KR20200132938A - 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법 - Google Patents

지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200132938A
KR20200132938A KR1020207029474A KR20207029474A KR20200132938A KR 20200132938 A KR20200132938 A KR 20200132938A KR 1020207029474 A KR1020207029474 A KR 1020207029474A KR 20207029474 A KR20207029474 A KR 20207029474A KR 20200132938 A KR20200132938 A KR 20200132938A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
amino acid
hvr
acid sequence
antibody
Prior art date
Application number
KR1020207029474A
Other languages
English (en)
Inventor
카챠 핑크
청이 왕
리사 퐁 포 응
로렌트 레니아
젠지로 삼페이
싱어 크리스틴 쿠
Original Assignee
추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤, 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 filed Critical 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20200132938A publication Critical patent/KR20200132938A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 지카 바이러스(ZIKV)에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스(항-DENV) 항체 및 그의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 항-DENV 항체는 ZIKV 감염을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는 용도를 갖는다. 또한, 청구된 항체는 LALA, KAES 및 ACT5 돌연변이를 함유하는 변이체 Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다.

Description

지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
본 발명은 항-지카 바이러스 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
뎅기열은 세계에서 가장 흔한 절지동물-매개 바이러스 질병이다. 뎅기열을 유발하는 바이러스(또는 본 명세서에서 DENV로 지칭됨)는 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4와 같은 4개의 상이한 감염성 혈청형으로 분류될 수 있다. 뎅기 감염의 증상은 열, 근육통, 두통, 낮은 혈소판수 및 낮은 백혈구수, 응고병증, 출혈, 및 뎅기 쇼크 증후군으로 이어질 수 있는 혈관 누수가 포함된다. 사람이 이전의 뎅기 감염후에 뎅기 바이러스에 노출될 때, 항바이러스성 항체가 숙주 세포내로의 바이러스의 흡수를 증대시킬 수 있으며, 환자는 중증의 뎅기열이 발생할 위험이 더 높다. 그러나, 중증의 뎅기열은 또한 처음 감염시에도 일어날 수 있다.
지금까지, 가장 흔한 절지동물-매개 바이러스 질병이지만, 뎅기열을 치료하기에 유용한 약물은 없다. 질병으로서 뎅기열에 관한 접근방법들은 주로 감염의 예방 및/또는 증상을 완화시키는 치료에 대한 것이었다.
바이러스 감염을 예방하고 치료하기 위한 백신 및 항체 치료제들이 현재 개발중에 있다. 그러나, 항체 기반 치료법은 위험성을 갖는다. 한가지 상기 위험은, 세포에서 증가된 감염성을 야기하는, 비-중화 항바이러스성 항체가 숙주 세포내로의 바이러스 진입을 촉진할 때 일어나는 항체-의존성 감염력강화(ADE)이다(문헌[Expert Rev Anti Infect Ther(2013) 11, 1147-1157]). ADE에 대한 가장 일반적인 메카니즘은 항체의 Fc 부분을 통한 바이러스-항체 복합체와 세포 표면상의 Fc 수용체(FcR)와의 상호작용이다. 보통 가벼운 바이러스 감염은 ADE에 의해 강화되어 생명을 위협하는 질병이 될 수 있다. FcγR에 대한 결합을 방해하는 Fc 영역에서의 돌연변이를 갖는 항-DENV 항체는 DENV 감염을 강화시키지 못했음이 보고되었다(WO 2010/043977). 그러나, 감염의 항체-의존성 감염력강화 위험을 증가시키지 않는 항체 치료제가 여전히 요구된다.
지카 바이러스에 대한 DENV-특이적 항체의 교차-반응성이 문헌[JCI Insight. 2017;2(8). doi: 10.1172/jci.insight.92428.]에서 보고되었다. 또한 DENV-특이적 Ab가 지카 감염을 증대시킬 수 있는 것으로 입증되었다(문헌[Nature. 2016;536 (7614):48-53. doi: 10.1038/nature18938, Nat Immunol. 2016;17(9):1102-8.]).
본 발명은 항-DENV 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드, 및 그를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 DENV E 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (ii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (iv) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (v) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (ii) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (ii) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (ii) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열; 또는 (d) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 7의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 DENV 또는 DENV E 단백질에 결합하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-DENV 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체의 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala 및 위치 235에 Ala를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체의 Fc 영역은 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역들로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-DENV 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체를 생산하도록 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-DENV 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명의 항-DENV 항체는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 DENV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 항-DENV 항체는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 DENV 감염의 치료를 위한 것이다.
본 발명은 또한 DENV 감염을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 항-DENV 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 추가의 치료제, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역과 비교시 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역과 비교시 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala, 위치 235에 Ala를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267, 268 및 324, (b) 위치 236, 267, 268, 324 및 332, 및 (c) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267의 Glu, (b) 위치 268의 Phe, (c) 위치 324의 Thr, (d) 위치 236의 Ala, (e) 위치 332의 Glu, (f) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp, 및 (g) 위치 333의 Ser.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 추가로 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala, (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 표 4에 기술된 바와 같은 아미노산 변경들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 기술된 모 Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래된다. 본 발명은 서열번호 51 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 항-바이러스 항체이다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 본 명세서에 기술된 항-DENV 항체로부터 유래된 가변 영역을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
추가의 실시양태에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3.
본 발명은 또한 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 폴리펩티드를 생산하도록 본 발명의 숙주를 배양하는 것을 포함하는, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 바이러스 감염의 치료를 위한 것이다.
본 발명은 또한 바이러스 감염을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기술된 항-DENV 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법은 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (ii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (iv) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (v) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (ii) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열; 또는 (d) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 지카 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 본 발명의 항-지카 항체 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala, 위치 235에 Ala를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267, 268 및 324, (b) 위치 236, 267, 268, 324 및 332, 및 (c) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267의 Glu, (b) 위치 268의 Phe, (c) 위치 324의 Thr, (d) 위치 236의 Ala, (e) 위치 332의 Glu, (f) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp, 및 (g) 위치 333의 Ser.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 추가로 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala, (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu.
본 발명은 서열번호 51 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 SG182(서열번호 46), SG1095(서열번호 54) 및 SG1106(서열번호 59)으로 이루어진 군에서 선택된 인간 IgG1 CH 서열과 함께 3CH1047(서열번호 6) 및 3CH1049(서열번호 95)로 이루어진 군에서 선택된 VH 변이체 서열; 및 인간 CL 서열 SK1(서열번호 60)과 함께 3CL(서열번호 7) 및 3CL633(서열번호 98)으로 이루어진 군에서 선택된 VL 변이체 서열을 포함한다.
도 1a 내지 1d는 실시예 2에 기술된 바와 같이, DENV-1 E 단백질(도 1a), DENV-2 E 단백질(도 1b), DENV-3 E 단백질(도 1c), 및 DENV-4 E 단백질(도 1d)에 대한 항-DENV 항체 3C 및 3Cam의 비아코어(BIACORE)® 센서그램을 예시한다.
도 2는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 인간 C1q에 대한 상이한 Fc 변이체들을 갖는 항체들의 결합 친화성을 예시한다. 결합 활성은 ELISA로 측정하였다. 시험된 Fc 변이체들은 WT, LALA + KWES, LALA + EFT + AE, LALA + EFT, 및 LALA이다.
도 3은 실시예 4에 기술된 바와 같이, 인간 C1q에 대한 상이한 Fc 변이체들을 갖는 항체들의 결합 친화성을 예시한다. 결합 활성은 ELISA로 측정하였다. 시험된 Fc 변이체들은 WT, LALA, LALA + KWES, LALA + KAES, LALA + KDES, LALA + KEES, 및 LALA + KMES이다.
도 4는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 인간 C1q에 대한 상이한 Fc 변이체들을 갖는 항체들의 결합 친화성을 예시한다. 결합 활성은 ELISA로 측정하였다. 시험된 Fc 변이체들은 WT, LALA, LALA + ACT3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + ACT3 + KAES, 및 LALA + ACT5 + KAES이다.
도 5는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 인간 C1q에 대한 상이한 Fc 변이체들을 갖는 항체들의 결합 친화성을 예시한다. 결합 활성은 ELISA로 측정하였다. 시험된 Fc 변이체들은 WT, LALA, LALA + ACT3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + ACT3 + KAES, 및 LALA + ACT5 + KAES이다.
도 6a 내지 6h는 실시예 5에 기술된 바와 같이, 인간 FcγR에 대한 Fc 변이체 결합의 비아코어 분석을 예시한다. 시험된 Fc 변이체들은 WT(도면에서 WT IgG로 기술됨), KWES, EFT + AE, EFT, KAES, LALA + KWES, LALA + EFT + AE, LALA + EFT, LALA, LALA + ACT3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + ACT3, 및 LALA + KAES + ACT5이다. 상기 Fc 변이체들은 다음을 포함한 FcγR에 대한 결합을 검사하였다: (도 6a) 인간 FcγR1a, (도 6b) 인간 FcγR2a 대립유전자 변이체 167H, (도 6c) 인간 FcγR2a 대립유전자 변이체 167R, (도 6d) 인간 FcγR2b, (도 6e) 인간 FcγR3a 대립유전자 변이체 158F, (도 6f) 인간 FcγR3a 대립유전자 변이체 158V, (도 6g) 인간 FcγR3b 대립유전자 변이체 NA1, 및 (도 6h) 인간 FcγR3b 대립유전자 변이체 NA2. 각각의 Fc 변이체는 Fc 변이체를 갖는 항체 단독(Ab 단독으로 기술됨)의 형태, 및 항체 및 삼량체성 CD154 항원과 함께 생성된 면역 복합체(CD154 IC로 기술됨)의 형태 둘 다로 평가되었다.
도 7a 내지 7d는 실시예 5에 기술된 바와 같이, 마우스 FcγR에 대한 Fc 변이체 결합의 비아코어 분석을 예시한다. 시험된 Fc 변이체들은 WT(도면에서 WT IgG로 기술됨), KWES, EFT + AE, EFT, KAES, LALA + KWES, LALA + EFT + AE, LALA + EFT, LALA, LALA + ACT3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + ACT3, 및 LALA + KAES + ACT5이다. 상기 Fc 변이체들은 (도 7a) 마우스 FcγR1, (도 7b) 마우스 FcγR2b, (도 7c) 마우스 FcγR3, 및 (도 7d) 마우스 FcγR4를 포함한 FcγR에 대한 결합을 시험하였다. 각각의 Fc 변이체는 Fc 변이체를 갖는 항체 단독(Ab 단독으로 기술됨)의 형태, 및 항체 및 삼량체성 CD154 항원과 함께 생성된 면역 복합체(CD154 IC로 기술됨)의 형태 둘 다로 평가되었다.
도 8은 실시예 5에 기술된 바와 같이, 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체 결합의 비아코어 분석을 예시한다. 시험된 Fc 변이체들은 WT(도면에서 hIgG1로 기술됨), LALA, LALA + ACT3, LALA + ACT5, LALA + KAES, LALA + KAES + ACT3, 및 LALA + KAES + ACT5이다. 각각의 Fc 변이체는 Fc 변이체를 갖는 항체 단독(Ab 단독으로 기술됨)의 형태, 및 항체 및 삼량체성 CD154 항원과 함께 생성된 면역 복합체(CD154 IC로 기술됨)의 형태 둘 다로 평가되었다.
도 9는 실시예 6에 기술된 바와 같이, AG129 마우스에서 DENV-2 바이러스 감염 3 일후의 바이러스혈증을 예시한다. WT(hIgG1로 기술됨), LALA, 및 LALA + KAES의 Fc 변이체들, 또는 음성 대조군으로서 PBS와 함께 항-DENV 항체 3C 및 3Cam을 바이러스 감염 2 일후에 투여하였다.
도 10은 실시예 6에 기술된 바와 같이, AG129 마우스에서 DENV 1 내지 4 바이러스 감염 3 일후의 바이러스혈증을 예시한다. 동일한 Fc 변이체(LALA + KAES) 또는 음성 대조군으로서 P1 완충제와 함께 항-DENV 항체 3C 및 3Cam2를 바이러스 감염 2 일후에 투여하였다. LOD: 검출 한계. 각각의 부호는 1마리의 마우스로부터의 바이러스혈증을 나타낸다. 일원 ANOVA 검정을 이용하여 군들 사이의 유의적 차이를 계산하였다.
도 11은 실시예 6에 기술된 바와 같이, AG129 마우스에서 DENV 2 바이러스 감염 3 일후의 바이러스혈증을 예시한다. 항-DENV 항체 3Cam2-LALA 및 3Cam2-LALA+KAES 또는 음성 대조군으로서 P1 완충제를 바이러스 감염 2 일후에 투여하였다.
도 12a 내지 도 12d는 실시예 2에 기술된 바와 같이, DENV-1 E 단백질(도 12a), DENV-2 E 단백질(도 12b), DENV-3 E 단백질(도 12c), 및 DENV-4 E 단백질(도 12d)에 대한 항-DENV 항체 3C 및 3Cam2의 비아코어® 센서그램을 예시한다.
도 13a 및 도 13b는 BHK-21-DC-SIGN 세포를 사용한 지카 중화 분석을 예시한다. 지카 균주 KF993678을 사용하였다. 각각의 데이터 점은 1회 측정으로부터 수득한 것이다. 3Cam2-LALA+KAES+ACT5에 대한 대략적인 NT50은 1차 실험(도 13a)에서 0.33 ㎍/mL이고 3C-LALA+KAES+ACT5에 대한 상기 값은 5.33 ㎍/mL이다. 2차 실험(도 13b)에서 3Cam2-LALA+KAES+ACT5에 대한 대략적인 NT50은 0.93 ㎍/mL이다.
도 14a 및 14b는 지카 바이러스에 대한 K562 세포 ADE 분석을 예시한다. 지카 균주 KF993678을 사용하였다. 도 14a) 감염증가는 3Cam2의 야생형 버전에서 관찰할 수 있지만, 그의 Fc-변이체들인 3Cam2-LALA+KAES 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5에서는 그렇지 않다. INFECTED: 항체 무첨가. n=2의 평균 ± 오차(범위)를 나타내었다. 도 14b) 대조군으로 3Cam2의 야생형 버전을 사용하고, 3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 새 배치를 사용하여 실험을 반복하였다. n=2의 평균 ± 오차(범위)를 나타내었다.
도 15는 지카 감염에 대한 생체내 효능을 예시한다. 마우스를 지카 바이러스로 복강내 감염시키고 감염 2 일후에 100 ㎍의 3Cam2-LALA+KAES+ACT5(3Cam2-SG1106) 또는 3C-LALA+KAES+ACT5(3C-SG1106)로 정맥내 처리하였다. P1 완충제를 대조군으로 사용하였다. 각각의 점은 1마리의 마우스를 나타내고, 평균 ± SD를 나타내었다. 크러스칼 월리스(Kruskal Wallis)를 이용하여 유의성을 검사하였다. *: p<0.05, **: p<0.005,
도 16은 항체 처리후 지카-감염된 IFNAR 마우스의 생존율을 예시한다. 마우스를 지카 바이러스로 복강내 감염시키고 감염 2 일후에 100 ㎍의 3Cam2-LALA+KAES+ACT5(3Cam2-SG1106) 또는 3C-LALA+KAES+ACT5(3C-SG1106)로 정맥내 처리하였다. P1 완충제를 대조군으로 사용하였다. 군 당 생존율 %는 감염후 40 일동안에 대해 나타낸 것이다.
도 17은 ZIKV에 대한 3C, 3C-LALA 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5 단일클론 항체의 결합 활성을 예시한다. 정제된 KIKV 비리온 상의 결합 ELISA 곡선.
도 18은 ZIKV에 대한 3C, 3C-LALA 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5 인간 항체의 시험관내 중화 활성을 예시한다. 바이러스 단독에 비해 항체와 함께 배양된 바이러스의 상대 감염성을 나타내었다. 3C 및 3C-LALA의 2개의 상이한 배치를 사용하였다(이전 및 새 배치).
도 19a 및 19b는 항체 처리가 IFNαR KO 마우스에서 ZIKV-유도된 선천성 발달 결함을 방지함을 예시한다. (도 19a) 모의군-감염 마우스(a), 이소타입 항체가 투여된 ZIKV-감염 마우스(b), 3C-LALA로 처리된 ZIKV-감염 마우스(c), 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5로 처리된 ZIKV-감염 마우스(d)로부터의 대표적인 태아들. (도 19b) 각 군(n)내 태아들의 중량: 전신 중량(A) 및 머리 중량(B). 각각의 점은 1마리의 태아를 나타낸다.
도 20a 내지 20d는 항체가 모체로부터 태아로 ZIKV의 전달을 유의적으로 감소시킴을 예시한다. 양수(도 20a), 태반(도 20b), 태아 뇌(도 20c) 및 태아 간(도 20d) 내 바이러스 부하량. 각각의 점은 각 군에서 1 마리의 태아, n≥7을 나타낸다.
본 명세서에 기술되거나 참조된 기법 및 절차들은 당해 분야의 숙련가들에 의해 일반적으로 충분히 이해되며 통상적인 방법, 예를 들어, 하기의 문헌들에 기술된 널리 사용된 방법들을 이용하여 통상적으로 사용된다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 문헌[March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당해 분야의 숙련가에게 본 출원에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개공보를 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 명세서를 해석하기 위해서 하기의 정의들을 적용할 것이며, 적합한 경우는 언제든, 단수로 사용된 용어들은 또한 복수를 포함하고 복수로 사용된 용어들은 또한 단수를 포함할 것이다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태들을 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다. 하기에 나타낸 임의의 정의가 본 명세서에 참고로 인용된 임의의 문서와 충돌하는 경우에, 하기에 나타낸 정의에 따를 것이다.
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"친화성"은 분자(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원)의 단일 결합 부위간의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 방법들을 포함하여 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적이고 예시적인 실시양태들을 하기에 기술한다.
"친화성 증진된" 항체는, 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변성 영역(HVR)에 하나 이상의 변경, 예를 들어, 항원에 대한 상기 항체의 친화성을 개선시키는 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-DENV 항체" 및 "DENV에 결합하는 항체"는 항체가 DENV를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성하에 DENV와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 상기 항체는 DENV의 E 단백질에 결합할 수 있다. 용어 "항-DENV E 단백질 항체" 및 "DENV E 단백질에 결합하는 항체"는 항체가 DENV를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성하에 DENV E 단백질과 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, DENV E 단백질이 아닌 비관련 단백질에 대한 항-DENV E 단백질 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정시 DENV E 단백질에 대한 상기 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, DENV 및/또는 DENV E 단백질에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-DENV 항체는 상이한 혈청형들로부터의 DENV 중에서 보존되는 DENV의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-DENV E 단백질 항체는 상이한 혈청형들로부터의 DENV E 단백질 중에서 보존되는 DENV E 단백질의 에피토프에 결합한다.
용어 "항-지카 바이러스 항체", "항-지카 항체", "항-ZIKV 항체" 및 "지카 바이러스에 결합하는 항체"는 항체가 지카 바이러스를 표적화하는데 진단제, 예방제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성하에 지카 바이러스와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 용어 "항-ZIKV 항체" 및 "항-DENV 항체"는 ZIKV 바이러스 및 DENV 둘 다와 결합할 수 있는 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조물들을 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성 세포(예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가 상기 세포독성 효과기 세포들이 항원-함유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이어서 세포독소로 표적 세포를 사멸시키게 할 수 있는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc 감마 RIII만을 발현하는 반면, 단핵세포는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, 및 Fc 감마 RIII를 발현시킨다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 미국 특허 제 5,821,337 호 또는 미국 특허 제 6,737,056 호(프레스타(Presta))에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포로는 PBMC 및 NK 세포가 포함된다. 다르게는 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"항체 단편"은 완전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 완전한 항체의 일부를 포함하는, 완전한 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 그 항원에 대한 상기 기준 항체의 결합을 차단하는 항체, 및 반대로, 경쟁 분석에서 그 항원에 대한 상기 항체의 결합을 차단하는 기준 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 분석이 본 명세서에 제공된다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. 2개의 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 함께 C1q는 보체 의존성 세포독성(CDC) 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는, 예를 들어, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 퀴델(Quidel)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상기 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 칭한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는, 그의 동족 항원에 결합되는 항체들(적절한 하위부류의)에 대한 보체 시스템의 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다. 변이된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체(변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력은, 예를 들어, 미국 특허 제 6,194,551 B1 호 및 WO 1999/51642에 기술되어 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]을 참조하시오.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 핵산분해 효소; 항생제; 단편 및/또는 그의 변이체를 포함한 독소, 예를 들어, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
"효과기 기능"은, 항체의 이소타입에 따라 변하는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어, 약학 제형의 "효과량"은 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정 아미노산들을 포함한다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자들의 화학 활성 표면 기를 포함할 수 있으며, 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물 중의 표적 항원상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 것(감마 수용체)이며 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태의 수용체들을 포함한, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체들을 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열들을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 중에 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 중에 면역수용체 티로신-계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(예를 들어, 문헌[Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은, 예를 들어, 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; 문헌[Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 문헌[de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 검토되어 있다. 차후에 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR들은 본 명세서의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; 문헌[Ghetie et al., Nature Biotechnology 15(7):637-640 (1997)]; 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219(힌톤(Hinton) 등) 참조). 생체내에서 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 유전자이식 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 상기 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석할 수 있다. WO 2000/42072(프레스타)는 FcR에 대한 개선되거나 감소된 결합을 갖는 항체 변이체를 기술하고 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조하시오.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(잔기 446-447)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은 EU 넘버링 체계(EU 지수로도 지칭된다)에 따른다.
용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(잔기 447) 또는 글리신-리신(잔기 446-447)을, 예를 들어, 상기 항체의 정제시에 또는 상기 항체를 암호화하는 핵산의 재조합 공학에 의해 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 G446-K447을 갖는 항체, G446을 갖고 K447은 없는 항체, G446-K447 모두가 제거된 항체, 또는 전술한 3가지 유형의 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL) 중에 하기의 서열로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "완전한 항체" 및 "전체 항체"는 본 명세서에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기와 같은 효과기 기능들은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합되는 Fc 영역을 필요로 하며, 예를 들어, 본 명세서의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 호환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 상기로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완벽히 일치하지 않을 수도 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포 중에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 특별히 제외한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 보편적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 하위군은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, 상기 VL에 대한 하위군은 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, 상기 VH에 대한 하위군은 카밧 등의 상기 문헌에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열이 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 고리("초가변 고리")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR, 즉 VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 HVR은 (a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 고리(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]); (b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)]); (c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함한, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기들(예를 들어, FR 잔기)은 본 명세서에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 붙여진다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하지만 이로 한정되지는 않는, 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시 95% 초과 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 핵산 분자를 통상적으로 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편)를 지칭하며, 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기 핵산 분자, 및 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은, 예를 들어, 천연 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 제조시에 발생하는 가능한 변이 항체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, "단일클론"이란 수식어는 항체들의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 것으로서 상기 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법들 및 단일클론 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법들은 본 명세서에 기술되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어, 세포독성 부분) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열에 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 알로타입); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 천연 변이체를 포함한다.
"패키지 삽입지"란 용어는 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하며, 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 일치 퍼센트(%)"는, 최대 서열 일치 퍼센트를 달성하도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후에, 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 상기 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어, 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록 상표)(제네틱스 캄파니, 리미티드(Genetyx Co., Ltd.))를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬시키기에 적합한 파라미터들을 결정할 수 있다.
상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에게 저작권이 있으며, 소스 코드가 미국 저작권 사무소(미국 워싱턴 DC 20559 소재)에 사용자 문서(미국 저작권 등록번호 TXU510087하에 등록되어 있다)와 함께 제출되었다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함한 유닉스 실행 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교에 사용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대한 아미노산 서열 일치%(다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대해 특정한 아미노산 서열 일치%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 하기와 같이 계산한다: 100 x 분수 X/Y; 여기에서, X는 A 및 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 일치하는 합치로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다. 상기 아미노산 서열 A의 길이가 상기 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 일치%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 일치%와 같지 않을 것임을 알 것이다. 특별히 달리 서술되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 아미노산 서열 일치% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고 상기 제형이 투여되는 대상에게 허용불가능하게 독성인 추가 성분들은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 외에, 대상에게 무독성인, 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "DENV E 단백질"은, 달리 나타내지 않는 한, DENV-1, DENV-2, DENV-3, 및 DENV-4를 포함한, 임의의 DENV 혈청형으로부터의 임의의 천연 DENV E 단백질을 지칭한다. DENV 게놈은 3개의 구조 단백질(캡시드(C), 막 전구체/막(prM/M), 및 피막(E)) 및 7개의 비구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)을 암호화한다. 약 55 kDa의 당단백질인 E 단백질은 비리온의 성숙 전에 PrM 단백질과의 이종이량체로서 존재한다. E 단백질의 엑토도메인에 대한 X-선 결정학 연구에 의해 나선형 줄기 앵커 및 2개의 역평행 막관통 도메인에 의해 바이러스 막에 연결된 3개의 별개의 베타-배럴(beta-barrel) 도메인들이 밝혀졌다. 도메인 III(EDIII)는 면역글로불린-유사 접힘을 취하며 수용체 상호작용에서 결정적인 역할을 하는 것으로 제시되었다. 도메인 II(EDII)는 2개의 긴 손가락-유사 구조로 이루어진 연장된 도메인이며 끝부분에 고도로 보존된 13개 아미노산 융합 고리(EDII-FL)를 함유하고 E 단백질의 막 융합 및 이량체화에 관여한다. 중앙 도메인(도메인 I; EDI)은 각각 1개 및 4개의 유연성 링커에 의해 EDIII 및 EDII에 연결된 9개-가닥의 β-배럴이다. E 단백질은 바이러스의 수명 주기동안 바이러스 구성, 수용체 부착, 진입, 바이러스 융합, 및 아마도 면역 회피에 중요하며, 따라서 바이러스 입자 상에서 다수의 별개의 입체구조 및 정렬을 취하기 위해 필요한 동적 단백질이다. 상기 용어는 "전장" 미가공 DENV E 단백질뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 야기되는 DENV E 단백질의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 DENV E 단백질의 천연 변이체, 예를 들어, 혈청형 변이체 또는 유사종(quasispecies)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "지카 바이러스(ZIKV)"는 플라비비리대 바이러스과의 구성원이다. 상기 바이러스는 이집트 숲모기(A. aegypti) 및 흰줄 숲모기(A. albopictus)와 같은 낮시간에 활동하는 숲모기(Aedes)에 의해 전파된다. ZIKV 게놈은 바이러스 세린 및 세포성 퓨린 프로테아제에 의해 기능성 도메인들: 캡시드(C), 막 전구체(prM), 피막(E) 및 7개의 비구조 단백질(NS)로 분열되는 3419개 아미노산의 단일 폴리단백질을 암호화한다.
본 명세서에서 사용된 "실질적으로 감소된", "실질적으로 증가된" 또는 "실질적으로 상이한"이란 어구는, 당해 분야의 숙련가가 두 값들 간의 차이가 상기 값(예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 배경내에서 통계적 유의성을 갖는 것으로 간주하는, 두 수치(일반적으로 분자와 연관된 한 값 및 기준/비교기 분자와 연관된 다른 한 값) 간의 충분히 높은 정도의 차이를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들어, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 상기 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 지연시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원 결합에 관련된 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리되어 각각 상보성 VL 또는 VL 도메인의 라이브러리를 선별할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 문헌[Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조하시오.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형(변경), 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에 비해 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에 또는 상기 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 10개 아미노산 치환, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본 발명에서 상기 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 가장 바람직하게는 상기와 적어도 약 90% 상동성, 보다 바람직하게는 상기와 적어도 약 95% 상동성을 가질 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 상기 벡터에 결합되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제성 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 상기 벡터가 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"라 칭한다.
II. 조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 항-DENV 항체 및 그의 용도를 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, DENV 및/또는 DENV E 단백질에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, DENV 감염의 진단 또는 치료에 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 용도를 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체이다. 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들어, 바이러스 감염의 진단 또는 치료에 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 항-ZIKV 항체 및 그의 용도를 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, ZIKV에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, DENV에 대해 교차-반응성을 갖는 항-ZIKV 항체가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 지카 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 기반으로 한다. 한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 임신한 모체로부터 태아로의 지카 바이러스의 전달을 억제하는 방법을 기반으로 한다. 한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 선천성 지카 증후군을 예방하는 방법을 기반으로 한다. 한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등) 감소를 억제하는 방법을 기반으로 한다.
일례로, 용어 "선천성 지카 증후군"은 출생전 지카 바이러스에 감염된 태아 및 유아에게 독특한 뚜렷한 패턴의 출생 결함을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가들이 이해하듯이, 선천성 지카 증후군을 갖는 대상은 선천성 발달 결함, 소두증, 두개골이 특히 붕괴되는 중증 소두증, 피질하 석회화를 포함한 특정 패턴의 뇌손상하의 감소된 뇌조직, 점상 상흔 및 초점 색소성 망막 반점을 포함한 안구 뒷부분의 손상, 선천성 구축, 예를 들어, 내반족 또는 관절구축, 출생직후 신체 움직임을 방해하는 긴장항진 등과 같은(이로 한정되지는 않는다) 증상들을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 투여는 선천성 지카 증후군의 하나 이상의(또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 모든) 증상을 예방하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체는 출생전에 지카 바이러스의 태아 또는 유아 감염을 예방함으로써 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등)의 감소를 억제한다.
한 양태에서, 본 섹션(II. 조성물 및 방법)에서 기술된 용어 "항-DNEV 항체"는, 항체가 DENV 및 ZIKV 둘 다에 결합할 수 있다면 ZIKV와 결합할 수 있는 항체("항-ZIKV 항체")를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 지카 바이러스와 결합하는 항체("항-ZIKV 항체")를 투여하는 것을 포함하는, 지카 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 지카 바이러스와 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 임신한 모체로부터 태아로의 지카 바이러스의 전달을 억제하는 방법을 제공한다.
A. 변이체 Fc 영역을 포함하는 예시적인 항- DENV 항체 및 폴리펩티드
한 양태에서, 본 발명은 DENV 및/또는 DENV E 단백질에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-DENV 항체는 숙주 세포에 대한 DENV 및/또는 DENV E 단백질의 결합을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항-DENV 항체는 숙주 세포내로의 DENV 진입을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-DENV 항체는 전체 DENV 입자에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 단량체성 DENV E 단백질에 보다 전체 DENV 입자에 더 잘 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는, DENV 혈청형 1(DENV-1), DENV 혈청형 2(DENV-2), DENV 혈청형 3(DENV-3), 및 DENV 혈청형 4(DENV-4)로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 DENV 혈청형 모두에 결합하고/하거나 이들을 중화시킨다. 특정 실시양태에서, 항-DENV 항체는 DENV-1, DENV-2, DENV-3, 및 DENV-4로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 DENV 혈청형 모두로부터 유래된 DENV E 단백질에 결합하고/하거나 이들을 중화시킨다. "혈청형"은 바이러스 종 내에서의 별개의 변이를 지칭한다.
한 양태에서, 본 발명은 ZIKV에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-ZIKV 항체는 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항-ZIKV 항체는 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-ZIKV 항체는 DENV에 대해 교차-반응성을 갖는다. 한 양태에서, 한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-DENV 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산은 하기의 HVR 위치들에서 치환된다: (a) HVR-H1(서열번호 11) 중, 위치 2 및 4에서; (b) HVR-H2(서열번호 13) 중, 위치 9 및 10에서; (c) HVR-H3(서열번호 16) 중 위치 3, 14 및 16에서; (d) HVR-L1(서열번호 21) 중, 위치 5 및 8에서; (e) HVR-L2(서열번호 24) 중, 위치 4 및 7에서; 및 (f) HVR-L3(서열번호 27) 중, 위치 4 및 5에서.
특정 실시양태에서, 항-DENV 항체의 하나 이상의 아미노산 치환은 본 명세서에서 제공되는 바와 같이 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 하기 치환들 중 임의의 하나 이상이 임의의 조합으로 이루어질 수 있다: (a) HVR-H1(서열번호 11) 중, N2Y; I4M; (b) HVR-H2(서열번호 13) 중, T9R; A10R; (c) HVR-H3(서열번호 16) 중, R3E; R14F; G16D 또는 L; (d) HVR-L1(서열번호 21) 중, D5E; K8Q; (e) HVR-L2(서열번호 24) 중, N4E; T7F; 및 (f) HVR-L3(서열번호 27) 중, D4S 또는 E; D5A.
상기 치환들의 모든 가능한 조합들이 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 각각에 대한 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 및 45의 공통 서열에 의해 포함된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는, (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR을 포함하는 항-DENV 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3 및 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3 및 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3 및 서열번호 10의 VL 서열로부터 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3 및 서열번호 7의 VL 서열로부터 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (b) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (b) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (b) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (b) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (ii) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (ii) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (ii) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1; (b) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2; (c) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3; (d) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (e) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 (i) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1, (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 항-DENV 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-DENV 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-DENV 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, FR 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항-DENV 항체는 하기의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 FR 서열들을 포함한다: 중쇄 가변 도메인의 경우, FR1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인의 경우, FR1은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-DENV 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-DENV 항체는 DENV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호 11 및 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 13 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 항-DENV 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-DENV 항체는 DENV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 6에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 서열번호 6의 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-DENV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-DENV 항체는 DENV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 21 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-DENV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-DENV 항체는 DENV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 10에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10의 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-DENV 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나 및 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나 및 서열번호 7의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-DENV 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 6 및 서열번호 10의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 항-DENV 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, DENV-2 E 단백질 상의 G100, W101, K122, I162, S274, K310, W391 및 F392로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, DENV-2 E 단백질 상의 K122, I162 및 S274로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 1개 이상, 2개 이상, 또는 전부를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 에피토프가 K122, I162 및 S274로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 1개 이상, 2개 이상, 또는 전부를 포함하는 경우, G100, W101, K310, W391 및 F392로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 임신한 모체로부터 태아로의 지카 바이러스의 전달을 억제하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 선천성 지카 증후군(예를 들어, 선천성 발달 결함, 소두증 등)을 예방하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등) 감소를 억제하는 방법을 제공한다.
일례로, 용어 "선천성 지카 증후군"은 출생전 지카 바이러스에 감염된 태아 및 유아에게 독특한 뚜렷한 패턴의 출생 결함을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가들이 이해하듯이, 선천성 지카 증후군을 갖는 대상은 선천성 발달 결함, 소두증, 두개골이 특히 붕괴되는 중증 소두증, 피질하 석회화를 포함한 특정 패턴의 뇌손상하의 감소된 뇌조직, 점상 상흔 및 초점 색소성 망막 반점을 포함한 안구 뒷부분의 손상, 선천성 구축, 예를 들어, 내반족 또는 관절구축, 출생직후 신체 움직임을 방해하는 긴장항진 등과 같은(이로 한정되지는 않는다) 증상들을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 투여는 선천성 지카 증후군의 하나 이상의(또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 모든) 증상을 예방하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체는 출생전에 지카 바이러스의 태아 또는 유아 감염을 예방함으로써 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등)의 감소를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법은 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 임신한 모체로부터 태아로의 지카 바이러스의 전달을 억제하는 방법은 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 선천성 지카 증후군(예를 들어, 선천성 발달 결함, 소두증 등)을 예방하는 방법은 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등) 감소를 억제하는 방법은 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일례로, 용어 "선천성 지카 증후군"은 출생전 지카 바이러스에 감염된 태아 및 유아에게 독특한 뚜렷한 패턴의 출생 결함을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가들이 이해하듯이, 선천성 지카 증후군을 갖는 대상은 선천성 발달 결함, 소두증, 두개골이 특히 붕괴되는 중증 소두증, 피질하 석회화를 포함한 특정 패턴의 뇌손상하의 감소된 뇌조직, 점상 상흔 및 초점 색소성 망막 반점을 포함한 안구 뒷부분의 손상, 선천성 구축, 예를 들어, 내반족 또는 관절구축, 출생직후 신체 움직임을 방해하는 긴장항진 등과 같은(이로 한정되지는 않는다) 증상들을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 투여는 선천성 지카 증후군의 하나 이상의(또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 모든) 증상을 예방하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체는 출생전에 지카 바이러스의 태아 또는 유아 감염을 예방함으로써 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등)의 감소를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 뎅기 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 하전된 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이고, X3은 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H3, (ii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT (이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 극성 아미노산이고, X2는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 하전된 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이고, X3은 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 극성 아미노산이고, X2는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 소수성 아미노산 또는 하전된 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H2, (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 하전된 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이고, X3은 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-H3, (iv) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 하전된 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이다)을 포함하는 HVR-L1; (v) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 극성 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 하전된 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이다)을 포함하는 HVR-L1; (ii) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 극성 아미노산 또는 하전된 아미노산이고, X2는 극성 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 하전된 아미노산 또는 극성 아미노산이고, X2는 하전된 아미노산 또는 소수성 아미노산이다)를 포함하는 HVR-L3.
당해 분야의 숙련가들이 이해하듯이, 하전된 아미노산으로는 아르기닌(R, Arg), 리신(K, Lys), 아스파트산(D, Asp), 및 글루탐산(E, Glu)이 포함되고; 극성 아미노산으로는 글루타민(Q, Gln), 아스파라긴(N, Asn), 히스티딘(H, His), 세린(S, Ser), 트레오닌(T, Thr), 티로신(Y, Tyr), 시스테인(C, Cys), 및 트립토판(T, Trp)이 포함되고; 소수성 아미노산으로는 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 발린(Val, V), 프롤린(Pro, P), 및 글리신(Gly, G)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (ii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 아미노산 서열 SX1YX2H(이때, X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M이다)(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(이때, X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R이다)(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(이때, X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L이다)(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (iv) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (v) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(이때, X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q이다)(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1; (ii) 아미노산 서열 DASX1LKX2(이때, X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F이다)(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(이때, X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A이다)(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (ii) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (ii) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열로부터의 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 1의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3을 포함하는 항체가 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 (a) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열; (c) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열; 또는 (d) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 7의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-ZIKV 항체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-ZIKV 항체는 ZIKV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-ZIKV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 항-ZIKV 항체는 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-ZIKV 항체는 ZIKV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-ZIKV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-ZIKV 항체는 DENV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-ZIKV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-ZIKV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-ZIKV 항체는 ZIKV에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 10에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-DENV 항체는 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10의 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-ZIKV 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나 및 서열번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나 및 서열번호 7의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-ZIKV 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 59의 불변 중쇄(즉, CH) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 60의 불변 경쇄(즉, CL) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 59 및 서열번호 60 각각의 불변 중쇄 및 불변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala 및 위치 235에 Ala를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 Fc 영역은 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역들로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-지카 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명의 항-지카 항체는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-지카 항체는 지카 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 항-지카 항체는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 지카 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
본 발명은 또한 지카 감염을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 효과량의 본 발명의 항-지카 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 추가의 치료제, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역과 비교시 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역과 비교시 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala, 위치 235에 Ala를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267, 268 및 324, (b) 위치 236, 267, 268, 324 및 332, 및 (c) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 아미노산 변경을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267의 Glu, (b) 위치 268의 Phe, (c) 위치 324의 Thr, (d) 위치 236의 Ala, (e) 위치 332의 Glu, (f) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp, 및 (g) 위치 333의 Ser.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산들을 추가로 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala, (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu, 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu.
일부 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체의 변이체 Fc 영역은 표 4에 기술된 바와 같은 아미노산 변경들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 기술된 모 Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래된다. 본 발명은 서열번호 51 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 (i) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH, (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL, (iii) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 및 (vi) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CL을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는, SG182(WT; 서열번호 46), SG1095(서열번호 54) 및 SG1106(3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 CH;서열번호 59)으로 이루어진 군에서 선택된 인간 IgG1 CH 서열과 함께 3CH1047(3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 VH; 서열번호 6) 및 3CH1049(서열번호 95)로 이루어진 군에서 선택된 VH 변이체 서열; 및 인간 CL 서열 SK1(3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 CL; 서열번호 60)과 함께 3CL(3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 VL; 서열번호 7) 및 3CL633(서열번호 98)으로 이루어진 군에서 선택된 VL 변이체 서열을 포함한다. 존재하는 상기 변이체 및 돌연변이의 서열은 표 2 및 4에서 참조되고 상술되어 있다.
몇몇 예에서, 본 발명의 지카 바이러스에 결합하는 항체는 본 개시내용의 실시예 섹션에서 예시된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체는 실시예 7에 개시된 바와 같은 항체, 예를 들어, 하기의 변이체들일 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다: (a) 3Cam2, 곧 DG_3CH1047(서열번호 6)-SG182(서열번호 46)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60), (b) 3Cam2-LALA+KAES, 곧 DG_3CH1047(서열번호 6)-SG1095(서열번호 54)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60), (c) 3Cam2-LALA+KAES+ACT5, 곧 DG_3CH1047(서열번호 6)-SG1106(서열번호 59)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60), (d) 3C, 곧 DG_3CH(서열번호 1)-SG182(서열번호 46)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60), (e) 3C-LALA, 곧 DG_3CH(서열번호 1)-SG192(서열번호 47)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60), (e) 3C-LALA+KAES+ ACT5, 곧 DG_3CH (서열번호 1)-SG1106(서열번호 59)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60) 등.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 항-DENV 또는 항-ZIKV 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함한 단일클론 항체이다. 한 실시양태에서, 항-DENV 또는 항-ZIKV 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어, 완전한 IgG1 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.
추가의 양태에서, 본 발명의 항-DENV 또는 항-ZIKV 항체는 Fc-감마-수용체(FcγR)에 대한 항체의 결합을 제거하는 변형을 가질 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것이 아니라, Fc-감마-수용체에 대한 항체의 결합을 제거하는 변형은, FcR에 대한 감소된 결합이, 주로 FcR과의 상호작용에 의해 매개되는 것으로 생각되는 감염의 ADE(항체-의존성 감염력강화) 현상을 피할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체의 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234에 Ala 및 위치 235에 Ala를 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 항-DENV 또는 항-ZIKV 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 기술된 바와 같은 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
1. 항체 친화성
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 방사성 표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 친화성은, 일련의 적정된 비표지 항원의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다(예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 상기 분석의 조건을 확립시키기 위해서, 마이크로티터(MICROTITER)(등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs)) 5 ㎍/㎖로 밤새 코팅하고, 이어서 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 비-흡착성 플레이트(눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM[125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다(예를 들어, 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치한다). 이어서, 상기 관심 Fab를 밤새 배양하지만; 상기 배양은 평형에 도달하도록 보다 오랜 기간(예를 들어, 약 65 시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서 배양(예를 들어, 1 시간 동안)을 위해 상기 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 섬광제(마이크로신트(MICROSCINT)-20™); 패커드(Packard))를 가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 카운터(패커드)상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시양태에 따라, Kd를 비아코어(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하여 측정한다. 예를 들어, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 분석을 약 10 응답 단위(RU)의 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25 ℃에서 수행한다. 한 실시양태에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 대략 10 응답 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)에 PBS 중에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20™) 계면활성제(PBST)를 주입한다. 결합속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 간단한 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 상기 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 계산한다. 상기 평행 해리 상수(Kd)는 koff/kon의 비로서 계산한다. 예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol . Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조하시오. 상기 결합속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 결합속도는, 분광계, 예를 들어, 스톱-플로우(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS, pH 7.2 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술된 다른 단편들을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오; 또한 WO 1993/16185; 및 미국 특허 제 5,571,894 호 및 미국 특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해, 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬 소재); 예를 들어, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조).
항체 단편은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 완전한 항체의 단백질분해적 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 에스케리치아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 다양한 기법에 의해 제조할 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체들이, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)]에 기술되어 있다. 일례로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변화된 "부류 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어, 상기 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337 호, 미국 특허 제 7,527,791 호, 미국 특허 제 6,982,321 호 및 미국 특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 그래프트화를 기술하고 있음); 문헌[Padlan, Mol . Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면처리"를 기술하고 있음); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법을 기술하고 있음)에 추가로 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:4285 (1992)]; 및 문헌[Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포 계열 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리로의 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Baca et al., J. Biol . Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol . Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조).
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol. 5:368-374 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr . Opin . Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 공격에 반응하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전한 항체를 생산하도록 변형된 유전자이식 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 상기 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외에 존재하거나 상기 동물의 염색체내로 무작위로 통합된다. 상기와 같은 유전자이식 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 검토는, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조하시오. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 6,075,181 호 및 미국 특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HuMab)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 5,770,429 호; K-M 마우스(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 7,041,870 호, 및 벨로시마우스(VelociMouse)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허출원 공개공보 제 2007/0061900 호를 참조하시오. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되었다(예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103:3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 추가의 방법들로는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 생성을 기술하고 있음) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기법(트라이오마(Trioma) 기법)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-191 (2005)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한, 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리 중에서 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 결합시킬 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 하기에서 기술된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2000)]; 문헌[O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol . Biol. 222:581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175]; 문헌[Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol . Biol. 338(2):299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol . Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]에 추가로 기술되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리들을 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리 중에서 무작위로 재조합하고, 이어서 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 나이브 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들어, 인간으로부터) 항체의 단일 공급원을 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같은 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 제공할 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol. 227:381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, PCR 프라이머 함유 랜덤 서열을 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공보들은, 예를 들어, 미국 특허 제 5,750,373 호, 및 미국 특허 공보 제 2005/0079574 호, 제 2005/0119455 호, 제 2005/0266000 호, 제 2007/0117126 호, 제 2007/0160598 호, 제 2007/0237764 호, 제 2007/0292936 호, 및 제 2009/0002360 호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 DENV E 단백질에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 DENV E 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수도 있다. 이중특이성 항체는 또한, DENV E 단백질을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키는데 사용할 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)], WO 1993/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작(WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교결합(예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980 호 및 문헌[Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조); 이중특이성 항체를 생성을 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 "다이아바디" 기법의 사용(예를 들어, 문헌[Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용(예를 들어, 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어, 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]에 기술된 바와 같은 삼중특이성 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어, US 2006/0025576 A1 참조).
본 명세서의 항체 또는 단편은 또한 DENV E 단백질뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열내에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은, 예를 들어, 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 삽입 및/또는 상기 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여, 최종 구조물이 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 갖는 한, 상기 최종 구조물에 도달할 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에 "바람직한 치환"의 제목하에 나타낸다다. 보다 실질적인 변화를 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같이 제공한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시킬 수 있으며 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해서 선별할 수 있다.
[표 1]
Figure pct00001
아미노산들은 공통 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원 대신 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성된 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질들(예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변화(예를 들어, 개선)를 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 증진된 항체이며, 상기 항체는 편의상, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 증진 기법, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 기법들을 사용하여 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 선별한다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에 변경(예를 들어, 치환)이 수행될 수 있다. 상기와 같은 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화된 잔기들(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol . Biol. 207:179-196(2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행될 수 있으며, 이때 생성되는 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 제작 및 재선택에 의한 친화성 증진은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2002)]; 문헌[O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기술되었다. 친화성 증진에 대한 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어, 오류유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이유발)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서, 상기 라이브러리를 선별하여 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-유도 접근방법을 포함하며, 상기 접근방법에서는 다수의 HVR 잔기들(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위 선정된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 주사 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 수행될 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어, 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기들 밖에 존재할 수 있다. 상기에서 제공된 변이 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서는, 표적 잔기들(예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 기를 확인하고, 이들을, 상기 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원간의 접촉점들을 확인할 수 있다. 상기와 같은 접촉 잔기 및 주변 잔기들을 치환 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체들은, 이들이 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 편리하게는 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물을 변이시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 결합되는 분지된 바이안테너리 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형은 특정한 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정시 Asn297에 결합된 모든 당구조물들(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서의 상기 당쇄내 푸코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역내의 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 항체내 미미한 서열 변화로 인해 위치 297의 대략 ±3개 아미노산 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294 내지 300에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 출원공개 제 2003/0157108 호(프레스타 엘(Presta, L.)); 제 2004/0093621 호(쿄와 학코 쿄고 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조하시오. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki et al., J. Mol . Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al., Arch. Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 출원공개 제 2003/0157108 A1 호, 프레스타 엘; 및 WO 2004/056312 A1, 아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]; 문헌[Kanda et al., Biotechnol . Bioeng. 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분 올리고사카라이드, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878(장 마레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546(우마나 등)에 기술되어 있다. 상기 Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964(라주 에스(Raju, S.); 및 WO 1999/22764(라주 에스)에 기술되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능(예를 들어, ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게 하는 일부(전부는 아닌)의 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여, 항체가 Fc 감마 R 결합(따라서 ADCC 활성을 가질 가능성) 및/또는 FcRn 결합 능력을 갖는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc 감마RIII 만을 발현하는 반면, 단핵세포는 Fc 감마RI, Fc 감마RII 및 Fc 감마RIII를 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국 특허 제 5,500,362 호(예를 들어, 문헌[Hellstrom et al. Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann et al., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 유세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc . Nat'l Acad. Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova et al., Int'l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
변형된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
FcR에 대한 변화된 결합을 갖는 특정 항체 변이체들이 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 변화시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 상기 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 미국 특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642, WO 2011/091078, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 기술된 바와 같이, 변화된(즉, 증가되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 야기하는 변경이 Fc 영역에서 수행된다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)(모체 IgG의 태아로의 전달을 담당)(문헌[Guyer et al., J. Immunol . 117:587(1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 증가된 결합을 갖는 항체들이 US 2005/0014934 A1(힌톤(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 증가시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다.
또한, Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제 5,648,260 호; 미국 특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.
또 다른 실시양태에서, 항체는 본 명세서 하기에 상세하게 기술된 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치되며, 이를 사용하여 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어, 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 상기 항체에 결합된 중합체들의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들 중합체는 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 상기 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 고려사항들에 기반하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 천연 또는 기준 변이체 서열의 Fc 영역(때때로 총칭적으로 본 명세서에서 "모" Fc 영역으로 지칭됨) 중 상응하는 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변경(예를 들어, 치환)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 비해 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 비해 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, FcγR은 인간 FcγR, 원숭이 FcγR(예를 들어, 사이노몰구스, 레서스 원숭이, 마모셋, 침팬지, 또는 비비원숭이 FcγR), 또는 마우스 FcγR이다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, 모 Fc 영역에 비해, FcγRIa, FcγRIIa(대립유전자 변이체 167H 및 167R 포함), FcγRIIb, FcγRIIIa(대립유전자 변이체 158F 및 158V 포함), 및 FcγRIIIb(대립유전자 변이체 NA1 및 NA2 포함)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 이상의 인간 FcγR에 대해 실질적으로 감소된 결합 활성을 갖는다. 추가의 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 비해 인간 FcγRIa, FcγRIIa(대립유전자 변이체 167H 및 167R 포함), FcγRIIb, FcγRIIIa(대립유전자 변이체 158F 및 158V 포함), 및 FcγRIIIb(대립유전자 변이체 NA1 및 NA2 포함)에 대해 실질적으로 감소된 결합 활성을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, 모 Fc 영역에 비해, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV를 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 이상의 마우스 FcγR에 대해 실질적으로 감소된 결합 활성을 갖는다. 추가의 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 비해 마우스 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대해 실질적으로 감소된 결합 활성을 갖는다.
"Fcγ 수용체"(본 명세서에서, Fcγ 수용체, FcγR 또는 FcgR로 지칭됨)는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 단일클론 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 지칭하며, 상기 Fcγ 수용체 유전자에 의해 암호화된 단백질 계열의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서, 상기 계열은 동형 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함한 FcγRI(CD64); 동형 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형) 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함), 및 FcγRIIc를 포함한 FcγRII(CD32); 및 동형 FcγIIIa(알로타입 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 여전히 발견되고 있는 임의의 인간 FcγR, FcγR 동형 또는 알로타입을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. FcγRIIb1 및 FcγRIIb2는 인간 FcγRIIb의 스플라이싱 변이체로서 보고되었다. 또한, FcγRIIb3으로 명명되는 스플라이싱 변이체가 보고되었다(문헌[J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385]). 이들 스플라이싱 변이체 외에, 인간 FcγRIIb는 NCBI에 등록된 모든 스플라이싱 변이체(NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, 및 NP_003992.3이다)를 포함한다. 또한, 인간 FcγRIIb는 모든 이전에-보고된 유전학적 다형체뿐만 아니라, FcγRIIb(문헌[Arthritis Rheum. 48:3242-3252 (2003)]; 문헌[Kono et al., Hum. Mol . Genet. 14:2881-2892 (2005)]; 및 문헌[Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46:1242-1254 (2002)]), 및 추후에 보고될 모든 유전학적 다형체를 포함한다.
FcγRIIa에는, 2개의 알로타입이 존재하는데, 하나는 FcγRIIa의 위치 167의 아미노산이 히스티딘이고(H형), 다른 하나는 위치 167의 아미노산이 아르기닌으로 치환된 것이다(R형)(문헌[Warrmerdam, J. Exp. Med. 172:19-25 (1990)]).
상기 FcγR은 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이-유래 FcγR을 포함하나, 이들로 한정되지 않으며, 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIV(CD16-2), 및 임의의 마우스 FcγR, 또는 FcγR 동형을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
인간 FcγRIa의 아미노산 서열은 서열번호 69에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIa(167H)의 아미노산 서열은 서열번호 70에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIa (167R)의 아미노산 서열은 서열번호 71에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIb의 아미노산 서열은 서열번호 72에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIIa(158F)의 아미노산 서열은 서열번호 73에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIIa(158V)의 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIIb(NA1)의 아미노산 서열은 서열번호 75에 제시되어 있고; 인간 FcγRIIIb(NA2)의 아미노산 서열은 서열번호 76에 제시되어 있다.
마우스 FcγRI의 아미노산 서열은 서열번호 77에 제시되어 있고; 마우스 FcγRIIb의 아미노산 서열은 서열번호 78에 제시되어 있고; 마우스 FcγRIII의 아미노산 서열은 서열번호 79에 제시되어 있고; 마우스 FcγRIV의 아미노산 서열은 서열번호 80에 제시되어 있다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 대한 FcγR-결합 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만인, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖는다. 한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 가지며, 이것은 [FcγR과 변이체 Fc 영역과의 상호작용 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]/[FcγR을 센서 칩에 포획하기 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]의 비가 1 미만, 0.8 미만, 0.5 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.08 미만, 0.05 미만, 0.03 미만, 0.02 미만, 0.01 미만, 0.008 미만, 0.005 미만, 0.003 미만, 0.002 미만 또는 0.001 미만인 것을 의미한다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않으며, 이것은 본 발명의 변이체 Fc 영역과 모 Fc 영역 사이의 C1q-결합 활성의 차이가 모 Fc 영역에 대한 C1q-결합 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만인 것을 의미한다.
한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 ADCC 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 CDC 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 감소된 ADCC 활성을 갖고 실질적으로 감소된 CDC 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 모 Fc 영역에 대한 ADCC 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만인, 실질적으로 감소된 ADCC 활성을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 실질적으로 감소된 CDC 활성을 갖지 않으며, 이것은 본 발명의 변이체 Fc 영역과 모 Fc 영역 간 CDC 활성의 차이가 모 Fc 영역에 대한 CDC 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만인 것을 의미한다.
한 양태에서, 본 발명은 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 단리된 폴레핍타이드를 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는, EU 넘버링에 따라, 234, 235, 236, 267, 268, 324, 326, 332, 및 333으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다.
한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 및 236, 267, 268, 324, 326, 332 및 333으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다.
한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 및 (a) 위치 267, 268 및 324; (b) 위치 236, 267, 268, 324 및 332; 및 (c) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 추가의 아미노산 변경을 포함한다.
추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 포함한다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267의 Glu; (b) 위치 268의 Phe; (c) 위치 324의 Thr; (d) 위치 236의 Ala; (e) 위치 332의 Glu; (f) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp; 및 (g) 위치 333의 Ser.
한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala 및 위치 333의 Ser의 아미노산을 포함한다. 한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Asp 및 위치 333의 Ser의 아미노산을 포함한다. 한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Glu 및 위치 333의 Ser의 아미노산을 포함한다. 한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Met 및 위치 333의 Ser의 아미노산을 포함한다. 한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Trp 및 위치 333의 Ser의 아미노산을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 428, 434, 436, 438 및 440으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산 변경을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 상기 변이체 Fc 영역은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다: EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala; (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu(또한, 아미노산 변경과 변이체 Fc 영역의 FcRn-결합 활성 사이의 관계를 기술하고 있는 WO 2016/125495를 참조하시오).
또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala, 위치 333의 Ser, 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu의 아미노산들을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala, 위치 333의 Ser, 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu의 아미노산들을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, 모 Fc 영역에 비해, 특히 pH 7.4에서, 실질적으로 증가된 FcRn 결합 활성을 갖지 않는 것이 바람직하다.
"FcRn"은 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 I의 폴리펩티드와 구조적으로 유사하고, MHC 부류 I 분자와 22% 내지 29% 서열 일치성을 나타낸다. FcRn은 막관통 α쇄 또는 중쇄와 복합체화된 가용성 β쇄 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)로 이루어진 이종이량체로서 발현된다. MHC와 유사하게, FcRn의 α쇄는 3개의 세포외 도메인(α1, α2 및 α3)을 함유하고, 그의 짧은 세포질 도메인은 이들을 세포 표면에 결속시킨다. α1 및 α2 도메인은 항체 Fc 영역의 FcRn-결합 도메인과 상호작용한다. 인간 FcRn의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은, 예를 들어, 각각 NM_004107.4 및 NP_004098.1(신호 서열 함유)에 나타낸 전구체로부터 유도될 수 있다.
인간 FcRn(α쇄)의 아미노산 서열은 서열번호 81에 제시되어 있고; 인간 β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열은 서열번호 82에 제시되어 있다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, 모 Fc 영역에 대한 FcRn 결합 활성에 비해, 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 90배 미만, 80배 미만, 70배 미만, 60배 미만, 50배 미만, 40배 미만, 30배 미만, 20배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 3배 미만, 또는 2배 미만인, 특히 pH 7.4에서 실질적으로 증가된 FcRn 결합 활성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 특히 pH 7.4에서 실질적으로 증가된 FcRn 결합 활성을 갖지 않으며, 이것은 [FcRn과 변이체 Fc 영역과의 상호작용 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]/[FcRn을 센서 칩에 포획하기 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]의 비가 0.5 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.08 미만, 0.05 미만, 0.03 미만, 0.02 미만, 0.01 미만, 0.008 미만, 0.005 미만, 0.003 미만, 0.002 미만, 또는 0.001 미만인 것을 의미한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 표 4에 기술된 아미노산 변경들 중 임의의 변경을 단독으로 또는 함께 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은 표 4에 기술된 아미노산 변경들 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 51 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항원-결합 도메인을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체 중쇄이다. 추가의 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 항체의 기원은 특별히 제한되지 않지만, 예로는 인간 항체, 마우스 항체, 래트 항체 및 토끼 항체가 포함된다. 추가의 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질이다.
본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역을 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드가 1개 분자에 포함될 수 있으며, 이때 변이체 Fc 영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드는 항체에서와 매우 유사하게 결합된다. 항체의 유형은 제한되지 않으며, IgA(IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 및 IgM 등이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항-바이러스 항체이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 다음을 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
(d) (i) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 다음을 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2;
(b) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3;
(c) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3;
(d) (i) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (ii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 10의 VL 서열로부터의 HVR-L3; 또는
(e) (i) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H1, (ii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H2, (iii) 서열번호 6의 VH 서열로부터의 HVR-H3, (iv) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L1; (v) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L2; 및 (vi) 서열번호 7의 VL 서열로부터의 HVR-L3.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기술된 항-DENV 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DENV 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 중쇄에 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 Fc 영역, 및 경쇄에 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "모 Fc 영역"은 본 명세서에 기술된 아미노산 변경의 도입 전의 Fc 영역을 지칭한다. 상기 모 Fc 영역의 바람직한 예는 천연 항체로부터 유래된 Fc 영역을 포함한다. 항체는, 예를 들어, IgA(IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 및 IgM 등을 포함한다. 항체는 인간 또는 원숭이(예를 들어, 사이노몰구스, 레서스 원숭이, 마모셋, 침팬지 또는 비비원숭이)로부터 유래될 수 있다. 천연 항체는 또한 천연 돌연변이를 포함할 수 있다. 유전학적 다형성에 기인한 IgG의 다수의 알로타입 서열들이 문헌["Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242]에 기술되어 있으며, 이들 중 임의의 서열을 본 발명에 사용할 수 있다. 특히, 인간 IgG1의 경우, 위치 356 내지 358(EU 넘버링)의 아미노산 서열은 DEL 또는 EEM일 수 있다. 상기 모 Fc 영역의 바람직한 예는 인간 IgG1(서열번호 83), 인간 IgG2(서열번호 84), 인간 IgG3(서열번호 85) 및 인간 IgG4(서열번호 86)의 중쇄 불변 영역으로부터 유래된 Fc 영역을 포함한다. 상기 모 Fc 영역의 또 다른 바람직한 예는 중쇄 불변 영역 SG1(서열번호 87)로부터 유래된 Fc 영역이다. 상기 모 Fc 영역의 또 다른 바람직한 예는 중쇄 불변 영역 SG182(서열번호 46)로부터 유래된 Fc 영역이다. 또한, 상기 모 Fc 영역은 본 명세서에 기술된 아미노산 변경 이외의 아미노산 변경을 천연 항체로부터 유래된 Fc 영역에 부가시킴으로써 생성된 Fc 영역일 수 있다.
또한, 다른 목적을 위해 수행된 아미노산 변경을 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, FcRn-결합 활성을 개선시키는 아미노산 치환(문헌[Hinton et al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006)]; 문헌[Dall'Acqua et al., J. Biol . Chem. 281(33):23514-23524 (2006)]; 문헌[Petkova et al., Intl . Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)]; 문헌[Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010)]; WO 2006/019447; WO 2006/053301; 및 WO 2009/086320), 및 항체 이종성 또는 안정성을 개선시키기 위한 아미노산 치환(WO 2009/041613)을 부가할 수 있다. 또는, WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 또는 WO 2013/180201에 기술된 항원 제거를 촉진하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2013/180200에 기술된 표적 조직에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드, WO 2009/125825, WO 2012/073992 또는 WO 2013/047752에 기술된 다수의 항원 분자에 반복 결합하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역과 결합시킬 수 있다. 또는, 다른 항원들에 결합 능력을 부여할 목적으로, EP 1752471 및 EP 1772465에 개시된 아미노산 변경들을 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역의 CH3에 결합시킬 수 있다. 또는, 혈장 체류를 증가시킬 목적으로, 불변 영역의 pI를 감소시키는 아미노산 변경(WO 2012/016227)을 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역에 결합시킬 수 있다. 또는, 세포내로의 흡수를 촉진시킬 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2014/145159)을 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역에 결합시킬 수 있다. 또는, 혈장으로부터 표적 분자의 제거를 촉진할 목적으로, 불변 영역의 pI를 증가시키는 아미노산 변경(WO 2016/125495 및 WO 2016/098357)을 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역에 결합시킬 수 있다.
산성 pH에서 인간 FcRn-결합 활성을 증대시키는 아미노산 변경을 또한 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역에 결합시킬 수 있다. 구체적으로, 상기와 같은 변경들은, 예를 들어, EU 넘버링에 따라, 위치 428에서 Met 대신 Leu의 치환 및 위치 434에서 Asn 대신 Ser의 치환(문헌[Nat. Biotechnol, 2010, 28:157-159]); 위치 434에서 Asn 대신 Ala의 치환(문헌[Drug Metab Dispos, 2010, 38(4):600-605]); 위치 5l2에서 Met 대신 Tyr의 치환, 위치 254에서 Ser 대신 Thr의 치환, 및 위치 256에서 Thr 대신 Glu의 치환(문헌[J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524]); 위치 250에서 Thr 대신 Gln의 치환 및 위치 428에서 Met 대신 Leu의 치환(문헌[J Immunol, 2006, 176(1):346-356]); 위치 434에서 Asn 대신 His의 치환(문헌[Clin Pharmacol Ther, 2011, 89(2):283-290], 및 WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, WO 2002/060919 등에 기술된 변경들을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기와 같은 변경은, 예를 들어, 위치 428에서 Met 대신 Leu의 치환, 위치 434에서 Asn 대신 Ala의 치환 및 위치 436에서 Tyr 대신 Thr의 치환으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경들은 위치 438에서 Gln 대신 Arg의 치환 및/또는 위치 440에서 Ser 대신 Glu의 치환을 추가로 포함할 수 있다(WO 2016/125495).
본 발명에서, 아미노산 변경은 치환, 결실, 부가, 삽입 및 변형, 또는 이들의 조합 중 어느 하나를 의미한다. 본 발명에서, 아미노산 변경은 아미노산 돌연변이로 바꿔 말할 수 있다.
아미노산 변경은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다양한 방법들에 의해 생성된다. 상기와 같은 방법으로는 부위-특이적 돌연변이유발 방법(문헌[Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-275 (1995)]; 문헌[Zoller, Meth . Enzymol. 100:468-500 (1983)]; 문헌[Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)]); 문헌[Kramer and Fritz, Methods Enzymol. 154: 350-367 (1987)]; 및 문헌[Kunkel, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985)]), PCR 돌연변이 방법, 및 카세트 돌연변이 방법이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.
Fc 영역에 도입되는 아미노산 변경의 수는 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 수는 1, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 8 이하, 10 이하, 12 이하, 14 이하, 16 이하, 18 이하, 또는 20 이하일 수 있다.
또한, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 다양한 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 세포독성 물질에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 폴리펩티드의 상기와 같은 화학적 변형 방법은 당해 분야에 확립되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 임의의 항원에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 항체 또는 Fc 융합 단백질이다. 상기 항체 및 Fc 융합 단백질에 의해 결합될 수 있는 항원의 예는 리간드(사이토카인, 케모카인 등), 수용체, 암 항원, 바이러스 항원, MHC 항원, 분화 항원, 면역글로불린, 및 면역글로불린을 부분적으로 함유하는 면역 복합체를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 항-DENV 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 한 양태에서, 상기 항-DENV 항체는 ZIKV에 대해 교차-반응성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 변이체 Fc 영역 또는 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 암호화할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-DENV 항체의 제조 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 Fc 영역 또는 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 상기에 제공된 바와 같은 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
항-DENV 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입한다. Fc 영역의 재조합 생성을 위해, Fc 영역을 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생산할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,648,237 호, 미국 특허 제 5,789,199 호 및 미국 특허 제 5,840,523 호를 참조하시오(또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 상기 항체는 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함한 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]; 및 문헌[Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,959,177 호, 미국 특허 제 6,040,498 호, 미국 특허 제 6,420,548 호, 미국 특허 제 7,125,978 호 및 미국 특허 제　6,417,429 호(유전자이식 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기법을 기술하고 있음)를 참조하시오.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어,문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol . Reprod. 23:243-252 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 77:4216 (1980)])를 포함한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들어, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조하시오.
다중클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 이작용성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물(통상적으로 비-인간 포유동물)을, 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트(Freund's) 완전 보조제와 혼합시키고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에 상기 동물을 프로인트 완전 보조제 중의 펩티드 또는 접합체의 원래량의 1/5 내지 1/10로 다수의 부위에 피하 주사함으로써 추가접종한다. 7 내지 14일 후에 상기 동물을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물들은 역가 평탄역까지 추가접종한다. 바람직하게는, 상기 동물은, 동일 항원이지만 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 접합체로 추가접종한다. 접합체는 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물 중에서 제조될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제가 상기 면역 응답을 증대시키기 위해 적절히 사용된다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개별적인 항체들은, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 상기 "단일클론"이라는 수식어는 상기 항체의 특성이 별개의 항체들의 혼합물은 아님을 가리킨다.
예를 들어, 상기 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터를 본 명세서에서 상기에 기술된 바와 같이 면역화시켜, 상기 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
상기 면역화제는 전형적으로 항원 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로 인간 기원의 세포가 필요한 경우 말초혈 림프구(PBL)가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 필요한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 상기 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]).
불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 상기와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 생육 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 생육시킨다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 상기 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 생육을 방지하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 입수할 수 있다) 및 SP-2 세포(및 그의 유도체, 예를 들어, X63-Ag8-653)(미국 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수할 수 있다)로부터 유래된 것들이 바람직하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생성에 대해 기술되었다(문헌[Kozbor et al. J. Immunol. 133(6):3001-3005 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)]).
하이브리도마 세포가 생육중인 배양 배지를 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어, 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해서 측정한다. 상기와 같은 기법 및 분석은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 문헌[Munson, Anal. Biochem. 107(1):220-239 (1980)]의 스캣차드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론들을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(고딩(Goding)의 상기 문헌)에 의해 생육시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 포유동물에서 종양으로서 생체내에서 생육시킬 수 있다.
상기 서브클론들에 의해 분비된 단일클론 항체는 상기 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 적절히 분리시킨다.
Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신과 같은 프로테아제를 사용하여 부분적으로 절단시킨 후에 단백질 A 컬럼상에 흡착된 분획을 재-용출시킴으로써 수득할 수 있다. 상기 프로테아제는, Fab 및 F(ab')2가 pH와 같은 효소 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 제한적인 방식으로 생성되도록 전장 항체를 절단할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 예로는 펩신 및 파파인이 포함된다.
또한, 본 발명은, 모 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변경을 도입하는 것을 포함하는, 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 생성된 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 일부 양태에서, 생성된 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질이다.
한 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서, EU 넘버링에 따라, 234, 235, 236, 267, 268, 324, 326, 332, 및 333으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산이 변경된다.
또 다른 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서, 위치 234 및 235에서의 2개의 아미노산이 변경된다.
또 다른 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 234 및 235에서의 2개의 아미노산 변경, 및 (b) 236, 267, 268, 324, 326, 332, 및 333으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 아미노산이 변경된다.
또 다른 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 234 및 235에서의 2개의 아미노산 변경, 및 (b) (i) 위치 267, 268 및 324; (ii) 위치 236, 267, 268, 324 및 332; 및 (iii) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 아미노산이 변경된다.
추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서, 아미노산 변경은, 각 위치에서, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 234의 Ala; (b) 위치 235의 Ala; (c) 위치 267의 Glu; (d) 위치 268의 Phe; (e) 위치 324의 Thr; (f) 위치 236의 Ala; (g) 위치 332의 Glu; (h) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp; 및 (i) 위치 333의 Ser로 이루어진 군에서 선택된다.
추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala 및 위치 333의 Ser이다. 추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Asp 및 위치 333의 Ser이다. 추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Glu 및 위치 333의 Ser이다. 추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Met 및 위치 333의 Ser이다. 추가의 양태에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Trp 및 위치 333의 Ser이다.
또 다른 양태에서, 상기-언급된 방법에서, EU 넘버링에 따라, 428, 434, 436, 438 및 440으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 하나 이상의 아미노산이 추가로 변경된다.
추가의 양태에서, 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala; (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu로부터 추가로 선택된다(또한, 아미노산 변경과 변이체 Fc 영역의 FcRn-결합 활성 사이의 관계를 기술하고 있는 WO 2016/125495 참조).
추가의 양태에서, 상기-언급된 방법에서, 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala, 위치 333의 Ser, 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu이다. 추가의 양태에서, 상기-언급된 방법에서 아미노산 변경은, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 위치 326의 Ala, 위치 333의 Ser, 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu이다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역은, 모 Fc 영역에 비해, 특히 pH 7.4에서, 실질적으로 증가된 FcRn 결합 활성을 갖지 않는 것이 바람직하다.
추가의 양태에서, 상기-언급된 생성 방법에서 아미노산 변경은 표 4에 기술된 임의의 단일 변경, 단일 변경들의 조합, 또는 조합 변경들로부터 선택된다.
상기-언급된 방법 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법들 중 임의의 방법에 의해 생성된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드들이 본 발명에 포함된다.
C. 분석
본 명세서에 제공된 항-DENV 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
한 양태에서, 본 발명의 항체를, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 한 양태에서는, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석을 이용하여 DENV 및/또는 DENV E 단백질에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기술된 임의의 항-DENV 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 상기 항체는 DENV 및/또는 DENV E 단백질에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상만큼 차단한다(예를 들어, 감소시킨다). 일부 경우에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼 억제된다. 특정 실시양태에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 본 명세서에 기술된 항-DENV 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체구조적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 지도화에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석에서는, 고정화된 DENV 또는 DENV E 단백질을, DENV 및/또는 DENV E 단백질에 결합하는 제1 표지된 항체, 및 DENV 또는 DENV E 단백질에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2의 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 DENV 또는 DENV E 단백질을, 상기 제 1 표지된 항체는 포함하지만 상기 제2의 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. DENV 또는 DENV E 단백질에 대한 상기 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에, 과잉의 비결합 항체를 제거하고, 고정화된 DENV 또는 DENV E 단백질과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 DENV 또는 DENV E 단백질과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이는 상기 제2 항체가 상기 DENV 또는 DENV E 단백질에 대한 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁함을 시사한다(문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
하나 이상의 FcR 계열 구성원들에 대한 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하기 위한 분석은 본 명세서에 기술되어 있거나 그렇지 않으면 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 결합 분석은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용하는 비아코어® 분석, 증폭된 발광 근접 균일성 분석(ALPHA) 선별, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)(문헌[Lazar et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2006) 103(11): 4005-4010])를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 비아코어® 분석을 이용하여 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 결합 활성이 특정한 FcR 계열 구성원에 대해 증대되는지, 또는 유지되는지, 또는 감소되는지, 예를 들어, 센서그램 분석(여기에서는 다양한 FcR을, 공지된 방법 및 시약, 예를 들어, 프로테인 A, 프로테인 L, 프로테인 A/G, 프로테인 G, 항-람다쇄 항체, 항-카파쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질을 사용하여 센서 칩상에 고정화되거나 포획된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와의 상호작용에 분석물로서 적용시킨다)으로부터 수득된 해리 상수(KD) 값의 감소 또는 증가가 존재하는지를 관찰함으로써 평가할 수 있다. 결합 활성의 변화는 또한, FcR 중 하나 이상의 유형을 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 포획된 폴리펩티드와의 상호작용에 분석물로서 적용시키기 전후의 센서그램 상의 공명 단위(RU) 값의 변화를 비교함으로써 측정할 수 있다. 또는, FcR은 상기 센서 칩상에 고정화되거나 포획될 수 있으며, 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 분석물로서 사용된다.
비아코어® 분석에서, 상호작용의 관찰시 물질들 중 하나(리간드)를 센서 칩상의 금 박막 위에 고정화시키고, 전반사가 상기 금박막과 유리 간의 계면에서 발생하도록 상기 센서 칩의 뒷면으로부터 빛을 비춤으로써, 감소된 반사강도의 일부가 상기 반사광의 일부분에서 형성된다(SPR 신호). 상호작용의 관찰시 물질들 중 다른 하나(분석물)를 센서 칩 표면위로 흐르게 하고 상기 리간드가 상기 분석물에 결합할 때, 상기 고정화된 리간드 분자의 질량이 증가하며 상기 센서 칩 표면상에서의 용매의 굴절률이 변화한다. 상기 SPR 신호의 위치는 이러한 굴절률 변화의 결과로서 이동한다(다른 한편으로, 상기 신호 위치는 상기 결합이 해리될 때 복귀된다). 상기 비아코어® 시스템은 상기에서 언급된 이동량을 가리키거나, 보다 구체적으로 측정 데이터로서 좌표상에 상기 센서 칩 표면상의 질량 변화를 플롯팅함으로써 질량의 시간 변수를 가리킨다(센서그램). 상기 센서 칩 표면상에 포집된 리간드에 결합된 분석물의 양이 상기 센서그램으로부터 측정된다. 동역학적 파라미터들, 예를 들어, 결합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)가 상기 센서그램의 곡선으로부터 측정되며, 해리 상수(KD)는 이들 상수의 비로부터 측정된다. 상기 비아코어® 방법에서는, 바람직하게는 억제를 측정하는 방법을 이용한다. 상기 억제 측정 방법의 한 예가 문헌[Lazar et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103(11): 4005-4010 (2006)]에 기술되어 있다.
ALPHA 선별은 하기의 원리에 기반하여, 2개의 비드, 공여체 및 수용체를 사용하는 ALPHA 기법에 의해 수행된다. 발광 신호는 오직 공여체 비드에 결합된 분자가 수용체 비드에 결합된 분자와 물리적으로 상호작용할 때에만 검출되며, 상기 두 비드는 서로 매우 가깝게 위치한다. 공여체 비드 중의 레이저-여기된 감광제는 주변 산소를 여기된-상태의 1중항 산소로 전환시킨다. 1중항 산소는 상기 공여체 비드 주위로 분산되고, 상기 1중항 산소가 인접한 수용체 비드에 도달하면, 화학발광 반응이 상기 비드에서 유도되고, 최종적으로 빛이 방출된다. 상기 공여체 비드에 결합된 분자가 상기 수용체 비드에 결합된 분자와 상호작용하지 않는 경우, 상기 공여체 비드에 의해 생성된 1중항 산소는 상기 수용체 비드에 도달하지 않기 때문에 상기 화학발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 비오틴화된 폴리펩티드 복합체는 상기 공여체 비드에 결합되고, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)로 태그된 Fc 수용체가 상기 수용체 비드에 결합된다. 변이체 Fc 영역을 포함하는 경쟁 폴리펩티드 복합체의 부재하에서, 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 복합체는 상기 Fc 수용체와 상호작용하여 520 내지 620 ㎚ 신호를 발생시킨다. 태그되지 않은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 복합체는 상기 Fc 수용체와의 상호작용을 위해 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 복합체와 경쟁한다. 상기 경쟁의 결과로서 관찰된 형광의 감소를 정량분석함으로써 상대적 결합 활성을 측정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 사용하여 항체와 같은 폴리펩티드 복합체를 비오틴화시키는 것은 공지되어 있다. 상기 Fc 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 중의 GST를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 인프레임으로 융합시키고 글루타티온 컬럼을 사용하여 정제를 수행함으로써 생성된 융합 유전자를 운반하는 세포에서 상기 Fc 수용체 및 GST를 발현하는 방법이, Fc 수용체를 GST로 태그하는 방법으로서 적절하게 이용된다. 상기 수득된 신호는, 바람직하게는, 예를 들어, 상기 신호를 그래프패드 프리즘(GRAPHPAD PRISM)(그래프패드(GraphPad), 미국 샌디에이고 소재)과 같은 소프트웨어를 사용한 비-선형 회귀 분석을 이용하는 단일-부위 경쟁 모델에 적합시킴으로써 분석한다.
감소된 FcR-결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은, 실질적으로 동일한 양의 상응하는 모 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 사용하여 분석을 수행할 때, 모 Fc 영역보다 필수적으로 더 약한 결합 활성하에 FcR에 결합하는 Fc 영역을 지칭한다. 또한, 증가된 FcR-결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은, 실질적으로 동일한 양의 모 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 사용하여 분석을 수행할 때, 상응하는 모 Fc 영역보다 필수적으로 더 강한 결합 활성하에 FcR에 결합하는 Fc 영역을 지칭한다. 유지된 FcR-결합 활성을 갖는 변이체 Fc 영역은, 실질적으로 동일한 양의 상응하는 모 Fc 영역, 및 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드를 사용하여 분석을 수행할 때, 모 Fc 영역과 동등하거나 그다지 상이하지 않은 결합 활성하에 FcR에 결합하는 Fc 영역을 지칭한다.
다양한 FcR에 대한 Fc 영역의 결합 활성이 증가하였는지 또는 감소되었는지의 여부는 상기 Fc 영역에 대한 다양한 FcR의 결합량의 증가 또는 감소(이는 상기 언급된 측정 방법에 따라 측정됨)로부터 측정할 수 있다. 여기에서, 상기 Fc 영역에 대한 다양한 FcR의 결합량은, 분석물로서 다양한 FcR과 상기 Fc 영역과의 상호작용 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이를 상기 센서 칩에 상기 Fc 영역을 포획하기 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이로 나누어서 수득된 값으로서 평가될 수 있다. FcγR 또는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 활성은 본 명세서 실시예 5에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에서, 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성은 바람직하게는, 예를 들어, FcγR에 대한 변이체 Fc 영역의 결합 활성이 모 Fc 영역에 대한 FcγR-결합 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만인 것을 의미한다. 이것은 또한 바람직하게는, 예를 들어, [FcγR과 변이체 Fc 영역과의 상호작용 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]/[FcγR를 센서 칩에 포획하기 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]의 비가 1 미만, 0.8 미만, 0.5 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.08 미만, 0.05 미만, 0.03 미만, 0.02 미만, 0.01 미만, 0.008 미만, 0.005 미만, 0.003 미만, 0.002 미만 또는 0.001 미만인 것을 의미한다.
본 발명에서, 특히 pH 7.4에서 실질적으로 증가되지 않는 FcRn-결합 활성은 바람직하게는, 예를 들어, FcRn에 대한 변이체 Fc 영역의 결합 활성이 모 Fc 영역의 FcRn-결합 활성에 비해 1000배 미만, 500배 미만, 200배 미만, 100배 미만, 90배 미만, 80배 미만, 70배 미만, 60배 미만, 50배 미만, 40배 미만, 30배 미만, 20배 미만, 10배 미만, 5배 미만, 3배 미만, 또는 2배 미만인 것을 의미한다. 이것은 또한 바람직하게는, 예를 들어, [FcRn과 변이체 Fc 영역과의 상호작용 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]/[FcRn을 센서 칩에 포획하기 전후에 변화된 센서그램의 RU 값의 차이]의 비가 0.5 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.08 미만, 0.05 미만, 0.03 미만, 0.02 미만, 0.01 미만, 0.008 미만, 0.005 미만, 0.003 미만, 0.002 미만, 또는 0.001 미만인 것을 의미한다.
C1q에 대한 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드의 결합 활성을 측정하기 위해, C1q 결합 ELISA를 수행할 수 있다. 간략하게, 분석 플레이트를 4 ℃에서 코팅 완충액중에서 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드 또는 모 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드(대조군)로 밤새 코팅할 수 있다. 이어서, 상기 플레이트를 세척하고 차단할 수 있다. 세척 후에, 인간 C1q의 분취량을 각 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간동안 배양할 수 있다. 추가의 세척 후에, 100 ㎕의 양 항-보체 C1q 퍼옥시다제 접합된 항체를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간동안 배양할 수 있다. 상기 플레이트는 다시 세척 완충액으로 세척하고, OPD(o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드(시그마))를 함유하는 기질 완충액 100 ㎕를 각 웰에 첨가할 수 있다. 황색의 출현으로 관찰된 산화 반응을 30 분동안 진행시키고 100 ㎕의 4.5 N H2SO4를 첨가하여 중단시킬 수 있다. 이어서, (492 내지 405) nm에서 흡광도를 판독할 수 있다. C1q에 대한 Fc 영역의 결합 활성은 본 명세서 실시예 4에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역과 모 Fc 영역 간의 C1q 결합 활성의 차이는 모 Fc 영역에 대한 C1q-결합 활성의 함수로서 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이다.
2. 활성 분석
한 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 항-DENV 항체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 차단, 숙주 세포내로의 DENV 진입 억제, 숙주 세포의 DENV 감염 억제 및/또는 방지 등을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. 특정 실시양태에서, 시험 항체의 활성 또는 중화 효력을 측정하기 위해 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 분석을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체내에서 항-DENV 활성을 측정하기 위해 동물 숙주를 이용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포를 DENV와 시험 항체 사이의 결합에 대해 직접 분석할 수 있다. 면역조직화학 기법, 공초점 기법 및/또는 결합을 평가하기 위한 다른 기법들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 상기 목적을 위해 특별히 조작된 세포들을 포함하여 다양한 세포주가 상기 선별 분석에 사용될 수 있다. 선별 분석에 사용된 세포의 예로는 포유동물 세포, 진균 세포, 세균 세포 또는 바이러스 세포가 포함된다. 세포는 성장 인자로 자극된 세포와 같은 자극된 세포일 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 본 명세서에 개시된 본 발명이 DENV에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정하기 위한 매우 다양한 분석들을 고려함을 이해할 것이다.
한 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 항-ZIKV 항체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 차단, 숙주 세포내로의 ZIKV 진입 억제, 숙주 세포의 ZIKV 감염 억제 및/또는 방지 등을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. 특정 실시양태에서, 시험 항체의 활성 또는 중화 효력을 측정하기 위해 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 분석 또는 병소-감소 중화 시험(FRNT) 분석을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체내에서 항-ZIKV 활성을 측정하기 위해 동물 숙주를 이용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포를 ZIKV와 시험 항체 사이의 결합에 대해 직접 분석할 수 있다. 면역조직화학 기법, 공초점 기법 및/또는 결합을 평가하기 위한 다른 기법들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 상기 목적을 위해 특별히 조작된 세포들을 포함하여 다양한 세포주가 상기 선별 분석에 사용될 수 있다. 선별 분석에 사용된 세포의 예로는 포유동물 세포, 진균 세포, 세균 세포 또는 바이러스 세포가 포함된다. 세포는 성장 인자로 자극된 세포와 같은 자극된 세포일 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 본 명세서에 개시된 본 발명이 ZIKV에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정하기 위한 매우 다양한 분석들을 고려함을 이해할 것이다.
분석에 따라서, 세포 및/또는 조직 배양물이 필요할 수 있다. 세포는 많은 상이한 생리학적 분석들 중 임의의 분석을 이용하여 검사될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 단백질 발현을 모니터링하고/하거나 단백질-단백질 상호작용을 시험하기 위한 웨스턴 블로팅; 다른 화학적 변형을 모니터링하기 위한 질량 분광분석법; 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는 분자 분석이 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법들은 동물 숙주를 사용한다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 동물 숙주는 영장류, 페럿, 고양이, 개, 소, 말, 및 설치류, 예를 들어, 마우스, 햄스터, 토끼 및 래트를 포함한 임의의 포유동물 숙주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 동물 숙주는 시험 항체의 투여 전에 또는 상기 투여와 함께 바이러스로 접종되거나, 바이러스로 감염되거나, 바이러스에 노출된다. 나이브 및/또는 접종된 동물들은 임의의 다양한 연구에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 동물 모델은 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 바이러스 전파 연구에 사용될 수 있다. 바이러스 결합을 차단하는데 있어 시험 항체의 효능 및/또는 동물 숙주에서의 감염성을 측정하기 위해 바이러스 전파 연구 전, 연구 중 또는 연구 후에 적합한 동물 숙주에게 시험 항체를 투여할 수 있다.
한 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, ADCC 활성 및 CDC 활성을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물학적 활성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 상기 생물학적 활성에 대해 시험한다. 특정 양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 모 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 효과기 기능을 조절한다. 특정 양태에서, 상기 조절은 ADCC 및/또는 CDC의 조절이다.
CDC 및/또는 ADCC 활성을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여 항체가 FcγR 결합(따라서 ADCC 활성을 가질 가능성)을 가지며 FcRn 결합 능력을 유지하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현이 문헌[Ravetch and Kinet, Annu Rev Immunol (1991) 9:457-492]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국 특허 제 5,500,362 호(예를 들어, 문헌[Hellstrom et al., Proc Nat'l Acad Sci USA (1986) 83:7059-7063] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc Nat'l Acad Sci USA (1985) 82:1499-1502]; 미국 특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann et al., J Exp Med (1987) 166:1351-1361] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 유세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스 96® 비-방사성 세포독성 분석(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc Nat'l Acad Sci USA (1998) 95:652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods (1997) 202:163-171]; 문헌[Cragg et al., Blood (2003) 101:1045-1052]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood (2004) 103:2738-2743] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova et al., Int Immunol (2006) 18:1759-1769] 참조).
D. 면역접합체
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 항-DENV 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는, 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 약물에 항체가 접합되는 항체-약물 접합체(ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제　5,208,020 호, 미국 특허 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 오리스타틴, 예를 들어, 모노메틸오리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제 5,635,483 호, 미국 특허 제 5,780,588 호 및 미국 특허 제 7,498,298 호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국 특허 제 5,712,374 호, 미국 특허 제 5,714,586 호, 미국 특허 제 5,739,116 호, 미국 특허 제 5,767,285 호, 미국 특허 제 5,770,701 호, 미국 특허 제 5,770,710 호, 미국 특허 제 5,773,001 호, 및 미국 특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med . Chem. 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 97:829-834 (2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg . & Med . Chem . Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al., J. Med . Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 포함하나 이로 한정되지 않는 효소 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예로는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용된 경우, 상기 방사성접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc-99m 또는 123I, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(자기공명 영상화, MRI로도 알려짐)용 스핀 표지, 예를 들어, 또한 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO 94/11026 참조). 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국 특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 면역접합체 또는 ADC는, (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터) 상업적으로 시판하는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB를 포함하나 이로 한정되지는 않는 가교결합제 시약을 사용하여 제조된 상기 접합체를 명백히 고려하나, 이로 한정되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체는 생물학적 샘플 중의 DENV 및/또는 DENV E 단백질의 존재를 검출하기에 유용하다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체는 생물학적 샘플 중의 ZIKV의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 명세서에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어, 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁액, 타액, 객담, 구강 세척액, 뇌척수액, 양막액, 복수, 유즙, 초유, 유선 분비물, 림프, 소변, 땀, 누액, 위액, 활액, 복막액, 수정체액 또는 점액을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-DENV 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플내 DENV의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 항-DENV 항체의 DENV에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-DENV 항체와 접촉시키고, 상기 항-DENV 항체와 DENV 간에 복합체가 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플내 DENV E 단백질의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 항-DENV 항체의 DENV E 단백질에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-DENV 항체와 접촉시키고, 상기 항-DENV 항체와 DENV E 단백질간에 복합체가 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-DENV 항체를 사용하여, 예를 들어, DENV 또는 DENV E 단백질이 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-DENV 항체를 사용한 요법에 적격인 대상을 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 DENV 감염, 및 뎅기열, 뎅기출혈열(DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(DSS)과 같은 DENV 감염에 의해 야기되거나 상기 감염과 연관된 질병 및/또는 증상을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-ZIKV 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플내 ZIKV의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 항-ZIKV 항체의 ZIKV에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-ZIKV 항체와 접촉시키고, 상기 항-ZIKV 항체와 ZIKV 간에 복합체가 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플내 ZIKV의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 항-ZIKV 항체의 ZIKV에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-ZIKV 항체와 접촉시키고, 상기 항-ZIKV 항체와 ZIKV 간에 복합체가 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-ZIKV 항체를 사용하여, 예를 들어, ZIKV가 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-ZIKV 항체를 사용한 요법에 적격인 대상을 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 ZIKV 감염, 및 발열, 발진, 두통, 관절통증, 충혈된 눈 및 근육통과 같은 ZIKV 감염에 의해 야기되거나 상기 감염과 연관된 질병 및/또는 증상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-DENV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 표지된 항-ZIKV 항체가 제공된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어, 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지로는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어, HRP를 산화시키는 효소와 결합된 것들), 락토퍼옥시다제 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체는 친화성 정제 물질로 사용될 수 있다. 상기 과정에서, 항체 변이체는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 고체상, 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 여과지 상에 고정화된다. 고정화된 항체 변이체는 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 지지체를 적절한 용매로 세척하면, 고정화된 항체 변이체에 결합된 정제될 항원을 제외하고 샘플내 실질적으로 모든 물질이 제거될 것이다. 최종적으로, 상기 지지체를, 항체 변이체로부터 항원을 방출시킬, 글리신 완충액, pH 5.0과 같은 또 다른 적합한 용매로 세척한다.
항체 변이체는 또한, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에서 유용할 수 있다.
항체 변이체는 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접적 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다(문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technique, (1987) pp.147-158, CRC Press, Inc.]).
F. 약학 제형
본 명세서에 기술된 바와 같은 항-DENV 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-ZIKV 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 폴리펩티드를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다.
약학적으로 허용되는 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 상대이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 출원공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 병용된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형들이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908에 기술된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 인터페론(예를 들어, 인터페린 α-2b, 인터페론-γ 등), 항-DENV 단일클론 항체, 항-DENV 다중클론 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, 헬리카제 억제제, 면역조절제, 안티센스 화합물, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, RNA 압타머, 리보자임 및 이들의 조합과 같은(이로 한정되지는 않는다) 항바이러스제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적절하게, 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에 봉입될 수 있다. 상기 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-DENV 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, DENV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 항-DENV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-DENV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 DENV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 상기 항-DENV 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-DENV 항체를 제공한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하는데 사용하기 위한 항-DENV 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 항-DENV 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하는 방법에 사용하기 위한 항-DENV 항체를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항-DENV 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 DENV 감염을 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 DENV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는 DENV 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는, 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 상기 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 DENV 감염의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 DENV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 항-DENV 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 항-DENV 항체를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체 및, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 약학 제형은 DENV 감염의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약학 제형은 숙주 세포에 대한 DENV E 단백질의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 DENV 진입을 차단하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약학 제형은 DENV 감염을 갖는 개체에게 투여된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
특정 실시양태에서, DENV 감염은 뎅기열, 뎅기 출혈열(DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(DSS)과 같은 DENV 감염에 의해 야기되거나 상기 감염과 연관된 질병 및/또는 증상을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 임신한 모체로부터 태아로의 지카 바이러스의 전달을 억제하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 선천성 지카 증후군(예를 들어, 선천성 발달 결함, 소두증 등)을 예방하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 ZIKV에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등) 감소를 억제하는 방법을 제공한다.
일례로, 용어 "선천성 지카 증후군"은 출생전 지카 바이러스에 감염된 태아 및 유아에게 독특한 뚜렷한 패턴의 출생 결함을 지칭한다. 당해 분야의 숙련가들이 이해하듯이, 선천성 지카 증후군을 갖는 대상은 선천성 발달 결함, 소두증, 두개골이 특히 붕괴되는 중증 소두증, 피질하 석회화를 포함한 특정 패턴의 뇌손상하의 감소된 뇌조직, 점상 상흔 및 초점 색소성 망막 반점을 포함한 안구 뒷부분의 손상, 선천성 구축, 예를 들어, 내반족 또는 관절구축, 출생직후 신체 움직임을 방해하는 긴장항진 등과 같은(이로 한정되지는 않는다) 증상들을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 투여는 선천성 지카 증후군의 하나 이상의(또는 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 모든) 증상을 예방하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체는 출생전에 지카 바이러스의 태아 또는 유아 감염을 예방함으로써 태아 체중(예를 들어, 아기 전신, 머리 등)의 감소를 억제한다.
본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-ZIKV 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, ZIKV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 항-ZIKV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-ZIKV 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ZIKV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 상기 항-ZIKV 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-ZIKV 항체를 제공한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하는데 사용하기 위한 항-ZIKV 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 항-ZIKV 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하는 방법에 사용하기 위한 항-ZIKV 항체를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항-ZIKV 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 ZIKV 감염을 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 ZIKV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는 ZIKV 감염의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는, 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 상기 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 ZIKV 감염의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 ZIKV 감염을 갖는 개체에게 효과량의 항-ZIKV 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제 효과량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하기에 효과적인 양의 항-ZIKV 항체를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체 및, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 약학 제형은 ZIKV 감염의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약학 제형은 숙주 세포에 대한 ZIKV의 결합 및/또는 상기 숙주 세포내로의 ZIKV 진입을 차단하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약학 제형은 ZIKV 감염을 갖는 개체에게 투여된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
특정 실시양태에서, ZIKV 감염은 발열, 발진, 두통, 관절통증, 충혈된 눈 및 근육통과 같은 ZIKV 감염에 의해 야기되거나 상기 감염과 연관된 질병 및/또는 증상을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 임의의 폴리펩티드는 치료 방법에 사용할 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 질환이 있는 개체에게 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 바이러스 감염이다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 치료될 질환이 있는 개체에게 효과량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 바이러스 감염이다. 한 실시양태에서, 상기 "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기와 같은 질환이 있는 개체에게 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 바이러스 감염이다. 한 실시양태에서, 상기 "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 치료 방법과 같은 치료 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 약학 제형은 질환의 치료를 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약학 제형은 질환이 있는 개체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 바이러스 감염이다. 한 실시양태에서, 상기 "개체"는 인간이다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-바이러스 항체는 통상적인 항-바이러스 항체들에서 관찰되는 항체-의존성 감염력강화(ADE)를 억제할 수 있다. ADE는, 항체에 결합된 바이러스가 세포에 바이러스의 감염이 증대되도록 활성화 FcγR을 통해 식균되는 현상이다. 활성화 FcγR과의 상호작용을 감소시키는 Fc 변형은 ADE의 위험을 경감시킬 수 있다. LALA 돌연변이체를 생성하는, 류신으로부터 알라닌으로의 위치 234 및 235에서의 돌연변이는 생체내에서 뎅기 바이러스 감염의 ADE 위험을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Cell Host Microbe (2010) 8, 271-283]). 그러나, 상기 변형은 항체에 의해 매개되는 다른 효과기 면역 기능, 예를 들어, ADCC 및 CDC를 감소시킨다. 특히, CDC는 ADE를 억제하는데 중요한 역할을 하는 것으로 예상될 수 있으므로, Fc 영역의 보체 성분 C1q 결합은 치료 효능을 위해 감소되지 않아야 한다. 또한, 항체 반감기는 그의 구제 수용체, FcRn에 대한 결합 친화성을 변화시키는 Fc 영역을 조작함으로써 연장될 수 있으며, 이에 의해 바이러스 감염을 보호하기 위한 항체의 예방적 용도가 도출될 수 있다.
바이러스는 바람직하게는 아데노바이러스, 아스트로바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 파포바바이러스, 폭스바이러스, 아레나바이러스, 분야바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 라브도바이러스 또는 토가바이러스로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 아스트로바이러스는 마마스트로바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 헤파드나바이러스는 B형 간염 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 헤르페스바이러스는 단순 헤르페스 바이러스 1형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 인간 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 대상포진 바이러스, 로제올로바이러스, 및 카포시(Kaposi) 육종-연관 헤르페스바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 파포바바이러스는 인유두종 바이러스 및 인간 폴리오마 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 폭스바이러스는 두창 바이러스, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 원숭이폭스 바이러스, 천연두 바이러스, 가성우두 바이러스, 구진성 구내염 바이러스, 타나폭스 바이러스, 야바 원숭이 종양 바이러스 및 전염성 연속종 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 아레나비아러스는 림프구성 맥락수막염 바이러스, 라사 바이러스, 마츄포 바이러스 및 후닌 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 분야바이러스는 한타 바이러스, 나이로바이러스, 오르토분야바이러스 및 플레보바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 칼리시바이러스는 베시바이러스, 노로바이러스, 예를 들어, 노워크(Norwalk) 바이러스 및 사포바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스(중증 급성 호흡기 증후군(SARS)의 기병성 인자)를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 필로바이러스는 에볼라(Ebola) 바이러스 및 마르부르크(Marburg) 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 플라비바이러스는 황열 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 뎅기 바이러스(DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4), C형 간염 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 세인트 루이스(St. Louis) 뇌염 바이러스, 러시아 봄-여름 뇌염 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 키야사나(Kyasanus) 삼림병 바이러스 및 파와산(Powassan) 뇌염 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 오르토믹소바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 및 C형 인플루엔자 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 파라믹소바이러스는 파라인플루엔자 바이러스, 루불라 바이러스(볼거리), 홍역바이러스(홍역), 폐렴바이러스, 예를 들어, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 및 아급성 경화성 범뇌염 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 피코르나바이러스는 폴리오바이러스, 리노바이러스, 콕삭키바이러스 A, 콕삭키바이러스 B, A형 간염 바이러스, 에코바이러스 및 엔테로바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 레오바이러스는 콜로라도 진드기열 바이러스 및 로타바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 및 인간 T-세포 림프친화 바이러스(HTLV)를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 라브도바이러스는 리사바이러스, 예를 들어, 공수병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 및 전염성 조혈기 괴사증 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 토가바이러스는 알파바이러스, 예를 들어, 로스(Ross) 리버 바이러스, 오뇽뇽(O'nyong'nyong) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스 및 서부 말 뇌염 바이러스, 및 풍진 바이러스를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법들에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-DENV 항체를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 약제 또는 약학 제형에 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법들에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-ZIKV 항체를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 약제 또는 약학 제형에 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에 단독으로 또는 다른 작용제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가적인 치료제와 동시-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적인 치료제는 항바이러스제, 예를 들어, 인터페론(예를 들어, 인터페린 α-2b, 인터페론-γ 등), 항-DENV 단일클론 항체, 항-DENV 다중클론 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, 헬리카제 억제제, 면역조절제, 안티센스 화합물, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, RNA 압타머, 리보자임 및 이들의 조합이나, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법들에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약제 또는 약학 제형의 제조 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 상기 약제 또는 약학 제형에 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 치료에 단독으로 또는 다른 작용제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적인 치료제와 동시-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적인 치료제는 항바이러스제, 예를 들어, 인터페론(예를 들어, 인터페린 α-2b, 인터페론-γ 등), 항-바이러스 단일클론 항체, 항-바이러스 다중클론 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, 헬리카제 억제제, 면역조절제, 안티센스 화합물, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, RNA 압타머, 리보자임 및 이들의 조합이나, 이로 한정되지는 않는다.
상기에 언급된 상기와 같은 병용 치료법은 병행 투여(이때 2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함된다), 및 별도 투여(이 경우, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 투여는 상기 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항-DENV 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 일어난다. 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 일어난다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드(및 임의의 추가적인 치료제)는, 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 필요한 경우, 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 부분적으로 투여가 단기간인지 또는 장기적인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에서는 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 투여 스케줄이 고려된다.
본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드는 모범 의료 행위와 일치되는 방식으로 제형화되고, 복용되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 요인들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 다른 요인들을 포함한다. 상기 작용제는, 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용된 하나 이상의 작용제와, 반드시는 아니지만, 선택적으로 함께 제형화된다. 상기와 같은 다른 작용제의 효과량은 상기 제형에 존재하는 작용제의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라서, 또는 본 명세서에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질병의 유형, 항체의 유형, 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)가, 예를 들어, 1회 이상의 별개 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라서, 치료는 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 상기 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량을 수령하도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 상기 치료법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형들 또는 치료 방법들은 항-DENV 항체 또는 항-ZIKV 항체 대신에 또는 상기 항체들에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 생각된다. 마찬가지로, 임의의 상기 제형들 또는 치료 방법들은 본 명세서에 제공된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 대신에 또는 상기 폴리펩티드에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 생각된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입지를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 유지하며, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 하나 이상의 활성 성분은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입지는 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 상기 제품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제품은 상기 조성물을 사용하여 특정 병태를 치료할 수 있음을 나타내는 패키지 삽입지를 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-DENV 항체 또는 항-ZIKV 항체 대신에 또는 상기 항체들에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 마찬가지로, 임의의 상기 제품은 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 대신에 또는 상기 폴리펩티드에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법들 및 조성물들의 실시예이다. 상기에서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들도 실시될 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 1: 항원 및 항체의 제조
DENV -1, DENV -2, DENV -3 및 DENV -4로부터 재조합 가용성 E 단백질의 발현 및 정제
카복실 말단 8x 히스티딘 태그를 갖는 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4(각각 서열번호 65 내지 68)로부터의 재조합 가용성 E 단백질들(0.8E-His)을 FreeStyle293-F 세포주 또는 Expi293 세포주(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. DENV-1, DENV-2, DENV-3, 및 DENV-4(각각 서열번호 61 내지 64)로부터 prM0.8E-His를 발현시킴으로써, prM0.8E-His가 세포내에서 단일 폴리펩티드로 발현되었으며, 상기 폴리펩티드는 이어서 prM과 0.8E-His 사이에서 절단되도록 세포내 처리되었다. 그 결과, 0.8E-His가 세포 배양 배지내에 분비되었다. 0.8E-His를 함유하는 조정 배지를, 니켈 또는 코발트로 충전된 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지로 패킹된 컬럼에 적용한 후, 이미다졸로 용출시켰다. 0.8E-His를 함유하는 분획들을 모아서 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어(GE healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)에 적용하였다. 0.8E-His를 함유하는 분획들을 모아서 -80 ℃에서 저장하였다.
재조합 인간 FcγR의 발현 및 정제
인간 FcγR의 세포외 도메인을 하기 방법에 의해 제조하였다. 먼저, FcγR의 세포외 도메인의 유전자를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 합성하였다. 그 때, 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록된 정보에 기반하여 생성하였다. 구체적으로, FcγRIa는 NCBI 등록번호 NM_000566(버전 번호 NM_000566.3)의 서열에 기반하여 생성하였고, FcγRIIa는 NCBI 등록번호 NM_001136219(버전 번호 NM_001136219.1)의 서열에 기반하여 생성하였으며, FcγRIIb는 NCBI 등록번호 NM_004001(버전 번호 NM_004001.3)의 서열에 기반하여 생성하였고, FcγRIIIa는 NCBI 등록번호 NM_001127593(버전 번호 NM_001127593.1)의 서열에 기반하여 생성하였고, FcγRIIIb는 NCBI 등록번호 NM_000570(버전 번호 NM_000570.3)의 서열에 기반하여 생성하였으며, His 태그를 각 FcγR 구조물의 C-말단에 결합시켰다. 또한, FcγRIIa, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb에 대해서는 다형태의 존재가 알려져 있으며, 상기 다형성 부위는 FcγRIIa의 경우 문헌[Warmerdam et al., J Exp Med (1990) 172, 19-25]; FcγRIIIa의 경우 문헌[Wu et al., J Clin Invest (1997) 100, 1059-1070]; 및 FcγRIIIb의 경우 문헌[Ory et al., J Clin Invest (1989) 84, 1688-1691]을 참조하여 생성하였다.
발현 벡터는 수득된 유전자 단편을 동물 세포 발현 벡터내에 삽입함으로써 제작하였다. 제작된 발현 벡터는 인간 배아 신장암 세포-유래 FreeStyle293 세포(인비트로겐) 내에 일시적으로 도입시켜 관심 단백질을 발현시켰다. 일시적 도입에 적용된 상기 세포의 배양 배지로부터 수득된 배양 상등액을 0.22-㎛ 필터를 통해 여과시켜 수득된 액체를, 원칙적으로, 하기의 4 단계에 의해 정제하였다: (i) 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피(SP 세파로스 FF); (ii) His-태그에 대한 친화성 컬럼 크로마토그래피(HisTrap HP); (iii) 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(슈퍼덱스 200); 및 (iv) 멸균 여과. FcγRI를 정제하기 위해서는, Q 세파로스 FF를 사용한 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피를 단계 (i)에 이용하였다. 정제된 단백질의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 측정하였다. 측정된 값을 기반으로, 정제된 단백질의 농도를, PACE(문헌[Protein Science (1995) 4, 2411-2423])와 같은 방법에 의해 측정된 흡광 계수를 사용하여 계산하였다.
재조합 마우스 FcγR의 발현 및 정제
마우스 FcγR(mFcγR)의 세포외 도메인을 하기 방법에 의해 제조하였다: 먼저, FcγR 세포외 도메인의 유전자를 당해 분야의 숙련가들에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 합성하였다. 상기 합성을 위해, 각각의 FcγR의 서열을 NCBI에 등록된 정보를 기반으로 제조하였다. 구체적으로, mFcγRI는 NCBI 기준 서열: NP_034316.1의 서열을 기반으로 제조하였고; mFcγRIIb는 NCBI 기준 서열: NP_034317.1의 서열을 기반으로 제조하였고; mFcγRIII는 NCBI 기준 서열: NP_034318.2의 서열을 기반으로 제조하였으며; mFcγRIV는 NCBI 기준 서열: NP_653142.2의 서열을 기반으로 제조하였다.　 상기 서열들 각각은 C-말단에 His 태그로 태그되었다.
수득된 각각의 유전자 단편을 동물 세포내 발현을 위한 벡터내에 삽입하여 발현 벡터를 제조하였다. 제조된 발현 벡터를 인간 배아 신장암 세포-유래 FreeStyle 293 세포(인비트로겐)로 일시적으로 전이시켜 관심 단백질을 발현시켰다. 수득된 배양 상등액을 회수한 다음, 0.22-㎛ 필터에 통과시켜 배양 상등액을 수득하였다. 수득된 배양 상등액은, 일반적으로, 하기 4개의 단계에 의해 정제하였다: (i) 이온-교환 컬럼 크로마토그래피; (ii) His 태그에 대한 친화성 컬럼 크로마토그래피(HisTrap HP); (iii) 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(슈퍼덱스 200); 및 (iv) 멸균 여과. 단계 (i)의 이온-교환 컬럼 크로마토그래피는, mFcγRI의 경우 Q 세파로스 HP를 사용하고, mFcγRIIb 및 mFcγRIV의 경우 SP 세파로스 FF를 사용하고 mFcγRIII의 경우 SP 세파로스 HP를 사용하여 수행하였다. D-PBS(-)를 단계 (iii) 또는 그 후에 용매로 사용한 반면, mFcγRIII에는 0.1 M 아르기닌을 함유하는 D-PBS(-)를 사용하였다. 각각의 정제된 단백질에 280 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 정제된 단백질의 농도는, PACE(문헌[Protein Science (1995) 4, 2411-2423])와 같은 방법에 의해 수득된 값으로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 계산하였다.
재조합 인간 FcRn의 발현 및 정제
FcRn은 FcRn 알파쇄와 베타2-마이크로글로불린의 이종이량체이다. 올리고-DNA 프라이머를 공개된 인간 FcRn 유전자 서열(문헌[J Exp Med (1994) 180, 2377-2381])을 기반으로 하여 제조하였다. 전체 유전자를 암호화하는 DNA 단편을, 주형으로 인간 cDNA(인간 태반 마라톤-준비된 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA), 클론테크(Clontech))와 상기 제조된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 수득된 DNA 단편을 주형으로 사용하여, 신호 영역(Met1-Leu290)을 함유하는 세포외 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고, 포유동물 세포 발현 벡터내에 삽입하였다. 유사하게, 공개된 인간 베타2-마이크로글로불린 유전자 서열(문헌[Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99, 16899-16903])을 기반으로 하여 올리고-DNA 프라이머를 제조하였다. 전체 유전자를 암호화하는 DNA 단편을, 주형으로 인간 cDNA(인간 태반 마라톤-준비된 cDNA, 클론테크)와 상기 제조된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 수득된 DNA 단편을 주형으로 사용하여, 신호 영역(Met1-Met119)을 함유하는 전체 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고, 포유동물 세포 발현 벡터내에 삽입하였다.
가용성 인간 FcRn을 하기 과정에 의해 발현시켰다. 인간 FcRn 알파쇄(서열번호 81) 및 베타2-마이크로글로불린(서열번호 82)을 발현시키기 위해 제작된 플라스미드를 PEI(폴리사이언스(Polyscience))를 사용한 리포펙션 방법에 의해 인간 배아 신장암-유래 세포주 HEK293H(인비트로겐)의 세포내에 도입하였다. 수득된 배양 상등액을 수거하고, IgG 세파로스 6 패스트 플로우(Fast Flow)(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))를 사용하여 FcRn을 정제한 후, 하이트랩(HiTrap) Q HP(지이 헬쓰케어)(문헌[J Immunol (2002) 169, 5171-5180])를 사용하여 추가로 정제하였다.
재조합 항체의 발현 및 정제
FreeStyle293-F 세포주 또는 Expi293 세포주(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 재조합 항체를 일시적으로 발현시켰다. 항체를 발현하는 조정 배지로부터의 정제는 단백질 A를 사용하는 통상적인 방법에 의해 수행하였다. 필요한 경우 겔 여과를 추가로 수행하였다.
재조합 가용성 인간 CD154의 발현 및 정제
인간 CD154 유전자를 공개된 단백질 서열(NP_000065.1)을 기반으로 합성하였다. FLAG 태그를 갖는 인간 CD154의 가용성 형태(shCD154)를 암호화하는 DNA 단편을, 합성된 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 제조하고, 생성된 DNA 단편들을 포유동물 세포 발현 벡터내에 삽입함으로써 FLAG-shCD154(서열번호 106) 발현 벡터를 생성하였다. 수득된 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 방법을 이용하여 측정하였다. 상기 FLAG-shCD154는 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 기재된 바와 같이 FreeStyle 293 세포주(인비트로겐)를 사용하여 발현시켰다. 형질감염 후에, 조정 배지를 수거하기 전 적절한 시간동안 세포를 생육시켰다. 조정 배지는 25 mM MES(pH 6.0)를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시켰고, FLAG-shCD154를 연속 구배 25 mM MES, 1M NaCl(pH6.0)을 사용하여 용출시켰다. 피크 분획들을 모으고, 아미콘울트라 울트라셀(AmiconUltra Ultracel)을 사용하여 농축하고, 포스페이트 완충 식염수(와코(Wako))를 사용하여 겔-여과 크로마토그래피에 적용하였다. 피크 분획들을 다시 모으고 아미콘울트라 울트라셀을 사용하여 농축한 다음, 0.22 ㎛ PVDF 막 필터를 사용하여 여과시켜 멸균하였다. 정제된 FLAG-shCD154의 농도를 측정하기 위해, 흡광도를 280 nm에서 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도는 문헌[Protein Science (1995) 4: 2411-2423]에 기술된 방법에 의해 계산된 흡광 계수를 사용하여 측정된 값으로부터 계산하였다.
실시예 2: DENV E 단백질에 대해 개선된 친화성을 갖는 항체 변이체의 생성
항-DENV E 단백질 항체의 VH(3CH, 서열번호 1) 및 VL(3CL, 서열번호 7)을 암호화하는 유전자를 합성하고 각각 인간 IgG1 CH(SG182, 서열번호 46) 및 인간 CL(SK1, 서열번호 60)과 결합시키고, 2개 구조물 모두 단일 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 상기 항체는 본 명세서에서 DG_3CH-SG182/3CL-SK1로서, 또는 3C로서 지칭된다.
3C의 결합 성질을 개선한 돌연변이 및 조합을 확인하기 위해 다수의 돌연변이 및 그의 조합을 검사하였다. 이어서, 다수의 돌연변이를 가변 영역에 도입시켜 E 단백질에 대한 결합 친화성을 증대시켰다. 최적화된 VH 변이체들, 3CH912(서열번호 2), 3CH953(서열번호 3), 3CH954(서열번호 4), 3CH955(서열번호 5), 3CH1047(서열번호 6), 3CH987(서열번호 90), 3CH989(서열번호 91), 3CH992(서열번호 92), 3CH1000(서열번호 93), 3CH1046(서열번호 94), 3CH1049(서열번호 95), 및 최적화된 VL 변이체들, 3CL499(서열번호 8), 3CL563(서열번호 9), 3CL658(서열번호 10), 3CL012(서열번호 96), 3CL119(서열번호 97), 3CL633(서열번호 98), 3CL666(서열번호 99), 3CL668(서열번호 100)이 상기와 같이 생성되었다. VH를 암호화하는 유전자를 인간 IgG1 CH(SG182, 서열번호 46; SG1095, 서열번호 54; 또는 SG1106, 서열번호 59 중 어느 하나)와 결합시키고, VL을 암호화하는 유전자를 인간 CL(SK1, 서열번호 60)과 결합시켰다. 이들 각각을 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 상기 항체 변이체들의 아미노산 서열은 표 2에 요약되어 있다. 변이체들 중의 하나인 DG_3CH1047-SG182/3CL658-SK1은 또한 본 명세서에서 3Cam으로 지칭되고, 또 다른 변이체인 DG_3CH1047-SG182/3CL-SK1은 본 명세서에서 3Cam2로 지칭된다.
항체들은 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 혼합물로 동시-형질감염된 HEK293 세포에서 발현되었으며, 단백질 A로 정제하였다.
[표 2]
3C 및 3C 변이체들의 아미노산 서열
Figure pct00002
DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 E 단백질에 결합하는 항-DENV E 단백질 항체들의 친화성을 25 ℃에서 비아코어 T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 측정하였다. 항-하스티딘 항체(지이 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포상에 고정화시켰다. 모든 항체 및 분석물들은 20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20 및 0.005% NaN3를 함유하는 PBS, pH 7.4 중에서 제조하였다. C-말단 His-태그를 갖는 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 E 단백질을 유동 세포 2 또는 3 상에 포획하였으며, 이때 유동 세포 1은 기준 유동 세포이다. E 단백질에 대한 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 항-DENV E 단백질 항체를 180 초동안 전체 센서 표면위로 250 nM로 주입한 후 300 초동안 해리시켰다. 각각의 주기 후에 10 mM Gly-HCl pH 1.5를 사용하여 센서 표면을 재생시켰다. 결합 친화성은 비아코어 T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(지이 헬쓰케어)을 사용하여 데이터를 처리하고 1:1 결합 모델에 적합시킴으로써 측정하였다.
표 3a 및 3b는 DENV-1(표에 DV1으로 기술됨), DENV-2(표에 DV2로 기술됨), DENV-3(표에 DV3으로 기술됨), 및 DENV-4(표에 DV4로 기술됨)의 E 단백질에 결합하는 항-DENV E 단백질 항체들의 친화성(Kd)을 나타낸다. 각각의 3C 변이체는 모 3C에 비해 4개 DENV 혈청형 모두에 대해 증가된 결합 친화성을 나타내었다. 예로서, 모 항체 3C(DG_3CH-SG182/3CL-SK1)의 센서그램 및 변이체 항체 3Cam(DG_3CH1047-SG182/3CL658-SK1)의 센서그램을 도 1에 나타내었다. 또한, 모 항체 3C(DG_3CH-SG182/3CL-SK1)의 센서그램 및 변이체 항체 3Cam2(DG_3CH1047-SG182/3CL-SK1)의 센서그램은 도 12에 나타내었다.
[표 3a]
4개 DENV 혈청형에 대한 3C 및 3C 변이체들의 Kd 값
Figure pct00003
주: *강한 결합자, <1E-05의 느린 해리 속도, KD는 특이하게 측정할 수 없음.
[표 3b]
DENV1 및 DENV3 혈청형에 대한 3C 및 3C 변이체들의 Kd 값
Figure pct00004
주: *강한 결합자, <1E-05의 느린 해리 속도, KD는 특이하게 측정할 수 없음.
실시예 3: 개선된 성질을 위한 항체 CH 변이체의 생성
다수의 돌연변이를 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH(SG182, 서열번호 46)에 도입하였고, 그 결과, 인간 IgG1 CH 변이체, SG192(서열번호 47), SG1085(서열번호 48), SG1086(서열번호 49), SG1087(서열번호 50), SG1088(서열번호 51), SG1089(서열번호 52), SG1090(서열번호 53), SG1095(서열번호 54), SG1096(서열번호 55), SG1097(서열번호 56), SG1098(서열번호 57), SG1105(서열번호 58), SG1106(서열번호 59), SG1109(서열번호 107), SG1044(서열번호 108), 및 SG1045(서열번호 109)가 생성되었다. CH 변이체를 암호화하는 유전자를 3C의 VH(3CH, 서열번호 1), 3C 변이체들 중 하나(3CH1047, 서열번호 6), 또는 항-CD154 항체(SLAPH0336a, 서열번호 88)와 결합시켰다. 항-CD154 항체의 VL 유전자(SLAPL0336a, 서열번호 89)를 인간 CL(SK1, 서열번호 60)과 결합시켰다. 이들 각각을 발현 벡터에 클로닝시켰다. CH 변이체들의 세부사항은 표 4에 요약되어 있다. 삼량체성 항원 CD154의 존재하에서 거대 면역 복합체를 형성할 수 있는, 항-CD154 항체 SLAPH0336a/SLAPL0366a의 가변 영역을, 각 Fc 수용체에 대한 CH 변이체의 친화적 결합을 평가하기 위해 사용하였다.
항체들은 중쇄와 경쇄 발현 벡터의 혼합물로 동시-형질감염된 HEK293 세포에서 발현시켰으며, 단백질 A에 의해 정제하였다.
[표 4]
변이체 Fc 영역의 아미노산 서열
Figure pct00005
실시예 4: Fc 변이체를 갖는 항체의 보체 C1q에 대한 결합 친화성
인간 C1q 결합 분석
Fc 변이체를 갖는 항-CD154 항체(실시예 3에 기술된 방법을 이용하여 생성된 사내 항체)를 눈크-이뮤노플레이트 맥시소프(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp)(날지 눈크 인터내셔날(Nalge Nunc International))에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 방치하였다. PBST로 세척한 후, 플레이트를 실온에서 0.5% BSA 및 1Х 블럭 에이스(Block Ace): 차단 시약(디에스 파르마(DS Pharma))을 함유하는 TBST로 2 시간동안 차단하였다. 플레이트를 세척한 후에, 인간 C1q(칼바이오켐(Calbiochem))를 플레이트 내에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 방치하였다. 플레이트를 세척하고, HRP-표지된 항-인간 C1q 항체(바이오 래드(Bio Rad))를 가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 이어서, TMB 기질(인비트로겐)을 첨가하였다. 신호는 450 nm(시험 파장) 및 570 nm(기준 파장)의 파장에서 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 야생형 Fc 영역을 갖는 항체(WT)의 인간 C1q에 대한 결합 친화성은, Fc 영역에 LALA 돌연변이를 도입시킴으로써 감소되었고, 인간 C1q에 대한 감소된 결합 친화성은 LALA 돌연변이 이외에 KWES, EFT, 또는 EFT + AE를 추가로 도입함으로써 회복되었다(도 2). LALA + KMES 돌연변이는 결합 친화성을 약간 증가시킨 반면, LALA + KWES, LALA + KAES, 및 LALA + KEES 돌연변이는 WT에 필적하는 친화성하에 C1q에 결합하였다(도 3). 전술한 LALA 또는 LALA + KAES 돌연변이체의 결합 성질은 ACT3 또는 ACT5 돌연변이를 추가로 도입하는 것에 의해 영향받지 않았다(도 4).
마우스 C1q 결합 분석
Fc 변이체를 갖는 항-CD154 항체(실시예 3에 기술된 방법을 이용하여 생성된 사내 항체)를 눈크-이뮤노플레이트 맥시소프(날지 눈크 인터내셔날) 상에 분산시키고 4 ℃에서 밤새 방치하였다. PBST로 세척한 후, 플레이트를 4 ℃에서 0.5% BSA 및 1Х 블럭 에이스: 차단 시약(디에스 파르마)을 함유하는 TBST로 7 시간동안 차단하였다. 플레이트를 세척한 후에, 10% 마우스 혈장(이노베이티브 리처시(Innovative Research))을 플레이트 내에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 방치하였다. 플레이트를 세척하고, 비오틴화 항-마우스 C1q 항체(하이컬트 바이오텍(Hycult Biotech))를 가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 스트렙타비딘-HRP(피어스(Pierce))를 첨가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 이어서, ABTS ELISA HRP 기질(KPL)을 첨가하였다. 신호는 405 nm의 파장에서 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 야생형 Fc 영역을 갖는 항체(WT)의 마우스 C1q에 대한 결합 친화성은, Fc 영역에 LALA 돌연변이를 도입시킴으로써 감소되었고, 마우스 C1q에 대한 감소된 결합 친화성은 LALA 돌연변이 이외에 KAES를 추가로 도입함으로써 회복되었다. 전술한 LALA 또는 LALA + KAES 돌연변이체의 결합 성질은 ACT3 또는 ACT5 돌연변이를 추가로 도입하는 것에 의해 영향받지 않았다(도 5).
실시예 5: FcγR 및 FcRn에 결합하는 Fc 변이체들에 대한 비아코어 분석
pH 7.4에서 인간 또는 마우스 FcγR 및 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체들의 결합은 25 ℃에서 비아코어 T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 측정하였다. 모든 항체, 및 FcγR 또는 FcRn은 50 mM Na-포스페이트, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3를 함유하는 PBS-P pH 7.4에서 제조하였다. FcγR 결합 분석을 위해, 항-히스티딘 항체(지이 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 상에 고정화시켰다. FcγR 각각을 항-히스티딘 항체에 의해 유동 세포 2, 3 또는 4 상에 포획하였으며, 이때 유동 세포 1은 기준 유동 세포이다. FcγR 포획 수준은 400 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 모든 항체를 모든 유동 세포위로 100 nM로 주입하였다. 1:1 몰비의 항체와 삼량체성 CD154를 혼합하여 면역 복합체를 제조하고, 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 각각의 주기 후에 10 mM 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하여 센서 표면을 재생시켰다.
FcRn 결합 분석을 위해, 비오틴 포획 시약(Biotin CAPture Reagent)(지이 헬쓰케어)을 비오틴 포획 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 CAP 센서 칩의 유동 세포 1 및 2 둘 다에 고정화시켰다. 비오틴화-FcRn을 기준 유동 세포로서 유동 세포 1을 사용하여 유동 세포 2 위에 포획하였다. FcRn 포획 수준은 400 RU를 목표로 하였다. 모든 항체를 유동 세포 1 및 2 위에 100 nM로 주입하였다. 1:1 몰비의 항체와 삼량체성 CD154를 혼합하여 면역 복합체를 제조하고, 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 각각의 주기 후에 8 M 구아니딘-HCl, 1M NaOH(3:1 부피/부피)를 사용하여 센서 표면을 재생시켰다.
결합 수준을 상응하는 FcγR 또는 FcRn의 포획 수준으로 표준화시켰다. 인간 또는 마우스 FcγR 및 인간 FcRn에 대한 항체 단독 또는 면역 복합체(항체와 삼량체성 CD154 항원)의 결합을 결합 반응을 기준으로 모니터링하였다. 면역 복합체를 사용하여 결합활성 효과를 통한 FcγR 또는 FcRn에 대한 증대된 결합을 평가하였다. 인간 FcγR1a, FcγR2a 167H 및 167R, FcγR2b, FcγR3a 158F 및 158V, FcγR3b NA1 및 NA2에 대한 결과를 도 6a 내지 6h에 나타내었다. 마우스 FcγR1, FcγR2b, FcγR3, FcγR4에 대한 결과는 도 7a 내지 7d에 나타내었다. 야생형 Fc 영역(WT IgG로 기술됨)의 결합은 시험된 FcγR 각각에 대해 Fc 영역내에 LALA, LALA + KAES, 또는 LALA + KWES 돌연변이를 도입함으로써 상당히 감소되었다. 항체 단독(Ab 단독으로 기술됨) 및 면역 복합체(CD154 IC로 기술됨)를 사용한 분석간에 경향은 대략 동일하였다. KAES 또는 KWES 돌연변이체의 결합은 시험된 FcγR 대부분에 있어서 WT IgG의 결합에 비해 크게 감소되지 않았다. 인간 FcRn에 대한 결과는 도 8에 나타내었다. 인간 FcRn에 대한 야생형 Fc 영역(hIgG1으로 기술됨)의 결합은 Fc 영역내에 LALA 또는 LALA + KAES 돌연변이를 도입한 후에도 영향받는 것으로 보이지 않았다. 상기 결합은 ACT3 또는 ACT5 돌연변이를 추가로 도입함으로써 약간 증대되었지만 여전히 비교적 낮게 유지되었다(도 8).
실시예 6: DENV 감염에 대한 항-DENV 항체의 생체내 효능
6 내지 8주령의 AG129 마우스를 106 플라크-형성 단위(pfu) DENV-2 균주 D2Y98P로 복강내에 감염시켰다. 48 시간 후에, 마우스를 P1 완충제 중의 1 내지 30 ㎍ 항체로 처리하였다. 항체는 안구뒤 경로를 통해 정맥내에 주사하였다. 추가로 24 시간 후(즉, 초기 감염 72 시간후)에, 혈액을 채취하였다. 이전의 연구(문헌[Zust et al, J Virol (2014) 88, 7276-7285]; 문헌[Tan et al, PLOS Negl Trop Dis (2010) 4, e672])에서, D2Y98P로 감염후 피크 바이러스혈증은 감염후 3 내지 4 일 사이에 도달한 것으로 확증되었다. 바이러스 RNA를 각 마우스의 혈장으로부터 추출하고 정량적 PCR을 수행하고 플라크 분석에서 알려진 감염성을 갖는 DENV-2 표준물에 대해 비교하였다. 3C 및 3Cam 항체 둘 다 상기 마우스 모델에서의 PBS 대조군에 비해 바이러스혈증을 크게 감소시켰으며, 두 항체 모두의 효능은 필적하였다. Fc 영역에 LALA + KAES 돌연변이를 갖는 항체는 LALA 돌연변이만을 갖는 항체에 비해 더 강한 효능을 나타내었다. 이것은 3C 및 3Cam 항체 둘 다에서 그러했다(도 9). 상기 결과는 LALA 돌연변이에 KAES 돌연변이를 부가함으로써 C1q 결합 활성의 회복이 항체들의 항바이러스 효능에 기여함을 시사한다.
6 내지 8주령의 AG129 마우스를 106 내지 107 플라크-형성 단위(pfu)의 DENV 바이러스(DENV-1 균주 08K3126, DENV-2 균주 D2Y98P, DENV-3 균주 VN32/96, DENV-4 균주 TVP360)로 복강내에 감염시켰다. 48 시간 후에, 마우스를 P1 완충제 중의 1 내지 30 ㎍ 항체로 처리하였다. 항체는 안구뒤 경로를 통해 정맥내에 주사하였다. 추가로 24 시간 후(즉, 초기 감염 72 시간후)에, 혈액을 채취하였다. 이전의 연구(문헌[Zust et al, J Virol (2014) 88, 7276-7285]; 문헌[Tan et al, PLOS Negl Trop Dis (2010) 4, e672])에서, D2Y98P로 감염후 피크 바이러스혈증은 감염후 3 내지 4 일 사이에 도달한 것으로 확증되었다. 바이러스 RNA를 각 마우스의 혈장으로부터 추출하고 정량적 PCR을 수행하고 플라크 분석에서 알려진 감염성을 갖는 DENV 표준물에 대해 비교하였다. 동일한 Fc 변이체(LALA+KAES)를 갖는 3C 및 3Cam 항체 둘 다 상기 마우스 모델에서의 P1 완충제 대조군에 비해 바이러스혈증을 크게 감소시켰으며, 3Cam2 항체가 3C 항체에 비해 바이러스혈증을 감소시켰다(도 10).
Fc 영역에 LALA + KAES 돌연변이를 갖는 3Cam2는, 증가하는 용량의 항체를 투여할 때 LALA 돌연변이만을 갖는 항체에 비해 더 강한 효능을 나타내었다(도 11). 상기 결과는 LALA 돌연변이에 KAES 돌연변이를 부가함으로써 C1q 결합 활성의 회복이 항체들의 항바이러스 효능에 기여함을 시사한다.
상기 발명을 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기술하였지만, 상기 설명 및 실시예들을 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 과학문헌의 개시는 그들의 내용 전체가 참고로 명백히 인용된다.
실시예 7: 지카 바이러스에 대한 뎅기 -특이적 항체 3C 및 3Cam2의 교차-반응성에 대한 시험관내 시험
7.1. FRNT 분석
지카에 대한 DG_3CH1047-SG1106/3CL_SK1(또는 3Cam2-LALA+KAES+ACT5)의 중화 능력을 시험하기 위해, 병소-감소 중화(FRNT) 분석을 수행하였다. 결과는 3Cam2-LALA+KAES+ACT5가 DG_3CH-SG1106/3CL_SK1(또는 3C-LALA+KAES+ACT5)에 비해 지카에 대해 더 높은 중화 능력을 가졌음을 나타내었다(도 13). 지카 바이러스에 대한 평균 중화 능력 또는 EC50은 표 5에 제공되어 있다.
시험한 항체들의 서열은 다음과 같다:
* 3Cam2:
DG_3CH1047(서열번호 6)-SG182(서열번호 46)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
* 3Cam2-LALA+KAES:
DG_3CH1047(서열번호 6)-SG1095(서열번호 54)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
* 3Cam2-LALA+KAES+ACT5:
DG_3CH1047(서열번호 6)-SG1106(서열번호 59)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
* 3C:
DG_3CH(서열번호 1)-SG182(서열번호 46)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
* 3C-LALA:
DG_3CH(서열번호 1)-SG192(서열번호 47)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
* 3C-LALA+KAES+ACT5:
DG_3CH(서열번호 1)-SG1106(서열번호 59)/3CL(서열번호 7)_SK1(서열번호 60)
[표 5]
지카에 대한 항체 3Cam2-LALA+KAES+ACT5 및 3C-LALA+KAES+ACT5의 중화 능력
Figure pct00006
7.2. 지카 바이러스를 사용한 ADE 분석
3Cam2-LALA+KAES+ACT5가 항체의 야생형 Fc 버전에 비해 DENV 감염의 증가를 저지할뿐 아니라 지카 바이러스 감염의 증가를 저지하는 지를 시험하기 위해, K562 세포를 사용하여 ADE 분석을 수행하였다(도 14). 방법은 DENV에 대해 사용한 방법과 동일하다. DG_3CH1047-SG182/3CL_SK1(또는 3Cam2)의 야생형 Fc 버전의 경우 감염증가가 관찰되었지만, 그의 Fc-변이체들인 DG_3CH1047-SG1095/3CL_SK1(또는 3Cam2-LALA+KAES) 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 경우에는 관찰되지 않았다(도 14a). 새 배치의 3Cam2 Ab를 사용하여 실험을 반복하여, Fc-변이체 항체에 의한 감염증가 저지를 확인하였다.
전체적으로, 상기 데이터는 LALA 돌연변이가 DENV 및 지카 바이러스 감염 둘 다의 증가를 저지하며, 부가적인 KAES 및 ACT5 돌연변이는 LALA의 효과를 역전시키지 않음을 보여준다.
7.3. 시험관내 방법
7.3.1. 바이러스
지카 바이러스(아시안(Asian) 균주, 등록번호 KF993678)는 싱가포르의 환경 건강 연구소(Environmental Health Institute)에서 입수하였다. 상기 바이러스를 다음과 같이 C6/36 세포(ATCC)에서 증식시키고 병소 형성 분석을 이용하여 정량분석하였다: 감염 20 내지 24 시간 전에, 웰 당 1x105 BHK-21 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 바이러스-함유 상등액을 1:100 내지 1:100,000으로 연속 희석하고 37 ℃, 5% CO2에서 세포 단층 위에서 500 ㎕의 부피로 2 내지 3 시간동안 배양하였다. 배양 마지막에, 각각의 웰을 RPMI 중의 0. 5mL 0.8% 메틸-셀룰로스로 덮어주었다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 4½ 일동안 배양하였다.
감염된 세포의 염색을 위해, 메틸셀롤로스를 함유하는 세포 배양 배지를 제거하고 세포를 3.7% 폼알데하이드로 30 분동안 고정시켰다. 폼알데하이드를 제거한후 플레이트를 수돗물로 세척하고 1XPBS 중에서 1% 트리톤 X-100을 사용하여 투과시켰다. 추가의 세척 단계 후에, 1% FBS/1XPBS에 희석시킨 항체 4G2를 사용하여 감염 세포를 염색한 다음, 1% FBS/PBS에 1:2,000으로 희석시킨 다중클론 염소 항-마우스-HRP와 함께 배양하였다. 트루블루 퍼옥시다제 기질(KPL)을 색 반응에 사용하였다. 각 웰에 병소들을 수동으로 계수하고, 초기 농도는 계수가능한 모든 웰로부터의 평균 수를 기반으로 계산하였다.
7.3.2. FRNT 분석
감염 20 내지 24 시간전에, 웰 당 1x105 BHK-21 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. RPMI 중에서 96 U-바닥 멸균 플레이트에서 항체 희석물을 제조하고 일정량의 바이러스를 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃, 5% CO2에서 30 분동안 배양한 후 세포에 가하였다. 24-웰 플레이트로부터 밤새 배양한 배지를 새로운 450 ㎕ 5% FBS/RMNI로 교체하고 50 ㎕ 바이러스/항체 혼합물을 웰에 가하고, 37 ℃, 5% CO2에서 2 내지 3 시간동안 배양하였다.
배양 마지막에, 각각의 웰을 RPMI 중의 0. 5mL 0.8% 메틸-셀룰로스로 덮어주었다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 4½ 일동안 배양하였다.
감염된 세포의 염색을 위해, 메틸셀롤로스를 함유하는 세포 배양 배지를 제거하고 세포를 3.7% 폼알데하이드로 30 분동안 고정시켰다. 폼알데하이드를 제거한후 플레이트를 수돗물로 세척하고 1XPBS 중에서 1% 트리톤 X-100을 사용하여 투과시켰다. 추가의 세척 단계 후에, 1% FBS/1XPBS에 희석시킨 항체 4G2를 사용하여 감염 세포를 염색한 다음, 1% FBS/PBS에 1:2,000으로 희석시킨 다중클론 염소 항-마우스-HRP와 함께 배양하였다. 트루블루 퍼옥시다제 기질(KPL)을 색 반응에 사용하였다. 각 웰에 병소들을 수동으로 계수하고, EC50 값을 프리즘(Prism) 소프트웨어(3개 파라미터 곡선-적합)를 사용하여 계산하였다.
7.3.3. K562 ADE 분석
RPMI/10%FCS 배지 중의 6x104 K562 세포/웰을 96-웰 환저 조직 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 별도의 환저 플레이트에서 항체의 연속 희석물을 제조하고 일정량의 바이러스를 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30 분동안 배양한 후 50 ㎕를 K562 세포에 가하였다. 1의 MOI를 사용하였다. 상기 항체/바이러스 혼합물을 가하기 전에 밤새 배양한 배지를 제거하였다. 37 ℃, RPMI에서 90분동안 배양한 후, 2.5일동안의 추가 배양을 위해 10% FCS를 첨가하였다. 이어서, 세포를 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm) 용액(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로 고정시킨 후 항-E 항체 4G2-Alexa647 및 항-NS1-Alexa488로 염색하였다. 96-웰 HTS 유닛을 갖는 FACS 버스(Verse) 유세포분석기(BD) 상에서 샘플을 분석하였다.
실시예 8: 지카 바이러스 감염에 대한 뎅기 -특이적 항체 3C 및 3Cam2의 보호 능력에 대한 생체내 시험
8.1. 치료적 항체 처리의 효능
AG129 마우스는 지카 바이러스에 매우 민감하고 DENV 감염후보다 훨씬 더 빨리 죽기 때문에, 지카를 위해 대신 IFNAR 모델을 선택하였다.
IFNAR 마우스는 1형 IFN 수용체(IFNAR)가 결핍되어 있지만, 정상적으로 2형 또는 IFN 감마 수용체(IFNGR)를 발현한다.
104 pfu/마우스의 바이러스 용량을 이전의 발표(문헌[Cell Host Microbe. 2016;19(5):720-30. doi: 10.1016/j.chom.2016.03.010.])에 기반하여 선택하였다. 사용된 지카 균주는 캐나다에서 태국으로 돌아가는 여행자로부터 단리하였다. 상기 균주는 아시안 계통이다. 마우스를 100 ㎍ 항체 용량으로 처리하였다.
지카 감염 2일후에 3Cam2-LALA+KAES+ACT5로 처리된 마우스는 P1 완충제로 처리된 대조군 마우스에 비해 감염 3일후 및 5일후에 훨씬 더 낮은 바이러스혈증을 나타내었다. 3Cam2-LALA+KAES+ACT5는 3C-LALA+KAES+ACT5보다 바이러스혈증을 더 효과적으로 감소시켰다(도 15). 생존율 분석에서, 2개의 항체-처리된 군들 모두 감염 15일후까지 모두 죽은 P1-처리된 마우스와 대조적으로 적어도 50일까지(실험 종료) 생존하였다(도 16).
8.2. 생체내 방법
8.2.1. 생체내 처리를 위한 항체 제조
항체를 P1 완충제(20 mM His, 150 mM Arg-Asp, pH6.0) 중에서 수 mg/mL로 농축하고, 생체내 처리 직전에 필요한 농도로 P1 완충제에 희석시켰다.
8.2.2. 마우스
AG129 마우스 또는 IFNAR 마우스를 나타낸 바와 같이 생체내 실험에 사용하였다. AG129 마우스는 영국 B&K 유니버셜(B&K Universal)에서 구입하였다. IFNAR 마우스(B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax)는 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory, 미국)에서 구입하였다.
8.2.3. 치료적 처리
마우스를 104 pfu/마우스로 복강내(i.p,) 감염시켰다. 감염 48 시간후에, 항체를 정맥내(i.v.) 주사하기 위해 마우스를 이소플루레인으로 마취시켯다. Ab를 P1 완충제로 희석하고 100 ㎕의 부피로 안구뒤에 주입하였다.
실시예 9: 지카 바이러스에 대한 3Cam2 - LALA + KAES + ACT5의 시험관내 효능
9.1 결합
지카 바이러스(ZIKV)에 대한 DG_3CH-SG182/3CL_SK1(또는 3C), DG_3CH-SG192/3CL_SK1(또는 3C-LALA) 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5 인간 항체의 결합을 측정하였다.
간략하게, mAb들을 희석하고, 이어서 37 ℃에서 1 시간동안 정제된 ZIKV-코팅된 ELISA 플레이트 상에서 배양하였다. HRP-접합된 2차 항-인간 IgG 항체를 사용하여 ZIKV 비리온에 대한 3C, 3C-LALA 및 3Cam2-LALA+KAES+ACT5의 결합을 검출하였다. 확인은 TMB 기질을 사용하여 행하였다. 반응을 중지시킨 후에, 흡광도를 측정하였으며, 판독은 2중으로 수행하였다.
3Cam2-LALA+KAES+ACT5는 ZIKV에 3C 및 3C-LALA 항체와 유사하게 결합한다(도 17).
9.2 중화
ZIKV가 세포를 감염시키는 것을 억제하는 항체의 능력도 또한 분석하였다. ZIKV를 희석된 인간 mAb와 MOI 10으로 혼합하고 약하게 교반하면서 37 ℃에서 2 시간동안 배양하였다. 이어서, 바이러스/mAb 혼합물을 96-웰 플레이트에서 접종된 HEK 293T 세포에 가하였다. 37 ℃에서 배양 2일후에, 유세포분석을 이용하여 ZIKV-특이적 항원을 검출함으로써 세포의 감염을 측정하였다. 모든 판독은 3중으로 이루어졌으며, 중화 능력은 항체의 부재하에 ZIKV로 감염된 세포에 대해 계산하였다.
모든 항체, 3Cam2-LALA+KAES+ACT5, 3C 및 3C-LALA가 ZIKV에 의한 HEK 세포의 감염을 중화시키는 유사한 능력을 나타낸다(도 18).
실시예 10: 지카 바이러스: 모체로부터 태아로의 전달에 대한 3Cam2 -LALA+KAES+ACT5의 생체내 효능
이어서, 모체에서 새끼로의 바이러스의 전달을 억제하는 항체의 능력을 연구하기 위해 항체를 생체내에서 시험하였다.
임신한 IFNαR 녹-아웃 마우스를 교배 10.5일후에 ZIKV로 접종하였다. 항체는 감염후 -1일, 0일 및 3일후에 투여하였다. 교배 16.5일후에, 임신한 마우스를 도태시키고 태아를 거두었다. 전신 및 머리 둘 다의 태아 중량을 기록하고; 양수, 태반, 태아 뇌 및 간에서 바이러스 부하량을 측정하였다.
처리된 모체로부터의 태아들은 미처리 마우스의 태아들에 비해 훨씬 더 높은 중량을 나타내어, 미처리 ZIKV-감염 동물에서 관찰되는 바와 같은 선천성 발달 결함으로부터의 보호를 시사한다(도 19). 항체들은 임신한 모체로부터 태아로의 바이러스 전달을 유의적으로 억제한다(도 20).
SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agency for Science, Technology and Research <120> Anti-Dengue Virus Antibodies Having Cross-Reactivity to Zika Virus and Methods of Use <130> 34246SG6/MBR(JKN)/ndh <140> PCT/SG2019/050145 <141> 2019-03-15 <150> SG 10201802164Y <151> 2018-03-15 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 3 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg 100 105 110 Asp Asp Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg 100 105 110 Asp Leu Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 6 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ala Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 9 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Gln Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Ala Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 10 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Glu Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Asn Tyr Ile His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 12 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 14 Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ser Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 15 Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 17 Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 18 Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Asp 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 19 Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Asp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 20 Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 22 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Gln Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 23 Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <400> 25 Asp Ala Ser Asn Leu Lys Phe 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <400> 26 Asp Ala Ser Glu Leu Lys Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 28 Gln Gln Phe Asp Ala Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 29 Gln Gln Phe Ser Ala Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 30 Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H3 <400> 34 Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys 20 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 38 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ile or Met <400> 40 Ser Xaa Tyr Xaa His 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Ala or Arg <400> 41 Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Xaa Xaa Ser Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Arg or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Arg or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gly, Asp or Leu <400> 42 Gly Gly Xaa Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Xaa Asp Xaa 1 5 10 15 Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro 20 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Lys or Gln <400> 43 Gln Ala Ser Gln Xaa Ile Arg Xaa Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Thr or Phe <400> 44 Asp Ala Ser Xaa Leu Lys Xaa 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp, Ser or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asp or Ala <400> 45 Gln Gln Phe Xaa Xaa Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 46 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 46 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 47 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 48 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Trp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 49 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 49 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 50 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 50 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 51 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 51 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Trp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 52 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 52 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 53 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 53 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 54 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 54 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 55 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 55 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Asp Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 56 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 56 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 57 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 57 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Met Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 58 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 58 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 59 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 59 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL <400> 60 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 61 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 61 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Lys 20 25 30 Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly Val Asn 35 40 45 Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 50 55 60 Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Ala Glu Pro Asp Asp Val 65 70 75 80 Asp Cys Trp Cys Asn Ala Thr Asp Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 85 90 95 Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala 100 105 110 Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 115 120 125 Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu 130 135 140 Arg His Pro Gly Phe Thr Val Ile Ala Leu Phe Leu Ala His Ala Ile 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ile Thr Gln Lys Gly Ile Ile Phe Ile Leu Leu Met Leu 165 170 175 Val Thr Pro Ser Met Ala Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp 180 185 190 Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu 195 200 205 His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp 210 215 220 Ile Glu Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys 225 230 235 240 Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys 245 250 255 Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe 260 265 270 Val Cys Arg Arg Thr Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 275 280 285 Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val 290 295 300 Thr Lys Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser 305 310 315 320 Val Ile Val Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu 325 330 335 Thr Thr Glu His Gly Thr Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr 340 345 350 Ser Glu Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp Cys Ser 355 360 365 Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys 370 375 380 Glu Lys Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu 385 390 395 400 Pro Trp Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln 405 410 415 Asp Leu Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val 420 425 430 Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly 435 440 445 Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His 450 455 460 Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser 465 470 475 480 Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu 485 490 495 Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp 500 505 510 Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr 515 520 525 Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu 530 535 540 Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile 545 550 555 560 Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys 565 570 575 Gly His His His His His His His His 580 585 <210> 62 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 62 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 20 25 30 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 35 40 45 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 50 55 60 Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Phe Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 100 105 110 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 115 120 125 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 130 135 140 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 145 150 155 160 Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 165 170 175 Val Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp 180 185 190 Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu 195 200 205 His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp 210 215 220 Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys 225 230 235 240 Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys 245 250 255 Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe 260 265 270 Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 275 280 285 Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys 290 295 300 Lys Asn Met Lys Gly Lys Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr 305 310 315 320 Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp 325 330 335 Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile 340 345 350 Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser 355 360 365 Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu 370 375 380 Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu 385 390 395 400 Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys 405 410 415 Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val 420 425 430 Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly 435 440 445 Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His 450 455 460 Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser 465 470 475 480 Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu 485 490 495 Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly 500 505 510 Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His 515 520 525 Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp 530 535 540 Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile 545 550 555 560 Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys 565 570 575 Gly His His His His His His His His 580 585 <210> 63 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 63 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 Phe His Leu Thr Ser Arg Asp Gly Glu Pro Arg Met Ile Val Gly Lys 20 25 30 Asn Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ala Ser Gly Ile Asn 35 40 45 Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Asp Asp Thr 50 55 60 Val Thr Tyr Lys Cys Pro His Ile Thr Glu Val Glu Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 Asp Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 85 90 95 Asn Gln Ala Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala 100 105 110 Pro His Val Gly Met Gly Leu Asp Thr Arg Thr Gln Thr Trp Met Ser 115 120 125 Ala Glu Gly Ala Trp Arg Gln Val Glu Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu 130 135 140 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Leu Ala Leu Phe Leu Ala His Tyr Ile 145 150 155 160 Gly Thr Ser Leu Thr Gln Lys Val Val Ile Phe Ile Leu Leu Met Leu 165 170 175 Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp 180 185 190 Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu 195 200 205 His Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp 210 215 220 Ile Glu Leu Gln Lys Thr Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys 225 230 235 240 Leu Cys Ile Glu Gly Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys 245 250 255 Pro Thr Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr 260 265 270 Val Cys Lys His Thr Tyr Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 275 280 285 Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu 290 295 300 Glu Ser Ile Glu Gly Lys Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr 305 310 315 320 Val Ile Ile Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu 325 330 335 Thr Gln Gly Val Thr Ala Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu 340 345 350 Ala Ile Leu Pro Glu Tyr Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg 355 360 365 Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys 370 375 380 Ala Trp Met Val His Arg Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp 385 390 395 400 Thr Ser Gly Ala Thr Thr Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu 405 410 415 Leu Val Thr Phe Lys Asn Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val 420 425 430 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr 435 440 445 Glu Ile Gln Thr Ser Gly Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys 450 455 460 Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala 465 470 475 480 Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln 485 490 495 His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro 500 505 510 Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn 515 520 525 Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro 530 535 540 Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile 545 550 555 560 Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly His 565 570 575 His His His His His His His 580 <210> 64 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 64 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 Phe Ser Leu Ser Thr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Met Ile Val Ala Lys 20 25 30 His Glu Arg Gly Arg Pro Leu Leu Phe Lys Thr Thr Glu Gly Ile Asn 35 40 45 Lys Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Glu Asp Thr 50 55 60 Val Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Val Asn Thr Glu Pro Glu Asp Ile 65 70 75 80 Asp Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Met Tyr Gly Thr Cys 85 90 95 Thr Gln Ser Gly Glu Arg Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Thr 100 105 110 Pro His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met Ser 115 120 125 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val Glu Ser Trp Ile Leu 130 135 140 Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Leu Ala Gly Phe Met Ala Tyr Met Ile 145 150 155 160 Gly Gln Thr Gly Ile Gln Arg Thr Val Phe Phe Val Leu Met Met Leu 165 170 175 Val Ala Pro Ser Tyr Gly Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp 180 185 190 Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu 195 200 205 His Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp 210 215 220 Phe Glu Leu Thr Lys Thr Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr 225 230 235 240 Tyr Cys Ile Glu Ala Ser Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys 245 250 255 Pro Thr Gln Gly Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr 260 265 270 Ile Cys Arg Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 275 280 285 Leu Phe Gly Lys Gly Gly Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser 290 295 300 Gly Lys Ile Thr Gly Asn Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr 305 310 315 320 Val Val Val Thr Val His Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp 325 330 335 Thr Ser Asn His Gly Val Thr Ala Met Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser 340 345 350 Val Glu Val Lys Leu Pro Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu 355 360 365 Pro Arg Ser Gly Ile Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys 370 375 380 Lys Lys Thr Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu 385 390 395 400 Pro Trp Thr Ala Gly Ala Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys 405 410 415 Glu Arg Met Val Thr Phe Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val 420 425 430 Thr Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Ala Gly 435 440 445 Ala Thr Glu Val Asp Ser Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His 450 455 460 Leu Lys Cys Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser 465 470 475 480 Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu 485 490 495 Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly 500 505 510 Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys 515 520 525 Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn 530 535 540 Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile 545 550 555 560 Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys 565 570 575 Gly His His His His His His His His 580 585 <210> 65 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 65 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Leu Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Ile Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly His His His His His 385 390 395 400 His His His <210> 66 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 66 Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Lys Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly His His His His His 385 390 395 400 His His His <210> 67 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 67 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys 50 55 60 Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr 165 170 175 Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn 180 185 190 Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg 195 200 205 Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr 210 215 220 Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn 225 230 235 240 Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly 245 250 255 Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly 260 265 270 Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp 275 280 285 Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe 290 295 300 Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile 305 310 315 320 Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 325 330 335 Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala 340 345 350 Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu 355 360 365 Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala 370 375 380 Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly His His His His His His His 385 390 395 400 His <210> 68 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV <400> 68 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Thr Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr Ser Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Met Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Ala Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 340 345 350 Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 355 360 365 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn 370 375 380 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly His His His His His 385 390 395 400 His His His <210> 69 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn 225 230 235 240 Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370 <210> 70 <211> 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 35 40 45 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 50 55 60 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 115 120 125 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 130 135 140 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 145 150 155 160 Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 165 170 175 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 195 200 205 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala 210 215 220 Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala 245 250 255 Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln 260 265 270 Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met 275 280 285 Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu 290 295 300 Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 71 <211> 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 35 40 45 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 50 55 60 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 115 120 125 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 130 135 140 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 145 150 155 160 Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 165 170 175 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 195 200 205 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala 210 215 220 Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala 245 250 255 Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln 260 265 270 Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met 275 280 285 Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu 290 295 300 Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 72 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr 20 25 30 Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro 35 40 45 Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 50 55 60 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 65 70 75 80 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 85 90 95 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 100 105 110 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 115 120 125 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 130 135 140 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 145 150 155 160 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 165 170 175 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 180 185 190 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 195 200 205 Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 210 215 220 Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro 245 250 255 Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr 260 265 270 Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln 275 280 285 Asn Arg Ile 290 <210> 73 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 74 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 75 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Val Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230 <210> 76 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230 <210> 77 <211> 404 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His 165 170 175 Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile 180 185 190 Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser 195 200 205 Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val 225 230 235 240 Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile 245 250 255 Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala 260 265 270 Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln 275 280 285 Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Val Trp Phe His Ile Leu Phe 290 295 300 Tyr Leu Ser Val Gly Ile Met Phe Ser Leu Asn Thr Val Leu Tyr Val 305 310 315 320 Lys Ile His Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Tyr Asn Leu Glu Val Pro 325 330 335 Leu Val Ser Glu Gln Gly Lys Lys Ala Asn Ser Phe Gln Gln Val Arg 340 345 350 Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr 355 360 365 Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly 370 375 380 Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Ser Gln Ser <210> 78 <211> 293 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Met Gly Ile Leu Pro Phe Leu Leu Ile Pro Met Glu Ser Asn Trp Thr 1 5 10 15 Val His Val Phe Ser Arg Thr Leu Cys His Met Leu Leu Trp Thr Ala 20 25 30 Val Leu Asn Leu Ala Ala Gly Thr His Asp Leu Pro Lys Ala Val Val 35 40 45 Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Thr Val Thr 50 55 60 Leu Thr Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp 65 70 75 80 Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ala Ser Tyr Thr 85 90 95 Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu 100 105 110 Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp 115 120 125 Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Leu Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile 130 135 140 Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser 145 150 155 160 Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Ser Ser Asn 165 170 175 Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys 180 185 190 Lys Gly Ser Leu Gly Arg Thr Leu His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile 195 200 205 Thr Val Gln Gly Pro Lys Ser Ser Arg Ser Leu Pro Val Leu Thr Ile 210 215 220 Val Ala Ala Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ile Ile Leu 225 230 235 240 Val Ser Leu Val Tyr Leu Lys Lys Lys Gln Val Pro Asp Asn Pro Pro 245 250 255 Asp Leu Glu Glu Ala Ala Lys Thr Glu Ala Glu Asn Thr Ile Thr Tyr 260 265 270 Ser Leu Leu Lys His Pro Glu Ala Leu Asp Glu Glu Thr Glu His Asp 275 280 285 Tyr Gln Asn His Ile 290 <210> 79 <211> 267 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Met Thr Leu Asp Thr Gln Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln 1 5 10 15 Trp Leu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp 20 25 30 Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro 35 40 45 Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly 50 55 60 Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Trp Ser 65 70 75 80 Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr 115 120 125 Pro Gln Arg Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His 130 135 140 Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu 145 150 155 160 Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys 165 170 175 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly 180 185 190 Ser Thr Gln His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro 195 200 205 Ala Thr Thr Ser Ser Ile Ser Leu Val Trp Tyr His Thr Ala Phe Ser 210 215 220 Leu Val Met Cys Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr 225 230 235 240 Val Arg Arg Asn Leu Gln Thr Pro Arg Asp Tyr Trp Arg Lys Ser Leu 245 250 255 Ser Ile Arg Lys His Gln Ala Pro Gln Asp Lys 260 265 <210> 80 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Val Leu Thr Ala Phe Ser 1 5 10 15 Gly Ile Gln Ala Gly Leu Gln Lys Ala Val Val Asn Leu Asp Pro Lys 20 25 30 Trp Val Arg Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly 35 40 45 Thr Phe Ser Pro Glu Asp Asn Ser Ile Lys Trp Phe His Asn Glu Ser 50 55 60 Leu Ile Pro His Gln Asp Ala Asn Tyr Val Ile Gln Ser Ala Arg Val 65 70 75 80 Lys Asp Ser Gly Met Tyr Arg Cys Gln Thr Ala Leu Ser Thr Ile Ser 85 90 95 Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Met Gly Trp Leu Leu Leu Gln Thr 100 105 110 Thr Lys Trp Leu Phe Gln Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His 115 120 125 Ser Trp Gln Asn Arg Pro Val Arg Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly 130 135 140 Lys Gly Lys Lys Tyr Phe His Glu Asn Ser Glu Leu Leu Ile Pro Lys 145 150 155 160 Ala Thr His Asn Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile Gly 165 170 175 His Asn Asn Lys Ser Ser Ala Ser Phe Arg Ile Ser Leu Gly Asp Pro 180 185 190 Gly Ser Pro Ser Met Phe Pro Pro Trp His Gln Ile Thr Phe Cys Leu 195 200 205 Leu Ile Gly Leu Leu Phe Ala Ile Asp Thr Val Leu Tyr Phe Ser Val 210 215 220 Arg Arg Gly Leu Gln Ser Pro Val Ala Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Ile 225 230 235 240 Gln Trp Ser Lys Glu Pro Gln Asp Lys 245 <210> 81 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320 Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 325 330 335 Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 355 360 365 <210> 82 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 83 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 84 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 85 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 86 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 87 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 87 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 88 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Ser Asn Gly Lys Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 89 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 89 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 90 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 91 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 91 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 92 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 93 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 93 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 94 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 94 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 95 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Arg Arg Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Glu Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Phe 100 105 110 Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 96 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 96 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 97 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 98 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 99 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 100 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys 100 105 <210> 101 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 101 Ser Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 102 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H1 <400> 102 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 103 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-H3 <400> 103 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 104 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L1 <400> 104 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 105 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-L3 <400> 105 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 106 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD154 <400> 106 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro 1 5 10 15 Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser 20 25 30 Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu 35 40 45 Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu 50 55 60 Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg 85 90 95 Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys 100 105 110 Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser 130 135 140 His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 145 150 155 <210> 107 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 107 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ser Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 108 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 108 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 109 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH <400> 109 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 325

Claims (11)

  1. 지카(Zika) 바이러스에 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서,
    상기 항체가
    (a) (i) X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L인 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (ii) X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A인 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3, 및 (iii) X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R인 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2;
    (b) (i) X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M인 아미노산 서열 SX1YX2H(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R인 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L인 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3;
    (c) (i) X1은 N 또는 Y이고, X2는 I 또는 M인 아미노산 서열 SX1YX2H(서열번호 40)를 포함하는 HVR-H1, (ii) X1은 T 또는 R이고, X2는 A 또는 R인 아미노산 서열 VINPRGGSX1X2SAQKFQG(서열번호 41)를 포함하는 HVR-H2, (iii) X1은 R 또는 E이고, X2는 R 또는 F이고, X3은 G, D 또는 L인 아미노산 서열 GGX1ALFYDSYTTPX2DX3GSWWFDP(서열번호 42)를 포함하는 HVR-H3, (iv) X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q인 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1, (v) X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F인 아미노산 서열 DASX1LKX2(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A인 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3; 또는
    (d) (i) X1은 D 또는 E이고, X2는 K 또는 Q인 아미노산 서열 QASQX1IRX2YLN(서열번호 43)을 포함하는 HVR-L1, (ii) X1은 N 또는 E이고, X2는 T 또는 F인 아미노산 서열 DASX1LKX2(서열번호 44)를 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) X1은 D, S 또는 E이고, X2는 D 또는 A인 아미노산 서열 QQFX1X2LPIT(서열번호 45)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하고,
    (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체가 아닌,
    방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체가 (b)에 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    항체가 (d)에 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FR2, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 FR3, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 추가로 포함하는, 방법.
  4. (a) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나의 VL 서열을 포함하는 항체를 투여함을 포함하는, 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
  5. 지카 바이러스에 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서,
    상기 항체가 (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드가 모 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 상기 변이체 Fc 영역이 모 Fc 영역과 비교시 실질적으로 감소된 FcγR-결합 활성을 갖고 실질적으로 감소된 C1q-결합 활성을 갖지 않는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    변이체 Fc 영역이, EU 넘버링에 따라, 위치 234의 Ala, 위치 235의 Ala, 및 (a) 위치 267, 268 및 324; (b) 위치 236, 267, 268, 324 및 332; 및 (c) 위치 326 및 333 중 어느 하나의 추가의 아미노산 변경을 포함하는, 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    변이체 Fc 영역이, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 267의 Glu; (b) 위치 268의 Phe; (c) 위치 324의 Thr; (d) 위치 236의 Ala; (e) 위치 332의 Glu; (f) 위치 326의 Ala, Asp, Glu, Met 또는 Trp; 및 (g) 위치 333의 Ser로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 포함하는, 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변이체 Fc 영역이, EU 넘버링에 따라, (a) 위치 434의 Ala; (b) 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; (c) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 436의 Thr, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu; 및 (d) 위치 428의 Leu, 위치 434의 Ala, 위치 438의 Arg 및 위치 440의 Glu로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 서열번호 51 내지 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 SG182(서열번호 46), SG1095(서열번호 54) 및 SG1106(서열번호 59)으로 이루어진 군에서 선택된 인간 IgG1 CH 서열과 함께 3CH1047(서열번호 6) 및 3CH1049(서열번호 95)로 이루어진 군에서 선택된 VH 변이체 서열; 및 인간 CL 서열 SK1(서열번호 60)과 함께 3CL(서열번호 7) 및 3CL633(서열번호 98)으로 이루어진 군에서 선택된 VL 변이체 서열을 포함하는, 방법.
KR1020207029474A 2018-03-15 2019-03-15 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법 KR20200132938A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10201802164Y 2018-03-15
SG10201802164Y 2018-03-15
PCT/SG2019/050145 WO2019177543A1 (en) 2018-03-15 2019-03-15 Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200132938A true KR20200132938A (ko) 2020-11-25

Family

ID=67908433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207029474A KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2019-03-15 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11891432B2 (ko)
EP (1) EP3765494A4 (ko)
JP (1) JP2021518343A (ko)
KR (1) KR20200132938A (ko)
CN (2) CN116327926A (ko)
CA (1) CA3093729A1 (ko)
IL (1) IL277375A (ko)
MX (1) MX2020009296A (ko)
PH (1) PH12020551492A1 (ko)
SG (1) SG11202009010RA (ko)
TW (1) TWI827585B (ko)
WO (1) WO2019177543A1 (ko)
ZA (1) ZA202005662B (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3059246T3 (pl) 2007-09-26 2018-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Zmodyfikowany region stały przeciwciała
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
JP2023537553A (ja) * 2020-08-14 2023-09-04 中外製薬株式会社 ワンアームド抗原結合分子およびその使用
CN114410588B (zh) * 2022-01-29 2022-11-04 西安电子科技大学 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
WO2024036265A2 (en) * 2022-08-12 2024-02-15 Takeda Vaccines, Inc. Novel anti-denv3 antibodies

Family Cites Families (263)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5126250A (en) 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
TW205553B (ko) 1991-04-25 1993-05-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
TW416960B (en) 1994-07-13 2001-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reshaped human antibody to human interleukin-8
US6048972A (en) 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
CN1156460A (zh) 1994-07-13 1997-08-06 中外制药株式会社 抗人白细胞介素-8的重构人抗体
JP3865418B2 (ja) 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
CZ296979B6 (cs) 1994-10-21 2006-08-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Farmaceutický prípravek pro prevenci nebo lécení Castlemanovy nemoci
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
JP2001506967A (ja) 1996-08-02 2001-05-29 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法
US6025158A (en) 1997-02-21 2000-02-15 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CN1068524C (zh) 1997-06-23 2001-07-18 叶庆炜 一种治疗顽症牛皮癣的药物
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US20020187150A1 (en) 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
PT1074268E (pt) 1998-03-17 2008-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes profilácticos ou terapêuticos para doenças intestinais inflamatórias contendo anticorpos antagonistas do receptor il-6
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
AU2006225302B2 (en) 1999-03-25 2010-08-12 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
CA2395660A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2014-12-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG
JP4889187B2 (ja) 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
CA2440221C (en) 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
ATE471344T1 (de) 2001-04-13 2010-07-15 Biogen Idec Inc Antikörper gegen vla-1
KR20100018071A (ko) 2001-08-03 2010-02-16 글리카트 바이오테크놀로지 아게 항체 의존적 세포 독성이 증가된 항체 글리코실화 변이체
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
EP1495055B1 (en) 2002-04-18 2013-08-14 Genencor International, Inc. Production of functional antibodies in filamentous fungi
JP4468803B2 (ja) 2002-05-31 2010-05-26 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシーズ・アーベー 結合剤を基板表面にカップリングさせる方法
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
DE60334141D1 (de) 2002-10-15 2010-10-21 Facet Biotech Corp VERÄNDERUNG VON FcRn-BINDUNGSAFFINITÄTEN ODER VON SERUMHALBWERTSZEITEN VON ANTIKÖRPERN MITTELS MUTAGENESE
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2347241T3 (es) 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
AU2003299641C1 (en) 2002-12-16 2016-06-02 Cormorant Pharmaceuticals Ab Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
ATE553128T1 (de) 2002-12-24 2012-04-15 Rinat Neuroscience Corp Anti-ngf-antikörper und verfahren zu ihrer verwendung
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
WO2004113387A2 (en) 2003-06-24 2004-12-29 Merck Patent Gmbh Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity
CA2531482A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Centocor, Inc. Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
CA2545539A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
ES2697327T3 (es) 2003-11-06 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
US20050142133A1 (en) 2003-12-03 2005-06-30 Xencor, Inc. Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP2221315A1 (en) 2003-12-04 2010-08-25 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
JP2008504289A (ja) 2004-06-25 2008-02-14 メディミューン，インコーポレーテッド 部位特異的突然変異誘発による哺乳動物細胞における組換え抗体の産生の増加
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CN103351434B (zh) 2004-07-15 2015-09-30 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
BR122018016031B8 (pt) 2004-08-04 2021-07-27 Applied Molecular Evolution Inc processo para produzir um anticorpo monoclonal variante com resposta de adcc realçada
WO2006031370A2 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JP4948413B2 (ja) 2004-09-23 2012-06-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗体および結合体
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
EP1805320B1 (en) 2004-10-22 2014-09-03 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
AU2005302453A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Llc Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
US9200079B2 (en) 2004-11-12 2015-12-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AU2005321974B2 (en) 2004-12-27 2011-11-17 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Orally deliverable and anti-toxin antibodies and methods for making and using them
PT1699826E (pt) 2005-01-05 2009-06-17 F Star Biotech Forsch & Entw Domínios de imunoglobulina sintética com propriedades de ligação construídos em regiões da molécula diferentes das regiões determinantes de complementaridade
US8716451B2 (en) 2005-01-12 2014-05-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human IgG2 and IgG3 antibodies
US20060275282A1 (en) 2005-01-12 2006-12-07 Xencor, Inc. Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
MX2007013058A (es) 2005-04-20 2008-02-22 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales de alta afinidad completamente humanos para interleucina-8 y epitopes para dichos anticuerpos.
WO2006130834A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
US7557190B2 (en) 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
PT2573114T (pt) 2005-08-10 2016-07-13 Macrogenics Inc Identificação e manipulação de anticorpos com regiões fc variantes e métodos de utilização dos mesmos
JP2009510102A (ja) 2005-09-29 2009-03-12 ヴァイラル ロジック システムズ テクノロジー コーポレーション 免疫調節組成物およびその使用
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
CA2625998C (en) 2005-10-06 2015-12-01 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
BRPI0617378B8 (pt) 2005-10-14 2022-09-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Uso de um inibidor de il-6 para produzir uma composição farmacêutica para suprimir dano a um ilhota transplantada depois do transplante de ilhota; e aperfeiçoar a viabilidade de uma ilhota em um transplante de ilhota
KR101239051B1 (ko) 2005-10-21 2013-03-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 심장질환 치료제
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009525986A (ja) 2006-02-03 2009-07-16 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
CN103073639A (zh) 2006-03-17 2013-05-01 比奥根艾迪克Ma公司 稳定的多肽组合物
US8048421B2 (en) 2006-03-23 2011-11-01 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist antibody to human thrombopoietin receptor
AU2007245164A1 (en) 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
IN2014DN10515A (ko) 2006-03-31 2015-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2025346B1 (en) 2006-04-07 2016-08-10 Osaka University Muscle regeneration promoter
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
TW200817006A (en) 2006-06-23 2008-04-16 Smithkline Beecham Corp IL-8 receptor antagonist
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
WO2008022152A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd19
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
KR101456728B1 (ko) 2006-09-08 2014-10-31 메디뮨 엘엘씨 인간화 항-ｃｄ19 항체, 및 이것의 종양학, 이식 및 자가면역 질환의 치료에서의 용도
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
WO2008121160A2 (en) 2006-11-21 2008-10-09 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd5
CN100455598C (zh) 2006-11-29 2009-01-28 中国抗体制药有限公司 功能人源化抗人cd20抗体及其应用
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008091798A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized ca9 antibodies and methods of using the same
CA2669412A1 (en) 2007-01-23 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
WO2008098115A2 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
EP2144931A2 (en) 2007-04-04 2010-01-20 The Government Of The U.S.A, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Monoclonal antibodies against dengue and other viruses with deletion in fc region
CL2008001071A1 (es) 2007-04-17 2009-05-22 Smithkline Beecham Corp Metodo para obtener anticuerpo penta-especifico contra il-8/cxcl8, gro-alfa/cxcl1, gro-beta/cxcl2), gro-gama/cxcl3 y ena-78/cxcl5 humanas; anticuerpo penta-especifico; proceso de produccion del mismo; vector, hbridoma o celela que lo comprende; composicion farmceutica; uso para tratar copd, otras enfermedades.
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2176298B1 (en) 2007-05-30 2017-11-15 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
EP2155790A1 (en) 2007-05-31 2010-02-24 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
US20090074780A1 (en) 2007-06-25 2009-03-19 David Urech Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
WO2009000098A2 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Esbatech Ag Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies
US20110105724A1 (en) 2007-08-16 2011-05-05 Stephanie Jane Clegg Novel compounds
JP2010537985A (ja) 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド 抗ｉｇｆ−１ｒ抗体およびその使用
WO2009032782A2 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
US20100226925A1 (en) 2007-09-14 2010-09-09 Amgen Inc. Homogeneous Antibody Populations
CA2700701C (en) 2007-09-26 2020-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
PL3059246T3 (pl) 2007-09-26 2018-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Zmodyfikowany region stały przeciwciała
AR068564A1 (es) 2007-09-26 2009-11-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti- receptor de il-6 (interleuquina 6)
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
EP4098661A1 (en) 2007-12-26 2022-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
EP2250279B1 (en) 2008-02-08 2016-04-13 MedImmune, LLC Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity
SG189775A1 (en) 2008-04-11 2013-05-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
CA2736511C (en) 2008-09-17 2017-06-13 Xencor, Inc. Novel compositions and methods for treating ige-mediated disorders
WO2010043977A2 (en) 2008-10-13 2010-04-22 Institute For Research In Biomedicine Dengue virus neutralizing antibodies and uses thereof
KR102100066B1 (ko) 2008-10-14 2020-04-10 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
GB0914691D0 (en) 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
US20120315267A1 (en) 2010-02-09 2012-12-13 Glaxosmithkline Llc Novel uses
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
DK3029066T3 (da) 2010-07-29 2019-05-20 Xencor Inc Antistoffer med modificerede isoelektriske punkter
CN103328632A (zh) 2010-11-30 2013-09-25 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
KR101904232B1 (ko) 2010-12-14 2018-10-05 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 뎅기 바이러스 세로타입 1 e 프로틴에 특이적인 인간 단일클론 항체 및 그들의 용도
JP6043629B2 (ja) 2011-01-07 2016-12-14 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
SG192945A1 (en) 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
CN107011443B (zh) 2011-05-04 2021-04-30 奥默罗斯公司 用于抑制masp-2依赖的补体活化的组合物
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
KR102528622B1 (ko) 2011-09-30 2023-05-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존성 결합 분자 라이브러리
TW201726745A (zh) 2011-09-30 2017-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失的抗原結合分子
RU2739792C1 (ru) 2011-11-30 2020-12-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Содержащий лекарственное средство переносчик в клетку для формирования иммунного комплекса
WO2013089647A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Agency For Science, Technology And Research Binding molecules against dengue virus and uses thereof
JP6138108B2 (ja) 2012-02-24 2017-05-31 中外製薬株式会社 ＦｃγＲＩＩＢを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
BR112014024612A2 (pt) 2012-04-02 2021-06-08 Univ North Carolina Chapel Hill ácido nucleico, polipeptídeo, glicoproteína e quimérica, epítopo de vírus da dengue, partícula semelhante a flavivírus quimérico (vlp), flavivírus quimérico, e métodos in vitro para identificar um anticorpo neutralizante e para identificar uma composição imunogênica contra um vírus da dengue
US9605058B2 (en) 2012-05-01 2017-03-28 Glaxosmithkline Llc Antibodies against the CXC-ELR family of chemokines
US9556254B2 (en) 2012-05-14 2017-01-31 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Cross-reactive antibodies against dengue virus and uses thereof
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
EP3892638A1 (en) 2012-05-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
SG11201408646VA (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
AU2013299986B2 (en) 2012-08-07 2018-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Anti-dengue virus antibodies and uses thereof
DK2889377T3 (da) 2012-08-24 2020-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc?RIIb-Specifik Fc-regionsvariant
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN105051064A (zh) 2013-01-24 2015-11-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 抗TNF-α抗原结合蛋白
LT2951203T (lt) 2013-03-15 2019-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeriniai baltymai
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20160031985A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Katherine S. Bowdish Charge-engineered antibodies or compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
AU2014267171A1 (en) 2013-05-17 2015-12-10 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Anti-CXCL1, CXCL7 and CXCL8 antibodies and their applications
ES2736326T3 (es) 2013-05-31 2019-12-27 Zymeworks Inc Heteromultímeros con función efectora reducida o silenciada
SG11201604719WA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Univ Pennsylvania Dna antibody constructs and method of using same
EP3104888A4 (en) 2014-02-11 2017-08-09 Massachusetts Institute Of Technology Novel full spectrum anti-dengue antibody
CA3212977A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 Visterra, Inc. Antibody molecules to dengue virus and uses thereof
GB201413086D0 (en) 2014-07-23 2014-09-03 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
CR20170326A (es) 2014-12-19 2017-08-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes, y métodos de uso
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
AU2016219511B2 (en) 2015-02-09 2020-11-12 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation
SG11201707592TA (en) * 2015-03-17 2017-10-30 Agency Science Tech & Res A serotype cross-reactive, dengue neutralizing antibody and uses thereof
US10940126B2 (en) 2015-07-03 2021-03-09 Camilla Svensson Inhibition of IL-8 in the treatment of pain and/or bone loss
MX2018003005A (es) 2015-09-18 2018-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos.
GB201610162D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
CN107586336A (zh) * 2016-07-09 2018-01-16 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单克隆抗体及应用
TW201815821A (zh) * 2016-07-18 2018-05-01 美商再生元醫藥公司 抗茲卡病毒抗體及使用方法
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
CN110172095B (zh) * 2016-08-10 2020-09-04 中国科学院微生物研究所 一种高中和活性的寨卡病毒人源单克隆抗体及其应用
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202009010RA (en) 2020-10-29
CA3093729A1 (en) 2019-09-19
TWI827585B (zh) 2024-01-01
CN112119090B (zh) 2023-01-13
ZA202005662B (en) 2021-08-25
CN112119090A (zh) 2020-12-22
RU2020133003A (ru) 2022-04-15
PH12020551492A1 (en) 2021-09-01
MX2020009296A (es) 2020-11-13
EP3765494A4 (en) 2022-03-23
JP2021518343A (ja) 2021-08-02
US11891432B2 (en) 2024-02-06
CN116327926A (zh) 2023-06-27
TW202003557A (zh) 2020-01-16
IL277375A (en) 2020-11-30
EP3765494A1 (en) 2021-01-20
WO2019177543A1 (en) 2019-09-19
US20210017256A1 (en) 2021-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7390336B2 (ja) 抗デングウイルス抗体、変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチド、およびその使用方法
US11891432B2 (en) Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to Zika virus and methods of use
US20170320937A1 (en) Anti-influenza b virus hemagglutinin antibodies and methods of use
RU2811697C2 (ru) Антитела к вирусу денге, обладающие перекрестной реактивностью с вирусом зика
RU2757135C2 (ru) Композиции антител к вич и способы их применения
WO2022139680A1 (en) Sars-cov-2 binding molecules and uses thereof