наличие связывающего домена только одного типа, может связываться и, следовательно, взаимодействовать с 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сгогамма и ΕΝΑ-78 человека.

В используемом в описании значении термин антитело означает также иммуноглобулин.

В используемом в описании значении термин антитело, перекрестно взаимодействующее с означает, что указанное антитело связывается не только с одним антигеном, но и также с другими антигенами.

Термин нейтрализация в используемом в описании значении означает частичное или полное ингибирование по меньшей мере одной биологической активности 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма, ССР-2 или ΕΝΑ-78 человека. Например, одной из биологических активностей 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма, ССР-2 или ΕΝΑ-78 человека является их способность индуцировать хемотаксис нейтрофилов.

Одним способом измерения кинетики связывания антитела является измерение поверхностного плазмонного резонанса. Термин поверхностный плазмонный резонанс в используемом в описании значении означает оптическое явление, которое позволяет анализировать биоспецифические взаимодействия в реальном времени путем обнаружения изменений в концентрации белков в биосенсорной матрице, например, при помощи системы В1Лсогс (РЬаттаиа Вюкепкот ΑΒ, Иррва1а, 8уебеп аиб Р1кса1ауау, Ν.Τ). Для ознакомления с более подробным описанием см. публикации .Топекой, и., е! а1. (1993), Αηη. Вю1. Сйп. 51:19-26; 1оп55оп, и., е! а1. (1991), ВюЮсЬпкщек 11:620-627; 1оЬп55оп, В., е! а1. (1995), 1. Мо1. Кесодш!. 8:125-131 и 1оЬпп5оп, В., е! а1. (1991), Αιτιΐ. ВюсЬет. 198:268-277.

Термин эпитоп означает детерминанту белка, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и имеют специфическую трехмерную структуру, а также характерные заряды.

Термин моноклональное антитело или тΑЬ (в отличие от поликлонального антитела) в используемом в описании значении означает молекулы антител, имеющие одинаковый молекулярный состав. Например, моноклональное антитело, выделенное у мыши (мышиное моноклональное антитело), может быть получено методом образования гибридом, таким как стандартная методика образования гибридом Колера и Милстейна (КоЫет апб МЙ5!еш).

Антитело-продуцирующие клетки могут быть получены у субъекта и использованы для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как метод гибридом, первоначально описанный Колером и Милстейном (1975, №!ите, 256:495-497) (см. также публикации Вгоуп е! а1. (1981), 1. 1ттипо1. 127:539-46; Вгоуп е! а1. (1980), 1. Вю1. СЬет. 255:4980-83; Уей е! а1. (1976), ΓΝΑΙ?, 76:2927-31 и Уей е! а1. (1982), 1п!. 1. Сапсег 29:269-75). Методика получения гибридом моноклонального антитела хорошо известна (см. публикации К.Н. Кеппе!Ь, ш Мопос1опа1 Αη!^Ъоб^е5: Α №у ПТтепкюп 1п Вю1одюа1 Лηа1у5е5, Р1епит РиЪИкЫпд Согр., №у Уогк, Ν.Υ. (1980); Ε.Α. Ьетет (1981), Уа1е 1. Вю1. Меб., 54:387402; М.Ь. Сейег е! а1. (1977), 8отайс Се11 Сепе!., 3:231-36).

Термин трансфектома в используемом в описании значении означает рекомбинантную эукариотическую клетку-хозяина, экспрессирующую антитело, такую как клетки СНО, клетки Νδ/0, клетки

- 4 024621

НЕК-293, растительные клетки или грибы, включая дрожжевые клетки.

В используемом в описании значении термин специфическое связывание означает связывание антитела с заранее определенным антигеном. Антитело обычно связывается при значениях константы равновесия КО, равных примерно 1х10^-7 М или меньше, и связывается с заранее определенным антигеном со сродством, соответствующим значению КО, которое по меньшей мере на два порядка величины меньше сродства связывания с неспецифическим антигеном (например, ΒδΑ, казеин), отличным от заранее определенного антигена или близко родственного антигена. Фразы антитело, узнающее антиген и антитело, специфичное к антигену имеют взаимозаменяемые значения с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.

Термин кб (с^-1) в используемом в описании значении означает константу скорости диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.

Термин ка (М-с^-1) в используемом в описании значении означает константу скорости ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.

Термин КО (М) в используемом в описании значении означает константу равновесия определенного взаимодействия антитело-антиген, которую получают в результате деления кб на ка.

Термин консервативные модификации последовательностей для модификаций нуклеотидных и аминокислотных последовательностей означает изменения, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, кодируемого данной нуклеотидной последовательностью или содержащего такую аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательностей включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации могут быть введены в последовательности стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают такие замены, в которых аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. В данной области известны семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, прогнозируемый заменимый аминокислотный остаток в антителе, имеющем рассмотренную последовательность, предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такой же боковой цепью. Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является пентаспецифическое антитело по настоящему изобретению, включающее все консервативные модификации рассмотренных аминокислотных последовательностей.

В объем настоящего изобретения входят также производные описанных аминокислотных последовательностей, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются производными остатками, полученными, например, путем ацилирования или гликозилирования, которые не оказывают существенного влияния и не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего указанные аминокислотные последовательности.

Термин по существу, идентичные применительно к нуклеиновым кислотам означает, что две нуклеиновые кислоты или их последовательности являются идентичными при оптимальном совмещении и сравнении с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов по меньшей мере примерно у 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере примерно у 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере примерно у 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, по существу, идентичными нуклеиновые кислоты являются тогда, когда сегменты гибридизируют в условиях селективной гибридизации с комплементом цепи.

Термин идентичный применительно к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям означает степень идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей при оптимальном совмещении и сравнении с соответствующими инсерциями или делециями. Альтернативно, по существу, идентичными последовательности являются тогда, когда сегменты ДНК гибридизируют в условиях селективной гибридизации с комплементом цепи.

Процентное значение идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений в указанных последовательностях (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений, умноженное на 100) с учетом числа разрывов и длины каждого разрыва, которые должны быть введены для оптимального сравнения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентного значения идентичности двух последовательностей может быть выполнено при помощи математического алгоритма, описанного в приведенных ниже неограничивающих примерах.

- 5 024621

Процентное значение идентичности двух нуклеотидных или полипептидных последовательностей может быть определено при помощи программы САР в пакете программного обеспечения ОСО (представлен на сайте Ьйр://№№№.дсд.сот) с использованием матрицы Ы^Здарйиа. СМР, весового коэффициента разрыва, равного 40, 50, 60, 70 или 80, и весового коэффициента длины разрывов, равного 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процентное значение идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм Е. Мейерса и В. Миллера (Е. Меуегк апй МШег, Сотри!. Арр1. Вюкск, 4:11-17 (1988)) который включен в программу ΑΜΟΝ (версия 2.0), таблицу весовых коэффициентов остатков РАМ120, штраф за длину разрыва, равный 12, и штраф за разрыв, равный 4. Кроме того, процентное значение идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм Нидлмана и Ванша (№ей1етап апй ХУшъсй. 1. Мо1. ΒίοΙ. 48:444-453 (1970)), который включен в программу ОАР пакета программного обеспечения ОСО (представлен на сайте Ьйр://№№№.дсд.сот), матрицу В1о88ит 62 или матрицу РАМ250, весовой коэффициент разрыва, равный 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и весовой коэффициент длины разрыва, равный 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Нуклеиновая кислота является функционально связанной при нахождении в функциональном взаимодействии с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности. Что касается транскрипции регуляторных последовательностей, то термин функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости, соединяют кодирующие области двух белков, которые являются смежными и находятся в рамке считывания. Термин функционально связанные применительно к переключающим последовательностям означает, что указанные последовательности могут осуществлять рекомбинацию на этапе переключения.

Термин вектор в используемом в описании значении означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать связанную с ним другую нуклеиновую кислоту. Одним типом вектора является плазмида, которая представляет собой кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы могут автономно реплицировать в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную природу репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть встроены в геном клеткихозяина при введении в клетку-хозяина, после чего указанные векторы реплицируют вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы могут направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы определяются в настоящем описании изобретения как рекомбинантные экспрессирующие векторы (или просто экспрессирующие векторы). Как правило, экспрессирующие векторы, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании изобретения термины плазмида и вектор могут иметь взаимозаменяемые значения, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако в объем настоящего изобретения входят также другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектом репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют такие же функции.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) в используемом в описании значении означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Очевидно, что такие термины относятся не только к определенной клетке, но и к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут появиться определенные модификации вследствие мутации или влияния окружающих условий, такое потомство фактически не может быть идентично материнской клетке, но все же входит в определение термина клетка-хозяин в значении, использованном в настоящем описании изобретения. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки N8/0 и лимфоциты.

В используемом в описании значении термин субъект означает человека или животное, отличное от человека. Термин животное, отличное от человека означает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы? кроме человека, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.

1. Структуры антител.

Интактные антитела.

Интактные антитела обычно являются гетеромногомерными гликопротеинами, имеющими по меньшей мере две тяжелые и две легкие цепи. Помимо 1дМ интактные антитела являются гетеротетрамерными гликопротеинами с длиной цепи около 150 кДа, состоящими из двух идентичных легких (Ь) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь обычно связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, причем число дисульфидных связей между тяжелыми цепями разных изотипов иммуноглобулина может быть различным. Все тяжелые и легкие цепи имеют также дисульфидные мостики внутри цепи. У одного конца каждой тяжелой цепи находится вариабельная область (У_н), за которой следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельную об- 6 024621 ласть (Уь) и константную область у другого конца; константная область легкой цепи совмещается с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи совмещается с вариабельной областью тяжелой цепи. Легкие цепи антител у большинства позвоночных могут быть отнесены к одному из двух типов, именуемых каппа и лямбда на основании аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей человеческие антитела могут быть отнесены к пяти разным классам: 1§А, 1§О, 1дЕ, 1§С и 1дМ. 1дС и 1дА могут быть далее подразделены на подклассы 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 и 1дА1 и 1дА2. Варианты существуют у мышей и крыс, имеющих по меньшей мере 1дС2а, 1дС2Ь. Вариабельная область сообщает антителу специфичность связывания с определенными областями, характеризующимися конкретной вариабельностью, которые именуются областями, определяющими комплементарность (СЭР). Более консервативные части вариабельной области именуются каркасными областями (РК). Вариабельные области тяжелых и легких цепей интактных антител включают четыре каркасные области, соединенные тремя СОК. СОК в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга каркасными областями и вместе с СОК из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего центра антител. Константные области непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют разные эффекторные функции, например опосредуют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС), участвуют в фагоцитозе благодаря связыванию с рецептором Реу, определяют период полувыведения/клиренс при помощи неонатального рецептора Рс (РсКп) и комплементзависимую цитотоксичность при помощи компонента С1с| пути активации комплемента. Константная область 1дС2 человека не может активировать комплемент по классическому пути активации комплемента или опосредовать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Константная область 1§С4 не может активировать комплемент по классическому пути активации комплемента и может лишь слабо опосредовать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Антитела, у которых, по существу, отсутствуют указанные эффекторные функции, могут именоваться нелитическими антителами.

Человеческие антитела.

Человеческие антитела могут быть получены рядом методов, известных специалистам в данной области. Человеческие антитела могут быть получены методом гибридом с использованием линий миеломных клеток человека или гетеромиеломных клеток мыши-человека; см. публикации Ко/Ьог 1. 1ттипо1. 133, 3001 (1984) и ВгоБеиг, Мопос1опа1 АпБЬоБу РтоБисБоп ТесЬтциек апБ АррйсаБопк, р.51-63 (Магсе1 Эеккег 1пс, 1987).

Альтернативные методы включают использование фаговых библиотек или трансгенных мышей на основе наборов У-областей человека (см. публикации ХУиНег С. (1994), Аппи. Кеу. 1ттипо1. 12, 433-455, Сгееп Ь.Ь. (1999), 1. 1ттипо1. те1БоБк 231, 11-23).

В настоящее время имеется несколько линий трансгенных мышей, у которых мышиные локусы иммуноглобулина заменены сегментами генов иммуноглобулина человека (см. публикации Топи/ика К. (2000), РЫА8 97, 722-727; ΡΐδΕ^ΐίά ϋ.Μ. (1996), Ыа1иге Вю1есйпо1. 14, 845-851, МепБе/ М.1, 1997, Ыа1иге СепеБск, 15, 146-156). В результате антигенной стимуляции такие мыши могут продуцировать набор человеческих антител, из которых могут быть выбраны антитела, представляющие интерес.

Особого внимания заслуживает система ТБтета™ (см. публикацию Егеп К. е1 а1. (1998), 1ттипо1оду 93:154-161), в соответствии с которой лимфоциты человека трансплантируют облученным мышам, а именно система отобранных лимфоцитных антител (8ЬАМ, см. публикацию ВаЬсоок е1 а1., ΡΝΛ8 (1996), 93:7843-7848), в которой лимфоциты человека (или другие разновидности) эффективно подвергают процедуре массового образования антител ш уйто с последующим выполнением процедуры неразрушающего, ограниченного разведения и отбора, и система Хепотоике II™ (АЬдетх 1пс). Альтернативным подходом является метод МотрБоБота™ компании МотрБо1ек 1пс.

Для получения человеческих антител (и их фрагментов) может быть использован метод отображения на фаге, см. публикации МсСаГГеБу; №1ите, 348, 552-553 (1990) и СБййБк АШ. е! а1. (1994), ЕМВО, 13:3245-3260. В соответствии с указанным методом гены У-области антитела клонируют в рамке считывания в главном или минорном гене оболочки белка нитевидного бактериофага, такого как М13 или ГБ, и отображают (обычно при помощи фага-хелпера) в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. На основании функциональных свойств антитела отбирают ген, кодирующий антитело, обладающее указанными свойствами. Метод отображения на фаге может быть использован для отбора антиген-специфических антител из библиотек, полученных из В-клеток человека, взятых у субъектов, страдающих вышеуказанным заболеванием или нарушением, или, альтернативно, у неиммунизированных людей-доноров (см. публикацию Магкк; I. Мо1. Вю. 222, 581-597, 1991). Если желательно получить интактное человеческое антитело, включающее Рс-область, необходимо реклонировать фрагмент, выделенный из антитела, отображенного на фаге, в экспрессирующих векторах млекопитающего, включающих требуемые константные области, и получить линии клеток, устойчиво экспрессирующих данное антитело.

- 7 024621

Метод созревания аффинности (Магкк; В|о/1ссНпо1. 10, 779-783 (1992)) может быть использован для улучшения сродства связывания, при этом сродство первичного человеческого антитела улучшается в результате последовательной замены У-областей Н- и Ь-цепей естественными вариантами и отбора, выполняемого на основании улучшенного сродства связывания. В настоящее время известны также варианты рассмотренного метода, такие как импринтинг эпитопа; см. \О 93/06213. См. также публикацию \а!егЬоике; Ыис1. Ашбк Кек. 21, 2265-2266 (1993).

Химерные и гуманизированные антитела.

Использование интактных антител, отличных от человеческих, при лечении заболеваний или нарушений у человека создает хорошо известные проблемы возможной иммуногенности, особенно при повторном введении антитела, которые заключаются в том, что иммунная система пациента может узнать чужеродное интактное антитело, отличное от человеческого, как несобственное и вызвать нейтрализующую реакцию. Помимо создания полностью человеческих антител (см. выше), в течение последних лет были разработаны разные методы, позволяющие преодолеть вышеуказанные проблемы, которые обычно предполагают уменьшение содержания аминокислотных последовательностей, отличных от человеческих, в интактном терапевтическом антителе при сохранении относительной простоты получения антител, отличных от человеческих, у иммунизированных животных, например мыши, крысы или кролика. Для достижения указанной цели широко используются два метода. Первый метод включает создание химерных антител, которые обычно содержат вариабельную область, отличную от человеческой (например, грызуна, такого как мышь), слитую с константной областью человека. Так как антигенсвязывающий центр антитела локализован в вариабельных областях, химерное антитело сохраняет сродство связывания с антигеном, но приобретает эффекторные функции константной области человека и поэтому может выполнять вышеописанные эффекторные функции. Химерные антитела обычно получают методами рекомбинантных ДНК. ДНК, кодирующую антитела (например, кДНК), выделяют и секвенируют стандартными методами (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с генами, кодирующими вариабельные области Н- и Ь-цепей антитела по настоящему изобретению. Клетки гибридомы являются типичным источником такой ДНК. Выделенную ДНК вводят в экспрессирующие векторы, которые трансфицируют в клетки-хозяева, такие как Е.сой, клетки СО8, клетки СНО или миеломные клетки, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, вызывая синтез указанного антитела. ДНК может быть модифицирована путем замены Ь- и Н-цепей человека кодирующей последовательностью для соответствующих константных областей Н- и Ь-цепей, отличных от человеческих (например, мыши); см., например, публикацию Моткой; ΡΝΆ8 81, 6851 (1984). Таким образом, другой вариант осуществления изобретения относится к химерному антителу, включающему У_н-область, имеющую последовательность 8ЕО ГО N0:2, 6 или 10, и У_ъ-область, имеющую последовательность 8Е0 ГО N0:4, 8 или 12, слитые с константной областью человека (которая может быть изотипом 1§О, например 1дО1).

Второй метод включает создание гуманизированных антител, в которых содержание части, отличной от человеческой, уменьшено путем гуманизации вариабельных областей. Широко применяются два метода гуманизации. Первый метод включает гуманизацию путем трансплантации СИК. СИК формируют петли рядом с Ν-концом антитела, где они образуют поверхность в каркасных областях.

Антигенсвязывающая специфичность антитела определяется, главным образом, топографией и химическими характеристиками поверхности СИК. Указанные свойства, в свою очередь, определяются конформацией отдельных СИК, относительным расположением СИК, характером и расположением боковых цепей остатков, образующих СИК. Значительное уменьшение иммуногенности может быть достигнуто в результате трансплантации только СИК антител, отличных от человеческих (например, мыши) (донорские антитела) в подходящую каркасную область человека (каркасная область акцепторного антитела) и константные области (см. публикации 1оиек е! а1. (1986), №!иге, 321, 522-525 и УегЬоеуеи М. е! а1. (1988), 8аеисе, 239, 1534-1536). Однако сама по себе трансплантация СИК не может гарантировать полного сохранения антигенсвязывающих свойств, поэтому часто оказывается, что необходимо сохранить некоторые остатки каркасной области донорского антитела (иногда определяемые как обратные мутации) в гуманизированной молекуле для достижения значительного антигенсвязывающего сродства (см. публикации Онеен С. е! а1. (1989), ΡΝΑ8 86, 10029-10033, Со, М. е! а1. (1991), №щ.1ге. 351, 501-502). В данном случае У-области человека, характеризующиеся наибольшей гомологией последовательностей (обычно 60% или больше) с донорским антителом, отличным от человеческого, могут быть выбраны из базы данных для создания каркасной области человека (РК). РК человека могут быть выбраны из консенсусных или индивидуальных антител человека. При необходимости основные остатки из донорского антитела вводят в каркасную область акцепторного антитела человека для сохранения конформаций СИК. Для идентификации таких структурно важных остатков может быть использовано компьютерное моделирование антитела; см. \О 99/48523.

Альтернативно, гуманизация может быть выполнена методом маскировки. Статистический анализ уникальных вариабельных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека и мыши показал, что точные паттерны остатков различны в антителах человека и мыши и в большинстве случаев предпочитают положения с небольшим числом разных остатков (см. публикации Раб1аи Е.А. е! а1. (1991),

- 8 024621

ΜοΙ. 1ттипо1. 28, 489-498 и Ребегкеп РТ. е! а1. (1994), 1. ΜοΙ. ΒίοΙ. 235; 959-973). Поэтому иммуногенность Ρν-фрагмента, отличного от человеческого, можно уменьшить, заменяя в каркасных областях остатки, отличающиеся от остатков, обычно обнаруживаемых в антителах человека. Так как антигенность белка можно коррелировать с доступностью поверхности, замена поверхностных остатков может быть достаточной для того, чтобы сделать вариабельную область мыши невидимой для иммунной системы человека (см. также публикацию Магк С.Е. е! а1. (1994), ίη НапбЬоок о£ Ехрейтейа1 РЬагтасо1оду νοί. 113: ТЬе рЬагтасо1оду о£ топос1опа1 Лп1ЫЬоб1е8, Зрйпдег-Уейад, р. 105-134). Данный процесс гуманизации определяется как маскировка, поскольку изменяется только поверхность антитела, при этом несущие остатки остаются без изменения. Другой альтернативный метод описан в \УО 04/006955. Другие альтернативные подходы включают методы, рассмотренные в \УО04/006955. и метод Нитапеегшд™ (Ка1оЬюк), который благодаря использованию бактериальных экспрессирующих систем позволяет получить антитела, в которых последовательность близка к зародышевой линии человека (А1£еш!о-М Абуапсшд Рго!еш ТЬегареийск, 1апиагу 2007, Зап О1едо, С’айкогша). Другой метод гуманизации включает отбор каркасных областей акцепторного антитела человека на основании структурного сходства областей СЭР человека с областями СЭР донорского антитела мыши, а не на гомологии других областей антитела, таких как каркасные области. Указанный метод также известен как супергуманизация™ (Ενοдешх 1пс.; Н\уапд е! а1. (2005), Ме!Ьобк 36:35-42).

Специалистам в данной области должно быть понятно, что термин выделенный означает не только источник физического происхождения материала, но также служит для определения материала, который идентичен в структурном отношении данному материалу, но получен из другого источника. Таким образом, остатки, обнаруженные в донорском антителе, необязательно должны быть очищены от донорского антитела.

Фрагменты антитела.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к терапевтическому антителу, которое является антигенсвязывающим фрагментом. Такие фрагменты могут быть функциональными антигенсвязывающими фрагментами интактных, гуманизированных и/или химерных антител, такими как РаЬ, Рб, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ру, ЗсРу фрагменты вышеописанных антител. Фрагменты, у которых отсутствует константная область, утрачивают способность активировать комплемент по классическому пути или опосредовать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Такие фрагменты традиционно получают в результате протеолитического расщепления интактных антител, например, папаином (см., например, \ТО 94/29348), но фрагменты могут быть получены непосредственно из рекомбинантно трансформированных клеток-хозяев. Для получения ЗсРу см. публикацию Вйб е! а1. (1988), Зшепсе, 242, 423-426. Кроме того, фрагменты антитела могут быть получены разными методами генной инженерии, описанными ниже.

Ρν-фрагменты, по-видимому, характеризуются более низкой энергией взаимодействия двух цепей, чем РаЬ-фрагменты. Чтобы стабилизировать ассоциацию У_Н- и Ун-областей, указанные области связывают пептидами (Βϊγ6 е! а1., (1988), Зшепсе 242, 423-426, Ник!оп е! а1., ΡΝΑδ, 85, 5879-5883), дисульфидными мостиками (01осккЬиЬег е! а1. (1990), ВюсЬет1к!гу, 29, 1362-1367) и мутациями выступ в отверстии (2Ьи е! а1. (1997), Рго!еш δοϊ., 6, 781-788). δсΡν-фрагменты могут быть получены методами, хорошо известными специалистам в данной области; см. публикации \νΐιίΐ1ο\ν е! а1. (1991), Ме!Ьобк сотрапюп Ме!Ьобк Еп/уток, 2, 97-105 и Ник!оп е! а1. (1993), Iη!.Реν.Iттиηο1. 10, 195-217. δсΡν-фрагменτы могут быть получены в бактериальных клетках, таких как Е.СоЬ, но обычно указанные фрагменты получают в эукариотических клетках. Одним недостатком δсΡν-фрагментов является одновалентность продукта, что делает невозможной повышенную авидность из-за многовалентного связывания и определяет короткий период полувыведения. Попытки преодолеть указанные проблемы привели к использованию двухвалентного (δсΡν')₂-фрагмента, полученного из δсΡν-фрагмента, содержащего дополнительный С-концевой цистеин, путем химического связывания (Абатк е! а1. (1993), Сап. Рек. 53, 4026-4034 и МсСайпеу е! а1. (1995), Рго!еш Епд. 8, 301-314) или спонтанной сайт-специфической димеризации δсΡν-фрагмента, содержащего неспаренный С-концевой остаток цистеина (см. публикацию Карпуапоу е! а1. (1995), Се11. ВюрЬук, 26, 187-204). Альтернативно, из δсΡν-фрагмента могут быть получены многомеры в результате укорачивания пептидного линкера между остатками 3-12 с образованием диател; см. публикацию НоШдег е! а1., ΡNΑδ (1993), 90, 6444-6448. Уменьшение линкера может далее привести к получению тримеров ЗсРу (триатела; см. публикацию Кой! е! а1. (1997), Рго!еш Епд., 10, 423-433) и тетрамеров (тетратела; см. публикацию Ье Оа11 е! а1. (1999), РЕВЗ Ье!!., 453, 164-168). Двухвалентные молекулы ЗсРу могут быть также созданы путем генетического слияния с димеризующими белок фрагментами с образованием миниантител (см. публикацию Раск е! а1. (1992), ВюсЬетщйу 31, 1579-1584) и минител (см. публикацию Ни е! а1. (1996), Сапсег Рек. 56, 3055-3061). Могут быть также получены тандемы ЗсРуЗс-Ру ((ЗсРу)₂) путем связывания двух звеньев ЗсРу третьим пептидным линкером; см. публикацию Кигис/ е! а1. (1995), ί. 1тто1. 154, 4576-4582. Биспецифические диатела могут быть получены путем нековалентного связывания двух одноцепочечных продуктов слияния, состоящих из УН-области одного антитела, соединенного коротким линкером с Уь-областью другого антитела; см. публикацию К1рйуапоу

- 9 024621 е! а1. (1998), Ιηΐ. I. Сап. 77, 763-772. Устойчивость таких биспецифических диател может быть увеличена путем введения дисульфидных мостиков или мутаций выступ в отверстии, описанных выше, или образования одноцепочечных диател (8еЭЬ), в которых два гибридных 8сРу-фрагмента соединены пептидным линкером; см. публикацию Коп!егтапп е! а1. (1999), I. 1ттипо1. Ме!кобз 226, 179-188. Четырехвалентные биспецифические молекулы могут быть получены, например, путем слияния 8еРу-фрагмента с СНЗ-областью молекулы 1§С или с РаЬ-фрагментом при помощи шарнирной области; см. публикацию Со1ота е! а1. (1997), Ыа1иге Вю1ееЬпо1. 15, 159-163. Альтернативно, четырехвалентные биспецифические молекулы были созданы путем слияния биспецифических одноцепочечных диател (см. публикацию Α1ΐ е! а1., (1999), РЕВ8 Ье!!, 454, 90-94). Более мелкие четырехвалентные биспецифические молекулы могут быть также образованы путем димеризации тандемов 8сРу-8сРу при помощи линкера, содержащего фрагмент спираль-петля-спираль (ΌίΒί-миниантитела; см. публикацию Ми11ег е! а1. (1998), РЕВ8 Бей 432, 45-49), или одноцепочечной молекулы, содержащей четыре вариабельные области антитела (Ун и У_ь) в ориентации, препятствующей внутримолекулярному спариванию (тандемное антитело; см. публикацию Клрпуапоу е! а1., (1999), I. Мо1. Вю1. 293, 41-56). Биспецифические Р (аЬ')₂-фрагменты могут быть созданы путем химического связывания РаЬ'-фрагментов или гетеродимеризации при помощи лейциновых зипперов (см. публикации 8ка1аЬу е! а1. (1992), I. Ехр. Меб. 175, 217-225 и Коз!е1пу е! а1. (1992), I. 1ттипо1. 148, 1547-1553). Кроме того, могут быть получены так называемые антитела-домены, созданные на основе выделенных У_н- или У_ъ-областей (ОотапЮ Ь!б.); см. патенты США № 6248516, 6291158, 6172197.

Г етероконъюгатные антитела.

Гетероконъюгатные антитела являются производными антителами, которые также относятся к одному варианту осуществления настоящего изобретения. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител, образованных при помощи любых известных методов перекрестного связывания. См. патент США № 4676980.

Другие модификации.

Антитела по настоящему изобретению могут также включать любые другие модификации в константных областях. Например, известно, что гликозилирование антител в консервативных положениях константных областей оказывает сильное воздействие на функцию антител, в частности, на вышеописанные эффекторные функции; см., например, публикацию Воуб е! а1. (1996), Мо1. 1ттипо1. 32, 13111318. Варианты гликозилирования терапевтических антител по настоящему изобретению включают добавление, замену, делецию или модификацию одной или нескольких углеводных частей. Введение фрагмента аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводных частей и поэтому может быть использовано для управления гликозилированием антитела. В публикации Ка)и е! а1. (2001), ВюсйенйШгу. 40, 8868-8876 указано, что сиалилирование конца иммуноадгезина Т№К-1дС было увеличено в результате регалактозилирования и/или ресиалилирования с использованием бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа-2,3-сиалилтрансферазы.

Считается, что повышенное сиалилирование конца увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела, наряду с большинством гликопротеинов, обычно образуются в природе в виде смеси гликоформ. Указанная смесь является особенно очевидной при получении антител в эукариотических клетках, в частности в клетках млекопитающих. Были разработаны разные методы получения определенных гликоформ; см. публикации 2кап§ е! а1., 8аепсе (2004), 303, 371, 8еат§ е! а1., 8шепсе (2001), 291, 2344, Гаскет е! а1. (2002), 8шепсе, 298, 1790, Паю е! а1. (2002), Скет. Кеу. 102, 579, Напу е! а1. (2001), Асс. Скет. Кез. 34, 727. Таким образом, настоящее изобретение относится к множеству терапевтических антител (которые могут быть изотипом 1§С, например, 1дС1), включающему определенное число (например, 7 или меньше, в частности 5 или меньше, а именно две или одну) гликоформ указанных антител.

Производные по настоящему изобретению включают также терапевтические антитела по настоящему изобретению, связанные с небелковым полимером, таким как полиэтиленгликоль (РЕС), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Конъюгация белков с РЕС является известным методом увеличения периода полувыведения белков, а также уменьшения антигенности и иммуногенности белков. Метод обработки полиэтиленгликолем с разными молекулярными массами и разных типов (линейные или разветвленные) был исследован с использованием интактных антител, а также РаЬ'-фрагментов; см. публикацию Коитешз Ι.Ό. е! а1. (2000), 1п!. I. Ркаттасеи!. 198:83-95. Конкретный вариант осуществления изобретения относится к антигенсвязывающему фрагменту по настоящему изобретению без эффекторных функций а) активации комплемента по классическому пути и Ь) опосредования антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (такому как РаЬ-фрагмент или зсРу), связанному с РЕС.

Считается, что взаимодействие Рс-области антитела с разными Рс-рецепторами (РсуК) опосредует эффекторные функции антитела, которые включают антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС), фиксацию комплемента, фагоцитоз и период полувыведения/клиренс антитела. Рс-область антител по настоящему изобретению может быть подвергнута разным модификациям в зависимости от требуемой эффекторной функции. В частности, константные области человека, у которых отсутствуют функции а) активации комплемента по классическому пути и Ь) опосредования антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, включают константную область 1дС4, константную

- 10 024621 область 1§С2 и константную область 1дС1, содержащие специфические мутации, например мутации в положениях 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и/или 322, описанные в ЕР 0307434 (№О 88/07089), ЕР 0629240 (\УО 93/17105) и \УО 2004/014953. Кроме того, было отмечено, что мутации в положении остатков 235 или 237 СН2-домена константной области тяжелой цепи (нумерация Кабата; европейская система индексации) уменьшают связывание с РсуК1, РсуКЛ и РсуКШ и, таким образом, уменьшают антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС) (Иипсап с1 а1. №Лиге 1988, 332; 563-564; Ьипб е1 а1. 1. 1ттипо1. 1991, 147; 2657-2662; Сйарре1 е1 а1. ΡΝΆ8, 1991, 88; 9036-9040; Вийоп апб \УооГ, Α6ν. 1ттипо1. 1992, 51; 1-84; Могдап е1 а1., 1ттипо1оду 1995, 86; 319-324; Не/агей е1 а1., 1. Уио1. 2001, 75 (24); 12161-12168). В некоторых научных отчетах было описано участие некоторых из указанных остатков в рекрутинге или опосредовании комплементзависимой цитотоксичности (СЭС) (Могдап е1 а1., 1995; Хи е1 а1., Се11. 1ттипо1. 2000; 200:16-26; Не/агей е1 а1., 1. Уио1. 2001, 75(24); 12161-12168). Поэтому остатки 235 и 237 были мутированы с введением остатков аланина (Вгей е1 а1., 1ттипо1оду 1997, 91; 346-353; Ваг1йо1оте\у е1 а1., 1ттипо1оду 1995, 85; 41-48 и \УО 99/58679 для уменьшения комплементопосредованных и РсуК-опосредованных воздействий. Антитела, включающие указанные константные области, могут именоваться нелитическими антителами.

В антитело можно ввести эпитоп связывания с рецептором реутилизации для увеличения периода полувыведения из кровяного русла; см. патент США № 5739277.

В настоящее время известны пять узнаваемых рецепторов Рсу, а именно, РсуК(1), РсуКЛа, РсуКЛЪ, РсуКШа и неонатальный рецептор РсКп. В публикации 31не1бк е1 а1. (2001), 1. Вю1. Сйет. 276, 6591-6604 было продемонстрировано, что общий набор остатков 1§С1 участвует в связывании всех рецепторов РсуК, в то время как РсуКЛ и РсуКШ используют другие сайты, не входящие в указанный общий набор. Одна группа остатков 1§С1 уменьшала связывание со всеми рецепторами РсуК при замене на аланин: Рго-238, Акр-265, Акр-270, Акп-297 и Рго-239. Все указанные остатки находятся в СН2-домене 1§С и образуют кластер рядом с шарнирным соединением СН1 и СН2. В то время как РсуК1 использует только общий набор остатков 1§С1 для связывания, РсуКЛ и РсуКШ взаимодействуют также с другими остатками помимо общего набора. Замена некоторых остатков уменьшала связывание только с РсуКЛ (например, Агд-292) или РсуКШ (например, О1и-293). Некоторые варианты характеризовались лучшим связыванием с РсуКЛ или РсуКШ, но не влияли на связывание с другим рецептором (например, замена Зег-2 67 аланином (А1а) улучшала связывание с РсуКЛ, не влияя на связывание с РсуКШ). Другие варианты характеризовались лучшим связыванием с РсуКЛ или РсуКШ при уменьшении связывания с другим рецептором (например, замена Зег-298 аланином (А1а) улучшала связывания с РсуКШ и уменьшала связывание с РсуКЛ). Варианты 1§С1, обеспечивающие лучшее связывание с РсуКШа, характеризовались общим введением аланина в положениях Зег-298, О1и-333 и Ьук-334. Считается, что неонатальный рецептор РсКп защищает молекулы 1§С от разрушения и, таким образом, увеличивает период полувыведения из кровяного русла и трансцитоз в тканях (см. публикации 1ипдйапк К.Р. (1997), 1ттипо1. Кек. 16, 29-57 и Сйейе е1 а1. (2000), Аппи. Ке\\ 1ттипо1. 18, 739-766). Установлено, что остатки 1§С1 человека, непосредственно взаимодействующие с РсКп человека, включают 11е253, Зег254, Ьук288, Тйг307, О1п311, Акп434 и Шк435.

Терапевтическое антитело по настоящему изобретению может включать любые вышеуказанные модификации константных областей.

2. Способы получения.

Антитела по настоящему изобретению могут быть продуцированы в трансгенных организмах, таких как козы (см. публикацию Ро11оск е1 а1. (1999), 1. 1ттипо1. Мебюбк 231:147-157), цыплята (см. публикацию Могготе КП (2000), Сепе1. Епд. №\ук 20:1-55), мыши (см. вышеуказанную публикацию Ро11оск) или растения (см. публикации Эогап Р.М. (2000), Сигг. Оршюп Вю1есйпо1. 11, 199-204, Ма 1К-С (1998), ΝηΙ. Меб. 4; 601-606, Вае/ 1. е1 а1., ВюРйагт (2000), 13:50-54, ЗЮдег Е. е1 а1. (2000), Р1ап1 Мо1. Вю1. 42:583-590). Антитела могут быть также получены методами химического синтеза. Однако антитела по настоящему изобретению обычно получают методом культивирования рекомбинантных клеток, хорошо знакомым специалистам в данной области. Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и вводят в реплицирующийся вектор, такой как плазмида, для последующего клонирования (амплификации) или экспрессии в клетке-хозяине. Одной приемлемой экспрессирующей системой является система на основе глутаматсинтетазы (компании йоп/а Вю1одюк), особенно при использовании в качестве клетки-хозяина СНО или N30 (см. ниже). Полинуклеотид, кодирующий антитело, легко выделяют и секвенируют стандартными методами (например, при помощи олигонуклеотидных зондов). Применяемые векторы включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, из которых наиболее типичными являются плазмиды. Такие векторы обычно дополнительно включают сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или несколько генов-маркеров, энхансер, промотор и последовательности терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепи для облегчения экспрессии. Полинуклеотид, кодирующий легкую и тяжелую цепи, может быть вставлен в отдельные векторы и одновременно или последовательно введен (например, путем трансформации, трансфекции, электропорации или трансдукции) в ту же клетку-хозяина, либо, при желании, тяжелая и легкая цепи

- 11 024621 могут быть вставлены в один и тот же вектор до введения в клетку-хозяина.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что вследствие избыточности генетического кода, помимо вышеуказанных полинуклеотидов, также существуют другие полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды по настоящему изобретению.

Сигнальные последовательности.

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в виде слитого белка с гетерологичной сигнальной последовательностью, имеющей специфический сайт расщепления у Ν-конца зрелого белка. Сигнальная последовательность должна быть узнана и процессирована клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев сигнальной последовательностью может быть щелочная фосфатаза, пенициллиназа или лидерные последовательности теплостойкого энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах сигнальными последовательностями могут быть лидерная последовательность инвертазы дрожжей, лидерная последовательность α-фактора или лидерные последовательности кислой фосфатазы; см., например, \νϋ 90/13646. В системах клеток млекопитающих могут быть использованы секретирующие лидерные последовательности вирусов, такие как сигнальная последовательность вируса простого герпеса и сигнальная последовательность природного иммуноглобулина (например, тяжелая цепь 1д человека). Сигнальная последовательность обычно лигирована в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим антитело по настоящему изобретению.

Ориджин репликации.

Ориджины репликации хорошо известны в данной области, при этом рВК.322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, 2μ плазмида пригодна для большинства дрожжей, и разные вирусы, такие как ЗУ40, вирус полиомы, аденовирус, УЗУ или ВРУ, пригодны для большинства клеток млекопитающих. Ориджин репликации обычно не нужен для интегрированных экспрессирующих векторов млекопитающих, за исключением введения вектора в Е.Сой. Однако ориджин репликации ЗУ40 может быть использован, так как данный вирус содержит ранний промотор.

Селектирующий маркер.

Типичные селектирующие гены кодируют белки, которые (а) сообщают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, или (Ь) восполняют недостаток ауксотрофов или предоставляют питательные вещества, отсутствующие в комплексной среде, или (с) выполняют обе функции. Схема селекции может включать замедление роста клеток-хозяев, которые не содержат вектора или векторов. Клетки, которые были успешно трансформированы генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают, например, благодаря лекарственной устойчивости, сообщенной доставленным селектирующим маркером. Одним примером является ΌΗΡΚ-селектирующая система, в которой трансформанты образуются в ΌΗΡΚотрицательных линиях хозяев (см., например, публикацию Раде апб Зубеийат, 1991, Вю!есйио1оду, 9:6468). В указанной системе ген ΌΗΡΚ доставляют вместе с полинуклеотидными последовательностями антитела по настоящему изобретению и затем отбирают ΌΗΡΚ-положительные клетки путем удаления нуклеозида. При необходимости, для отбора трансформантов с амплификацией гена ΌΗΡΚ также используют ингибитор ΌΗΡΚ метотрексат. В результате функционального связывания гена ΌΗΡΚ с кодирующими последовательностями антитела по настоящему изобретению или функциональными производными указанных последовательностей амплификация гена ΌΗΡΚ вызывает сопутствующую амплификацию представляющих интерес последовательностей требуемого антитела. Клетки СНО представляют собой особенно пригодную линию клеток для отбора с помощью ΌΗΡΚ/метотрексата, и в данной области хорошо известны методы амплификации и отбора клеток-хозяев с использованием системы ΌΗΡΚ; см. публикацию КаиГтап Κ.Ρ е! а1., 1. Мо1. Βίοί. (1982), 159, 601-621; для обзора см. публикацию Vете^ Κ.Ο., Ыое V., Корр К., Зсй1и!ег М., Арргорпа1е таттайаи ехргеззюп зуз1етз Гог ЬюрйагтасеиЕса1з, Лг/пеп1ние1-Гогзс1шпд. 48(8): 870-80, 1988 Аид. Другим примером является экспрессирующая система на основе глутаматсинтетазы (йоп/а Вю1од1ез). Подходящим селектирующим геном, предназначенным для использования в дрожжах, является ген !гр1; см. публикацию ЗйисйсотЬ е! а1., Ыа1иге, 282, 38, 1979.

Промоторы.

Подходящие промоторы для экспрессии антител по настоящему изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим данное антитело. Промоторы для прокариотических хозяев включают промотор р1оА, промоторные системы на основе бета-лактамазы и лактозы, щелочную фосфатазу, триптофан и гибридные промоторы, такие как Тас. Промоторы, пригодные для экспрессии в дрожжевых клетках, включают 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, например, энолазу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, пируватдекаробоксилазу, фосфофруктокиназу, глюкоза-6-фосфатизомеразу, 3-фосфоглицератмутазу, глюкокиназу и др. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают алкогольдегидрогеназу-2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, металлотионеин, ферменты, отвечающие за азотистый обмен или утилизацию мальтозы/галактозы, и др.

- 12 024621

Промоторы, предназначенные для экспрессии в клеточных системах млекопитающих, включают РНК-полимеразу II, в том числе вирусные промоторы, такие как вирус полиомы, птичий поксвирус и аденовирусы (например, аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, птичий вирус саркомы, цитомегаловирус (в частности, промотор предраннего гена), ретровирус, вирус гепатита В, актин, вирус саркомы Рауса (К8У) и ранний или поздний вакуолизирующий обезьяний вирус 40, и невирусные промоторы, такие как ΕΡ-1-альфа (Μίζιΐδΐιίιηα апб Ыада!а, ШсШс Ααά8 Кез., 1990, 18(17): 5322), и др. Выбор промотора может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Энхансер.

В случае необходимости, например, для экспрессии в высших эукариотических клетках могут быть использованы дополнительные энхансерные элементы вместо промоторов или энхансерные элементы, обнаруженные в описанных выше промоторах. Подходящие энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы из глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионина и инсулина. Альтернативно можно использовать энхансерный элемент из вируса эукариотической клетки, такой как энхансер 8У40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, энхансер бакуловируса или локус 1дС2а мыши (см. \УО 04/009823). Несмотря на то что такие энхансеры обычно находятся в векторе в сайте вверху от промотора, они могут быть расположены в любом месте, например, в нетранслированной области или внизу от сигнала полиаденилирования. Энхансер и его местоположение могут быть выбраны с учетом подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Полиаденилирование/терминация.

В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с полинуклеотидом, кодирующим антитело по настоящему изобретению. Такие сигналы обычно находятся у З'-конца открытой рамки считывания. В системах млекопитающих неограничивающие примеры сигналов включают последовательности, выделенные из гормонов роста, альфа-фактора элонгации 1 и вирусных (например, 8У40) генов или длинных концевых повторов ретровирусов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают последовательности, выделенные из генов фосфоглицераткиназы (РСК) и алкогольдегидрогеназы 1 (ΑΌΗ). В прокариотической системе сигналы полиаденилирования обычно не требуются, и вместо них обычно используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/терминации может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Другие методы/элементы для повышения выхода.

Помимо вышеизложенного, другие признаки, которые позволяют увеличить выход, включают элементы ремоделирования хроматина, интроны и модификацию конкретного кодона клетки-хозяина. Кодон, используемый в антителе по настоящему изобретению, может быть модифицирован для соответствия смещению кодона клетки-хозяина, например, для увеличения выхода транскрипта и/или продукта (см., например, публикацию Ноекета Α. е! а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ., 1987, 7(8):2914-24). Выбор кодонов может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Клетки-хозяева.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела по настоящему изобретению, являются, например, прокариотическими, дрожжевыми или высшими эукариотическими клетками. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерии, например, энтеробактерии, такие как ЕзсНепсЫа. например, Е.Сой (например, АТСС 31446, 31537, 27325), Еп1етоЬас1ет, Ег\уииа. К1еЬ81е11а Рто1еи8, 8а1топе11а, например 8а1топе11а 1урЫтигшт, 8етгаИа, например, 8етгаПа татсезсапз, и 8Ыде11а, а также ВашШ, такие как В.зиЬППз и В.ПсНешГогпиз (см. ΌΌ 266710), Рзеиботопаз, такие как Р.аетидшоза и 81тер1отусез. Из дрожжевых клеток-хозяев могут быть также использованы 8ассЬатотусе8 сегеу181ае, 8сЫζο8ассЬа^οтусе8 ротЬе, К1иууеготусе8 (например, АТСС 16045, 12424, 24178, 56500), уатгомта (ЕР 402226), РюЫа Ра81от18 (ЕР 183070, см. также публикацию Репд е! а1., 1. Вю1есЬпо1. 108 (2004), 185-192), СапбМа, ТпсНобегта гее81а (ЕР 244234), РетсШт, То1урос1аШит и А8регдШи8, такие как А.пШи1аи8 и А.шдет.

Несмотря на то что в объем настоящего изобретения входят прокариотические и дрожжевые клетки-хозяева, обычно клетками-хозяевами по настоящему изобретению являются клетки позвоночных. Подходящие клетки-хозяева позвоночных включают клетки млекопитающих, такие как СО8-1 (АТСС № СКЬ 1650), СО8-7 (АТСС СКЬ 1651), линия клеток почек эмбриона человека 293, РегС6 (Сгисе11), клетки почек детеныша хомячка (ВНК) (АТСС СКЬ 1632), ВНК570 (АТСС № СКЬ 10314), 293 (АТСС № СКЬ 1573), клетки яичника китайского хомячка СНО (например, СНО-К1, АТСС № ССЬ 61), линия клеток ИНРК-СНО, такая как ИС44 (см. приведенную выше публикацию Иг1аиЬ е! а1. (1986)), в частности линии клеток СНО, адаптированные для суспензионной культуры, клетки Сертоли мыши, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зеленой мартышки (АТСС СКЬ 1587), клетки НЕЬА, клетки почки собаки (АТСС ССЬ 34), клетки легких человека (АТСС ССЬ 75), клетки Нер С2 и миеломные или лимфомные клетки, например, N80 (см. патент США № 5807715), 8р2/0, Υ0.

- 13 024621

Таким образом, один вариант осуществления изобретения относится к устойчиво трансформированной клетке-хозяину, содержащей вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела по настоящему изобретению. Такие клетки-хозяева обычно содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь.

Такие клетки-хозяева могут быть также созданы или адаптированы для изменения качества, функции и/или выхода антитела по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры включают экспрессию специфических модифицирующих (например, гликозилирующих) ферментов и чаперонов, производящих укладку белка.

Методы культивирования клеток.

Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антитела по настоящему изобретению, можно культивировать любым методом, известным специалистам в данной области. Клетки-хозяева можно культивировать во вращающихся колбах, встряхиваемых колбах, роллерфлаконах или системах полых волокон, но для широкомасштабного производства предпочтительны реакторы с мешалками или реакторы с корзинами (см., например, \Уауе Бю1есЬ. ЗотсгзсЕ №\у 1ет8еу, И8А), особенно для суспензионных культур. Баки с мешалкой обычно приспосабливают для аэрации при помощи барботеров, дефлекторов или импеллеров со слабым сдвигающим усилием. Для барботажных колонн и реакторов с перемешиванием струей воздуха может быть использована прямая аэрация пузырьками воздуха или кислорода. При культивировании клеток-хозяев в бессывороточной культуральной среде желательно ввести в среду защищающий клетки агент, такой как плюроник Р-68, для предотвращения разрушения клеток в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клеткихозяина в качестве субстратов роста для якорной подложки могут быть использованы микроносители, или клетки могут быть адаптированы для суспензионной культуры (которая является типичной). При культивировании клеток-хозяев, в частности, клеток-хозяев позвоночных, могут быть использованы разные методы, такие как периодическое культивирование, культивирование с подпиткой, повторяющееся периодическое культивирование (см. публикацию Эгарсаи е! а1. (1994), Су!о!есНпо1оду, 15:103-109), продолжительное периодическое культивирование или перфузионное культивирование. Хотя рекомбинантно трансформированные клетки-хозяева млекопитающих можно культивировать в сывороточной среде, которая включает фетальную телячью сыворотку (РС8), клетки-хозяева предпочтительно культивируют в синтетической бессывороточной среде, аналогичной описанной в публикации Кееп е! а1. (1995), Су!о!есНпо1оду, 17:153-163, или в коммерчески доступной среде, такой как РгоСНО-СЭМ или иИгаСНО™ (СатЬтех N1, И8Л), содержащей при необходимости источник энергии, такой как глюкоза, и синтетические факторы роста, такие как рекомбинантный инсулин. Культивирование клеток-хозяев в бессывороточной среде может потребовать адаптации указанных клеток для роста в бессывороточных условиях. Одним методом адаптации является культивирование таких клеток-хозяев в сывороточной среде и последовательная замена 80% культуральной среды бессывороточной средой, в результате чего клетки-хозяева будут адаптироваться к бессывороточным условиям (см., например, 8сНагГепЬегд К. е! а1. (1995), ίη Лшта1 Се11 !есНпо1оду: Оеуе1ортеп15 1о\\агЙ5 (Не 2Г’¹ сепШгу (Веиуегу Е.С. е! а1., ей§), р. 619623, К1и\уег Лсайепис риЬНкНещ).

Антитела по настоящему изобретению, секретируемые в среду, могут быть выделены и очищены от среды разными методами с достижением степени чистоты, подходящей для предполагаемого применения. Например, применение терапевтических антител по настоящему изобретению для лечения людей требует по меньшей мере 95% чистоты, определяемой методом 8Ό8-ΡΑΟΕ, обычно 98 или 99% чистоты по сравнению с культуральной средой, содержащей терапевтические антитела. В первом случае клеточный дебрис из культуральной среды обычно удаляют центрифугированием с последующим выполнением стадии очистки супернатанта при помощи микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубинной фильтрации. Альтернативно антитело может быть получено микрофильтрацией, ультрафильтрацией или глубинной фильтрацией без предшествующего центрифугирования. Существует целый ряд других методов, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографических методов, таких как хроматография на колонке с гидроксиапатитом (НА), аффинная хроматография (необязательно включающая аффинную систему мечения, такую как полигистидин) и/или хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С, см. патент США № 5429746). В одном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению получают после выполнения разных стадий очистки при помощи аффинной хроматографии белков А или С с последующим выполнением ионообменной хроматографии и/или хроматографии на колонке с гидроксиапатитом, анионообменной или катионообменной хроматографии, гель-хроматографии и осаждения сульфатом аммония. Кроме того, могут быть использованы разные стадии удаления вируса (например, нанофильтрация с использованием, например, фильтра Όν-20). В результате выполнения вышеуказанных стадий получают очищенный (обычно моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 10 мг/мл или больше, например, 100 мг/мл или больше антитела по настоящему изобретению, который представляет собой еще один вариант осуществления изобретения. Концентрация до 100 мг/мл или больше может быть достигнута ультрацентрифугированием. Такие препараты, по существу, не содержат агрегированные формы антител по настоящему изобретению.

- 14 024621

Бактериальные системы особенно пригодны для экспрессии фрагментов антитела. Такие фрагменты локализованы внутри клетки или в периплазме. Нерастворимые периплазматические белки могут быть экстрагированы и подвергнуты повторной укладке с образованием активных белков согласно методам, известным специалистам в данной области; см. публикации 5>апсЬе/ с1 а1. (1999), Ε Вю1есЬио1. 72, 13-20 и СирЬ Р.М. е1 а1. (1999), Ьей. Αρρ1. МюгоЪюЬ, 29, 273-277.

3. Фармацевтические композиции и способ введения.

Очищенные препараты антител по настоящему изобретению, описанные выше, могут быть введены в фармацевтические композиции для применения при лечении вышеуказанных заболеваний и нарушений у человека. Такие композиции обычно дополнительно включают фармацевтически приемлемый (т.е. инертный) носитель, используемый в общепринятой фармацевтической практике; см., например, РепипдЮпк РЬагтасеийса1 Баеисек, 16* еб. (1980), Маск РиЪЬкЫид Со. Примеры таких носителей включают стерилизованные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, содержащие подходящие буферы для достижения значения рН, равного 5-8. Фармацевтические композиции для инъекций (например, внутривенных, внутрибрюшинных, внутрикожных, подкожных, внутримышечных или внутрипортальных) или вливаний не содержат видимых частиц и могут включать от 0,1 мг до 10 г терапевтического антитела, обычно от 5 до 25 мг антитела. Методы получения таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции содержат от 0,1 мг до 10 г терапевтических антител по настоящему изобретению в стандартной лекарственной форме с прилагаемой инструкцией по применению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть лиофилизованы (высушены вымораживанием) для восстановления перед введением способами, хорошо известными специалистам в данной области. Когда варианты осуществления изобретения относятся к антителам по настоящему изобретению с изотипом 1§С1, в фармацевтическую композицию может быть добавлен хелатор меди, такой как цитрат (например, цитрат натрия), ΕΌΤΑ или гистидин, для уменьшения степени опосредуемого медью разрушения антител данного изотипа; см. ЕР 0612251.

Эффективные дозы и схемы введения антитела по настоящему изобретению обычно определяются эмпирически и зависят от таких факторов, как возраст, масса тела и состояние здоровья пациента, подлежащее лечению заболевание или нарушение. Такие факторы должны учитываться лечащим врачом. Руководство по выбору соответствующих доз приведено, например, в публикации διηίΐΐι е1 а1. (1977), АибЪоб1ек ίη Ьитап б1адпо515 апб 1Ьегару, Кауеи Ргекк, №\ν Уогк, но приемлемая доза обычно находится в пределах от 0,1 мг до 1 г. В одном варианте осуществления изобретения схема введения при лечении человека составляет от 0,1 мг до 10 г терапевтического антитела по настоящему изобретению, вводимого подкожно один раз в неделю или через две недели, либо в виде внутривенного вливания через 1 или 2 месяца. Композиции по настоящему изобретению могут быть также использованы в профилактических целях.

4. Клинические применения.

Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕΝΑ-78 человека. Настоящее изобретение относится также к способам лечения указанным антителом заболеваний или нарушений, характеризующихся повышенным или несбалансированным уровнем одного или нескольких хемокинов, включающих 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕΝΑ-78 человека, а именно хронического обструктивного заболевания легких (СОРЭ), остеоартрита, ревматоидного артрита, эрозивного артрита, астмы, атеросклероза, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, отторжения трансплантата, подагры, рака, острого поражения легких, острого заболевания легких, сепсиса, респираторного дистресс-синдрома у взрослых (ΑΚΌδ), заболевания периферических артерий, системного склероза, респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, обострения астмы и СОРЭ. муковисцидоза, диффузного панбронхиолита, поражения, вызванного реперфузией, и/или эндометриоза, к фармацевтическим композициям, содержащим указанное антитело, и способам приготовления таких композиций.

Настоящее изобретение относится также к применению антитела для приготовления лекарственного средства для лечения заболеваний или нарушений, характеризующихся повышенным или несбалансированным уровнем одного или нескольких хемокинов, включающих 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сгогамма, ССР-2 и ΕΝΑ-78 человека, а именно, хронического обструктивного заболевания легких (СОРЭ), остеоартрита, ревматоидного артрита, эрозивного артрита, астмы, атеросклероза, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, отторжения трансплантата, подагры, рака, острого поражения легких, острого заболевания легких, сепсиса, респираторного дистресс-синдрома у взрослых (ΑΚΌδ), заболевания периферических артерий, системного склероза, респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, обострения астмы и СОРЭ, муковисцидоза, диффузного панбронхиолита, поражения, вызванного реперфузией, и/или эндометриоза. Несмотря на то что настоящее изобретения описано, главным образом, применительно к лечению заболеваний или нарушений у человека, настоящее изобретение может быть также использовано для лечения аналогичных заболеваний или нарушений у млекопитающих, отличных от человека.

- 15 024621

Конкретные варианты осуществления изобретения

Пример 1. Получение мышиного моноклонального антитела 656.35, 197.2 и 81.1.

Получение пентаспецифического моноклонального антитела против хемокинов-мишеней (1Ь-8, Ого-альфа, Ого-бета, Ого-гамма и ЕNΑ-78 человека).

Были использованы разные методы и схемы иммунизации мышей с целью создания панспецифических моноклональных антител (тАЬ).

Панспецифические моноклональные антитела были получены с использованием разных смесей множественных антигенных пептидов (МАР) и/или интактных хемокинов-мишеней (1Ь-8, Ого-α, -β, -γ и ЕNΑ-78), смешанных в полном или неполном адъюванте Фрейнда (сРА или 1РА), в соответствии с измененным протоколом повторной иммунизации нескольких сайтов (Р1ММЗ) в линии мышей ЗГО/.Юг1Сг1.

МАР или множественные антигенные пептиды выполняют две функции в протоколе иммунизации. Во-первых, МАР обеспечивают селективное множественное представление известной аминокислотной последовательности-мишени. Во-вторых, вызывают увеличение массы благодаря многочисленным копиям последовательности, связанным, например, при помощи лизинового ядра, что также повышает иммуногенность последовательности по сравнению с отдельными пептидами (Ргапшк, РР. с1 а1., 1ттипо1оду, 1991: 73; 249, 8сЬо«, М.Е. е1 а1., Се11. 1ттипо1. 1996: 174, 99-209, Тат, РР. Ргос. №И. Асаб. 8ά. 1988: 85; 5409-5413). На фиг. 1 представлено схематическое изображение набора МАР, имеющих аминокислотные последовательности ЗЕр ГО N0:49-53. Линкер в МАР может быть любым линкером, кроме лизинов.

Общая временная последовательность иммунизации.

Панспецифические моноклональные антитела были получены в соответствии с двумя разными протоколами иммунизации в указанной временной последовательности.

1. Первичная иммунизация (0-й день) состояла из нескольких подкожных инъекций (конечности, спина и шея) всех хемокинов-мишеней, смешанных с сРА (по 10 мкг каждого). Нижеследующие 4 бустер-дозы состояли из смеси всех хемокинов-мишеней, смешанных в 1РА (по 10 мкг каждого). Пятая и все последующие бустер-дозы состояли из коктейля всех хемокинов-мишеней и всех 5 линейных МАР (по 10 мкг каждого) в 1РА. Конечная бустер-доза, вводимая при помощи внутрибрюшинной (1Р) инъекции за 3 дня до умерщвления и слияния, состояла из всех хемокинов-мишеней и линейных МАР в РВЗ.

2. Первичная иммунизация (0-й день) состояла из нескольких подкожных инъекций (конечности, спина и шея) всех пяти линейных МАР, смешанных в сРА (по 10 мкг каждого). Следующие 4 бустердозы состояли из смеси всех пяти линейных МАР в 1РА (по 10 мкг каждого). Пятая и все последующие бустер-дозы состояли из коктейля всех 5 линейных МАР и всех хемокинов-мишеней (по 10 мкг каждого) в 1РА. Последняя бустер-доза, вводимая при помощи внутрибрюшинной (1Р) инъекции за 3 дня до умерщвления и слияния, состояла из всех 5 линейных МАР и всех хемокинов-мишеней (по 10 мкг каждого) в РВЗ.

Пример 2. Пансвязывание моноклонального антитела с хемокинами-мишенями.

(1Ь-8, Ого-альфа, Ого-бета, Ого-гамма, ОСР-2 и ЕNΑ-78 человека) было подтверждено при помощи иммунофлуоресцентного анализа с флуоресцентным усилением и разрешением по времени. Каждый антиген (ГО-8, Ого-альфа, Ого-бета, Ого-гамма, ОСР-2, ЕNΑ-78 человека и ЫЬ-18, используемый в качестве отрицательного контрольного образца) отдельно наносили на 96-луночный иммунофлуоресцентный планшет. Затем планшеты промывали и блокировали коммерчески доступным блокирующим раствором. Блокирующий раствор удаляли, в каждую лунку добавляли образцы, содержащие моноклональное антитело, и инкубировали в течение 40-60 мин (в течение указанного времени моноклональное антитело связывалось с хемокинами-мишенями). Планшеты снова промывали и в каждую лунку добавляли детектирующее антитело. В качестве детектирующих реагентов было использовано соответственно 2-кратное количество антитела 656.35, химерные (НсЬс) и гуманизированные моноклональные антитела:биотинилированный 1§О против мыши, биотинилированный РаЬ2 1§О против человека и 1§О против человека, обработанный европием. Детектирующее антитело было конъюгировано с европием или биотином. Планшет снова промывали, чтобы удалить несвязанное детектирующее антитело, и в анализируемые образцы с обнаруживаемым биотином добавляли раствор стрептавидина-европия. Смесь стрептавидина-европия связывается с биотином, позволяя обнаружить указанный реагент. После выполнения последней промывки для удаления несвязанного стрептавидина-европия или в случае анализа гуманизированного моноклонального антитела после последующей промывки конъюгата с европием все лунки заполняли раствором хелатирующего детергента для активации флуоресценции, продуцируемой европием. Более сильная флуоресценция пропорциональна количеству детектирующего антитела, присутствующего в лунке, которое пропорционально количеству хемокин-связывающего моноклонального антитела.

На фиг. 5А показано связывание мышиного моноклонального антитела 656.35 с хемокинамимишенями человека.

На фиг. 5В показано связывание химерного антитела (НсЬс) с хемокинами-мишенями человека.

На фиг. 5С показано связывание гуманизированных моноклональных антител с хемокинамимишенями человека.

- 16 024621

Пример 3.

Функциональное панингибирование мышиным моноклональным антителом было подтверждено разными методами: СХСК2-опосредованная мобилизация Са²+, хемотаксис нейтрофилов человека и активация нейтрофилов человека (поверхностная экспрессия СЭ11Ь).

Анализ мобилизации кальция на титрационном микропланшете Η .1РИ (спектрофотометр для прочтения планшетов с флуорометрической визуализацией, Мо1еси1аг Эеуюез, 8иппууа1е, СА [8сЬгоейег, 1996] выполняли для функционального исследования нейтрализующего воздействия антител на [Са²⁺]1мобилизацию, индуцированную РРИ + хемокином, в клетках СНО-К1, трансфицированных НСХСК2 и Οα16 и устойчиво экспрессирующих указанные вещества.

За один день до анализа клетки высевали на 96-луночные планшеты с черными стенками и светлым основанием (Раскагй У1е\у) в количестве 40000 клеток/лунку. Через 18-24 ч из лунок отсасывали среду и заменяли 100 мкл рабочей среды, содержащей минимальную эссенциальную среду Игла (ЕМЕМ) с солями Эрла и Б-глутамином, 0,1% В8А (8его1од1са1з СогрогаНоп), 4 мкМ флуоресцентного индикаторного красителя на основе флуо-4-ацетоксиметилового эфира (флуо-4 АМ) и 2,5 мМ пробенецида. Клетки инкубировали в указанной среде, содержащей краситель, в течение 1 ч при 37°С. Среду, содержащую краситель, отсасывали и заменяли такой же средой без флуо-4 АМ, содержащей 0,1% желатина (В8А удаляли) и 2,5 мМ пробенецида. Клетки инкубировали в течение 10 мин при 37°С и затем трижды промывали буфером для анализа КИН [буфер Кребса-Рингера-Хенселейта (120 мМ №С1, 4,6 мМ КС1, 1,03 мМ КН₂РО4, 25 мМ №НСОэ, 1 мМ СаС1₂, 1,1 мМ М§С1₂, 11 мМ глюкозы, 20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4)), содержащий 0,1% желатина и 2,5 мМ пробенецида]. После последней промывки буфером к клеткам добавляли 100 мкл буфера для анализа КИН, содержащего 0,1% желатина и 2,5 мМ пробенецида, нагревали до 37°С в течение 10 мин и вводили в ББ1РИ, где клетки, окрашенные красителем, подвергали воздействию возбуждающего излучения (488 нм), создаваемого аргонным лазером мощностью 6 Вт. [Са²⁺]1-мобилизацию измеряли в виде увеличения интенсивности излучения флуо-4, связанного с Са²+, при 516 нм. Изменение интенсивности излучения непосредственно связано с уровнями цитозольного кальция [Са²⁺]Р После измерения исходного значения в течение 10 секунд в планшет добавляли 50 мкл 3-кратного количества смеси ЕИБ + хемокин, которую предварительно инкубировали с антителом в разных концентрациях, и регистрировали данные каждую секунду в течение 1 мин, затем еще в течение 0,5 мин с интервалами в 3 с. Максимальную клеточную реакцию, которая была выше исходного значения, использовали для построения графика в программе ОгарЬРай Рпзт (версия 4.03).

Значение 1С50 определяли в виде концентрации антитела, необходимой во время предварительной обработки 3-кратным количеством хемокина в концентрации ЕС80 для нейтрализации СХСИ2опосредованного стимулирующего действия смеси ЕБИ + хемокин в концентрации ЕС80 на 50%. Вторичную клеточную реакцию на 25 мкМ АТР измеряли для исследования жизнеспособности клеток [8агаи, 1999].

Ингибирование индуцированного смесью ЕИБ + хемокин кальциевого потока у человека (геометрически усредненное значение 1С50, мкг/мл) тремя мышиными моноклональными антителами. (п=3-6) (п.й.=определение не производилось, N/А=данные отсутствуют)

	3 нМ ЫЬ-8	10 нМ ЬСКСа	6 нМ ьскор	30 нМ ΙιΕΝΑ-78	100 нМ ЬССР-2
Мышиное моноклональное антитело	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.
656.35	0,18	0,14- 0,25	1,43	0, 603,42	1,06	0,78- 1,42	2,09	0,716, 14	9, 58	1,1778, 57
81.1	67,65	18,80- 243,50	0, 94	0, 372,38	п.а.	Ν/Α	1, 84	0, 694,93	9, 11	1,44- 57,61
197.2	2,19	0,61- 7,88	2,24	0, 3912, 98	п.а.	Ν/Α	13,86	1,71- 112,49	>157	Ν/Α

8сЬгоейег К.8., №ад1е, Β.Ώ. ББ1РИ: а пе\у тз1гитеп! Юг ассига1е, Ыдй Шгоидйри! орЬса1 зсгеетпд. I. Вюто1. 8сгееп. 1996:1-75.

8агаи Н.М., Атез И.8., СЬатЬегз I., Е1Ьз С., Е1зЬоигЬаду Ν., Но1еу Ι.Ι. е! а1. ЫепИйсаИоп, то1еси1аг с1отпд, ехргеззюп, апй сЬагас1еп/.аЬоп о£ а суз!ету1 1еико1пеп гесер!ог. Мо1. РЬагтасо1. 1999; 56:657-663.

Ингибирование стимулированного ГБ-8 хемотаксиса нейтрофилов человека было также продемонстрировано при использовании микрокамеры Бойдена. Микрокамера Бойдена состоит из двух небольших камер, расположенных выше и ниже пористой мембраны толщиной 3 мкм. В нижнюю камеру помещают агент, вызывающий хемотаксис (т.е. 1Б-8), или смесь хемокина с пентаспецифическим моноклональным антителом. В верхней камере находятся очищенные неактивированные нейтрофилы человека. После сборки камеры возникает градиент концентраций из нижней части в верхнюю, стимулирующий движение нейтрофилов через мембрану к хемотаксину. Результаты анализа выражены в виде С1 (хемотаксического индекса), который представляет собой отношение числа клеток, подверженных хемотаксису под воздействием стимулятора, к числу нестимулированных клеток. В процессе предварительной инкубации хемокина (т.е. 1Б-8) с пентаспецифическим моноклональным антителом в нижней камере указанное антитело ингибировало в зависимости от дозы стимулируемый 1Б-8 хемотаксис нейтрофилов. 1Б-8 в количестве 10 нМ обеспечивал достижение С1 в пределах 3,6±0,8. Предварительная инкубация 1Б-8 с пентас- 17 024621 пецифическим моноклональным антителом (656.35) в возрастающих концентрациях вызывала ингибирование в зависимости от дозы хемотаксиса нейтрофилов человека, при этом статистически значимое значение было достигнуто при С1, равном 2,2±0,6, при дозе 1 мкг/мл. Другие хемокины (Ого-α, -β, -γ и ΕΝΑ78) нельзя было исследовать из-за используемых количеств и чувствительности анализа.

Ингибирование активации очищенных нейтрофилов человека путем измерения поверхностной экспрессии СИ11Ь. СГО11Ь или Мас-1 опосредуют адгезию к субстратам, агрегацию и хемотаксис, и, как известно, их уровень повышается на поверхности активированных нейтрофилов (Мо1ай УД. с1 а1., СЬп. 1ттипо1. 1ттипораФо1. 1994: 71; 281-286). Неактивированные нейтрофилы человека очищают и стимулируют ех νίνο хемокинами-мишенями (т.е. 1Ь-8) или хемокинами, предварительно инкубированными с пентаспецифическим моноклональным антителом против хемокинов. Данные выражены в виде процентного значения активации при максимальной поверхностной экспрессии СИ 11Ь в результате стимуляции 1Ь-8. Предварительная инкубация 1Ь-8 с моноклональным антителом 656.35 позволяла ингибировать в зависимости от дозы повышенные уровни поверхностной экспрессии СИ11Ь, что свидетельствует об ингибировании активации нейтрофилов (79,9±3,7%, 48,5±7,2%, 28,7±3,2% и 31,6±3,4% соответственно в дозе 0,01, 0,1, 1, 10 и 50 мкг/мл).

Пример 4.

Значения ассоциации/диссоциации пентаспецифических моноклональных антител для каждого хемокина-мишени (1Ь-8, Ото-бета и ΕΝΑ-78 человека).

Методы анализа Ыасоте.

Для выполнения эксперимента, именуемого КЬ, 1§О-Рс кролика против мыши (Ыасоте ВК-1005-14) иммобилизуют на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином в соответствии с инструкциями изготовителей.

Для выполнения эксперимента, именуемого ВЕ, очищенные антитела иммобилизуют на чипе путем связывания с амином.

Супернатант или очищенное антитело, выделенное из родительского мышиного моноклонального антитела, улавливают на поверхности 1§О-Рс против мыши. Каждое анализируемое вещество (1Ь-8, Ого-бета, ΕΝΑ-78) в определенных концентрациях пропускают над поверхностью иммобилизованного или уловленного антитела, при этом для каждого впрыскивания анализируемого вещества используют вновь уловленное антитело. После каждого впрыскивания анализируемого вещества поверхность восстанавливают, впрыскивая слабый кислотный раствор, который удаляет уловленное антитело, но не оказывает значительного влияния на способность 1§О-Рс против мыши выполнять другое улавливание и не влияет на иммобилизованные антитела. На поверхность уловленного антитела также впрыскивают буфер для двойного контроля. Данные анализируют при помощи программного обеспечения для анализа, предназначенного для данного компьютера, используя модель связывания в отношении 1:1.

		1Ь-8			бго-в		ΕΝΑ-78
	МОиОклОнальнОй антитело	ка	ка	КО	ка	ка	КО	ка	ка	КО
ΚΙ	656.35	1,48Е-03	1,53Е+06	9,64Е-10	2,01Е-03	3,82Е+06	5,26Е-10	1,87Е-03	1,07Е+0б	1/74Е-09
ВБ		б,87Е-04	3,19Е+06	8,39Е-11	1,4бЕ-03	1,32ЕТ07	1,11Е-10	7,9бЕ-04	2,94Е+0б	2/71Е-10
къ	81.1	9,32Е-03	1,95Е+06	4,80Е-09	3,12Е-04	2,76Е+06	1,13Е-10	3,76Е-04	6,11Е+05	6,16Е-10
ВЕ		1,08Е-01	1,95Е+06	5,55Е-08	4,89Е-04	5,44Е+06	8,98Е-11	3,94Е-06	1,65Е+05	2/39Е-11
къ	197.2	3,69Е-03	6,27Е+05	5,89Е-09	9,93Е-04	1,55Е+05	6,39Е-10	2,69Е-03	2,99Е+05	9,00Е-09
ВЕ		4,99Е-04	7,23Е+05	6,90Е-10	4,ЗОЕ-08	1,04Е+0б	4,62Е-14	3,02Е-03	3,01Е+05	1/01Е-03

Пример 5. Картирование эпитопов.

Было произведено картирование эпитопов моноклонального антитела 656.35, при этом было установлено, что указанное антитело связывается с эпитопом КЕБКС’ОС'ЖТУЗКР (8ЕЦ ГО N0:54) в 1Ь-8 человека. Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пентаспецифическому антителу, которое связывается с эпитопом §ЕЦ ГО N0:54 1Ь-8 человека.

Пример 6.

Исследование эффективности химерного антитела, полученного из антитела 656.35, имеющего последовательность тяжелой цепи §ЕЦ ГО N0:56 и последовательность легкой цепи §ЕЦ ГО N0:58. (Указанное антитело будет именоваться химерным антителом).

Исследования ίη νί\Ό.

Для исследования способности пентаспецифического антитела ингибировать инфильтрацию нейтрофилов в легкие приматов кроме человека (NΗΡ - циномолгус) была использована модель острого воспалительного заболевания легких, вызванного ингаляцией ЬР§. У приматов (NΗΡ) обследовали состояние здоровья и восприимчивость к экзогенно добавляемому 1Ь-8 циномолгуса (цино-1Ь-8). У отобранных приматов брали образцы для получения исходных данных (кровь и бронхоальвеолярный лаваж - ВАЬ) за пять дней до первой стимуляции ЬР§. В процессе стимуляции ЬР§ приматов транквилизировали при помощи одной внутримышечной инъекции гидрохлорида кетамина (~10 мг/кг). После достижения седативного эффекта приматов анестезировали путем внутривенного вливания пропофола (~0,2 мг/кг/мин, в случае необходимости). Анестезированных животных помещали на грелку-одеяло с цирку- 18 024621 лирующей теплой водой и/или обертывали одеялом с циркулирующим теплым воздухом и в каждый глаз вводили глазную мазь. Затем животных интубировали и искусственно вентилировали легкие для достижения стимуляции. Для стимуляции использовали дыхательный аппарат с положительным давлением и регулируемым объемом (дыхательный аппарат для кошек/кроликов компании §!ое111п§, \у\у\у.Чое11п18со.сот № по каталогу 5019510).

Стимуляцию липополисахаридом (ΕΡδ) выполняли путем ингаляции при помощи ультразвукового распылителя И1!гапеЪ-99 компании ОеУПЪйз. Аэрозоль ΕΡδ вводили в течение 5 мин в количестве 100 мкг/мл. Во время стимуляции контролировали и регистрировали частоту сердечных сокращений, температуру тела и частоту дыхания. Первичная стимуляция подтвердила, что приматы реагируют на ΕΡδ (повышенная инфильтрация нейтрофилов в легкие и повышенные уровни цино-1Ь-8). Индивидуальные реакции приматов были подтверждены образцами, полученными через 6 и 24 ч после стимуляции.

Приматов (NНΡ), подвергнутых первичной стимуляции ΕΡδ, произвольно распределяли в две группы. После восстановления в течение 4 недель у всех приматов брали образцы крови и ΒΑΕ Через четыре дня после измерения исходных показателей подопытным животным внутривенно инъецировали наполнитель или 1 мг/кг химерного антитела. На следующий день приматов снова стимулировали ингалируемым ΕΡδ и через 6 и 24 ч после стимуляции брали образцы для анализа. После дополнительного периода восстановления у приматов, которым вводили наполнитель, брали исходные образцы и через 4 дня указанным приматам делали одну внутривенную инъекцию ударной дозы химерного антитела в количестве 10 мг/кг. На следующий день животных стимулировали ΕΡδ и через 6 и 24 ч брали образцы для анализа.

Ингаляция ΕΡδ представляет собой модель острого воспалительного заболевания, стимулирующую повышение хемотаксических хемокинов, таких как 1Ь-8, которые вызывают повышенную инфильтрацию нейтрофилов в легкие. Первичным параметром эффективности химерного антитела является ингибирование инфильтрации нейтрофилов в легкие приматов, стимулированных ΕΡδ. Инфильтрация нейтрофилов в указанной модели острого воспалительного заболевания происходит в течение первых 24 ч после стимуляции ΕΡδ, после чего более выраженными становятся другие воспалительные процессы.

Предварительное введение химерного антитела значительно и в зависимости от дозы ингибирует инфильтрацию нейтрофилов в легкие приматов, стимулированных ΕΡδ. Введение химерного антитела также предотвращает повышение уровней циркулирующих нейтрофилов, не влияя на действительную функцию нейтрофилов (т.е. способность клеток к фагоцитозу). Введение химерного антитела также не оказывало сильного воздействия на клетки других типов, такие как макрофаги/моноциты, в легких или кровотоке. См. фиг. 2.

Пример 7. Дальнейшие исследования гуманизированных моноклинальных антител.

Было получено несколько конструкций на основе гуманизированного пентаспецифического антитела, четыре из которых, как было показано, прочно связываются со всеми хемокинами-мишенями и ингибируют указанные хемокины. (Для ознакомления с каждой последовательностью см. приведенную ниже информацию о последовательностях). Указанный анализ состоял из измерений сродства (В1аСоге), анализов мобилизации кальция (функциональный анализ ίη уйго, ΡΕΙΡΚ) и анализа стимуляции нейтрофилов С'ГО11Ъ человека и приматов (функциональный анализ ех У1уо, проточная цитометрия).

В1аСоге.

Кинетику гуманизированных и химерных конструкций определяли методом улавливания белка А, выполняемым следующим образом.

Белок А иммобилизуют на чипе СМ5 путем связывания с первичным амином в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищенное гуманизированное или химерное антитело улавливают на поверхности белка А. Каждое анализируемое вещество (1Ь-8, Ого-β и ΕNΑ-78) в определенных концентрациях пропускают над поверхностью уловленного антитела, выполняя отдельное улавливание для каждого впрыскивания анализируемого вещества. После каждого впрыскивания анализируемого вещества поверхность регенерируют, впрыскивая слабый кислотный раствор, который удаляет уловленное антитело, но не оказывает значительного воздействия на способность белка А выполнять следующее улавливание. На поверхность уловленного антитела также впрыскивают буфер для двойного контроля. Данные анализируют при помощи программного обеспечения для анализа, предназначенного для данного компьютера, используя модель связывания в отношении 1:1.

- 19 024621

Измерения с использованием Ого-бета

Конструкция	ка(1/Мз)	Μ(1/з)	Κϋ (М)
НсЬс	7,39Е+06	8,16Е-04	1,11Е-10
НсЬс	2,11Е+07	0,0011	5,21Е-11
НсЬс	1,59Е+07	8,88Е-04	5,57Е-11
НсЬс	1,19Е+07	6,16Е-04	5,17Е-11
НсЬс	1,43Е+07	5,43Е-04	3,79Е-11
НсЬс	1,ЗЗЕ+07	б,76Е-04	5,09Е-11
НсЬс	1,51Е+07	б,73Е-04	4,45Е-11
НсЬс	1,49Е+07	6,44Е-04	4,ЗЗЕ-11
НсЬс	2,54Е+07	0,001163	4,57Е-11
НсЬс	1,81Е+07	0,001058	5,85Е-11
НсЬс	2,04Е+07	8,54Е-04	4,18Е-11
НсЬс	1,82Е+07	5,06Е-04	2,78Е-11
Н0Ь7	6,99Е+06	9,66Е-04	1,38Е-10
Н0Ь7	1,76Е+07	0,001305	7,40Е-11
Н0Ь7	1,63Е+07	0,001039	6,39Е-11
Н0Ь7	1,14Е+07	0,005616	4,93Е-10
Н0Ь7	1,20Е+07	0,004398	3,66Е-10
Н0Ь7	1,42Е+07	9,57Е-04	6,73Е-11
Н0Ь7	1,76Е+07	0,00118	6,72Е-11
Н0Ь7	1,63Е+07	0,001389	8,52Е-11
Н0Ь7	1,12Е+07	0,008212	7,32Е-10
Н0Ь7	2,63Е+07	0,001546	5,88Е-11
Н0Ь7	2,10Е+07	9,28Е-04	4,41Е-11
НОЬЗ	1,28Е+07	0,005462	4,27Е-10
НОЬЗ	1,99Е+07	0,01065	5,36Е-10
ноье	1,19Е+07	0,007727	6,52Е-10
Н0Ь8	1,18Е+07	0,007799	6,60Е-10
Н0Ь8	1,61Е+07	0,006903	4,29Е-10

- 20 024621

Н0Ь8	1,85Е+07	О,004586	2,48Е-10
НОЫО	1,23Е+07	0,001395	1,13Е-10
НОЫО	1,45Е+07	0,001261	8,68Е-11
НОЪЮ	1,44Е+07	0,001477	1,03Е-10
НОЪЮ	1,28Е+07	0,001394	1,09Е-10
НОЪЮ	1,98Е+07	0,00144	7,28Е-11
ноыо	1,94Е+07	0,00109	5,62Е-11
НОМО	1,20Е+07	0,001394	1,17Е-10
номо	1,13Е+07	0,007071	6,24Е-10
НОМО	1,58Е+07	0,001708	1,08Е-10
номо	1,43Е+О7	0,001829	1,28Е-10
номо	1,ОЗЕ+О7	0,009588	9,34Е-10
НОМО	1,85Е+07	0,001728	9, 35Е-11
номо	1,81Е+07	0,001252	6, 91Е-11

Измерения с использованием 1Ь-8

Конструкция	ка(1/Мз)	кб(1/з)	Κϋ (М)
НсЬс	3,77Е+06	2,34Е-04	6,22Е-11
НсЬс	1,03Е+07	2,87Е-04	2,78Е-11
НсЬс	8,20Е+06	2,76Е-04	3,37Е-11
НсЬс	1,04Е+07	2,68Е-04	2,58Е-11
НсЬс	9,44Е+06	2,53Е-04	2,68Е-11
НсЬс	9,97Е+06	2,30Е-04	2,31Е-11
Н0Ь7	2,74Е+06	2,84Е-04	1,04Е-10
Н0Ь7	8,99Е+06	4,00Е-04	4,45Е-11
Н0Ь7	7,64Е+06	2,84Е-04	3,71Е-11
Н0Ь7	5,98Е+06	0,001167	1,95Е-10
Н0Ь7	8,74Е+06	3,52Е-04	4,ОЗЕ-11
Н0Ь7	7,51Е+06	3,63Е-04	4,83Е-11
Н0Ь7	9,10Е+06	3,89Е-04	4,28Е-11
Н0Ь8	5,90Е+06	0,00111	1,88Е-10

- 21 024621

Н0Ъ8	7,89Е+06	0,001126	1,43Е-10
Н0Ъ8	6,8 0Е + 0 6	0,001193	1,75Е-10
ноъе	7,ЗОЕ+О6	0,001112	1,52Е-10
ноъю	б,8 6Е + 0 б	4,57Е-04	6,66Е-11
ноъю	7,20Е+06	3,67Е-04	5,10Е-11
НОЪЮ	7,21Е+06	3,96Е-04	5,48Е-11
НОЪЮ	7,43Е+06	3,73Е-04	5,02Е-11
номо	7,02Е+06	3,98Е-04	5,67Е-11
номо	6,40Е+06	0,001467	2,29Е-10
номо	7,96Е+06	4,09Е-04	5,14Е-11
НОМО	7,97Е+06	4,60Е-04	5,77Е-11
НОМО	7,50Е+06	4,18Е-04	5,57Е-11

Измерения с использованием ΕΝΑ-78

Конструкция	ка(1/Мз)	кб(1/з)	КЗ (М)
НсЪс	3,67Е+06	1,70Е-04	4,63Е-11
НсЪс	5,81Е+06	1,71Е-04	2,94Е-11
НСЪС	5,11Е+06	1,84Е-04	3,60Е-11
НсЪс	5,28Е+06	1,54Е-04	2,91Е-11
НсЪс	4,87Е+06	1,56Е-04	3,20Е-11
НсЪс	4,78Е+06	1,23Е-04	2,58Е-11
Н0Ъ7	2,95Е+06	2,04Е-04	6,93Е-11
Н0Ъ7	5,28Е+06	2,97Е-04	5,63Е-11
Н0Ъ7	4,59Е+06	2,17Е-04	4,74Е-11
Н0Ъ7	3,03Е+06	3,ЗЗЕ-04	1,10Е-10
Н0Ъ7	5,11Е+06	2,58Е-04	5,04Е-11
Н0Ъ7	4,76Е+06	3,07Е-04	6,45Е-11
Н0Ъ7	4,91Е+06	2,77Е-04	5,63Е-11
Н0Ъ8	2,88Е+06	2,88Е-04	1,00Е-10
Н0Ъ8	2,82Е+06	2,66Е-04	9,41Е-11
Н0Ъ8	2,95Е+06	2,69Е-04	9,12Е-11
Н0Ъ8	3,29Е+0б	2,48Е-04	7,55Е-11
НОЫО	4,07Е+06	3,66Е-04	8,99Е-11
Н0Ы0	4,72Е+06	3,40Е-04	7,22Е-11
ноъю	4,20Е+06	3,12Е-04	7,42Е-11
ноъю	4,38Е+06	2,68Е-04	6,13Е-11
НОМО	3,91Е+06	3,09Е-04	7,89Е-11
номо	2,97Е+06	3,49Е-04	1,17Е-10
номо	4,39Е+06	3,16Е-04	7,20Е-11
номо	4,18Е+06	3,34Е-04	7,99Е-11
номо	4,52Е+06	2,94Е-04	6,51Е-11

- 22 024621

Сродство (КО) определяют, исследуя скорость ассоциации (ка) и скорость диссоциации (кй) белков.

НсЬс означает химерное антитело, полученное из антитела 656.35, имеющего последовательность тяжелой цепи 8ЕЦ ГО NО:56 и последовательность легкой цепи 8ЕЦ ГО NО:58.

Функциональный анализ: мобилизация кальция (РЫРР) с использованием СХСР2 (с Са16) в клетках СНО-К1.

При выполнении анализа мобилизации кальция на титрационном микропланшете РЫРР (спектрофотометр для прочтения планшетов с флуорометрической визуализацией, Мо1еси1аг Эеулсек, 8иииууа1е, СА, [8сНгоейег, 1996]) был использован для функционального исследования нейтрализующего воздействия антител на [Са²+]1-мобилизацию, индуцированную ЕЬР+ хемокином, в клетках СНО-К1, трансфицированных НСХСР2 и Са16 и устойчиво экспрессирующих указанные вещества.

За один день до анализа клетки высевали на 96-луночные планшеты с черными стенками и светлым основанием (Раскагй У1е\у) в количестве 40000 клеток на лунку. Через 18-24 ч из лунок отсасывали среду и заменяли 100 мкл рабочей среды, содержащей минимальную эссенциальную среду Игла (ЕМЕМ) с солями Эрла и Ь-глутамином, 0,1% В8А (8его1од1са1к Согрогайоп), 4 мкМ флуоресцентного индикаторного красителя на основе флуо-4-ацетоксиметилового эфира (флуо-4 АМ) и 2,5 мМ пробенецида.

Клетки инкубировали в указанной среде, содержащей краситель, в течение 1 ч при 37°С. Среду, содержащую краситель, отсасывали и заменяли такой же средой без флуо-4 АМ, содержащей 0,1% желатина (В8А удаляли) и 2,5 мМ пробенецида. Клетки инкубировали в течение 10 мин при 37°С и затем трижды промывали буфером для анализа КРН [буфер Кребса-Рингера-Хенселейта (120 мМ №С1, 4,6 мМ КС1, 1,03 мМ КН₂РО₄, 25 мМ NаНСОз, 1,0 мМ СаС1₂, 1,1 мМ МдС1₂, 11 мМ глюкозы, 20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4)), содержащий 0,1% желатина и 2,5 мМ пробенецида]. После последней промывки буфером к клеткам добавляли 100 мкл буфера для анализа КРН, содержащего 0,1% желатина и 2,5 мМ пробенецида, нагревали до 37°С в течение 10 мин и вводили в РЫРР, где клетки, окрашенные красителем, подвергали воздействию возбуждающего излучения (488 нм), создаваемого аргонным лазером мощностью 6 Вт. [Са²+]1-мобилизацию измеряли в виде увеличения интенсивности излучения флуо-4, связанного с Са²+, при 516 нм. Изменение интенсивности излучения непосредственно связано с уровнями цитозольного кальция [Са²+]1. После измерения исходного значения в течение 10 секунд в планшет добавляли 50 мкл 3-кратного количества смеси ЕРЬ + хемокин, которую предварительно инкубировали с антителом в разных концентрациях, и регистрировали данные каждую секунду в течение 1 мин, затем еще в течение 0,5 мин с интервалами в 3 с. Максимальную клеточную реакцию, которая была выше исходного значения, использовали для построения графика в программе СгарНРай РгЕт (версия 4.03).

Значение 1С₅₀ определяли в виде концентрации антитела, необходимой во время предварительной обработки 3-кратным количеством хемокина в концентрации ЕС₈₀ для нейтрализации СХСР2опосредованного стимулирующего действия смеси ЕЬР + хемокин в концентрации ЕС₈₀ на 50%. Вторичную клеточную реакцию на 25 мкМ АТР измеряли для исследования жизнеспособности клеток [8агаи, 1999].

Ингибирование индуцированного смесью ЕРЬ + хемокин кальциевого потока человека (геометрически усредненное значение 1С₅₀, мкг/мл) четырьмя конструкциями гуманизированного моноклонального антитела (п=3)

	НО 1/7	Н0Ь8	ноыо	номо
Предварительно обработанное 3кратмое количество смеси ЕКЬ + хемокин в концентрации ЕСво	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.	1С50 (мкг/мл)	95% С.1.
3 вМ ЫЬЗ	0, 30	0,12-0,72	0,83	0,70-0,98	0,19	0,15-0,22	0,19	0,15-0,23
10 нМ ЬбКОа	1, 48	0,98-2,23	3,52	2,74-4,53	1,09	0,58-2,06	1 г 11	0,67-1,83
6 нн ьакоъ	1,04	0,19-5,58	7,93	4,20-14,97	0, 66	0,24-1,86	0,99	0,35-2,76
30 нМ ЬЕНА-78	2, 48	0,78-7,91	2,42	1,27-4,63	1,88	0,83-4,26	1,75	1,33-2,29
юо нн ьеср-2	11,43	8,19-15,96	40,38	38,45-42,41	11,54	6,30-21,17	13,03	7,20-23,56

8сНгоейег К.8., №ад1е, ВГО. РЫРР: а пе\у шкйитей Гог ассига1е, НщН (НгоидНри! орйса1 ксгеетпд. 1. Вюто1. 8сгееп. 1996:1-75.

8агаи Н.М., Атек Р.8., СНатЬегк 1., ЕШк С., ЕкНоигЬаду Ν., Ро1еу 1.1. е! а1. Иепййсайоп, то1еси1аг с1отп§, ехргеккюп, апй сНагас1еп/а1юп оГ а сук1е1пу1 1еикойгеп гесер!ог. Мо1 РНагтасок 1999;56:657-663.

Анализ стимуляции нейтрофилов человека СЭ11Ь ех угуо.

Способность гуманизированных пентаспецифических антител предотвращать индуцированную хемокинами активацию очищенных нейтрофилов человека исследовали при помощи проточной цитометрии, анализируя физические изменения клеток (размер и форма - грануляция) и маркеры поверхностной активации (повышенная поверхностная экспрессия СЭ11Ь). Контрольный стимулятор нейтрофилов ГМЙР использовали для подтверждения способности очищенных нейтрофилов человека активироваться, см. фиг. 4.

Информация о последовательностях.

Полную РНК экстрагировали из клеток гибридомы 656.35, 197.2 и 81.1, затем получали последовательность кДНК вариабельной области тяжелой и легкой цепей, выполняя обратную транскрипцию и

- 23 024621 полимеразную цепную реакцию (КТ-РСК). Верхняя затравка для КТ-РСК представляла собой смесь вырожденных затравок, специфичных для лидерных последовательностей гена иммуноглобулина мыши, и нижняя затравка была специфична для константных областей антитела, в данном случае изотипа 1дС2а/К. Затравки были созданы в соответствии с описанием, приведенным в публикации Джонса и Бендига (Вю/ТесЬпо1оду 9:88, 1991). КТ-РСК выполняли дважды для обеих последовательностей У-области, чтобы можно было произвести последующую проверку правильных последовательностей У-области. Продукты У-области, полученные при помощи КТ-РСК, клонировали (набор для клонирования ТА 1пу|1годеп) и получали данные для последовательностей. Данный процесс оказался безуспешным для вариабельной области легкой цепи 81.1. Таким образом, аминокислотная последовательность, показанная ниже (ЗЕО ГО N0:12), была получена в результате секвенирования белков легкой цепи, выделенной методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в восстановительных условиях.

Области, определяющие комплементарность, (СОК) подчеркнуты.

Полинуклеотидные последовательности для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (соответственно ЗЕО ГО N0:1 и 3) для антитела 656.35.

ЗЕО ГО N0:1:

САСаТССАаТТОСАОСАОТСТСОАОСТСААСТООТААаОССТОООАСТТС

АСТСАССАТАТССТСТААСССТТСТСССТАСАССТТСАСТААСТАСТССАТ

АОТТТОООТСАААСАОАООССТСОАСАТООАСТТОАОТООАТТОСАОАТС

ТТТАСТСТаСАООТООТТАТАСТТТСТАСАСТСААААГТТСААОСОСААО

СССАСАСТСАСТССАОАСАСАТССТССАССАСТСССТАСАТССАССТСАТ

ТАОССТОАСАТСТОАООАСТСТССТОТСТАТТТСТОТОСААОАТСОСОТТА

ССАСАОААССТОСТТТОСТСАСТСОООССААОООТСТСТООТСАСТОТСТ

СТССА

ЗЕО ГО N0:3:

ОАСАТСААСАТОАСССАОТСТССАТССТССАТСТСТОСАТСССТОООАОА

САОАСТСАСТАТСАСТТОТСАОССОАСТСАООАСАТТОАААОСТАТТТАА

ОСТООТАТСАССАОАААССАТООАААТСТССТААОАСССТОАТСТАТТАС

ОСТАСААООТТООСАОАТООООТСССАТСААОАТТСАОТООСАОТООАТС

ТССТСААСАТТАТТСТСТААССАТСАССАСССТССАСТСТСАССАТАСАС

СААСТТАТТАСТСТСТАСААСАТССТСАСАССССТСССАССТТСССТССТС ааАССААОСТООАОС'ТСАААСОа

Полипептидные последовательности для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (соответственно ЗЕО ГО N0:2 и 4) для антитела 656.35.

ЗЕО ГО N0:2:

ОУОТ.ОО5САЕТ.УКРСТ5УТ15СКА5С|¥ТГЖУ\УТУЦЛЛ<ОКРСНС|Т.Е\¥ТСРТ.

Υ5ΟΟΟΥΤΡΥ8ΕΝΡΚΟΚΑΊΈΤΑΡΤ835ΤΑΥΜΗΕΙ5ΕΤ8ΕΡ8ΑνΥΡΤΑΚ8ΟΥΡΚ

ТУУГАНХУОООВЬУТУЗА

ЗЕО ГО N0:4:

Р1КМТО8Р38М8А8ЕСЕК.УТ1ТСС>А8ОР1Е8УЕЗУУТОС>КР\УК8РКТПУУАТК

ЕАРСУР8КГ5С8С5СОРУ5ЕТ185ЕЕ8РРТАТУУСЕОНСЕ5РРТГСАОТКЕЕЕ

КК

Полипептидные последовательности для СОК тяжелой цепи (соответственно ЗЕО ГО N0:13, 14, 15) для антитела 656.35.

ЗЕО ГО N0:13:

ΝΥ\νιν

ЗЕО ГО N0:14: ΡίΥδΟΟΟΥΤΡΥδΕΝΕΚΟ ЗЕО ГО N0:15:

УРЕТРЕ АН

Полипептидные последовательности для СОК легкой цепи (ЗЕО ГО N0:16, 17, 18) для антитела

656.35.

ЗЕО ГО N0:16:

ΟΑδΓίΟΤΕδΥΙΑ ЗЕО ГО N0:17:

ΥΑΤΚΕΑΡ ЗЕО ГО N0:18:

ЬОНСЕЗРРТ

- 24 024621

Полипептидные последовательности для СОК тяжелой цепи (8ЕЦ ГО N0:31, 32, 33) для антитела

656.35.

У) ГО N0:31:

ААСТАСТССАТАСТТ 81 У) ГО N0:32:

ОАТСТТТАСТСТОаАООТООТТАТАСТТТСТАСАОТОААААТТТСААОООС 81 У) ГО N0:33:

ТСОООТТАСОАСАОААССТООТТТОСТСАС

Полинуклеотидные последовательности для СОК легкой цепи (8ЕЦ ГО N0:34, 35, 36) для антитела

656.35. 81Т) ГО N0:34

САООСОАОТСАООАСАТТОАААОСТАТТТААОС 81Т) ГО N0:35:

ТАСОСТАСААООТТООСАОАТ

81Т) ГО N0:36:

СТАСААСАТООТОАОАОСССТСССАСО

Полинуклеотидные последовательности для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (соответственно 8ЕЦ ГО N0:5 и 7) для антитела 197.2.

81Т) ГО N0:5:

састтссасстссассастстссасстсасстсстсаассстсссссттс

АОТОААОАТАТССТОСААООСТТСТООТТАСТСАТТСАСТОАСТАСААСАТ оаастооотоааосаоаосаатооаааоаоссттоаотооаттооаота

АТТААТССТААОТАТООТАСТАСТАОТТАСААТСАОААОТТСААОООСАА ооссасоттоастотаоассаатсстссаасасаосстасатосаостса осаосстоасатстоаооастстосаотстатсастотосааоаооаато

ООАСТССТСТТТООТАТООАСТАСТООООССААООААССТСТОТСАССОТ

СТССТСА

81Т) ГО N0:7:

ОАСАТТОТОАТОАСАСАОТСТССАТССТСССТОАОТОТОТСАОСАООАОА

ОААООТСАСТАТОАОСТОСААОТССАОТСАОАОТСТОТТАААСАОТООАА

АТСАКААОААСТАСТТООССТООТАССАОСАОАААССАОООСАОССТССТ

АААСТОТТОАТСТАСООООСАТССАСТАООАААТСТООООТСССТОАТСО

СТТСАСАООСАОТООАТСТООААССОАТТТСАСТСТТАССАТСАОСАОТОТ

ОСАООСТОААОАССТООСАОТТТАТТАСТОТСАОААТОАТСАТАОТТТТСС

ОТОСАСОТТСООАООООООАССААОСТООАААТААААСОО

Полипептидные последовательности для вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (соответственно 8ЕЦ ГО N0:6 и 8) для антитела 197.2.

81Т) ГО N0:6:

ΕΡ0Ε0080ΡΕΕνΚΤ0Α8νΚ]8<:ΚΑ50Υ8ΡΤΡΥΝΜΝλννΚ.08Ν0Κ-8ΕΕ\νΐ0νΐΝ

ΡΚΥΰΤΤ8ΥΝΟΚΡΚΟΚΑΤΕΤνΡΟ55ΝΤΑΥΜΟΕ55ΕΤ5ΕΡ5ΑνΥΗ€ΑΚΟΜΟΕΕ

ГСМРУ\’/С0СТ8\’ТУ88

Τ) ΙΌ N0:8:

ΡΐνΜΤΟ5Ρ58Ε5ν5ΑΟΕΚ·νΤΜ50Κ55Ο5ΕΕΝ5ΟΝΟΚΝΥΕΑφΥΟΟΚΡΟ0ΡΡΚΕ

ΕΙΥ0Α5ΤΚΚ50νΡΡΚΡΤ08080ΤΡΡΤΕΤΙ55ν0ΑΕΡΕΑνΥΥ00ΝΡΗ8ΡΡ0ΤΡ0

ΟΟΤΚΡΓ.ΙΚΡ

Полипептидные последовательности для СОК тяжелой цепи (соответственно 8ЕЦ ГО N0:19, 20, 21) для антитела 197.2.

81Т) ГО N0:19:

ϋΥΝΜΝ

Τ) ΙΌ N0:20: νΐΝΡΚΥΟΤΤ8ΥΝ<3ΚΡΚΟ 81 Τ) ΙΌ N0:21:

СМСЕЕРСМРУ

Полипептидные последовательности для СОК легкой цепи (8ЕЦ ГО N0:22, 23, 24) для антитела 197.2.

81Т) ГО N0:22:

Κδδ<5δΕΕΝ8ΟΝ<3ΚΝΥΕΑ

- 25 024621

8ЕС) ΙΌ ^:23:

ΟΑ8ΤΚΚ8 8ЕС) ΙΌ ^:24:

ΟΝΟΗδΡΡΕΤ

Полинуклеотидные последовательности для СИК тяжелой цепи (8ЕЦ ГО NО:37, 38, 39) для антитела 197.2.

8ЕС) ГО Ш:37:

ОАСТАСААСАТОААС 8ЕС) ГО Ш:38:

ОТААТТААТССТААОТАТОСТАСТАСТАОТТАСААТСАОААОТТСААСОС

С

8ЕС) ГО Ш:39:

ССААТСССАСТССТСТТТССТАТССАСТАС

Полинуклеотидные последовательности для СГОК легкой цепи (8ЕЦ ГО NО:40, 41, 42) для антитела 197.2.

8ЕС) ГО Ш:40

ААСТССАСТСАСАСТСТСТТАААСАСТССАААТСААААСААСТАСТТССС

С

8ЕС) ГО Ш:41:

ООООСАТССАСТАООАААТСТ

8ЕС) ГО Ш:42:

САОААТОАТСАТАОТТТТССОТОСАСО

Полинуклеотидная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи (8ЕЦ ГО NО:9) для антитела 81.1.

У) ГО Ш:9:

ОАООТССАОСТОСАОСАОТСТООАССТОААСТООАОААОССТООСОСТТС

АОТОААОАТАТССТОСААООСТТСТООТТАСТСТТТСАСТОТСТАСООСАТ

ОААСТОООТОАОАСАОАОСААТООАААОАОССТТОААТООАТТООАААТ

ТТТОАТССТТАСТТТАОТОТСАСТТССТАСААССАОААОТТССАООАСААО

ОССАСАТТОАСТОТАОАСАААТССТССАОСАСАОССТАСАТОСАОСТСАА

ОААССТСАСАТСТОААОАСТСТОСАОТСТАТТТСТОТСС.ААСАОСОАССТ

СССАААССАТТТТТССТТАСТССССССААСССАСТСТССТСАСТСТСТСТС

СА

Полипептидная последовательность для вариабельной области тяжелой цепи (8ЕЦ ГО NО:10) для антитела 81.1.

У) ГО Ш:10:

ΕνθΕΘ08ΟΡΕΤΕΚΤ^,ΟΑ5νΚΙ5€ΚΑ5ΟΥ5ΡΤνΥ0ΜΝ\ννΚ·ΟδΝΟΚ5ΕΕ\νΐΟΝΓ

ΡΡΥΡ5νΤ5ΥΝΟΚΡΟΡΚΑΤΕΤνΡΚ558ΤΑΥΜΟΕΚΝΕΤ8ΕΡ5ΑνΥΓ€ΑΚΟ8\¥Ε

ПРАУХУСОСТЬУТУЗА

Полипептидные последовательности для СИК тяжелой цепи (соответственно 8ЕЦ ГО NО:25, 26, 27) для антитела 81.1.

У) ГО Ш:25:

νΥΟΜΝ

У) ΙΌ ^:26:

ΝΓΡΡΥΡδντδΥΝςκΓφΡ 81 У) ΙΌ ^:27:

ΟδΨΕΤΙΡΑΥ

Полинуклеотидные последовательности для СГОК тяжелой цепи (8ЕЦ ГО NО:43, 44, 45) для антитела 81.1.

У) ГО Ш:43:

СТСТАСООСАТОААС 81 У) ГО Ш:44

ААТТТТСАТССТТАСТТТАСТСТСАСТТССТАСААССАСААСТТССАССАС 81 У) ГО Ш:45

ОССАССТСОСАААССАТТТТТССТТАС

Полипептидная последовательность для вариабельной области легкой цепи (8ЕЦ ГО NО:12) для антитела 81.1.

- 26 024621

ЗЕО ΙΌ N0:12:

ОАУУТОЕаАЬТТаРСЕТУТЬТСКЗЗТСАУТТЗЧУАКХУУОЕКРРНЬРТОЫСОТЧК

КАРОУРАКР8О8Е1ОРКААЕТ1ТСАОТЕРЕА1УРСАЕ\УУ5МНУЕОаОТКЕТУЕОР

К

Полипептидные последовательности для СОР легкой цепи (соответственно ЗЕО ГО N0:28, 29 и 30) для антитела 81.1.

ЗЕО ГО N0:28:

Κ.85ΤΟΑνΤΤ8ΝΥΑΝ

ЗЕО ГО N0:29:

ΟΤΝΝΚΑΡ ЗЕО ГО N0:30:

ΑΕΛΥΥδΝΗν

Полинуклеотидная последовательность химерного антитела* (вариабельная область тяжелой цепи + Ι§01 с оптимизированным кодоном) ЗЕО ГО N0:55:

САССТССАОТТССАССАСТСТССАССТСААСТССТААССССТСССАСТТС

АОТОАСОАТАТССТОТААООСТТСТСССТАСАССТТСАСТААСТАСТООАТ

АОТТТОООТСАААСАОАСОССТСОАСАТССАСТТСАСТООАТТСОАСАТС

ТТТАСТСТССАССТССТТАТАСТТТСТАСАСТСААААТТТСААСОССААС

ОССАСАСТОАСТОСАОАСАСАТССТССАОСАСТОССТАСАТОСАССТСАТ

ТАОССТОАСАТСТОАООАСТСТОСТОТСТАТТТСТОТОСААОАТСОСОТТА

ССАСАСААССТССТТТССТСАСТССССССААСССТСАСТАСТСАСССТСТ

ССАОССССАОСАССААОСОССССАСССТОТТСССССТСССССССАОСАСС

ААСАССАССАОСООСООСАСАОССОСССТОООСТОССТООТОААООАСТ

АСТТССССОААССОСТОАССОТОТССТОСААСАОСООАОСССТОАССАОС

СОССТССАСАССТТССССОСССТССТОСАОАОСАОСОСССТОТАСАОССТ

САССАОСОТОСТСАССОТССССАССАОСАСССТСООСАСССАСАССТАС

АТСТОТААСОТОААССАСААОСССАОСААСАССААООТООАСААОААОО

ТССАССССААСАОСТСТСАСААСАСССАСАССТССССССССТОСССТССС

ССССАССТССТСООАОСССССАОССТСТТССТОТТСССССССААОССТАА

СОАСАСССТОАТОАТСАОСАОААССССССАСОТОАССТСТСТОСТОСТСО

АТСТОАОССАССАСОАСССТСАССТОААОТТСААСТССТАССТООАССОС

СТССАССТССАСААТСССААСАССААССССАСССАССАССАСТАСААСА аСАССТАСССССТаОТаТССОТОСТОАССОТОСТОСАССАОСАТТООСТО

ААССССААООАОТАСААОТСТААССТОТССААСААСССССТОССТССССС

ТАТСОАСААААССАТСАССААССССААСССССАССССАОАСАСССССАС

ОТСТАСАСССТОСССССТАОСАОАОАТОАОСТОАССААОААССАССТСТС

ССТСАССТСССТССТСААССССТТСТАССССАСССАСАТСССССТССАОТ

ОООАОАОСААСООССАОСССОАОААСААСТАСААОАССАСССССССТОТ

ССТООАСАСССАТСССАССТТСТТССТОТАСАССААССТОАСССТССАСА

АСАССАОАТСССАОСАССССААСОТСТТСАССТОСТССОТСАТССАССА

ООСССТССАСААТСАСТАСАСССАОААСАСССТСАСССТОТССССТОССА

АС

Полипептидная последовательность химерного антитела* (вариабельная область тяжелой цепи + Ι§01 с оптимизированным кодоном) ЗЕО ГО N0:56:

ςν(3Ε(3(33ΟΑΕΕνΚΡΟΤ8νΤΤ8€ΚΑ3ΟΥΤΡΤΝΥλντν\ννκρΚΡΟΗΟΕΕ\νΤΟΡΕ

Υ3ΟΟΟΥΤΡΥ3ΕΝΡΚΟΚΑΤΕΤΑΡΤ338ΤΑΥΜΗΕ1δΕΤ3ΕΡ3ΑνΥΡΓΑΚ3ΟΥΡΚ τν/ΡΑΗχνοφαδΕντνδδΑδτκορδνρρΕΑΡδδκδτδοατΑΑΕΟΟίΛ' ντνδν/Νδϋ АI ,Т8СУНТЕР Α νΡΟδδΟΙΥδΙ.δδ УУТУР883ЕОТС)Т\

ΚΡΥΡΡΕΡ

ΙΟΝΥΝΗΚΡ ‘ϊΝΤΚ'νΠΚΚνΡ.ΡΚδσΠΚΤΗΤΡΡΡΓ'ΡΑΡΡ.ΙΙ.ΟϋΡδνΡΙΡΡΡΚΡΚΡΤΙ.ΜΙδΡΤΡΡνΤ (νννϋνδΗΕΡΡΕνΚΡΝΧνΥ νΡίινΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΥδΤΥΚ УУ8 νίΤνίΗ ΟΡν/ΕΝΟΚΕΥΚ€ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟ<3ΡΚ.ΕΡ(3νΥΤΕΡΡ8ϊ<ΡΕΕΤΚΝ<3 У81.та.УКСЕУР8Ю1АУР\УР8ЕО)РЕ^ЫУКТТ1ФУ1,1)ЗР08БЕГУШТУ1Ж8 Κ\νζ)ζ)0ΝνΡδ€δνΜΗΕΑΕΕίΝΕ1ΥΤ<>ΚδΕδΕδΡ0Κ

- 27 024621

Полинуклеотидная последовательность химерного антитела* (вариабельная область легкой цепи + сК человека с оптимизированным кодоном) ЗЕр ГО N0:57:

САСАТСААСАТСАСССАОТСТССАТССТССАТОТСТССАТСССТСССАСА

ОАОАОТСАСТАТСАСТТОТСАООСОАОТСАООАСАТТОАААОСТАТТТАА

ОСТООТАТСАОСАОАААССАТООАААТСТССТААОАСССТОАТСТАТТАС

ОСТАСААООТТООСАСАТССООТСССАТСААСАТТСАСТСССАОТООАТС

ТСОТСААОАТТАТТСТСТААССАТСАОСАОССТООАОТСТСАСОАТАСАО

СААСТТАТТАСТСТСТАСААСАТССТСАСАССССТСССАСОТТСССТОСТС

ООАССААОСТОСАССТСАААСОТАСООТООССОСССССАОСОТОТТСАТС

ТТСССССССАаСОАТОАОСАОСТаААаАОСООСАСССССАОСОТООТаТО

ТСТОСТОААСААСТТСТАСССССОООАОСССААООТОСАОТООААООТОО

АСААТОСССТССАОАОСООСААСАОССАССАОАСССТСАССОАССАССА

САОСААСОАСТССАССТАСАОССТОАОСАССАСССТСАСССТСАССААСО

ССОАСТАСОАСААОСАСААСОТОТАССССТОТСАСОТОАСССАССАССО

ССТОТССАОССССОТОАССААОАОСТТСААССООСОСОАОТОС

Полипептидная последовательность химерного антитела* (вариабельная область легкой цепи + сК человека с оптимизированным кодоном) ЗЕр ГО N0:58:

^IΚΜΤ^8Ρ83Μ8Α8^ΟΕΕ.VΤIΤС^Α5^^IΕ8Υ^8XУΥ^^ΚΡ\VΚ8ΡΚΤ^[ΥΥΑΤΕ.

ЬАОСУР8КГ30305СОО¥8ЬТ135ЕЕ8ВОТАТ¥¥СЬрНСЕЗРРТРСАСТКЬЕЕ

ΚβΤΥΑΑΡ8\ΤΙΡΡΡ8Γ)Ε(.)Ι,Κ8ίίΤΑδννΕ[|.ΝΝΡΥΓΨΕΑΚνθ\νκνΓ)4ΑΕ(.)8(;Ν

39Е8¥ТЕ0О8КГ)ЗТ¥8Ь38ТЕТЕ8Ю\ОУЕКНКУУЛСЕУТН0ОЬ88РУТК8Г\7<

ОЕС

Химерное антитело* является химерным антителом, полученным из мышиного антитела 656.35. Последовательность ДНК Н0 зрелой тяжелой цепи ЗЕр ГО N0:11:

САООТОСАОСТСОТОСАОАОСООСОССОААОТОААОААОСССООООССАОСО

ТОААООТОАОСТОСААООССАОСООСТАСАССТТСАССААСТАСТООАТСОТО

ТОООТСАООСАСОСССССООССАОООАСТООАОТООАТОааСОАССТСТАТА

ОСООСООСООСТАСАССТТСТАСАОСОАОААСТТСААОООСАОООТОАССАТ

ОАССАСООАСАССАОСАССАОСАССОТОТАСАТООАОСТОАОСАОССТОАОО

АОССАООАСАССОССОТСТАСТАСТОССССАОСАСССССТАСОАСАООАСТТ

ООТГТОСТСАСТОООаССАОООСАСАСТАОТОАССОТОТССАОСОССАОСАСС

ААОООССССАОСОТОТТСССССТааСССССАОСАОСААОАОСАССАОСаОСО аСАСАСССаСССТОСССТОССТСОТаААООАСТАСТТССССОААССОСТОАСС

СТСТССТСОААСАССССАССССТСАССАССССССТССАСАССТТССССССССТ

ОСТОСАСАОСАОСОСССТОТАСАОССТОАОСАОСОТООТОАССОТОСССАОС

АССАСССТССССАСССАСАССТАСАТСТСТААССТСААССАСААССССАССА

АСАССААССТССАСААСААССТССАССССААСАССТСТСАСААСАСССАСАС

СТОСССССССТОСССТОСССССОАОСТОСТОООАООССССАОСОТОТТССТОТТ

СССССССААСССТААССАСАСССТОАТСАТСАССАСААССССССАССТСАССТ

СТСТССТССТССАТСТСАСССАССАССАСССТСАССТСААСТТСААСТССТА

ССТООАСООСОТООАООТОСАСААТОССААОАССААОСССАСООАООАОСАО

ТАСААСАОСАССТАССОООТООТОТССОТОСТОАССОТОСТОСАССАООАТТО

ОСТОААССОСААООАСТАСААОТОТААООТОТССААСААООСССТОССТОСС

ССТАТСОАОААААССАТСАССААСОССААООСССАССССАОАОАОССССАСО

ТОТАСАСССТОСССССТАОСАОАОАТОАОСТОАССААОААССАООТОТСССТО

АССТОССТОСТОААОСССТТСТАССССАОССАСАТССССОТСОАОТОООАОА

ОСААСООССАССССОАОААСААСТАСААОАССАСССССССТОТОСТСОАСАО

СОАТООСАССТТСТТССТОТАСАССААССТОАСССТСОАСААСАССАСАТССС

АОСАОООСААСОТОТТСАаСТССТССОТОАТОСАСОАОаСССТССАСААТСАС

ТАСАСССАОААОАОССТОАОССТОТССССТООСААО

- 28 024621

Белковая последовательность Н0 зрелой тяжелой цепи ЗЕО ГО NО:46: φνρΕνφδΟΑΕνΚΚΡΟΑδνκνδΟΚΑδΟΥΤΡΤΝΥλνίν'Λ'νΚ.φΑΡΟρΟΕΕ'λ'ΜΟΟίΥ 80α0ΥΤΡΥ3ΕΝΡΚ0ΚνΤΜΤΕϋΤδΤ5ΤνΥΜΕΕδ3ΕΕ8ΕΟΤΑνΥΥ€ΑΕ.δ0ΥϋΚΤλνΡ АНТОрОТЕУТУбЗАЗТКОРЗУРРЕАРЗЗКЗТЗООТААЕОСЕУКПУРРЕРУТУЗ^ 80ΑΕΤ80νΗΤΡΡΑνΕς)530ΕΥ5Ε53νντνΡ555Ε0Τς>ΤΥΙΰΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚν0ΚΚ.ν ΕΡΚδΕΟΚΤΗΤΕΡΡΕΡΑΡΕΕΕΟΟΡδνΡΕΡΡΡΚΡΚΟΤΕΜΙδΚΤΡΕνΤΕνννονδΗΕϋΡΕ νΚΡΝλνγνΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗΟϋΨΕΝΟΚΕΥΚΟΚνδ ΝΚ.νΕΡΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟΟΡΓ<ΕΡ9νΥΤΕΡΡ8ΚΟΕΕΤΚΝ9ν3ΕΤΕΕνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕ ’ΛΈ3ΝΟ0ΡΕΡΙΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8θαδΡΡΕΥ8ΚΕΤνθΚδΓί\\^ρθΚνΡ3Εδν\-1ΗΕΛΕΗΝ нутокзьзезрок

Последовательность ДНК Ь7 зрелой легкой цепи ЗЕО ГО NО:47: ОАТАТССАСАТОАСССАСАССССТАОСТСССТСАОСОСАТСАОТССССОАСАС АОТОАСААТСАССТОССАООСАТСССАООАСАТСОАОТСТТАССТОАОСТСОТ АССАОСАОААОСССООАААООССССАААОСТССТОАТСТАСТАСОССАСТСО остсссА§аеСССОтосстАОСАОоттстссоостсАОоотстоооАСАОАСтт САСССТОАССАТСАОСТСАСТОСАОСССОАООАТТТСОССАССТАСТАСТОТС ТОСАССАСООАОАОАОССССССААССТТТООССАОООААССААОСТООАОАТ Саа§СОТАСООТООССОСССССАОСОТОТТСАТСТТСССССССАОСОАТОАОСА ОСТОААОАОСООСАССОССАОСОТООТОТОТСТОСТСААСААСТТСТАССССС ОООАССССААООТССАОТООААССТСОАСААТССССТССАОАОСООСААСАС ССАСОАСАОСОТОАССОАССАООАСАОСААООАСТССАССТАСАСССТСАСС АССАСССТСАСССТСАССААСССССАСТАССАСААССАСААССТСТАССССТ СТСАССТСАСССАССАСССССТСТССАССССССТСАССААСАССТТСААССС ОООСОАОТОС

Белковая последовательность Ь7 зрелой легкой цепи ЗЕО ГО NО:48: ΟίρΜΤφδΡδδΕδΑδνΓ,ΟΡνΤΙΤερΑδΟΟΙΕδΥΕδννΥ’ΟΟΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥΥΑΤΚΕΑΟ ΟνΡδΚΡδΟδΟδΟΤΟΡΤΕΤΙδδΕφΡΕΟΡΑΤΥΥΟΕΟΗΟΕδΡΡΤΡΟφΟΤΚΕΕΙΚΚΤνΑΑΡ 3νΕ]ΓΡΡ3ΟΕρΕΚ50ΤΑ3ννΕΈΕΝΝΕΥΡΚΈΑΚνρ\ΥΚνθΝΑΕ<3$ΰΝ3<3Ε3νΤΕρθ8

ΚΟδΤΥδΕδδΤΕΤΕδΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑΟΕνΤΗφαΕδδΡνΤΚδΡΝΚΟΕε

Последовательность ДНК Ь8 зрелой легкой цепи ЗЕО ГО NО:59: ОАТАТССАОАТСАСССАОАОСССТАОСТСССТСАОСОСАТСАОТСООССАСАО АСТОАСААТСАССТСССАООСАТСССАООАСАТССАОТСТТАССТСАОСТООТ АССАОСАОААОСССООАААООССССАААОСТССТОАТСТАСТАСОССАСТСО ОСТООСА^асООСОТОССТАОСАООТТСТСССОСТСАОООТСТОСОАСАОАСТТ САСС11сАССАТСАОСТСАСТОСАОСССОАООАТа1сОССАССТАСТАСТОТСТОС АССАСОСАСАСАСССССССААССТТТССССАСОСААССААССТССАСАТСаад СОТАСООТООССОСССССАОСОТОТТСАТСТТСССССССАОСОАТОАОСАОСТ СААСАСССССАСССССАСССТССТСТСТСТССТСААСААСТТСТАСССССССС АООССА АООТОСА ОТООА АООТООАСА АТОСССТОС А О А ОСООСАА САОССА ООАОАОСОТОАССОАОСАООАСАОСААООАСТССАССТАСАОССТОАОСАОС АСССТОАСССТОАОСААООССОАСТАСОАОААОСАСААООТОТАСОССТОТО АООТОАСССАССАОООССТОТССАОССССОТОАССААОАОСТТСААССОООО СОАОТОС

Белковая последовательность Ь8 зрелой легкой цепи ЗЕО ГО NО:60:

□Ι<3ΜΤΡδΡ3δΕδΑ5νθΟΚνΤΙΤΟ<3Αδ<3ϋΙΕδΥΕδ\νΥΟ<3ΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥΥΑΤΚΕΑΟ θνΡ3ΚΡ8Ο3Ο8ΟΤΟΡΤΡΤΙ33Ε9ΡΕΟΙΑΤΥΥΟΕ0ΗΟΕ3ΡΡΤΡθρθΤΚΕΕΙΚΙίΤνΑΑΡ3 νΡΙΡΡΡ3Γ3Ε9Τ.Κ8ΟΤΛ3ννΕΤ.[.ΧΝΡλ’ΡΠΕΛΚΥ0\νκνΠΝ\[.Γ)3ΟΝ8φΕ8νΤΡ.9Γ)3Κ

Ο5ΤΥ5Ε55ΤΕΤΕ8ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑ€ΕνΤΗφΟΕ3δΡνΤΚ8ΡΝΚΟΕ€

- 29 024621

Последовательность ДНК Ь10 зрелой легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:61: ОАТАТССАОАТОАСССАОАОСССТАОСТСССТСАОСОСАТСАОТСООСОАСАО АСТОАСААТСАССТОССАОССАТСССАСОАСАТСОАСТСТТАССТСАССТООТ АССАОСАСААССССООАААООССССАААОСТССТОАТСТАСТАСОССАСТСО ССТСССАеасССССТСССТАССАССТТСТСССССТСАСССТСТСССсаеСАС(асА СССТСАССАТСАОСТСАСТОСАОСССОАООАТТТСОССАССТАСТАСТОТСТО САОСАСООАСАОАОССССССААССТТТООССАОООААССААОСТООАОАТСА АОСОТАСООТООССаСССССАОСОТОТТСАТСТТСССССССАОСОАТОАОСАО

СТОААОАОСООСАССОССАОСОТООТОТОТСТОСТОААСААСТТСТАСССССО

ОаАООССААООТОСАОТООААООТООАСААТОСССТОСАОАОСООСААСАОС

САООАОАОСОТОАССОАОСАООАСАОСААООАСТССАССТАСАОССТОАОСА

ОСАСССТОАСССТОАОСААООССОАСТАСОАОААаСАСААОСТОТАСОССТО

ТОАООТОАСССАССАОООССТСТССАОССССаТОАССААОАОСТТСААССОО

ССССАСТСС

Белковая последовательность Ь10 зрелой легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:62: Γ)ΙφΜΤ0δΡ38Ε3ΛδνθΓΗ<νΤΙΤΕρΛ3<)Γ)ΤΕ8ΥΕ8'ΛΎ(Χ,)ΚΡ6ΚΛΡΚΕΕΤΥΥΛΤΠΕΛΤ) θνΡ3ΚΡ5Ο5Ο5Ο<3ΟΥΤΕΤΙ85Ε(3ΡΕΠΡΑΤΥΥ<:Ε()ΗαΕ8ΡΡΤΡΟ(3ΟΤΚΧΕΙΚΚΤνΑΑΡ 8νΡΙΡΡΡ8ΟΕ0ΕΚ3ΟΤΑδνν0Ι.ΕΝΝΡΥΡΚΕΑΚν0ΥνκνθΝΑΙ,()3ΟΝ5<5ΕδνΤΕ(5ϋ5

Κβ5ΤΥ3Ε83ΤΕΤΕ5ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑ6ΕνΤΗς>ΟΕ38ΡνΤΚ5ΡΝΚαΕ€

Последовательность ДНК М0 зрелой легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:63:

ОАОАТСаТОСТОАСССАОТСТСССОССАСССТОТСАСТОТСТСССООСОАААО аОСААСССТОАОСТОССАООССАОССАСОАСАТСОАОАОСТАССТСАССТОа

ТАССАССАСААОСССООССАСОСССССАОССТОСТОАТСТАСТАСОССАССАО астоассаАсаасАттсссоссАОоттсАссаоААосаасАосоосАссаАс

ТТСАСТСТОАССАТСАССАСССТСОАОСССОАООАСТТСОСССТОТАСТАСТО

ССТССАОСАСООСОАОАОСССТСССАССТТСООССАООССАССААОСТССАС

АТСААОССТАСООТООССОСССССАОСОТОТТСАТСТТСССССССАОСОАТОА

ОСАОСТОААОАОСООСАССОССАОСОТООТОТ аТСТССТОААСААСТТСТАСССССООСАСОССААООТОСАСТООААООТООА

СААТОСССТОСАОАОССОСААСАОССАООАОАОСОТОАССОАОСАООАСАОС

ААООАСТССАССТАСАОССТОАОСАОСАСССТСАСССТОАОСААООССОАСТ

АСОАОААОСАСААСОТОТАСОССТСТОАООТОАСССАССАОООССТОТССАС

ССССОТОАССААСАОСТТСААССОСООСОАСТОС

Белковая последовательность М0 зрелой легкой цепи 8ЕЦ ГО N0:64:

ΕΐνΕΤ(}8ΡΑΤΕ5Ε8ΡαΕΚΑΤΙ.8Ες>Α5ς>Ο1Ε8ΥΕ5\νΥς>ς>ΚΡα<}ΑΡΚΕΕ1ΥΥΑΤΚΕΑΟ

Ο[ΡΑΚΡ5α3α3ΟΤΟΡΤΕΤΙ33ΕΕΡΕϋΡΑνΥΥ€Ε<3ΗΟΕ8ΡΡΤΡ<3(3ΟΤΚΕΕ[ΚΙίΤνΑΑΡ8 λΤΙΡΡΡδΟΕΟΕΚδΟΤΛδλ'νϋΕΕΝΝΓΥΡΚΕΛΚνΟ'Λ'ΚνΟΝΛίΟδΟΝδΟΕδλΥΕρΟδΚ

ΟδΤΥ5Ε5δΤΕΤΕ5ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥΑΟΕνΤΗΟΟΕ53ΡνΤΚ5ΡΝΚΟΕ€

- 30 024621

Список последовательностей <110> СЬЕСС, СЬерЬапФе О.

ΟΟΒΚΖΥΝ5ΚΙ, ЕГ1С ЕЬЫЗ, ОГопаьЬап Н.

СЕРМА5СНЕИЗК1, νο 1 кег СООТЬЬОТ, А. Раи1 ΟΟΝΑΚ, 2с1епка Ь.

ЬЕЮЗ, А1ап Р.

ΝΗΙΤΕ, ОоЬп К.

<120> НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ <130> РЕ6242 <150> 60/912,225 <151> 2007-04-17 <150> 61/044,132 <151> 2008-04-11 <160> 64 <170> ЕазЬЗЕО бог ΜιηάοΜδ Уегз1ап 4.0 <210> 1 <211> 357 <212> ДНК <213> Мышь <400> 1 саддЕссадГ бдсадсадСс ЬддадсЕдаа сгддСааддс сЕдддасЕСс адЕдасдаЕа 60

ЬссЬдЕаадд сЕЬсЬддсСа сассЕ-СсасЕ аасЬасЕдда ЕадЕЕЕдддР сааасададд 120 ссЕддасаЕд дасЕЕдадСд дабЛддадаС. ссЕЛасЕсЕд даддЕддЕЕа ЕасЕЕЕсЕас 180 адЕдааааЕЕ Ссааддддаа ддссасасЕд асСдсадаса саЕссЕссад сасЕдссЕ.ас 240 аЕдсассЕса ЕЕадссЕдас аЕсЕдаддас ЕсЕдсьдЕсЕ аЕЕЕсЕдЕдс аадаЕсдддЕ 300

Еасдасадаа ссЕддЕЛЕдс ЕсасЕддддс саадддЕсЕс ЕддЕсасЕдЕ сЕсЕдса 357 <210> 2 <211> 119 <212> РКТ <213> Мышь <400> 2

С1п 1

Уа!

С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег

С1у

А1а

21и 10

Ьеи

Уа1

Агд

Рго

21 у 15

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

Тгр

Не

Уа1

Тер

Уа1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

Ηί 5

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

21у

А2р

Ьеи

Г/г

5ег

С1у

31у

21у

Туг

ТЬг

РЬе

Туг

Зег

С1и

Азп

РЬе

50

55

60

Ьуз

31у

Ьуз

а 1а

ТЬг

Ьеи

ТЬе

А1а

А$р

ТЬГ

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1 а

Туг

65

70

75

30

Мег

Н15

Ьеи

Не

Зет

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

7а1

Туг

РЬе

Суз

35

90

95

А1а

Агд

Зег

С1у

Туг

Азр

Агд

ТЬг

Тгр

РЬе

А1а

ΗΪΞ

Тгр

С1у

31 п

31у

100

105

110

5ег

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

115

- 31 024621

<2	10>	3
<2	11>	324
<2	12>	ДНК
<2	13>	Мышь
64	00>	3

дасабоэзоа абсасббдбс бддааабсбс адаббсадбд дасдабасад дддассаадс бдасссадбс аддсдадбса сб аадасссб дсадбддабс саасб бабба бддадсбдаа бссабссбсс ддаса б бдаа дабсбаббас бддбсаадаб сбдбсбасаа асдд абдбсбдсаб адсбабббаа дсбасааддб баббсбсбаа саГ ддбдада сдсбдддада дс бддбабса бддсадабдд ссабсадсад дсссбсссас дададбсасб дсадааасса ддбсссабса ссбддадбсб дббсддбдсб

12С зс

4 О 300

324 <210> 4 <211> 108 <212> РЕТ <213> Мышь <400> 4

Азр 1

Не

Ьуз

Меб

ТОг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Меб

Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

С1 у

С1и

Агд

Уа1

ТНг

Не

ТНг

Суз

С1п

Αύ а

Зег

С1п

Азр

11е

С1и

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

5θΐ

Тгр

Дуг

С1п

С1п

Ьу5

Рго

Тгр

Ьуз

Зег

Рго

Ьуэ

ТНг

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТНг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

Шу

Уа1

Рго

Зег

Агд

РНе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

Шу

С1п

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТНг

11е

Зег

Зег

Ьеи

(Ши

Зег

65

70

75

80

Азр

Αερ

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Туг

Су5

Ьеи

С1п

Ηΐ5

С1 у

С1и

Зег

Рго

Рго

85

90

95

ТНг

РЬе

СЗу

А] а

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

100

105

<210> 5 <211> 357 <212> ДНК <213> Мышь <400> 5 дадббссадс бдсадсадбс бддассбдад сбддбдаадс сбддсдсббс адбдаадаба 60 бссбдсаадд сббсбддбба сбсаббсасб дасбасааса бдаасбдддб даадсададс 120 аабддааада дссббдадбд даббддадба аббаабссба адбабддбас басбадббас 180 аабсадаадб бсаадддсаа ддссасдббд асбдбадасс аабссбссаа сасадссбас 240 абдсадсбса дсадссбдас абсбдаддас бсбдсадбсб абсасбдбдс аададдаабд 300 ддасбссбсб ббддбабдда сбасбддддс сааддаассб сбдбсассдб сбссбса 357 <210> 6 <211> 119 <212> РКТ <213> Мышь <4ОО> 6

С1и

РНе

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1 у

А1а

1

5

10

15

Зег

7а1

Ьуз

I 1_е

Зег

Су5

Ьуэ

А1а

Зег

С1у

Туг

Зег

РНе

ТНг

Азр

Туг

20

25

30

Азп

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Зег

Азп

С1у

Ьуз

Зег

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

01 у

7а ί

Не

Азп

Рго

Ьуз

Туг

С1 у

ТНг

ТНг

Зег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

01 у

Ьуз

А 1а

ТНг

Ьеи

Т5г

Уа1

Азр

С1п

Зег

Зег

Азп

ТНг

АХа

Туг

65

70

75

80

- 32 024621

Чет

С1п

Ьеи

8$ г

Зег 85

Ьеи

ТНг

Зег

С1и

Азр 90

Зег

А1а

Уа1

Туг

НЬз 95

Суз

А1а

Агд

ЗЬу

Ме 1

С1у

Ьеи

Ьеи

РЬе

С1у

Ме5

Аар

Туг

Тгр

31 у

СЬп

СЬу

1 СО

105

НО

ТЬг

Эег

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Зег

115

<2 10>	Ί
<211 >	342
<212>	ДНК
<213>	Мышь
<400	7

дасаНЬдНда Ндасасад5с НссаНссГсс сЬдадНдНдН садсаддада дааддЬсасГ 60 аНдадсНдса адНссадНса дадСсНдНЬа аасадЬддаа аНсагаадаа сСасНЬддсс 120

ГддЬассадс адааассадд дсадссНссН ааасНдЬНда Нсьасддддс аЬссас^адд 180 аааЬсЬдддд НсссГдаНсд сЬНсасаддс адНддаЬсЬд даассдаьнь сасНсННасс 240 аНсадсадНд Ндсаддс5да адассНддса дЬПЬаНЬасН дНсадаагда НсаНадЫЮН 300 сед^дсасдд дсддаддддд дассаадсНд даааЬаааас дд 342 <210> 8 <211> 114 <212> РКТ <21 3> Мышь <400> 8

Азр

Не

УаЬ

МеГ

ТНг

СЬп

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

УаЬ

Зег

АЬа

С1у

1

5

10

15

С1и

Ьуз

Уа 1

ТНг

МеО

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

СЬп

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

2 0

25

30

ЗЬу

Азп

СЬп

Ьуз

А5П

Туг

Ьеи

АЬа

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьуз

Рго

С1у

СЬп

35

40

45

Его

Его

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Пе

Туг

ЗЬу

АЬа

Зег

ТНг

Агд

Ьуз

Зег

С1у

УаЬ

50

55

60

Рго

Азр

Агд

РНе

ТНг

СЬу

Зег

31 у

Зег

СЬ у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

65

70

75

80

Не

5е с

Зег

УаЬ

СЬп

АЬа

СЬи

Азр

Ьеи

А1а

УаЬ

Туг

Туг

Суз

С1г

Азп

85

90

95

Азр

НЬз

Зег

РНе

Рго

Суз

ТНГ

РНе

СЬу

С1у

СЬу

ТНг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Пе

ЮО

105

110

Ьуз

Агд

<2Ю> 9 <2Ы> 354 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 9 даддНссадс	СдсадсадЬс	ЬддассЬдаа	сьддадаадс	сНддсдсЬНс	адНдаадаГа	60
ОссЬдсаадд	с ЬЬоЬддЬЬа	сЬсЬЬЬсасЬ	дОсЬасддса	ЬдаасЬдддО	дадасададс	120
аагддааада	дссН 5дааГд	даНГддаааГ	Г 55да5сс5 0	асЬННадьдН	сасС ЬссЬас	130
аассадаадН	сссаддасаа	ддссасаннд	асНдНадаса	ааНссГссад	сасадссСас	240
аьдсадсНса	адаассНсас	аНсНдаадас	ЬсНдсадЬсН	аНЬНсЬдЬдс	аададддадс	300
Едддааасса	5 ЬгнндсЬНа	сНддддссаа	дддасНсНдд	СсасНдНсНс	Ндса	354
<210> 10 <211> 118 <212> РРТ <213> Мышь
<400> 10

- 33 024621

О1и 1

Уа1

С1п

Ъеи

С1п 5

С1п

Зег

С1у

Рго

С1и 10

Ъеи

С1и

Ъуз

Рго

<31 у 15

А1а

Зег

Уа1

Ъуз

11е

Зег

Суз

Ъуз

А1а

Зег

С1у

Туг

Зег

РЬе

ТЬг

Уа1

Туг

20

25

30

Ίΐγ

Мес

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

Зег

Азп

С1у

Ъу5

Зег

Ъеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

01 у

Азп

РЬе

Азр

Рго

Туг

РЬе

Зег

Уа1

ТЬг

Зег

Туг

Азп

31п

Ъу5

РЬе

50

55

60

31п

А5р

Ъу5

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ъу5

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

4еЬ

С1п

Ъеи

Ъу5

Азп

Ъеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

Ма

Агд

С1у

Зег

Тгр

С1и

ТЬг

Не

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

Ьеи

Уа1

ГЬг

Уа1

Зег

А1а

115

<210 >	11
¢211 >	1347
4212>	ДНК
<213>	Мышь
<400>	11

саддСдсадс эдсСдсаадд оссддосадд эдсдадаасС аСддадсРда Сасдаоадда адсассаадд асадссдосс аасадеддад сЬдСасадсс асо5дЬаасд адсбдСдаса адсдСдС Ссс дбдассСдСд дСддасддсд асссассддд ЬасаадСдСа дссаадддос ассаадаасс деддадьддд дасадсдасд садддсаасд аададссСда <2Ю> 12 <211> 111 <212 > РВТ <213> Мышь

СсдСдсадад ссадсддсса дассддадбд

Ъсаадддсад дсадссЪдад сПддЪЬЪдс дссссадсдЪ рдддсЪдссЬ ссеодассад

ЪдадсадсдЬ

Ъдзассасаа адасссасас

СдЬОсссссс сддОддрдда

СддаддСдса

ЬддСдОссдС аддодСссаа адсссадада аддОдЬсссЬ ададсаасдд дсадсъьсгъ

ОдЪЬсадсОд дссЬдЪссос сддсдссдаа сассЪЬсасс даЬдддсдас ддЪдассаГд дадсдаддас ГсасГддддс дЬ ГсссосЪд ддЬдааддас сддсдбдсас ддЬдассдОд дсссадсаао сбдссссссс саадссьаад рдсдадссас саабдссаад дсГдассдбд сааддсссгд дссссаддЬд дассбдссЬд ссадсссдад ссддСасадс сСссдСдасд Сддсаад дОдаадаадс аасЪасЬдда сСдСаСадсд ассадддаса ассдссдъдъ садддсасас дссессадса

ЬасЬЬссссд ассИссссд сссадсадса ассааддсдд

ОдсссЪдссс дасасссбда даддасссСд ассаадссса сСдсассадд ссгдссссРа сасасссЬдс дЬдаадддсО аасаасЬаса аадсСдассд сасдаддссс ссддддссад СсдСдЕдддЕ. дсддсддсСа ссадсассад асбасОдсдс СадСдассдС дсаададсас ааосддгдас ссдСдсСдса дссСдддсас асаадааддС ссдадсСдсС СдаСсадсад аддСдаадС Ь дддаддадса аССддсСдаа Рсдадаааас ссссоадоад ОсЪассссад адассасссс Сддасаадад ЬдсасааСса сдГдааддЪд саддсаддсс сассЬЬсГас сассдЪдЪас саддадеддс дЬссадсдсо садсддсддс сдСдСссСдд дадсадсддс ссадассЪас ддадсссаад дддаддсссс аасссссдад саасОддЪас дбаоаасадс сддсааддад сабсадсаад адасдадссд сдасаСсдсс сссСдСдсСд садасддсад сбасасссад

120

130

0

300

60

420

430

0

600

660

720

730

840

900

960

1020

1080

1П0

1200

1260

1320

134 7 <400> 12

С1п

А1а

Уа1

Уа1

ТЬг

С1п

С1и

Зег

А1а

Ъеи

ТЬг

ТЬг

Зег

Рго

С1у

С1и

1

5

10

15

ТЬг

Уа!

ТЬг

Ъеи

ТЬг

Суз

Агд

Зег

Зег

ТЬг

С1у

А] а

Уа1

ТЬг

ТЬг

Зег

20

25

30

Азп

Туг

А1а

Азп

Тгр

Уа1

С1п

С1и

Ъуз

Рго

Азр

Нгз

Ъеи

РЬе

ТЬг

С1у

35

40

45

Ъеи

Пе

С1у

С] у

ТЬг

Азп

Азп

Агд

А1а

Рго

С1у

Уа 1

Рго

А1а

Агд

РЬе

50

55

60

Зег

С1у

Зег

Ъеи

11е

С1у

Азр

Ъуз

А1а

А1а

Ъеи

ТЬг

Пе

ТЬг

С1у

А1а

65

70

7 5

80

- 34 024621

^1л

ТЬг

С1и Азр

С1и А1а 85

11е Туг

РЬе

Суз 90

А1а

Ьеи

Тгр Туг

Зег Азп 95

4Ϊ3

Уа1

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Еуг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1п

Рго

Ьуз

100

105

110

<210>	13
<211>	5
<212?	РКТ
<213>	Мышь
<400>	13
^зп Туг Тгр

5 <210> 14 <211> 17 <212> РРТ <213> Мышь <400> 14

Азр Ьеи Туг Зег С1у С1у С1у Туг ТЬг РЬе Туг Зег С1и Азп РЬе Ьуз 15 10 15

31у <210> 15 <211> 10 <212> РКТ <213> Мышь <4 00> 15

Зег С1у Туг Азр Агд ТНг Тгр РЬе А1а Н13 1 5 10 <210 16 <211> ]1 <212> РКТ <213> Мышь <400> 16

С1п А1а Зег С1п Азр Не С1и Зег Туг Ьеи Зег 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> РКТ <213> Мышь <400> 17

Туг А1а ТЬг Агд Ьеи А1а Азр 1 5

<210>	18
<2 11 >	9
<212 >	РРТ
<213>	Белок
<400>	18

- 35 024621

Ьеи С1п НЬз (31у С1и Зег Рго Рго ТЬг 1 5

<210>	19
<211?	5
<212?	РКТ
<213?	Мышь
<400?	19
Азр Туг Азп

<210? 20 <211? 12 <212? РВТ <213? Мышь <400> 20

Уа1 Не Азп Рго Ьуз Туг С1у ТЬг ТЬг Зег Туг Азп С1п Ьуз РЬе Ьуз 15 10 15

01у <210? 21 <211? 10 <212? РВТ <213> Мышь <400? 21

С1у Мер С1у Ьеи Ьеи РЬе С1у Мер Азр Туг 1 5 10 <210? 22 <211> 17 <212? РКТ <213? Мышь <400? 22

Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азп Зег С1у Азп С1п Ьуз Азп Туг Ьеи 15 10 15

А1а <210? 23 <211> 7 <212? РКТ <213> Мышь <400? 23

С1у А1а Зег ТЬг Агд Ьуз Зег

1
<210>	24
<211 >	9
<212>	РЕТ
<213>	Мышь
<4 00>	24

- 36 024621

<210> 26 <211> 17 <212> РКТ <213> Мышь <400> 26

Азп РЬе Азр Рго Тур РНе Зег Уа1 ТЬг Зег Туг Азп 31п Ьуз РЬе 61п 15 10 15

Азр <210> 27 <211> 9 <212> РКТ <213> Мышь <400> 27

С1у Зег Тгр СЬи ТЬг Т1е РЬе А1а Туг 1 5 <210> 28 <211> 14 <212> РКТ <213> Мышь <400> 28

Агд Зег Зег ТЬг С1у АЬа Уа1 ТЬг ТЬг Зег Азп Туг А1а Азп 1 5 10 <2Ь0> 29 <211> 7 <2Ь2> РКТ <213> Мышь <400> 29

С1у ТЬг Азп Азп Агд АЬа Рго 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> РКТ <21 3> Мышь <4 007- 30

А1а Ьеи Тгр Туг Зег Азп Ньз УаЬ 1 5

- 37 024621 <210 31 <211> 15 <212> ДНК <213> Мышь <400> 31 аасСастдда Сади <210> 32 <211> 51 <212> ДНК <21 3> Мышь <400> 32 даЮН^асС. с!.ддадд£дд ЫаЪасИСс 1аеад1дааа аСЛСсааддд д <210> 33 <211> 30 <212> ДНК <213> Мышь <400> 33

ОсдддЮасд асадаасслд дтдсгсас <210> 34 <2Ц> 33 <212> ДНК <213> Мышь <400> 34 саддсдад!с аддасассда аадс!а£С£а аде <210 35 <211> 21 <212> ДНК <213> Мышь <400> 35

Насдс^асаа ддШддсада ΐ <210> Зй <211> 27 <212> ДНК <213> Мышь <400> 36 с5асааса£д дсдададссс Тсссасд <210> 37 <211> 15 <212> ДНК <213> Мышь <400> 37 дассасааса Ъдаас <210> 38 <211> 51 <2Ю ДНК <213> Мышь <400> 38

СЬп 1

УаЬ

С1п

Ьеи

УаЬ 5

СЬп

Зег

СЬу

А1а

СЬи 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у 15

АЬа

Зег

УаЬ

Ьуз

Уа1

Зег

С/5

Ьуз

АЬа

Зег

СЬу

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

Ггр

Не

Уа1

Тгр

Уа1

Агд

СЬп

АЬа

Рго

С1у

СЬп

31у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

3ΐγ

Азр

Ьеи

Туг

Зег

С1у

СЬу

СЬу

Туг

ТЬг

РЬе

Туг

Зег

СЬи

Азп

РЬе

50

55

60

Ьуз

СЬу

Агд

Уа 1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

Уа1

Туг

65

70

75

80

ЫЬ

СЬи

Ьеи

8е г

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

АЬа

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Зег

С1у

Туг

Азр

Агд

ТЬг

Тгр

РЬе

АЬа

НЬз

Тгр

СЬу

С1п

СЬу

] 00

105

110

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

АЬа

Зег

ТЫ

Ьуз

СЬу

Рго

Зег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

АЬа

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

СЬу

ТЬг

А1а

АЬа

Ьеи

130

135

140

31у

Суз

Ьеи

νοί

Ьуз

АЗр

Туг

РЬе

Рго

СЬи

Рго

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

С1у

А1 а

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

Уа1

НЬз

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

С1п

Зег

Зег

31 у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

УаЬ

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

]&0

185

190

Зег

Зег

Ьеи

сзу

ТЬг

С1п

ТЫ

Туг

Пе

Суз

АЗП

Уа1

АЗП

ΗΪ3

Ьуз

Рго

195

200

205

5ег

Азп

ТЬг

куз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

СЬи

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

210

215

220

ТЬг

Η 15

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

АЬа

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у

СЬу

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

I Ье

Зег

24 5

250

255

Агд

ТЬг

Рго

С1и

νοί

ТЬг

Суз

УаЬ

Уа1

Уа1

А5р

УаЬ

Зег

НЬз

СЬи

Азр

260

265

270

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

УаЬ

Азр

СЬу

УаЬ

С1и

Уа1

НЬз

Азп

275

280

285

АЬа

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

СЬп

Туг

АЗП

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

НЬз

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

АЗП

С1у

Ьуз

01 и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьу5

Уа1

Зег

А5П

Ьуз

А 1а

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

11е

С1и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

СЬп

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

УаЬ

Туг

ТЬг

34 0

345

350

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

СЬи

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

СЬу

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

АЬа

Уа1

С1и

Тгр

С1и

370

375

390

Зег

Азп

С1у

С ίη

Рго

СЬи

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Зег

Азр

С ί у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уз1

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

УаЬ

МеЬ

НП

С1и

420

425

430

А1а

Ьеи

Нгз

Азп

ΗΪ5

Туг

ТЬг

СЬп

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

435

440

445

Ьуз <210> 47 <211> 642 <212> ДНК <213> Мышь

- 40 024621 <400 47 да£а£ссада аЬсасс1;дсс ддаааддссс аддИсОссд даддаЬС Год ддаассаадс адсдаОдадс ссссдддадд дададсдЬда с^дадсаадд сОдОссадсс <210 48 <211> 214 <212> РЕТ <213> Мышь

Ьдзсссадад аддса сссса сааадсьсс! деЮадддТс ссассьасьа ^ддадаЬсаа адсьдаадад ссааддгдса ссдадсадда ссдасьасда ссдодассаа сссЬадсОсс ддасассдад даЬсЪасьас

Ьдддасадас сЕд^сГдсад додЬасддЬд сддсассдсс дГддааддОд садсааддас даадсасаад дадсОсаас сЬсадсдсаЬ ооасода дссасЬсддс

ЮсасссОда сасддадада досдссссса адсдЬддЬдЬ дасааОдссс

Ьссассьаса дЬд1;асдссЬ еддддсдадО садЬсддсда дсОддЬасса Оддсадасдд ссаЬсадсЬс дссссссаас дсдО дЫсао дЬсодсЬдаа Одсададсдд дссОдадсад дЬдаддУдас дс сададОдаса дсадаадссс сдГдссЬадс асодсадссс сНЬддссад с!Оссссссс саасЫзсьас саасадссад сасссЬдасс ссассадддс

120 180 24 0 300 360 420 4 80 540 600 64?

<400> 48

Азр 1

Не

С1п

МеЬ

ТЬг 5

01п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

□ 1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

С1п

А1а

Зег

С1п

Азр

Не

С1и

Зег

Туг

2 0

2 5

30

Леи

Зег

Тгр

Туг

01п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

'Гуг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1г

Рго

65

70

75

ЭО

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

ΗΪ3

С1у

С1и

Зег

Рго

Рго

85

90

95

ТНг

РЬе

С1у

С1_п

С1у

ТЬг

Ьу5

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

но

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

Й1и

□ 1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

ТЬг

А1 а

Зег

Уа1

Уа1

Су5

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

РГО

Агд

С1и

А1а

1 30

135

140

Луз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

31п

Зег

С1 у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

Тпг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Η 1 Ξ

Ьуз

Уа1

Туг

130

185

190

А1а

Суз

С1и

Уа 1

ТЬг

Ηΐ 5

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

210

<210> 49 <211> 15 <212> РЕТ <21 3> Мышь <400> 49

Ьеи А1а ТНг <31и Ъеи Агд Зег 1 5

<210 >	50
<211 >	15
<212>	РЕТ
<213 >	Мышь

ί400> 50

Зег АЬа Ьуз СЬи Ьеи Агд Зег СЬп Зег Не Ьуз ТЬг Туг Зег Ьуз 15 10 15 <210> 51 <211> 14 <212> РКТ <213> Мышь <400 51

Ьеи Агд СЬи Ьеи Агд Зег Уа1 Зег Ьеи СЬп ТЬг ТЬг СЬп СЬу 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> РКТ <213> Мышь <400> 52

Зег Рго СЬу Рго Ηιξ Зег АЬа СЬп ТИг С1и УаЬ Ые А1а ТДг 1 5 10 <210 53 <211> 14 <212> РКТ <213> Мышь <400> 53

01и Зег СЬу Ρΐ о Н1з Зег АЬа Азп ТЬг СЬи 11е Ые УаЬ Ьуз

5 10 <210> 54 <211> 14 <212> РКТ <21 3> Мышь <400 54

Ьуз СЬи Ьеи Агд Суз СЬп Суз I1е Ьуз ТОг Туг Зег Ьуз Рго 15 10 <210> 55 <2Ы> 1347 <212> ДНК <213> Мышь <400 55 саддЬссадС ИдсадсадОс сддадсЬдаа сЬддСааддс сЬдддасНс адЬдасдаоа 60

ЬссЬдСаадд сНсОддсСа оассЬЬсасо аасСасСдда ЪадЬИддд£ сааасададд 120 ссСддасаЬд дас£ЛдадЪд даЬИддадас сЫзИасСсИд даддьддиЬасНОсДас 180 адСдааааСЛ Ьсааддддаа ддссасасЬд асЬдсадаса саДссЪссад сасЬдссЬас 240 аГдсассЬса ££адсс£дас а£сЬдаддас Ъс5дс5д5сЬ аЫЬсЁдЬдс аадаЪсдддЬ 300

Ьасдасадаа сс1ддС£Сдс Ьсас^ддддс саадддесас ЬадОдассдС дСсеадсдсс 360 адсассаадд дссссадсдС д17£сссссЬд дсссссадса дсаададсас садсддсддс 420 асадссдссс ЬдддсЧдссГ ддЬдааддас еасЫссссд аассддЬдас сдЬдСсскдд 480 аасадсддад сссЬдассад сддсдЬдсас ассСХссссд ссдДдсЪдса дадсадсддс 540 сЬдьасадсс ьдадсадсдЬ ддЬдассд£д сссадсадса дссОдддсас ссадассОас 600 аСсСдОаасд ьдаассасаа дсссадсаас ассаадд£дд асаадааддЬ ддадсссаад 660 адсгдСдаса адасссасас с£дссссссс СдсссЪдссс ссдадссдск дддзддсссс 20

- 42 024621

эдсдбдббсс	бдббсссссс	саадссбаад	дасасссбда	бдабсадсад	аасссссдад	780
Збдассбдбд	бддбддбдда	бдбдадссас	даддасссбд	аддбдаадбб	саасбддбас	840
дЬддасддсд	бддаддбдса	саабдссаад	ассаадссса	дддаддадса	дбасаасадс	900
ассбассддд	бадбдбссдб	дсбдассдбд	сбдсассадд	аббддсбдаа	сддсааддад	96С
басаадбдба	аадбдбссаа	сааддсссбд	ссбдссссба	бсдадаааас	сабсадсаад	1020
дссаадддсс	адсссадада	дссссаддбд	басасссбдс	ссссбадсад	адабдадсбд	1080
эссаадаасс	аддбдбсссб	дассбдссбд	дбдаэдддсб	бсбассссад	сдасабсдсс	1140
дбддадбддд	ададсаасдд	ссадсссдад	аасаасбаса	адассасссс	сссбдбдсбд	12 СО
дасадсдабд	дсэдсббсбб	ссбдбасадс	аадсбдассд	бддасаадад	садабддсад	12 0 0
садддсаасд	бдб бсадсбд	сбссдбдабд	сасдаддссс	бдсасаабса	сбасэсссад	1320
аададссбда	дссбдбсссс	бддсаад				1347
<210> 56
<211> 449
<212> РЕТ
<213> Мышь
<400> 56

31 η 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег

С1у

АХа

С1и 10

Ьеи

Уа1

Агд

Рго

СЬу 15

ТНг

Зег

Уа1

ТНг

Не

Зег

Суз

Ьу5

А1а

Зег

(Лу

Туг

ТНг

РНе

ТНг

Азп

Туг

20

2.5

30

Тгр

Не

УаЬ

Тхр

Уа1

Ьуз

ст

Агд

Рго

С1у

НЬз

С1 у

Ьеи

СЬи

Тгр

Пе

35

40

45

С1у

АЗр

Ьеи

Туг

Зег

СХу

С1у

С1у

Туг

ТНг

РНе

Туг

Зег

СЬи

Азп

РНе

50

55

60

Ьуз

О1у

Ьуз

А] а

ТНг

Ьеи

ТНг

А1а

Азр

ТНг

Зег

Зег

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

7 5

80

Ме б

Ηί3

Ьеи

Не

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

РНе

Суз

65

90

95

А1а

Агд

Зег

С1у

Туг

Азр

Агд

ТНг

Тгр

РНе

А1а

НЬз

Тгр

С1у

С1п

С1у

100

105

110

Зег

Ьеи

Уа1

ТНг

7а1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТНг

Ьуэ

СЬу

Рго

Зег

Уа1

РНе

115

120

125

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Зег

ТНг

Зег

СЬу

СЬу

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

С1у

Суз

Ьеи

νπ

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

С1и

Рго

νΗ

ТНг

Уа1

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

С1у

А1а

Ьеи

ТНг

Зег

С1у

Уа1

ΗΪ5

ТНг

РНе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

С1п

Зег

Зег

31 у

Ьеи

Туг

Зег

ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТНг

УаЬ

Ргс

Зег

180

185

190

Зег

Зег

Ьеи

Шу

ТНг

С1п

ТНг

Туг

Не

Суз

АЗП

Уа1

Азп

НЬз

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТНг

Ьуз

νπ

Азр

Ьуз

Ьуз

νπ

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

210

215

220

ТНг

ΗΪ3

ТНГ

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

Меб

11е

Зег

245

250

255

Агд

ТНг

Рго

(Пи

Уа1

ТНг

Суз

νπ

0а1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

НЬз

СХи

Азр

260

265

27 0

Рго

С1и

Уа1

Ь'/5

РНе

А5П

Тгр

Туг

Уа 1

Азр

С1у

7а1

С1и

Уа1

нт

Азп

275

290

285

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

СЬп

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

Агд

7а1

290

295

300

7а1

Зег

Оа1

Ьеи

ТНг

νπ

Ьеи

НН

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

СЬу

Ьуз

С1и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

ν$1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

Пе

СЬи

Ьу5

325

330

335

ТНг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

01 у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТНг

340

34 5

350

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТНГ

355

360

365

- 43 024621

Суз

Ьеи 370

Уа1

Ьуз

01 у

РЬе

Туг 375

Рго

Зег

Азр

Не

А1а 380

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

АЗП

С1у

01 η

Рго

С1и

АЗП

АЗП

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

385

390

395

400

Чар

Зег

Аар

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

А5р

Ьу5

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

СНп

С1п

С1 у

Азп

УаЬ

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеГ

Нгз

СЬи

420

425

430

Ма

Ьеи

Ηι з

Азп

Н15

Туг

ТЫ

С1п

Ь/з

Зег

Ьеи

Зег

Ъеи

Зег

Рго

С1у

435 440 44 5

Ьуз <210> 57 <211> 642 <212> ДНК <213> Мышь <400> 57 дасаюаада аЬсасЫздГс

ЬддаааЫЬо адаЫсад^д дасда Ьасад дддасоаадс адсдаидадс ссссдддадд дададсд Ьда сГдадсаадд сЬд5ссадсс

ЪдзсссадЬс аддсдадСса сс задасссЬ дсадЬддаЫ саас! ЬаЬЬа СддадсЬдаа адс7даадад ссааддгдса ссдадсадда ссдасТасда ссдьдассаа

Ссса1сс1сс ддасаЬЬдаа даЬсСаСгас СддСсаадаС. сЬдрсЬасаа асдЬасддЬд сддсассдсс дЬддааддЬд садсааддас даадсасаад дадсС Исаас асд£с1дсас адсЬаьЬЬаа до! асаадде саььсьсьаа са!ддСдада дссдссссса адсдГддГдГ дасааЬдссс ЬссассЬаса дГдЪасдссЬ сддддсдадг сдсЬдддада дсПдд^аСса

СддсадаЬдд ссаисадсад дсссЬсссас дсдЬдуьсаЬ дЬсЬдоьдаа

Ьдсададсдд дссЬдадсад дЬдаддЬдас дс дададЬсас!

дсадааасса ддЬсосасса сс£ддад£сь дЫсддСдсЬ сЬЬссссссс саасЬЬсГас саасадссад сасссЬдасс ссассадддс

120

0

240

300

360

420

480

540

600

2 <2Ю> 58 <2П> 214 <212> РКТ <213> Мы^ь <400> 58

Азр 1

Пе

Ьуз

ТЬг 5

СТп

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Мег

Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

С1у

С1и

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

С1п

А1а

Зег

С1п

Азр

Пе

С1и

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

Тгр

Ьуз

Зег

Рго

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

СТ у

Уа 1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

С1п

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

Зег

Ьеи

С1и

Зег

65

70

75

80

Азр

Азр

ТЬг

АЬа

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

Ηΐ3

С1у

С1и

Зег

Ргс

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

А~а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

АЬа

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

СЬу

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

□ 1и

А1а

130

135

140

Ьуз

УаТ

С1п

Ггр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

С1и

Зег

Уа1

'ГЬг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТНг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

'ГЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ъуз

К15

Ьу5

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

Уа 1

ТЬг

Нгз

СТп

СТу

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьу£

Зег

195

200

205

РЬе Азп Агд С1у С1и Суз 210 <210> 59 <211> 642 <212> ДНК <213> Мышь <4ОО> 59 даЕаЕссада аЕсассЕ дсс ддаааддссс аддЕЕсЕссд даддаЕаЕсд ддаассаадс адсдаЕдадс ссссдддадд дададсдЕда сЕдадсаадд сЕдЕссадсс <2Ю> 60 <211> 214 <212> РРТ <213> Мышь

Едасссадад аддсаЕссса сааадсЕссЕ дсЕсадддЕс ссассЕасЕа Еддада Есаа адсЕдаадад ссааддЕдса ссдадсадда ссдасЕасда ссдЕдассаа сссЕадсЕсс ддасаЕсдад даЕсЕасЕас

Едддасадас сЕдЕсЕдсад дсдЕасддЕд сддсассдсс дЕддааддЕд садсааддас даадсасаад дадсЕЕсаас сЕсадсдсаЕ ЕсЕ ЕассЕда дссасЕсддс ЕЕсассЕЕса сасддадада дссдссссса адсдЕддЕдЕ дасааЕдссс ЕссассЕаса дЕдЕасдссЕ сддддсдадЕ садЕсддсда дсЬддСасса Еддсадасдд ссаЕсадсЕс дссссссаас дсдЕдЕЕса Е дЕсЕдсЕдаа Едсададсдд дссЕдадсад дЕдаддЕдас дс сададЕдаса дсадаадссс сдЕдссЕадс асЕдсадссс сЕЕЕддссад сЕ Ессссссс саасЕЕсЕас саасадссад сасссЕдасс ссассадддс

120 18 0 240 300 360 4 20 480 54 0 600 642 <400> 60

Азр 1

X 1е

С1п

МеЕ

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬГ

Суз

С1п

А1а

Зег

С1п

Азр

11е

С1и

Зег

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1 у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

11е

А ] а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

Н15

СИ у

С±и

Зег

Рго

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

С] п

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

но

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

7а1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

61п

145

150

155

160

С1и

Зег

УаЬ

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н 13

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н ι з

С1п

С1у

Ьеи

5ег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

С 1у

С1и

Суз

210

<2	10>	61
<2	11 >	642
<2	12>	ДНК
<2	13>	Мышь
<4	00>	61

- 45 024621 даЕаЕссада аЕсассгдсс ддаааддссс аддЕЕсЕссд даддасIЕсд ддаассаадс адсдаЕдадс ссссдддадд дададсдЕда сЕдадсаадд сЕдЕ ссадсс <210> 62 <211> 214 <212> РЕТ <213> Мышь

Едасссадад аддсаЕссса сааадсЕссЕ дсЕсадддЕс ссассЕасЕа

ЕддадаЕсаа адсЕдаадад ссааддЕдса ссдадсадда ссцасЕасда ссдЕдассаа сссЕадсЕсс ддасаЕсдад даЕсЕасЕас

Едддсаддас сЕдЕсЕдсад дсдЕасддЕд сддсассдсс дЕддааддЕд садсааддас даадсасаад дадсЕЕсаас сЕсадсдсаЕ

ЕсЕЕассЕда дссасЕсддс

ЕасасссЕда сасддадада дссдссссса адедЕддЕдЕ дасааЕдссс

ЕссассЕаса дЕдЕасдссЕ сддддсдадЕ садЕсддсда дсЕддЕасса

Еддсадасдд ссаЕсадсЕс дссссссаас дсдЕдЕЕсаЕ дЕсЕдсЕдаа

Едсададсдд дссЕдадсад дЕдаддЕдас дс сададЕдаса дсадаадссс сдсдссЕадс асЕдсадссс сЕЕЕддссад сЕЕссссссс саасЕЕсСас саасадссад сасссЕдасс ссассадддс

120

180

240

300

60 42 0

80 54 0 600 642 <400> 62

Αερ 1

Ие

С1п

МеЕ

ТЪг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

АЬа

Зег

УаЬ 15

О1у

Аар

Агд

Уа1

ТЪг

Не

ТЪс

Суз

С1п

А1а

Зег

С1п

Азр

Не

СЬи

5βϊ

Туг

20

25

30

Ьеи

Зег

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Туг

А1а

ТЪг

Агд

Ьеи

А1а

Азр

С1 у

Уа 1

Рго

Зег

Агд

РЪе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

СЬу

Зег

□ ί у

С1п

Азр

Туг

ТЪГ

Ьеи

ТЪГ

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЪе

А1а

ТЪг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

Ηιε

С1у

СЬи

Зег

Рго

Рго

85

90

95

ТЪг

РЪе

С1у

31п

С1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Не

Ьуз

Агд

ТЪг

Уа1

А1а

А1а

100

105

НО

Рго

Зег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Зег

Азр

СЬи

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

ТЪг

А1а

Зег

УаЬ

УаЬ

Су5

Ьеи

Ьеи

Азп

Агп

РЪе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

130

135

140

Ъуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

УаЬ

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

31п

145

150

155

160

<31 и

Зег

Уа1

ТЪг

С1и

31п

Аар

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЪг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н Т_5

Ьуз

Уа ί

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

УаЬ

ТЪг

Н15

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Ρί О

УаЬ

ТЪг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЪе

Азп

Агд

СЬ у

СЬи

Суз

210

<210> 63 <211> 642 <212> ДНК <213> Мышь <400> 63 дадаЕсдЕдс ЕдасссадЕс Есссдссасс сЕдЕсасЕдЕ сЕсссддсда аадддсаасс 60 сЕдадсЕдсс аддссадсса ддасаЕсдад адсЕассЕда дсЕддЕасса дсадаадссс 120 ддссаддссс ссаддсЕдсЕ даЕсЕасЕас дссассаддс Еддссдасдд саЕЕсссдсс 180 аддЕЕсадсд даадсддсад сддсассдас ЕЕсасЕсЕда ссаЕсадсад ссЕддадссс 240 даддасЕЕсд ссдЕдЕасЕа сЕдссЕдсад сасддсдада дсссЕсссас СЕЕсддссад ЗСО ддсассаадс ЕсдадаЕсаа дсдЕасддЕд дссдссссса дсдЕдЕЕсаЕ сЕЕссссссс 360 адсдаЕдадс адсЕдаадад сддсассдсс адсдЕддЕдЕ дЕсЕдсЕдаа саасЕЕсЕас 420 ссссдддадд ссааддЕдса дЕддааддЕд дасааЕдссс Едсададсдд саасадссад 480 дададсдЕда ссдадсадда садсааддас ЕссассЕаса дссЕдадсад сасссЕдасс 540 сЕдадсаадд ссдасЕасда даадсасаад дЕдЕасдссЕ дЕдаддЕдас ссассадддс 600

- 46 024621 ±дЬссадсс ссдЬдассаа дадсМсаас сддддсдадЬ дс 642

¢2	10>	64
<2	11>	214
	12>	РКТ
<2	13>	Мышь
<4	00>	64

31и

Не

УаЬ

Ьеи

ТЬг

СЬп

Зег

Рго

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

1

5

10

15

СЬи

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

С1 п

А1а

Зег

СЬп

Азр

Не

СЬи

Зег

Туг

20

25

30

Ьеа

Бег

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьу5

Рго

С1у

СЬп

АЬа

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Туг

АЬа

ТЬг

Агд

Ьеи

АЬа

Азр

СЬу

Ые

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1 у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ые

Зег

Зег

Ьеи

СЬи

Рго

65

70

75

80

СЬи

АЗр

РЬе

А ] а

УаЬ

Туг

Туг

Суз

Ьеи

СЬп

НЬз

С1 у

СЬи

Бег

Рго

Рго

95

90

95

ТНг

РЬе

(Ну

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

УаЬ

АЬа

АЬа

юо

105

110

Рго

Бег

УаЬ

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Бег

Азр

СЬи

СЬп

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

115

120

125

ТНг

А1а

Зег

УаЬ

УаЬ

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

СЬи

А1а

130

135

140

Ьуз

УаЬ

сп

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

СЬп

Зег

С1у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

СЬи

Бег

Уа1

ТЬг

СЬи

СЬп

Азр

Бег

Ьуз

Азр

Бег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

АЬа

Азр

Туг

СЬи

Ьуе

НЬз

Ьуз

УаЬ

Туг

180

185

190

АЬа

Суэ

СЬи

УаЬ

ТЬг

НЬз

СЬп

СЬу

Ьеи

Зег

Бег

Рго

УаЬ

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

<31у

СЬи

Суз

210

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пентаспецифическое антитело, которое перекрестно взаимодействует с 1Ь-8, Сго-альфа, Сго-бета, Сго-гамма и ΕNΑ-78 человека, включающее вариабельные области тяжелой и легкой цепей, которые содержат аминокислотные последовательности СГОК 8ЕЦ ГО NО:13, 14 и 15 и 8ЕЦ ГО NО:16, 17 и 18 соответственно.
2. 2. Антитело по п.1, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО NО:46 и 8ЕЦ ГО NО:48, 60, 62 или 64 соответственно.
3. 3. Антитело по п.1, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО NО:46 и 8ЕЦ ГО NО:48 соответственно.
4. 4. Антитело по п.1, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО NО:46 и 8ЕЦ ГО NО:62 соответственно.
5. 5. Антитело по п.1, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО NО:46 и 8ЕЦ ГО NО:60 соответственно.
6. 6. Антитело по п.1, включающее тяжелую и легкую цепи, содержащие аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО NО:46 и 8ЕЦ ГО NО:64 соответственно.
7. 7. Антитело по п.1, которое является гуманизированным.
8. 8. Антитело по п.7, включающее константную область 1дС1.
9. 9. Антитело по п.7, включающее константную область 1дС4.
10. 10. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела, содержащую последовательности СГОК 8ЕЦ ГО NО:13, 14 и 15 или 8ЕЦ ГО NО:16, 17 и 18 соответственно.
11. 11. Рекомбинантная эукариотическая или прокариотическая клетка, продуцирующая антитело по пп.1-9, содержащая экспрессирующий вектор по п. 10.
12. 12. Способ продуцирования антитела по одному из пп.1-9 в единичной клетке-хозяине, включающий следующие стадии:

    (ί) трансформация указанной единичной клетки-хозяина первой последовательностью ДНК, кодирующей, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи антитела, включающую области СГОК 8ЕЦ ГО NО:13, 14 и 15; и второй последовательностью ДНК, кодирующей, по меньшей мере, вариабельную область легкой цепи антитела, включающую области СГОК 8ЕЦ ГО NО:16, 17 и 18; и (ίί) экспрессия указанной первой последовательности ДНК и указанной второй последовательности ДНК, в результате которой указанные тяжелую и легкую цепи антитела получают в виде отдельных молекул в указанной трансформированной единичной клетке-хозяине.
13. 13. Способ по п.12, в котором указанные первая и вторая последовательности ДНК присутствуют в разных векторах или указанные первая и вторая последовательности ДНК присутствуют в одном векторе.
14. 14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики ХОБЛ, остеоартрита, ревматоидного артрита, эрозивного артрита, астмы, атеросклероза, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, отторжения трансплантата, подагры, рака, острого поражения легких, острого заболевания легких, сепсиса, АКИ8, заболевания периферических артерий, системного склероза, респираторного дистресссиндрома у новорожденных, обострения астмы и СОРИ, муковисцидоза, диффузного панбронхиолита, поражения, вызванного реперфузией, и/или эндометриоза, включающая эффективное количество антитела по одному из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. 15. Способ уменьшения хемотаксиса нейтрофилов у пациента путем введения антитела по одному из пп.1-9.