MX2007013058A

MX2007013058A - Anticuerpos monoclonales de alta afinidad completamente humanos para interleucina-8 y epitopes para dichos anticuerpos.

Info

Publication number: MX2007013058A
Application number: MX2007013058A
Authority: MX
Inventors: Jaspal S Kang; Orit Foord; Palaniswami Rathanaswami; John Babcook
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2006-04-18
Publication date: 2008-02-22
Also published as: JP2008536517A; US20090130110A1; US20140105905A1; WO2006113643A2; WO2006113643A3; EP1874820A2; AU2006236417A1; US8604174B2; JP4909988B2; EP1874820A4; CA2605964A1; AU2006236417B2

Abstract

Las presentes modalidades estan relacionadas con anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra IL-8, a metodos para elaborar y caracterizar dichos anticuerpos y a usos de dichos anticuerpos. Se proveen secuencias de polinucleotido aisladas que codifican para, y secuencias de aminoacido que comprenden, moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada, en particular secuencias que corresponden a secuencias de cadena ligera y pesada contiguas que abarcan regiones de marco (FR) y/o regiones determinantes de complementariedad (CDR).

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ALTA AFINIDAD COMPLETAMENTE HUMANOS PARA INTERLEUCINA-8 Y EPITOPES PARA DICHOS ANTICUERPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en términos generales a anticuerpos novedosos para interleucina-8 (IL-8). De manera más específica, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos con alta afinidad hacia interleucina-8 y epítopes que son ligados por dichos anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Interleucina-8 (IL-8) es un miembro de la familia de quimiocina C-X-C y actúa como el quimioatrayente primario para neutrófilos. IL-8 está implicada en muchas enfermedades inflamatorias. Aunque el reclutamiento y activación de neutrófilos son importantes en la respuesta normal de inflamación, el reclutamiento excesivo o continuo de neutrófilos con frecuencia conduce a inflamación aguda (Matsumoto et al., J. Leukoc . Biol . , 62(5):581-7 (1997)). Además, IL-8 es un factor angiogénico potente para lasi células endoteliales y ha sido implicada en angiogénesis de tumor. Se han desarrollado y utilizado anticuerpos anti-IL-8 para tratar neumonía bacteriana (patente E.U.A. No. 5,686,070), asma (patente E.U.A. No. 5,874,080), y colitis ulcerante (patente E.U.A. No. 5,707,622). Además, los anticuerpos anti-IL-8 han sido propuestos para el tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , la cual es ' una de las condiciones crónicas más comunes y la cuarta causa importante de fallecimientos en los Estados Unidos de ' Norteamérica. COPD incluye varios trastornos relacionados que | I restringen la capacidad del paciente para expulsar aire. Por consiguiente, los pacientes con frecuencia experimentan disnea, o acortamiento del aliento. La disnea típicamente ocasiona malestar en el paciente, limita la capacidad del paciente para participar en actividades física, y puede I inducir también efectos adversos a la salud debido a un suministro disminuido de oxígeno. Los dos trastornos más comunes asociados con COPD son bronquitis crónica y enfisema, aunque los pacientes que padecen de COPD también presentar asma crónica, bronquiectasia, deficiencia de1 inmunoglobulina, y fibrosis quística. Recientemente, se ha sugerido que IL-8 puede ser un objetivo novedoso para el tratamiento de enfermedades que1 involucran inflamación aguda, tal como enfermedades gastrointestinales (Ajuebor et al., Immunology, 105(2): 137- 43 (2002)) . IL-8 también puede ser un objetivo para el tratamiento de cáncer y tumores, tales como melanoma (Singh et al., Histol . Histopa thol , 15(3): 843-9 (2000) y síndrome inflamatorio sistémico (SIRS) (Dinarello et al., JAMA, 269(14) :1829-35 (1993) ) . Otras enfermedades asociadas con IL-8 incluyen ' I enfermedades inflamatorias (Matsumoto et al., J. Leukoc . Biol . , 62(5): 581-7 (1997)) tal como ARDS, glomerulonefritis, hepatitis alcohólica, daño por reperfusión, psoriasis (J?ang¡ 1 et al., In t J Derma tol , 40 (11) : 699-703 (2001)), artritis > reumatoide (Kraan et al., J Invest Derma tol , 116 (2) : 319-29 (2001)), y enfermedad inflamatoria del intestino (Imada et al., Scand J Gastroenterol , 36(8): 854-64 (2001)), trastornos pulmonares, tales como fibrosis pulmonar idiopática (Lynch et al., Am Rev Respir Dis . , 145(6): 1433-9 (1992)), progreso de tumor (Xie et al., Cytokine Growth Factor Rev. , 12(4): 375-91 (2001) ) y cáncer y tumores en general, tales como melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tejido mamario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro. ABX-IL-8, un anticuerpo monoclonal completamente humano generado con tecnología XenoMouse®, ha demostrado1 bloquear la actividad de interleucina-8 (Conferencia de Prensa ress Reléase, Abgenix, Inc., 3 de enero de 2002). ABX-IL-8 ha demostrado tener actividad anti-inflamatoria potente.

ABX-IL-8 se une con alta afinidad a IL-8, bloquea la unión de IL-8 a los neutrófilos, e inhibe la activación y migración de neutrófilos (Yang et al., J. Leukoc . Biol . , 66 (3) : 01-410 (1999) ) . Las descripciones adicionales de anticuerpos humanos para IL-8 y los métodos para elaborarlos se pueden encontrar en la patente E.U.A. No. 6,150,584 (Kucherlapati et al.) y patente E.U.A. No. 6,713,610 (Kucherlapati et al.), incorporadas para referencia en sus totalidades. Serían deseables anticuerpos de alta afinidad contra IL-8. Sin embargo, se ha propuesto que bajo condiciones fisiológicas, existe un límite en cuanto a la maduración de afinidad de anticuerpo in vivo para cualquier antígeno y que este límite es de alrededor de 100 pM. (Véase en general, Foote, J. y Eisen, H.N., PNAS USA, 92:1254-6 (1995); Batista, F.D. y Neuberger, M.S., Immuni ty, 8:751-9 (1998); y Watts, C. y Davidson, H.W., EMBO J. , 7:1937-45 (1998) ) . Asimismo, incluso los anticuerpos optimizados, tales como aquellos que han sido madurados en cuanto a afinidad in vi tro mediante despliegue en fago, levadura, o ribosoma, parecen tener afinidades que están limitadas a más de 10 pM. (Véase, "Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8, " Rathanaswami et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1004-13 (2005) , incorporada en su totalidad para referencia) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto la presente invención se refiere a anticuerpos de alta afinidad para IL-8. Los anticuerpos de preferencia tienen una Kd para IL-8 menor de 10 pM, más preferido menor de 1 pM, incluso más preferido menor de 100 fM y más preferido aún menor de 10 fM. Los anticuerpos de preferencia son anticuerpos monoclonales humanos y se pueden unir a un epítope con configuración o a un epítope lineal. En modalidades preferidas, los anticuerpos neutralizan por lo menos una actividad biológica de IL-8, tal como la capacidad de unirse al receptor de IL-8. En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a un péptido, en el cual el péptido es ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) . En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a un péptido, en el cual el péptido es ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) . En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a un péptido, en el cual el péptido es LRCQCIKTYSKPFHPKFIKE (SEQ ID NO: 62) o ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) . En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-8, en el cual dicho anticuerpo anti-IL-8 se une a un péptido que tiene la secuencia contigua ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) . En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-8, en el cual dicho anticuerpo anti-IL-8 se une a un péptido, en el cual dicho péptido es ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) . En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-8, en el cual dicho anticuerpo anti-IL-8 se une a IL-8 con una Kd menor de aproximadamente 10 pM. En algunos aspectos, la presente invención se refiere a una composición terapéutica que comprende un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con un epítope de IL-8, en el cual dicho epítope de IL-8 son los aminoácidos ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79), en el cual dicho anticuerpo previene la inflamación, y en el cual el anticuerpo tiene una Kd que es menor de aproximadamente 10 pM. En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un uso de un anticuerpo monoclonal contra IL-8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-8, en el cual el trastorno relacionado con IL-8 se selecciona a partir del grupo que consiste de: melanoma maligno de IL-8, trastornos pulmonares, una condición inflamatoria; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino, y en el cual el anticuerpo monoclonal humano tiene una Kd para IL-8 que es menor de aproximadamente 10 pM. En algunos aspectos, la presente invención se refiere a un uso del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se describe en la presente descripción, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-8, en el cual el trastorno relacionado con IL-8 se selecciona a partir del grupo que consiste de: melanoma maligno de IL-8, trastornos pulmonares, una condición inflamatoria; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino. En otro aspecto la invención se refiere a un anticuerpo que se selecciona a partir del grupo que consiste de los anticuerpos número, descritos más adelante, 33, 142, 203, 215, 469, 809, 837, 861, 928, 1064, 1080 y 1093. En modalidades particulares un anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de los anticuerpos número 809, 837, 861, 928, y 1064.

En algunas modalidades el anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad comprende una secuencia de aminoácido de la ¡ I región variable de cadena pesada que comprende una secuencia | de aminoácido que es por lo menos 90%, más preferido por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90%, más preferido por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 1. , En otras modalidades los anticuerpos comprenden regiones ! variables de cadena pesada y cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácido que son por lo menos 90%, más preferido por lo menos 95% idénticas a SEQ ID NOs: 7 y 5, 11 y 9, 15 y 13, 19 y 17, 23 y 21, 27 y 25, 31 y 29, 35 y 33, 39 y 37, 43 y 41, y 47 y 45, respectivamente. En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo de alta afinidad para IL-8 comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, y 47. La región variable de la cadena ligera de preferencia comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, y 45. En otras modalidades los anticuerpos anti-IL-8 de alta afinidad comprenden regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que son codificadas por ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que son por lo menos 90%, más preferido por lo menos 95% idénticas a SEQ ID NOs: 4 y 2, 8 y 6, 12 y 10, 16 y 14, 20 y 18, 24 y 22, 28 y 26, 32 y 30, , 36 y 34, 40 y 38, 44 y 42, y 48 y 46, respectivamente. En modalidades particulares, se provee un anticuerpo que se une específicamente a IL-8 que comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 35, más preferido por lo menos 95% idéntica. El anticuerpo de preferencia comprende] una cadena ligera que es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID i i NO: 33, más preferido por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: ' 33. En una modalidad, el anticuerpo de preferencia es el anticuerpo número 928. En otra modalidad particular, un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a IL-8 con alta afinidad comprende una secuencia de aminoácido de cadena ¡ pesada que comprende los residuos de aminoácido 1-66 de SEQ ! ID NO: 35 y a secuencia de aminoácido de cadena ligera que1 comprende SEQ ID NO: 33. El anticuerpo de preferencia tiene una afinidad mayor de 1 pM. También se proveen anticuerpos que específicamente, I se unen a IL-8 con alta afinidad, en los cuales la secuencia' de aminoácido de cadena pesada comprende una secuencia de CDRl, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3, la secuencia de CDRl se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 26-35 de SEQ ID NO: 7, 11, 19, 15, 23, 35, 39, 31, 47, 3, 27, y 43; la secuencia de CDR2 se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO: 7, 11, 19, 15, 23, 35, y 39 y los residuos de aminoácido 50-65 de SEQ ID NO: 31, 47, 3, 27, o 43; y la secuencia de CDR3 se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 99-113 de SEQ ID NO: 7 y 11, residuos de aminoácido 99-112 de SEQ ID NO: 19, residuos de aminoácido 99-106 de SEQ ID NO: 15, 23, 35, y 39, y los residuos de aminoácido 98-106 de SEQ ID NO: 31, 47, 3, 27, o 43. En otras modalidades se proveen anticuerpos que específicamente se unen a IL-8 con alta afinidad, en los cuales la secuencia de aminoácido de cadena ligera comprende una secuencia de CDRl, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3, la secuencia de CDRl se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 24-34 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, y 17, y los residuos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, y 45; la secuencia de CDR2 se selecciona de manera independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 50-56 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, y 17, y los residuos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, y 45; y la secuencia de CDR3 se selecciona de manera 11 independiente a partir del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 89-97 de SEQ ID NO: 5, 29, y 17, residuos de aminoácido 89-98 de SEQ ID NO: 9, residuos de aminoácido 89-96 de SEQ ID NO: 13, 21, 33, y 37, residuos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO: 1, 25, y 41, y los residuos de aminoácido 95-102 de SEQ ID NO: 45. En una modalidad, el anticuerpo de preferencia tiene una afinidad de unión para IL-8 de por lo menos aproximadamente 10 pM. En una modalidad particular, un anticuerpo monoclonal que específicamente se une a IL-8 con alta afinidad comprende una secuencia de CDRl, una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 de cadena ligera, que comprende los residuos de aminoácido 24-34, 50-56 y 89-96 de SEQ ID NO: 33. En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo que se une al mismo epítope en IL-8 que un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 33. En otro aspecto la invención provee una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades el anticuerpo puede estar ligado a un radioisótopo o toxina. En otro aspecto, la invención provee un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad. El paciente de preferencia es un paciente mamífero, más preferido un paciente humano. En una modalidad el paciente padece de un trastorno inflamatorio. En otras modalidades la enfermedad a ser tratada es un cáncer, tal como melanoma maligno. En modalidades particulares, se utilizan uno o más anticuerpos anti-IL-8 de alta afinidad para tratar una enfermedad o trastorno que se selecciona a partir del grupo que consiste de neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, y fibrosis quística. Otras modalidades proveen un sistema para la detección de IL-8 en tejidos, fluidos o células de mamífero. La prueba se puede utilizar para someter a los pacientes a tamizaje para una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de IL-8, tal como neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, fibrosis quística, u otras enfermedades asociadas con cambios en los niveles y/o actividad de IL-8. El sistema de preferencia comprende un paquete que contiene, en una cantidad suficiente para efectuar por lo menos una prueba, una composición que contiene un anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad. Esta composición de anticuerpo puede estar, por ejemplo, en solución líquida o unida a una matriz de fase sólida. El sistema también contiene una marca detectable para indicar la presencia de moléculas de anticuerpo en cualesquiera productos de inmuno-reacción formados después de poner en contacto una muestra proveniente de un paciente con la composición de anticuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se entenderá mejor a partir de la descripción detallada y a partir de las figuras anexas, las cuales pretenden ilustrar y no limitar la invención, y en las cuales : La figura ÍA es un listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura IB es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos particulares dirigidos, contra IL-8. La figura 1C es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura 2A es un listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada que codifican para anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura 2B es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada que codifican para anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura 2C es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada que codifican para anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura 2D es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada que codifican para anticuerpos particulares dirigidos contra IL-8. La figura 2E es una continuación del listado de secuencias de ejemplos de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada que codifican para anticuerpos dirigidos contra IL-8. La figura 3 es una gráfica que muestra la distribución de las Kd para varios experimentos que examinan la afinidad de mAb 928 hacia IL-8. La figura 4A es una alineación de las secuencias de aminoácido de la cadena pesada de varios anticuerpos anti-IL-8. La figura 4B es una alineación de las secuencias de aminoácido de la cadena ligera de varios anticuerpos anti-IL-8. La figura 5 muestra la alineación de fago filamentoso que despliega péptidos con un epítope de IL-8 y la secuencia de consenso entre dichos péptidos. La figura 6 muestra el análisis de espectrometría de masas de fragmentos de IL-8 que se unen específicamente a anticuerpos ABXha-IL-8, inmovilizados en chips PS2. La figura 7 muestra un gel que indica una falta de unión de los anticuerpos ABXha-IL-8 al antígeno de IL-8 que tiene una mutación en la prolina en la posición de aminoácido 16. La figura 8 representa varios péptidos de IL-8 e identifica los péptidos que se unen a ABXha-IL-8 y ABX-IL-8. La figura 9 muestra secuencias que son ligadas por ABXha-IL-8 809, pero no por ABX-IL-8. La figura 10 muestra secuencias que son ligadas por ABXha-IL-8928, pero no por ABX-IL-8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las mejoras en la afinidad del mAb pueden proveer mejoras en cuanto a potencia. Por lo tanto, sería deseable identificar anticuerpos que reconozcan a IL-8 con alta afinidad (una "Kd" baja) . En la presente invención se describe la creación de dichos anticuerpos. En algunas modalidades, la unión de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos evita la interacción de IL-8 con otras moléculas, tales como el receptor de IL-8, y de esta manera reduce la actividad biológica de IL-8. Como resultado, los anticuerpos se pueden utilizar para tratar enfermedades o trastornos relacionados con la actividad de IL-8. Estos también se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar cambios en los niveles de IL-8 en un individuo y de esta manera se pueden utilizar para diagnosticar trastornos asociados con dichos cambios. En algunas modalidades, los anticuerpos de interés son aquellos que se pueden unir a IL-8 con una Kd menor de 10 pM, de preferencia menor de 1 pM, y más preferido menor de 500 fM. Estos anticuerpos pueden tener una afinidad especialmente alta para IL-8. Las enfermedades que involucran a IL-8 que se pueden tratar y/o diagnosticar con los anticuerpos de alta afinidad para IL-8 descritos en la presente invención incluyen, sin limitación, neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, psoriasis y fibrosis quística. En asociación con dicha diagnosis y/o tratamiento, también se proveen artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos anti-IL-8 descritos en la presente invención. También se identifican los epítopes particulares de IL-8 ligados por los anticuerpos. Por ejemplo, el epítope que comprende la secuencia de aminoácido LRCQCIKTYSKPFHPKFIKE (SEQ ID NO: 62), así como subpartes de la misma, son reconocidas por algunos de los anticuerpos contra IL-8 descritos más adelante. Se pueden crear anticuerpos adicionales que estén dirigidos contra estos epítopes yj utilizar para diagnosticar y tratar enfermedades y trastornos' asociados con IL-8. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo de interés se une a IL-8 a través de uno de los fragmentos de péptido descritos o "fragmentos antigénicos", por ejemplo, LRCQCIKTYSKPFHPKFIKE (SEQ ID NO: 62), KPXPXF (SEQ ID NO: 63), y/o KPFHPKF (SEQ ID NO: 64). En algunas modalidades, los anticuerpos que se unen a uno o más de estos fragmentos también tienen una afinidad elevada hacia IL-8.

Estos anticuerpos pueden tener una Kd que sea menor de 10 pM, 1 pM, 0.5 pM, y 0.1 pM.

I Definiciones i A menos que se defina de otra manera, los términos, científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención deberán tener los significados comúnmente entendidos por los expertos en la técnica. Además, a menos que sea requerido de otra manera por el contexto, los términos en singular deberán incluir las formas en plural y los términos en plural deben incluir las formas en singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y de tejido, biología molecular, y química e hibridación de proteína y oligonucleótido o polinucleótido descritas en la presente invención son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis de oligonucleótido de ADN recombinante, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de conformidad con las especificaciones del fabricante o en la forma en que comúnmente se efectúan en el campo o como se describe en la, presente invención. Véase por ejemplo Singleton et al , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química de síntesis orgánica, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente invención son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación, formulación, y suministro farmacéutico, y tratamiento de pacientes. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "IL-8", e "IL8" se refieren a interleucina-8 de humano, la cual se conoce también en la técnica cómo proteína activadora de neutrófilos, factor quimiotáctico de neutrófilo1 (NCF) y factor quimiotáctico de célula T. El término "anticuerpo ABX-IL-8" se refiere a un anticuerpo anti-IL-8 particular de humano desarrollado por Abgenix, Inc. de Fremont, California. En particular, es el anticuerpo monoclonal completamente humano generado con tecnología XenoMouse®, discutido en una conferencia de prensa de Abgenix, Inc., el 3 de enero de 2002, y también discutido en Yang et al, J. Leukoc . Biol . , 66 (3) : 401-410 (1999). "Anticuerpo ABXha-IL-8" se refiere a un anticuerpo anti-IL-8 de "alta afinidad", el cual se describe en la presente invención. El término "epítope de ABXha-IL-8" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un epítope en el antígeno de IL-8 que puede unirse específicamente al anticuerpo ABXha-IL-8. El "epítope de ABXha-IL-8" de preferencia comprende la prolina en la posición de aminoácido 16 de IL-8, más preferido la secuencia de aminoácido KPXPXF (SEQ ID NO: 63) la cual corresponde a los residuos de aminoácido 15 a 21 de IL-8 y de manera más preferida la secuencia de aminoácido "LRCQCIKTYSKPFHPKFIKE" (SEQ ID NO: 62) . El epítope puede ser lineal o puede tener configuración. Como se indica más adelante los epítopes adicionales también son relevantes. Tal como se utiliza en la presente invención, un anticuerpo de "alta afinidad" es un anticuerpo con una Kd para IL-8 menor de 100 pM, incluso más preferido menor de 10 pM, incluso más preferido aún menor de 1 pM, incluso más preferido menor de 100 fM y todavía más preferido menor de 10 fM. Muchos de los anticuerpos particulares descritos en la presente invención poseen alta afinidad hacia IL-8. Por ejemplo, el anticuerpo 809 tiene una Kd de aproximadamente 2.23 pM, el anticuerpo 837 tiene una Kd de aproximadamente 10.9 pM, el anticuerpo 861 tiene una Kd de aproximadamente 2.89 pM y el anticuerpo 928 tiene una K de aproximadamente 0.06 pM. Estos son anticuerpos de alta afinidad que no han experimentado maduración de afinidad. Un anticuerpo con una "Kd baja" es aquel que se une con afinidad elevada a un antígeno. "Reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la cual se amplifican cantidades diminutas de una pieza específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe, por ejemplo, en la patente E.U.A. No. 4,683,195. Se pueden diseñar iniciadores de oligonucleótido; estos iniciadores son idénticos o similares en cuanto a secuencia a una porción de las cadenas opuestas de la plantilla que será amplificada. Los nucleótidos 5' -terminales de los dos iniciadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófago o plásmido, etc. Véase en general Mullís et al . , Cold Spring Harbor Symp . Quan t . Biol . 51:263 (1987); Erlich, ed. , PCR Technology (Stockton Pres, NY, 1989) . Tal como se utiliza en la presente invención, PCR es considerada como un ejemplo, pero no el único, de un método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como un iniciador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una pieza específica de ácido nucleico. "Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos exhiben especificidad de unión hacia un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas tipo anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático a y a niveles incrementados por los mielomas. "Anticuerpos e inmunoglobulinas originales" normalmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, constituidas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un puente de disulfuro covalente, aunque el número de puentes de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intra-cadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada (Chothia et al., J. Mol . Biol . 186:651 (1985; Novotny y Haber, Proc . Na ti .

Acad. Sci . U. S . A. 82:4592 (1985); Chothia et al., Na ture 342:877-883 (1989)). El término "anticuerpo" se utiliza en la presente invención en el sentido más amplio y abarca, sin limitación, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multi-específicos {por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpo incluyendo Fab y F(ab)'2, en tanto que estos presenten la actividad biológica deseada y variantes de secuencia de anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) provenientes de cualquier especie invertebrada se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados K y ?, tomando como base las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes. Los fragmentos de unión de un anticuerpo se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante corte enzimático o químico de anticuerpos intactos.* Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena individual. Se entiende que un anticuerpo diferente de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contra-receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contra-receptor en por lo menos 20%, 40%, 60% u 80% aproximadamente, y de manera más común mayor de aproximadamente 85% (según se mide en una prueba de unión competitiva in vi tro) . Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a "clases" diferentes. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir también . en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan OÍ, d, e, y, y µ, respectivamente. Son bien conocidas las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas . El término "mAb" se refiere a un anticuerpo monoclonal. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituye una población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren en forma natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo sitio antigénico. Asimismo, en contraste con los preparados de anticuerpo policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopes) diferentes, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el ' antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son convenientes en el sentido que estos se pueden sintetizar sin que estén contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe considerar que se requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que serán utilizados de conformidad con la presente invención se pueden elaborar utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al , Na ture, 256:495 (1975), o se pueden elaborar utilizando métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente E.U.A No. 4,816,567 y patente E.U.A No. 5,627,052). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar a partir de genotecas de anticuerpo de fagos, por ejemplo mediante el uso de las técnicas descritas en Clackson et al , Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) . Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purifica (1) hasta más de 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry, y la secuencia terminal o interna de aminoácido mediante el uso de un determinador de secuencia de recipiente giratorio, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, de preferencia, tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del entorno natural del anticuerpo no está presente. Por lo general, sin embargo, el anticuerpo aislado se prepara utilizando por lo menos un paso de purificación. Un "anticuerpo neutralizante" es una molécula de anticuerpo que puede eliminar o reducir en forma significativa una actividad biológica de un antígeno objetivo al cual éste se une. Por consiguiente, un anticuerpo contra IL-8 "neutralizante" puede eliminar o reducir en forma significativa una actividad de IL-8. Por ejemplo, un anticuerpo contra IL-8 neutralizante puede reducir o eliminar la unión al receptor de IL-8. En otro ejemplo, un anticuerpo contra IL-8 neutralizante puede reducir o evitar la quimiotaxis mediante unión a IL-8 y depuración de IL-8 desde un sitio de inflamación. "Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por célula en la cual células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc de Ig (FcRs) {por ejemplo células asesinas naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, únicamente expresan Fc?RIII, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII. La expresión de los FcR en células hematopoyéticas se presenta en forma resumida en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede efectuar una prueba de ADCC in vi tro, tal como la descrita en la patente E.U.A No. 5,500,362, o 5,821,337. Las células efectoras útiles para dichas pruebas incluyen células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . De manera alternativa, o adicional, se puede evaluar in vivo la actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al . PNAS (USA) 95:652-656 (1988). El término "variable" se refiere al hecho que algunas porciones de los dominios variables difieren exhaustivamente en cuanto a secuencia entre anticuerpos y son utilizadas en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida de manera uniforme a través de todos los dominios variables de los anticuerpos. Esta está concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera de Ig. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el bastidor (framework) (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera originales comprenden cada una cuatro regiones de FR, y la mayor parte de las mismas adopta una configuración de lámina ß, conectadas por tres CDRs, las cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana mediante las regiones de FR y, con las CDRs provenientes de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. (1991). Los dominios constantes no están involucrados directamente en la> unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La digestión de anticuerpos con la enzima papaína da como resultado dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, conocidos también como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc", que no tiene actividad de unión a antígeno pero tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima pepsina da como resultado el fragmento F(ab')2 en el cual los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen ligados y comprenden dos sitios de unión a antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de entrelazar al antígeno. "Fab" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. "Fv" cuando se utiliza en la presente invención se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene sitios tanto de reconocimiento de antígeno como de unión a antígeno. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar ligados covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo tal que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que la del sitio de unión entero. El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo los cuales son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable por lo general comprende residuos de aminoácido provenientes de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" {por ejemplo los' residuos 24-34 (Ll) , 50-62 (L2), y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-55 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological In terest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos provenientes de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91- 96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 ((Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). Los residuos de la "región de bastidor" o "residuos de FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se describe en la presente invención. "Regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs" son partes de receptores inmunológicos, tales como anticuerpos, que hacen contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. Las CDRs de receptores inmunológicos son la parte más variable de la proteína del receptor, dando a los receptores su diversidad, y son portados en seis bucles en el extremo distal de los dominios variables del receptor, tres bucles provienen de cada uno de los dos dominios variables del receptor. El término "epítope" se utiliza para hacer referencia a los sitios de unión para los receptores inmunológicos, en particular anticuerpos, en antígenos proteínicos. Los determinantes epitópicos normalmente consisten de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activos tales como cadenas laterales de aminoácido o azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga. Se dice que un anticuerpo es específico, se une específicamente, se une en forma preferente o términos similares, cuando su capacidad para unirse al objetivo específico o preferente es mayor que su capacidad para unirse a otra molécula. El término "fragmento antigénico" indica un fragmento de proteína, en este caso un fragmento de proteína IL-8, de 8 a 20 aminoácidos de longitud, más preferido 10 a 16 aminoácidos y de manera más preferida 12 aminoácidos. Los fragmentos antigénicos descritos en la presente invención pueden ser especialmente útiles para desarrollar anticuerpos, con KDS hacia IL-8 muy pequeñas. El término "aminoácido" o "residuo de aminoácido", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a L-aminoácidos o a D-aminoácidos presentes normalmente en la Naturaleza como se describe más adelante con respecto a las variantes. En la presente invención se utilizan las abreviaturas de una y de tres letras comúnmente utilizadas para aminoácidos (Bruce Alberts et al . , Molecular Biology of the Cell , Garland Publishing, Inc., New York (3a ed. 1994)). El término "XENOMAX®" se refiere al uso del "Método de Anticuerpo de Linfocito Seleccionado" (Babcook et al., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, Í93 : 7843-7848 (1996) y que se discute más adelante en los ejemplos), cuando se utiliza en conjunto con animales de tipo XENOMOUSE®. La creación de las1 primeras cepas de ratón XenoMouse se describe en Green et al., (Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las cepas XenoMouse se manipulan genéticamente con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contienen fragmentos de configuración de' línea germinal con tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada de humano y del locus de cadena ligera kappa, respectivamente, los cuales contienen secuencias centrales de la región constante y la región variable. Id. Los YACs que contienen Ig de humano demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para la transposición como para la expresión de anticuerpos y son capaces de sustituir los genes ¡ de Ig de ratón inactivados. Esto queda demostrado por su capacidad para inducir el desarrollo de célula B, para: producir un repertorio humano de anticuerpos completamente humanos tipo adulto, y para generar mAbs de humano específicos de antígeno. Estos resultados también sugieren que la introducción de porciones más grandes del loci de Ig de humano que contienen números más grandes de genes V, elementos reguladores adicionales, y regiones constantes de Ig de humano podría recapitular el repertorio sustancialmente completo que es característico de la respuesta humoral humana' hacia la infección e inmunización. El trabajo de Green et al. recientemente se extendió a la introducción de más del 80% aproximadamente del repertorio de anticuerpo de humano a, través de la introducción de fragmentos de YAC de configuración de línea germinal con tamaño de megabases del loci de cadena pesada y del loci de cadena ligera kappa de humano, respectivamente. (Véase Méndez et al. Nature Genetics1 15:146-156 (1997) y solicitud de patente E.U.A. No. de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre 3, 1996, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia) . La producción del ratón XenoMouse se discute y delinea también en las solicitudes de patente E.U.A. Nos. de serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de Julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, presentada 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, y 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, las patentes E.U.A Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Véase también Méndez et al. Na ture Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp . Med. 188:483-495 (1998). Véase también patente europea No., EP 0 463 151 Bl, otorgamiento publicado el 12 de junio de 1996, solicitud internacional de patente No., WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, solicitud internacional de patente No. WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, WO 03/47336. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes, y referencias antes citadas quedan incorporadas en la presente invención para referencia en su totalidad. El término "SC" se refiere a célula individual y un anticuerpo particular derivado de XENOMAX® puede ser referido como SC seguido por tres dígitos, o sólo tres dígitos, que se refieren al número de célula individual a partir del cual se obtiene el anticuerpo en la presente invención. El término "SLAM®" se refiere al "Método de Anticuerpo de Linfocito Seleccionado" (Babcook et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, i93 : 7843-7848 (1996), y Schrader, patente E.U.A No. 5,627,052), de las cuales ambas se incorporan para referencia en sus totalidades. SLAM se describe con mayor detalle más adelante. En breve, SLAM es una estrategia para la creación de anticuerpos monoclonales basada en la clonación molecular y expresión de moléculas de ADNc de la región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales que se seleccionan para la producción de anticuerpos específicos. Las células individuales se pueden seleccionar utilizando una prueba de placa hemolítica específica de antígeno. Después, se rescatan las moléculas de ADNc de la región variable de cadena pesada y cadena ligera a partir de las células individuales mediante PCR-transcriptasa inversa y se expresan en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina de humano. Estos anticuerpos monoclonales recombinantes reproducen las especificidades de objetivo de las células formadoras de anticuerpo originales. El término "estado patológico" se refiere a un estado fisiológico de una célula o de un mamífero completo en el cual ha ocurrido una interrupción, cese, o trastorno de las funciones celulares o corporales, sistemas, u órganos. El término "síntoma" significa cualquier manifestación física u observable de un trastorno, ya sea que éste sea o no generalmente característico de dicho trastorno. El término "síntomas" puede significar todas las manifestaciones o cualquier subconjunto de las mismas. "Inflamación" tal como se utiliza en la presente invención es un término general para la acumulación local de fluido, proteínas plasmáticas, y leucocitos que es iniciada por lesión física, infección, o una respuesta inmune local. Muchas formas diferentes de inflamación están asociadas con diferentes enfermedades. Enfermedades "asociadas con inflamación" incluyen, por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino. Otras enfermedades asociadas con inflamación se discuten en la presente invención. "Tumor", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al crecimiento anormal tanto en la velocidad como en lo estructural que surge a partir de tejido normal, pero que no cumple ninguna función aparente. "Cáncer" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a la condición en mamíferos que se caracteriza por el crecimiento incontrolado y diseminación de células anormales. Los ejemplos de "cáncer" incluyen melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro. Un "trastorno" o "enfermedad" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una condición anormal que afecta uno o más de los procesos corporales. Dicha "enfermedad" o "trastorno" se puede evitar o su gravedad se pude reducir con tratamiento. Algunos ejemplos de trastornos o enfermedades que se pueden tratar utilizando los anticuerpos descritos incluyen, sin limitación, tumores, en particular tumor maligno, melanoma maligno, carcinoma de célula renal (RCC) , cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pulmonar de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro y tumores esofágicos; enfermedades inflamatorias, en particular psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino; y trastornos pulmonares, tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y fibrosis pulmonar idiopática; y enfermedades inflamatorias agudas, tales como enfermedades gastrointestinales. Estos son ejemplos de "enfermedades o trastornos relacionados con IL-8". Un "trastorno relacionado con IL-8" o enfermedad es un trastorno o enfermedad que resulta de la sobre-expresión de IL-8 y/o actividad incrementada de IL-8 o un receptor de IL-8. Tal como se utiliza en la presente invención, "agente antineoplásico" se refiere a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o avance de un neoplasma en un humano, en particular una lesión maligna (cancerosa) , tal como un melanoma, carcinoma, sarcoma, linfoma, o leucemia. La inhibición de metástasis con frecuencia es una propiedad de los agentes antineoplásicos. Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a tratamiento tanto terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas, en los cuales el objetivo es prevenir o desacelerar (aminorar) un cambio fisiológico o trastorno indeseado, tal como el desarrollo o diseminación de cáncer o una enfermedad inflamatoria. En algunas modalidades, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado patológico estabilizado (es decir, que no empeore) , retraso o desaceleración del avance de la enfermedad, mejoramiento o alivio del estado patológico, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea que se pueda o no detectar. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la condición o trastorno así como aquellos propensos a tener la condición o trastorno o aquellos en los cuales se va a prevenir la condición o trastorno. El término "paciente" incluye humanos, mamíferos, e individuos veterinarios. El término "fluido corporal" incluye cualquier fluido que en algún punto está o ha estado en un cuerpo. Esto puede incluir, por ejemplo y sin limitación, sangre, bilis, ácido estomacal, moco, orina, y fluido cerebroespinal. "Administrar", para los propósitos de tratamiento, significa el suministro a un paciente. Dicho suministro puede ser mediante cualesquiera medios conocidos, por ejemplo intravenoso, intraperitoneal, mediante inhalación, intramuscular, subcutáneo, oral, tópico, transdérmico, o quirúrgico.

"Cantidad terapéuticamente efectiva", para los propósitos de tratamiento, significa una cantidad tal que pueda dar como resultado un cambio observable en la condición y/o síntomas del paciente a partir de su administración, ya sea sola o en combinación con otro tratamiento. Un vehículo "farmacéuticamente aceptable" para los propósitos de tratamiento, es una modalidad física que se puede administrar a un paciente. Los vehículos, o portadores, farmacéuticamente aceptables pueden ser, pero no se limitan a, pildoras, cápsulas, tabletas con forma de cápsula, tabletas, fluidos administrados por vía oral, fluidos inyectables, aspersiones, aerosoles, pastillas, nutracéuticos, cremas, lociones, aceites, soluciones, pastas, polvos, vapores, o líquidos. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución isotónica amortiguada, tal como solución salina regulada con fosfatos (PBS) . "Neutralizar", para los propósitos de tratamiento, significa suprimir parcial o completamente la actividad biológica y/o química. "Regular en forma negativa", para los propósitos de tratamiento, significa disminuir el nivel de una composición objetivo particular. El término "polipéptido" se utiliza en la presente invención como un término genérico para hacer referencia a proteína original, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Por lo tanto, proteína original, fragmentos, y análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos preferidos comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada de humano representadas en las figuras ÍA, IB, 1C, 4A, y 4B y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa de humano representadas por las figuras ÍA, IB, 1C, 4A, y 4B, (por ejemplo, secuencias nones SEQ ID NO: 1-47 ) así como moléculas de anticuerpo formadas mediante combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como variantes, fragmentos y análogos de las mismas. El término "proteína aislada" tal como se utiliza en la presente invención significa una proteína de ADNc, ARN recombinante, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, la cual debido a su origen o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la Naturaleza, (2) ha sido separada de una o más de otras proteínas provenientes de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas de múrido, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no se presenta en la Naturaleza.

El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en la presente invención incluye nucleótidos de origen natural, y nucleótidos modificados ligados entre sí mediante enlazamientos de tipo oligonucleótido presentes en la Naturaleza, y no presentes en la Naturaleza. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprenden una longitud de 200 bases o menos. De1 preferencia, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y de manera más preferida 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 hasta 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos normalmente son de una sola cadena, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble cadena, por ejemplo, para uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o de antisentido. El término "nucleótidos de origen natural" referido en la presente invención incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente invención incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlazamientos tipo oligonucleótido" referido en la presente invención incluye enlazamientos de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am . Chem . Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucí . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al. Anti -Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87- 108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., patente E.U.A ?o. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. El término "polinucleótido" al que se hace referencia en la presente invención significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de AD? de cadena sencilla y de doble cadena. Los ácidos nucleicos descritos en la presente invención, y los fragmentos y variantes de los mismos, se pueden utilizar, a manera de ejemplo no limitativo, (a) para dirigir la biosíntesis de las proteínas codificadas, polipéptidos, fragmentos y variantes correspondientes como productos génicos recombinantes o heterólogos, (b) como sondas para la detección y cuantificación de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención, (c) como plantillas de secuencia para preparar moléculas de antisentido, y similares. Dichos usos se describen de manera más completa más adelante. El término "presente en la Naturaleza" tal como se utiliza en la presente invención se refiere al hecho que un objeto se puede encontrar en la Naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que se puede aislar a partir de una fuente natural y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de alguna otra manera está presente en la Naturaleza. El término "polinucleótido aislado" tal como se utiliza en la presente invención debe significar un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, el cual (1) no está asociado con la totalidad o una porción de uno o más polinucleótidos en los cuales el "polinucleótido aislado" se encuentra en la Naturaleza o con el cual éste está asociado en la Naturaleza, (2) está ligado en forma operable a un polinucleótido al cual no está ligado en la Naturaleza, o (3) no está presente en la Naturaleza. El término "ligado en forma operable" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a posiciones de componentes descritos de modo tal que están en una relación que permita que éstos funcionen en su manera pretendida. Por ejemplo, una secuencia de control "ligada en forma operable" a una secuencia codificadora está conectada de tal modo que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo| I condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "se hibrida selectivamente" al que se| hace referencia en la presente invención significa unirse en forma detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hidridan selectivamente a cadenas de ácido nucleico bajo condiciones ¡ de hibridación y lavado que reducen al mínimo las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de astringencia elevada para lograr condiciones de hibridación selectiva como las conocidas en la técnica y discutidas en la presente ' invención. En términos generales, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico de interés es de por lo menos 80%, y de! manera más típica con homologías de preferencia cada vez mayores de por lo menos 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son "homologas" si ' existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias.

Por ejemplo, 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se , alinean para el máximo de coincidencia (matching) . Se permiten espacios (en cualquiera de las dos secuencias que ( I I están siendo comparadas) para llevar al máximo el apareamiento de secuencia; se prefieren longitudes de espacio de 5 o menos siendo más preferido 2 o menos. De manera alternativa y de preferencia, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de por lo menos 30 aminoácidos de longitud aproximadamente) son homologas, de acuerdo con la manera en la que se utiliza este término en la presente invención, si éstas tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y un castigo por espacio de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el Suplemento 2 para este volumen, pp . 1-10. De manera más preferida, las dos secuencias o partes de las mismas son homologas si sus, aminoácidos son idénticos en un 50% o más cuando se alinean de manera óptima utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la i presente invención para indicar que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, no' estrictamente relacionada desde el punto de vista evolutivo) ¡ a la totalidad o a una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia dej polipéptido es idéntica a toda o a una porción de una secuencia de polipéptido de referencia.

En contraposición, el término "complementaria a" se utiliza en la presente invención para indicar que la ¡ secuencia complementaria es homologa a toda o a una porción1 de una secuencia de polinucleótido o polipéptido de, referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de ¡ i polinucleótido o aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia",1 "porcentaje de identidad de secuencia", e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para una comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de longitud completa de ADNc o de; un gen dado en un listado de secuencias o puede comprender! una secuencia completa de ADNc o de gen. En términos generales, una secuencia de referencia tiene una longitud de por lo menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos, frecuentemente' de por lo menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y muchas veces de por lo menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos! de longitud. Debido a que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácido pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa de polinucleótido ' o aminoácido) que sea similar entre las dos moléculas, y (2) ' también pueden comprender una secuencia que sea divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácido, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas típicamente se efectúan comparando las secuencias de las dos I i moléculas a través de una "ventana de comparación" paral identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza i I en la presente invención, se refiere a un segmento conceptual, de aproximadamente por lo menos 18 posiciones de nucleótido contiguas o aproximadamente 6 aminoácidos en el cual lai secuencia de polinucleótido o la secuencia de aminoácido se compara con una secuencia de referencia de por lo menos 18 I I nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y en el cual la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede incluir adiciones, deleciones, sustituciones, y similares {es decir, espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia ! (la cual no comprende adiciones o deleciones) para alineaciónl óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de I secuencias para alinear una ventana de comparación se puede efectuar utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl . Ma th . 2:482 (1981), utilizando al algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch JJ Mol . Biol . 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda respecto a similitud de Pearson y Lipman Proc . Na ti . Acad. Sci . (U. S . A . ) 85:2444 (1988), mediante implementaciones de estos algoritmos en computadora (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de software de Wisconsin Genetics versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), los paquetes de software GENEWORKS™, o MACVECTOR®), o mediante inspección, y se selecciona la mejor1 alineación (es decir, la que dé como resultado el porcentaje más alto de homología a través de la ventana de comparación) generada por los diversos métodos. Con "contigua", se quiere decir que las partes (por ejemplo, aminoácidos individuales, ácidos nucleicos, o fragmentos de anticuerpo tales como CDRs y FRs) están inmediatamente colindantes entre sí sin nada significativo que esté bloqueando o que se intercale en su asociación. El término "secuencia de control" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificadoras a las cuales éstas están conectadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo hospedero; en los procariotas, dichas secuencias de control por lo general incluyen secuencia de promotor, de sitio de unión ribosómico, y de terminación de transcripción; en los eucariotas, por lo general, dichas secuencias de control incluyen secuencias de promotor y de terminación de transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión. Tal como se utiliza en la presente invención, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology—A Synthesis (2a edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como los alfa-aminoácidos, aminoácidos alfa-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos en algunas modalidades. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen, sin limitación, 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N- metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación de polipéptido utilizada en la presente invención, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxilo-terminal, de conformidad con el uso y convención normales. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido o de aminoácido son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) a través de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a través de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se presentan bases de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o residuos de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, dividiendo el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (és decir, el tamaño de la ventana) , y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" tal como se utiliza en la presente invención indica una característica de una secuencia de polinucleótido o de aminoácido, en la cual el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferido por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia a través de una ventana de comparación de por lo menos 18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), con frecuencia a través de una ventana de por lo menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en la cual el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia la cual puede, incluir deleciones o adiciones que totalicen 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a través de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. De preferencia, las posiciones de residuo que no sean idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácido. Las variantes preferidas de anticuerpo comprenden secuencias de aminoácido que son sustancialmente idénticas a aquellas descritas en la presente invención. De manera similar, a menos que se especifique de otra manera, el extremo hacia el lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de cadena individual es el extremo 5'; la dirección hacia el lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de doble cadena es referida como la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes se conoce como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la del ARN y las cuales son 5' hacia el extremo 5' del transcrito de ARN son conocidas como las "secuencias hacia el extremo 5'"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la del ARN y las cuales son 3' hacia el extremo 3' del transcrito de ARN son conocidos como las "secuencias hacia el extremo 3 ' " . Las "variantes" de anticuerpo que comprenden variaciones en las secuencias de aminoácido de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están contempladas para que sean abarcadas por las presentes modalidades. Las variaciones en la secuencia de aminoácido mantienen por lo menos 75%, más preferido por lo menos 80%, 90%, 95%, y más preferido aún 99% de identidad de secuencia comparada con la secuencia presente en la Naturaleza. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácido. Los reemplazos conservadores son aquellos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados generalmente están divididos en familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son la familia hidroxi-alifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, seria razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valma, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, en especial si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio del bastidor. El que un cambio de aminoácido dé como resultado o no un péptido funcional se puede determinar fácilmente analizando la actividad específica del derivado de polipéptido. Las pruebas se describen con mayor detalle en la presente invención. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino-terminal y carboxilo-terminal preferidos de fragmentos o análogos se presentan cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparación de datos de secuencia de nucleótido y/o de aminoácido con bases de datos de secuencia públicas o privadas. De preferencia, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación proteínicos pronosticados que se presentan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Son conocidos los métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales > que se pueden utilizar para definir los dominios estructurales y funcionales. Las sustituciones de aminoácido preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la actividad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente a la secuencia de péptido presente en la Naturaleza. Por ejemplo, se pueden efectuar sustituciones de aminoácido individual o múltiple (de preferencia sustituciones de aminoácido conservadoras) en la secuencia presente en la Naturaleza. En algunas modalidades, estas sustituciones de preferencia están en la porción del polipéptido fuera del o los dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácido conservadora no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia progenitora (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se presente en la secuencia progenitora, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caractericen a la secuencia progenitora) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991), de las cuales cada una se incorpora en la presente invención para referencia. El término "fragmento de polipéptido" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxilo-terminal, pero que en la secuencia de aminoácido remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia deducida presente en la Naturaleza, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente son de por lo menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, de preferencia de por lo menos 14 aminoácidos de longitud, más preferido por lo menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente por lo menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferido por lo menos 70 aminoácidos de longitud. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o uniendo a un polipéptido porciones biotinilo que se puedan detectar utilizando avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contenga un marcador fluorescente o actividad enzimática que se pueda detectar mediante métodos ópticos o colorimétricos) . En algunas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen y se pueden utilizar varios métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 1C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, U1ln, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, luminóforos de lantánido), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes polipeptídicos predeterminados reconocidos mediante un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítope) .

En algunas modalidades, las marcas se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial . El término "agente farmacéutico o fármaco" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto químico o composición que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de manera adecuada a un paciente. Otros términos de química en la presente invención se utilizan de conformidad con el uso convencional en la técnica, como queda ejemplificado por el diccionario de términos químicos The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado en la presente invención para referencia) . Tal como se utiliza en la presente invención, "sustancialmente puro" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (es decir, en una base molar éste es más abundante que cualquiera otra especie individual en la composición) , y de preferencia una fracción sustancialmente purificada es una composición en la cual la especie objetivo comprende por lo menos 50% aproximadamente (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En términos generales, una composición sustancialmente pura comprende más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferido más de aproximadamente 85%, 90%, 95%, y 99%. De manera más preferida, la especie objetivo se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición utilizando métodos de detección convencionales) en la cual la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular .

Estructura del anticuerpo Se sabe que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está constituido por dos pares de cadenas de polipéptido idénticas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del' reconocimiento de antígeno. La porción carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más , aminoácidos, la cadena pesada incluye también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase en general, Fundamen tal Immunology cap. 7 (Paul, W. , ed. , 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (incorporado para referencia en su totalidad) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de bastidor (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par están alineadas mediante las regiones de bastidor, lo que permite la unión a un epítope específico. Desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de conformidad con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological In terest (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al. Na ture 342:878-883 (1989). Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas 1 pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlazamiento de fragmentos Fab' . ' Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann Clin . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol . 148:1547-1553 (1992). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un procedimiento de trabajo relativamente intenso comparado con la producción convencional de anticuerpos y los rendimientos y grado de pureza generalmente son más bajos para anticuerpos biespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un solo sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab', y Fv) .

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de múrido o rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de múrido o rata puede conducir a la eliminación rápida de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por parte de un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de múrido o rata, se pueden crear anticuerpos completamente humanos mediante la introducción de la función de anticuerpo humano en un roedor de modo tal que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos. Un método para generar anticuerpos completamente humanos es mediante el uso de cepas de ratones XENOMOUSE® los cuales han sido manipulados genéticamente para que contengan fragmentos de configuración de línea germinal con tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada y del locus de la cadena ligera kappa de humano. Véase Green et al. Na ture Genetics 7:13-21 (1994). Las cepas XENOMOUSE® se pueden conseguir a partir de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) . La producción del XENOMOUSE® también se discute y se delinea en las solicitudes de patente E.U.A. Nos. de serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, presentada el 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, y 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las patentes E.U.A Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Véase también Méndez et al. Na ture Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp . Med. 188:483-495 (1998). Véase además patente europea No. EP 0 463 151 Bl, otorgamiento publicado el 12 de junio de 1996, solicitud de patente internacional No. WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de ! 1994, solicitud de patente internacional No. WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes, y referencias antes citadas se incorporan en la presente invención para referencia en sus totalidades . En una estrategia alternativa, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado una estrategia de "minilocus". En la estrategia de minilocus, se imita un locus1 de Ig exógeno a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, se configuran uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) como una construcción para inserción en un animal. Esta estrategia se describe en la patente E.U.A No. 5,545,807 para Surani et al. y en las patentes E.U.A Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 cada una para Lonberg y Kay, patentes E.U.A Nos. 5,591,669 y 6,023,010 para Krimpenfort y Berns, patentes E.U.A Nos. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 para Berns et al., y patente E.U.A No. 5,643,763 para Choi y Dunn, y las solicitudes de patente E.U.A. para GenPharm International con Nos. de serie 07/574,748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 diciembre de 1993, 08/165,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo de 1994, cuyas! descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Véase también patente europea No. 0 546 073 Bl, solicitudes internacionales de patente Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y patente E.U.A No. 5,981,175, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en sus totalidades. Véase también Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996), cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en sus totalidades . Kirin también demostró la creación de anticuerpos humanos a partir de ratón en los cuales, se han introducido, a través de fusión microcelular, piezas grandes de cromosomas, o cromosomas completos. Véase solicitudes de patente europea Nos. 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en sus totalidades . Las respuestas de anti-anticuerpo de ratón, de humano, (HAMA por sus siglas en inglés) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de alguna otra manera. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante de humano y una región variable de múrido, es de esperar que se observen algunas respuestas anti-anticuerpo quimérico de humano (HACA por sus siglas en inglés), particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo.

Preparación de anticuerpos Se pueden preparar anticuerpos monoclonales de alta afinidad, completamente humanos contra IL-8 utilizando la tecnología XENOMOUSE® (Abgenix Inc., Freemont, CA) . Dichos ratones pueden producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos de humano y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos de múrido. Esencialmente, se inmunizan líneas de ratones XENOMOUSE® con un antígeno de interés (por ejemplo, IL-8) . El antígeno puede ser, por ejemplo y sin limitación, IL-8 de longitud completa o un fragmento de IL-8. En otras modalidades el antígeno es i i una proteína de fusión que comprende por lo menos una porción ¡ de IL-8. La inmunización se puede repetir múltiples veces según se desee. Después de la inmunización, se recuperan células linfáticas (tal como células B) a partir de los' ratones que expresan anticuerpos, y las líneas celularesl recuperadas se fusionan con una línea celular tipo mieloide; para preparar líneas de célula de hibridoma inmortales. Estas; líneas celulares de hibridoma se someten a tamizaje y se, seleccionan para identificar líneas de célula de hibridoma que produzcan anticuerpos específicos contra el antígeno de, interés y que tengan las propiedades deseadas. En otras modalidades, en vez que se fusionen a células de mieloma para generar hibridomas, las células' aisladas a partir de líneas de ratones XENOMOUSE® inmunizados se tamizan adicionalmente respecto a anticuerpos que sean reactivos contra el antígeno inicial, de preferencia IL-8. Dicho tamizaje puede incluir, por ejemplo, ELISA con IL-8, una prueba competitiva con anticuerpos que se sabe se unen a IL-8, y estudios in vi tro de la capacidad para neutralizar a IL-8. Después se pueden aislar células B individuales que secreten los anticuerpos de interés, utilizando por ejemplo una prueba de placa hemolítica específica de IL-8 (véase, por ejemplo, Babcook et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, i93:7843-7848 (1996), que describe "SLAM"). Las células elegidas para lisis de preferencia son eritrocitos de oveja' (SRBCs) revestidas con antígeno IL-8. En presencia de un cultivo de célula B que secrete la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica lisis mediada por IL-8 específica de las células objetivo. Se puede aislar la célula plasmática específica de antígeno individual en el centro de la placa y la información genética que codifica para la especificidad del anticuerpo se aisla a partir de la célula plasmática individual. Utilizando PCR de transcriptasa inversa, se puede clonar el ADN que codifica para la región variable del anticuerpo secretado. Dicho ADN clonado se puede insertar después en un vector de expresión apropiado, tal como pcADN (Invitrogen) , más preferido un vector que contenga los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. El vector generado se puede transfectar después en células hospederas, tales como células CHO. Independientemente de su fuente inicial, los anticuerpos anti-IL-8 se pueden producir en líneas celulares diferentes a las líneas celulares de hibridoma. Se pueden i utilizar secuencias que codifiquen para anticuerpos particulares, de preferencia en un vector, para transformación de una célula hospedera de mamífero apropiada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera, incluyendo, por ejemplo empacado del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula hospedera con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica mediante las patentes E.U.A Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455 (las cuales se incorporan en la presente invención para referencia) . El procedimiento de transformación utilizado depende del hospedero a ser transformado. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del o los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos. Las líneas de célula de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de célula inmortalizada disponibles a partir del Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular de humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñon embrionario de humano (HEK) y otras líneas celulares conocidas en la técnica. Las células hospederas transformadas se cultivan en el medio nutritivo apropiado para producir los anticuerpos deseados, los cuales se pueden purificar a partir del medio utilizando técnicas convencionales. Los expertos en la técnica pueden seleccionar los medios nutritivos y técnicas de purificación en función de las circunstancias particulares. Además, como será reconocido por el experto en la técnica, los medios se pueden modificar como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o para amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas . A los anticuerpos anti-IL-8 descritos en la presente invención se les puede cambiar el isotipo para que se les provean propiedades deseables. Por ejemplo, en algunas modalidades, particularmente en el contexto de anticuerpos terapéuticos, los anticuerpos anti-IL-8 de preferencia tienen capacidad para fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Un número de isotipos de anticuerpos pueden fijar el complemento, incluyendo, sin limitación, IgM de múrido, IgG2a de múrido, IgG2b de múrido, IgG3 de múrido, IgM de humano, IgGl de humano, e IgG3 de humano. En otras modalidades se puede cambiar el isotipo para proveer propiedades tales como tiempo de vida media prolongado y eliminación más lenta. Si se desea, se puede cambiar fácilmente el isotipo de un anticuerpo humano que posea la actividad deseada hacia IL-8 para generar un isotipo IgM de humano, IgGl de humano, o IgG3 de humano, y que siga teniendo la misma región variable. Dicho anticuerpo podría entonces ser capaz de fijar el complemento y participar en CDC. Por lo tanto, los anticuerpos anti-IL-8 que se generan no necesitan poseer inicialmente el isotipo deseado' sino que se pueden cambiar de isotipo utilizando técnicas convencionales que son bien conocidas en el campo. Dichas técnicas incluyen, sin limitación, el uso de técnicas recombinantes directas (véase por ejemplo, patente E.U.A No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula (véase por, ejemplo, patentes E.U.A Nos. 5,916,771 y 6,207,418), entre otras. Estas técnicas son bien conocidas en el campo. Brevemente, en la técnica de fusión célula-célula, se prepara una línea celular de mieloma u otra línea celular que posea una cadena pesada con un isotipo deseado y se prepara otra línea celular de mieloma u otra línea celular que posea la cadena ligera. Dichas células se fusionan y se puede aislar una línea celular que exprese un anticuerpo intacto del isotipo deseado. Por consiguiente, a medida que se generan candidatos de anticuerpo que cumplen con los atributos "estructurales" deseados, estos se pueden proveer con algunos atributos "funcionales" a través del intercambio de isotipo si se desea.

Listado de secuencias Las secuencias de aminoácido y de nucleótido de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera de anticuerpos anti-IL-8 de humano representativos, identificados como se describe en los ejemplos más adelante, se proveen en el listado de secuencias anexo, cuyos contenidos se presentan en forma resumida en la tabla 1. Las secuencias por sí mismas se muestran en las figuras 1A-2E.

TABLA 1 TABLA 1 (cont.) TABLA 1 (cont.) Las secuencias de cadena ligera y pesada anteriores se combinan como se indicó anteriormente en los anticuerpos con los números de identificación de mAb indicados en la tabla. Por ejemplo, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 33 juntas comprenden las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera para el anticuerpo #928. En otras modalidades, sin embargo, las cadenas pesada y ligera se pueden mezclar o combinar en forma diferente para generar anticuerpos con propiedades diferentes. También se contemplan variantes, incluyendo variantes que sean sustancialmente homologas a los anticuerpos anteriores. En algunas modalidades, las variantes de anticuerpo difieren de los anticuerpos descritos en su secuencia de línea germinal. Una manera de identificar dichas variantes es mediante alineación de las diversas secuencias de anticuerpo como se muestra en la figura 4A y en la figura 4B. En dicha figura, se comparan las diversas secuencias de línea germinal con las secuencias identificadas en la presente invención. En una modalidad, una variante de anticuerpo tiene por lo menos una mutación en la línea germinal que hace que el anticuerpo sea más similar a uno de los otros anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo, una "I" en la posición 34 de SEQ ID NO: 50 dará como resultado una variante de SEQ ID NO: 50 que ahora es más similar a SEQ ID NO: 11. También se contemplan alteraciones de los anticuerpos de línea no germinal para crear variantes. Por lo tanto, también se contemplan variantes que sean 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, y 99-100% idénticas a los anticuerpos de línea no germinal descritos. De preferencia, los anticuerpos variantes tienen alta afinidad para IL-8, y cierto grado de selectividad. Por lo tanto, también se contemplan alteraciones a las secuencias de línea no germinal anteriores ya sea que incrementen la afinidad o que no reduzcan en forma significativa la afinidad.

Terapéutica de anticuerpo Se espera que los anticuerpos descritos en la presente invención tengan efecto terapéutico en el tratamiento de síntomas y condiciones que resultan de la , actividad de IL-8. En modalidades específicas, los anticuerpos y métodos de la presente invención se refieren al tratamiento de neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, I deficiencia de mmunoglobulma, psoriasis o fibrosis ¡ quística. Anti-IL-8 puede tener efectos terapéuticos para tratar síntomas y condiciones que resultan de la actividad de IL-8. Además, se pueden utilizar los anticuerpos de alta afinidad para identificar enfermedades o trastornos asociados con cambios en los niveles de IL-8 en el cuerpo. En modalidades preferidas se utilizan uno o más anticuerpos anti-IL-8 de alta afinidad para tratar una enfermedad inflamatoria. En modalidades especificas, los anticuerpos y métodos de la presente invención se utilizan en el tratamiento de una o más enfermedades o trastornos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de inflamación aguda, ARDS, glomerulonefritis, hepatitis alcohólica, psoriasis, daño por reperfusión, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina o fibrosis quística. En otras modalidades los anticuerpos se utilizan para tratar cáncer, tal como un cáncer que se selecciona a partir del grupo que consiste de melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro.

Administración y formulaciones terapéuticas Los anticuerpos que se unen a IL-8 con alta afinidad se pueden utilizar terapéuticamente para tratar una enfermedad o trastorno mediante reducción de la actividad de IL-8. Los anticuerpos anti-IL-8 de preferencia poseen afinidad adecuada para suprimir la actividad de IL-8 lo suficiente para tener un efecto terapéutico a la dosis deseada. De preferencia, los anticuerpos para uso terapéutico están en un preparado farmacéutico estéril, como se discute con mayor detalle más adelante. Cuando se utiliza para administración in vivo, la formulación de anticuerpo de preferencia es estéril. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de liofilización y reconstitución opcionales. El anticuerpo comúnmente se almacena en forma liofilizada o en solución. Las composiciones de anticuerpo terapéuticas generalmente se colocan dentro de un contenedor que tenga un orificio estéril de acceso, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tenga un adaptador que permita la recuperación de la formulación, tal como un tapón que se pueda perforar mediante una aguja para inyección hipodérmica. Los anticuerpos, como se describe en la presente I invención, se pueden preparar en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica se puede administrar por vía intravenosa como un líquido o aerosol en polvo (liofilizado) . La composición también se puede administrar por vía parenteral o subcutánea según se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable teniendo las debidas consideraciones respecto a pH, isotonicidad, y estabilidad. Estas condiciones son conocidas por los expertos en la técnica. En breve, las formulaciones para dosificación de los compuestos descritos en la presente invención se preparan para almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Dichos materiales son no tóxicos para quienes los reciben a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen reguladores de pH tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales acidas orgánicas; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o 7! inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contra-iones tales como sodio y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o ' polietilenglicol. Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de conformidad con la práctica farmacéutica convencional como se describe en Remington : The Science and Practi ce of Pharmacy (20a ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003) ) . Por ejemplo, sería deseable disolver o suspender el compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal de origen natural tal como aceite de ajonjolí, cacahuate, o de semilla de algodón o un vehículo graso sintético tal como oleato de etilo o similares. Se pueden incorporar reguladores de pH, conservadores, antioxidantes y similares de conformidad con la práctica farmacéutica aceptada. Los anticuerpos también se pueden administrar y liberar a través del tiempo en preparados de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de preparados de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen al anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos configurados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices para liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , por ejemplo, como se describe en Langer et al., J. Biomed Ma ter . Res . , (1981) 15:167-277 y Langer, Chem . Tech . , (1982) 12:98-105, o poli (alcohol vinílico)), poliláctidos (patente E.U.A. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., supra ) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el dispositivo de depósito LUPRON Depot™ (microesferas inyectables constituidas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) , y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por alrededor de 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante intervalos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, éstas se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en el carácter inmunogénico. Se pueden contemplar estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de puentes S-S intermoleculares a través de intercambio de disulfuro, la estabilización se puede lograr mediante modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilización a partir de soluciones acidas, control del contenido de humedad, uso de aditivos apropiados, y desarrollo de composiciones de matriz polimérica específicas. ' Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparados de cristales del anticuerpo suspendidos en formulaciones apropiadas que puedan mantener los cristales en suspensión. Estos preparados cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal pueden producir un efecto de, liberación sostenida. Otras composiciones también incluyeni anticuerpos atrapados en liposomas. Los liposomas que1 contienen a dichos anticuerpos se preparan utilizando métodos conocidos, por ejemplo, como se describe en la patente E.U.A. No. DE 3,218,121; Epstein et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, ^ (1985) 82:3688-3692; Hwang et al, Proc . Na ti . Acad. Sci . , ¡ USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EPI 143,949; 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes E.U.A Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. La vía de administración del anticuerpo puede ser, por ejemplo y sin limitación, mediante inyección o infusión a través de las vías intravenosa, intraperitoneal, I intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intratecal, por inhalación o intra-lesión, o utilizando sistemas de liberación sostenida como se indica más adelante. El anticuerpo de preferencia se administra en forma continua] mediante infusión o mediante inyección de bolo. I La dosis de la formulación de anticuerpo para un paciente dado puede ser determinada por el médico encargado! tomando en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de fármacos incluyendo gravedad y tipo de enfermedad, peso corporal, género, dieta, tiempo y vía de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. Las dosis terapéuticamente efectivas se pueden determinar utilizando métodos in vi tro o in vivo . Una cantidad efectiva de los anticuerpos, descritos' i en la presente invención, que será utilizada terapéuticamente puede depender, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y la condición del paciente. Pori consiguiente, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y? modifique la vía de administración según se requiera para, obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede variar desde aproximadamente 0.001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, más preferido desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, dependiendo de las circunstancias particulares, incluyendo, por ejemplo, los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el empleado, clínico administra el anticuerpo terapéutico hasta que se obtiene una dosis que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se puede monitorear fácilmente utilizando pruebas convencionales o como se describe en la presente invención. Los anticuerpos se pueden administrar en una sola dosis. Sin embargo, de preferencia, los anticuerpos se administran una o más veces diariamente a lo largo de un periodo prolongado de tiempo. El régimen de dosificación puede incluir una administración de refuerzo en algún momento después de la última dosis regular. Los anticuerpos terapéuticos de preferencia se ' administran con vehículos, excipientes, .y otros agentes apropiados que se incorporan en formulaciones para proveer transferencia, suministro, tolerancia, y similares mejorados.' Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicas o aniónicas) (tal como' Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas anhidras para absorción, emulsiones aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares) , geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de conformidad con algunas de las modalidades, con la condición que el agente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y que la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul . Toxicol . Pharmacol . 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals" . In t . J. Pharm . 203(1-2) : 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci . 89(8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients, for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998) y las referencias citadas en las mismas para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos . Los anticuerpos anti-IL-8 se pueden administrar en forma individual. Sin embargo, en algunas modalidades, de! preferencia se administra más de un anticuerpo. Los anticuerpos se pueden administrar en forma simultánea o en secuencia. Por ejemplo, se pueden administrar dos o más i anticuerpos anti-IL-8 de alta afinidad a un paciente en unaj I sola formulación. En otras modalidades los anticuerpos se administran junto con otros agentes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, anticuerpos contra un objetivo diferente, agentes quimioterapéuticos y otras composiciones que se sabe son benéficas en el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Como se mencionó anteriormente, a intervalos periódicos durante el tratamiento, se monitorea a los pacientes para determinar la eficacia del tratamiento y para ajustar la dosificación si fuera necesario. Los métodos para determinar la eficacia de un régimen de dosificación particular son conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, la eficacia de los anticuerpos anti-IL-8 de alta afinidad para tratar psoriasis se puede medir utilizando el índice de severidad del área de psoriasis (PASI por sus siglas en inglés), área de superficie corporal total (BSA por sus siglas en inglés), evaluación global del médico (PGA por sus siglas en inglés), y fotografías de placa. El análisis PASI es una medida ampliamente aceptada de respuesta de fármaco en pacientes con psoriasis. Los pacientes psoriáticos tratados con anticuerpos anti-IL-8 tienen una puntuación PASI mejorada en comparación con pacientes psoriáticos que no son tratados con anticuerpos anti-IL-8. La eficacia del uso del anticuerpo anti-IL-8 como un tratamiento para artritis reumatoide se puede medir mediante el 20% de criterios de respondedor del Colegio Americano de Reumatología (ACR20), también conocido como mejora mínima del 20% en artritis reumatoide del paciente.

Una respuesta ACR20 requiere una reducción mayor del 20% en el conteo de articulaciones hinchadas, una reducción mayor del 20% en el conteo de juntas blandas y una mejora mayor del 20% en tres de cinco de los siguientes: evaluación de dolor del paciente, evaluación de actividad de enfermedad del paciente, evaluación de actividad de enfermedad del investigador, reactante de fase aguda (CRP por sus siglas en inglés) y evaluación de estatus funcional del paciente (puntuación HAQ) . Los pacientes con artritis reumatoide que son tratados con anticuerpos anti-IL-8 tienen una respuesta ACR20 mientras que los pacientes con artritis reumatoide que no son tratados con anticuerpos anti-IL-8 no experimentan una respuesta ACR20. En el tratamiento de cáncer con anticuerpos anti-IL-8, la eficacia se puede medir mediante el nivel de crecimiento de tumor, angiogénesis y metástasis. Además, se puede utilizar un incremento en el número de células que experimentan apoptosis como una medida de la eficacia en pacientes con tumor a los que se les administran anticuerpos anti-IL-8. En una modalidad particular, se identifica un paciente que padece de COPD. Se administra una dosis de aproximadamente 5 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad mediante inyección intravenosa al paciente. Tres semanas más tarde se aplica una administración de refuerzo, y después de esto cada tres semanas. El anticuerpo ocasiona una inhibición parcial o completa de quimiotaxis de neutrófilos de los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de quimiotaxis de neutrófilos reduce la gravedad de daño tisular a los pulmones y vías respiratorias. Las descripciones y lineamientos adicionales referentes a los métodos para tratar un trastorno relacionado con IL-8 (por ejemplo, COPD) se pueden encontrar en la publicación E.U.A. No. 20030232048, presentada el 18 de marzo de 2003, para Yang et al. (incorporada para referencia en su totalidad) . Se puede encontrar información y lineamientos adicionales referentes al tratamiento de neumonía bacteriana (patente E.U.A. No. 5,686,070), asma (patente E.U.A. No. 5,874,080), y colitis ulcerante (patente E.U.A. No. 5,707,622), todas incorporadas para referencia en sus totalidades. Como será apreciado por el experto en la técnica, las formulaciones se pueden utilizar en las preparaciones de medicamentos para el tratamiento de los trastornos relevantes relacionados o dependientes de IL-8.

Diagnósticos de IL-8 Los anticuerpos de alta afinidad para IL-8 se pueden utilizar en pruebas para la detección de IL-8 en tejidos, fluidos o células de mamífero. Las pruebas se pueden utilizar, por ejemplo, para evaluar pacientes respecto a una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de IL-8, tales como neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, COPD, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, y fibrosis quística. Un sistema de prueba de preferencia comprende un paquete que contiene, en una cantidad suficiente para llevar a cabo por lo menos una prueba, una composición que contiene un anticuerpo anti-IL-8 de alta afinidad. Esta composición de anticuerpo puede estar, por ejemplo, en solución líquida o unida a una matriz de fase sólida. El sistema también incluye de preferencia una marca detectable para indicar la presencia de moléculas de anticuerpo en cualesquiera productos de inmuno-reacción que se formen después de poner en contacto una muestra proveniente de un paciente con la composición de anticuerpo. Se pueden comparar los niveles de IL-8 identificados en una muestra con una muestra de control para determinar si están presentes niveles elevados de IL-8.

Identificación de epítopes ligados por anticuerpos anti-IL-í La siguiente discusión describe varios métodos de ejemplo para identificar y caracterizar el epítope en IL-8 al que se unen anticuerpos particulares. Otros métodos que se pueden utilizar serán evidentes para los expertos en la técnica .

IL-8 se puede someter a SDS-PAGE y analizar mediante inmunoblot con el anticuerpo anti-IL-8 deseado. El análisis SDS-PAGE se puede efectuar ya sea en ausencia o en presencia de un agente reductor. Por consiguiente, es posible determinar si los anticuerpos contra IL-8 se unen a un epítope lineal en IL-8 o a un epítope con configuración. También se puede efectuar el mapeo de epítope , utilizando desorción/ionización de láser de superficie mejorada (SELDI) . Se utilizan arreglos ProteinChip® de SELDI (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA) para definir los sitios de interacción proteína-proteína. Brevemente, los antígenos se capturan específicamente en anticuerpos covalentemente inmovilizados sobre la superficie del arreglo Protein Chip mediante una incubación y lavado iniciales. Los antígenos unidos se pueden detectar mediante un proceso de desorción inducido por láser y analizar directamente para determinar sus masas. Los fragmentos del antígeno que se unen se utilizan para identificar el epítope al que se une el anticuerpo. El epítope ligado por un anticuerpo anti-IL-8 también se puede determinar mediante despliegue de fago. Despliegue de fago describe una técnica de selección en la cual un péptido se expresa como una fusión con una proteína de cubierta de un bacteriófago, lo que da como resultado el despliegue de la proteína fusionada sobre la superficie del virión. La inspección visual (panning) se efectúa mediante incubación de una genoteca de péptido desplegado en fago con una placa o tubo revestido con el objetivo, eliminando mediante lavado el fago no unido, y eluyendo el fago unido específicamente. El fago eluido se amplifica después y se lleva a través de ciclos de unión y amplificación adicionales para enriquecer la población (pool) en favor de las secuencias de unión. Después de tres o cuatro rondas, los clones individuales que se unen se analizan adicionalmente respecto a unión mediante pruebas ELISA con fago efectuadas en cavidades revestidas con anticuerpo y se caracterizan mediante determinación de secuencia de ADN específica de los clones positivos. Después de rondas múltiples de dicha inspección visual contra un anticuerpo el fago unido se puede eluir y someter a estudios adicionales para la identificación y caracterización del péptido unido. I j En algunos casos podría ser deseable generar ' . I anticuerpos adicionales que se unan a un epítope particular , de IL-8. Por ejemplo, si un anticuerpo tiene atributos , i particularmente deseables, los anticuerpos adicionales elaborados para dicho epítope pueden mantener esos atributos , I I pero pueden tener otros atributos, tales como una afinidad más alta. El antígeno utilizado para generar dichos, i i anticuerpos podría comprender al epítope deseado. En algunas modalidades el antígeno puede consistir de un péptido con la secuencia del epítope deseado. En otras modalidades, el antígeno puede ser un péptido que comprenda la secuencia del epítope, tal como una proteína de fusión. Los anticuerpos humanos para epítopes particulares se generan utilizando tecnología Xenomouse, como se describe en la presente invención, o utilizando otros métodos conocidos para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos. Aunque los anticuerpos humanos son preferidos para aplicaciones terapéuticas, en otras situaciones el uso de anticuerpos humanos no es necesario. Por lo tanto, en algunas modalidades, se pueden generar anticuerpos monoclonales utilizando otros métodos, tales como el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Na ture 256:495 (1975), o se pueden elaborar utilizando métodos de ADN recombinante como se describe en la patente E.U.A No. 4,816,567, la cual se incorpora para referencia en su totalidad. En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describió anteriormente en la presente invención para que induzca linfocitos que produzcan o que puedan producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína utilizada para inmunización. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro . Los linfocitos o, de manera más preferida, linfocitos enriquecidos para células B se fusionan después con células de mieloma utilizando un procedimiento de fusión electrocelular o mediante el uso de un agente para fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103, [Academic Press, 1996] ) . Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo apropiado que de preferencia contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan la producción estable de alto nivel de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. De entre éstas, las líneas de célula de mieloma preferidas son las líneas de mieloma de múrido, tales como aquellas obtenidas a partir de tumores de ratón MOP-21 y MC-11 disponibles a partir del Centro de Distribución de Células del Instituto Salk (Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles a partir del Depósito Americano de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland EE.UU. También se han descrito líneas de célula de mieloma de humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol . 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal An tibody Production Techniques and Applica tions, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York,

[1987]). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se analiza respecto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma mediante inmuno-precipitación o mediante una prueba de unión in vi tro, tal como la prueba radio-inmunológica (RÍA) o la prueba con inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal . Biochem . 107:220 (1980). Después que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, las células se pueden subclonar utilizando procedimientos de dilución limitante y cultivo utilizando métodos estándar (Goding, Monoclona l Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996) . Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio DMEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera apropiada del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía por afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla y se le determina la secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales {por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que se puedan unir específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, los cuales se transfectan después en células hospederas tales como células de E . coli , células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, uniendo covalentemente a la secuencia que codifica' para la inmunoglobulina todo o una parte de la secuencia que codifica para un polipéptido de tipo no inmunoglobulina. De esta manera, en la presente invención se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la • especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-IL-8. Típicamente dichos polipéptidos de tipo no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o éstos se sustituyen por los dominios variables de un sitio que se combine con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio que se combine con el antígeno que tenga especificidad para IL-8 y otro sitio para combinación con el antígeno que tenga especificidad para un antígeno diferente. Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vi tro utilizando métodos conocidos en química de síntesis de proteína, incluyendo aquellos que involucran agentes entrelazadores. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato . Para confirmar que los anticuerpos inmuno-reaccionan específicamente con el epítope deseado, se puede evaluar la capacidad de los anticuerpos para unirse a IL-8 con una mutación en el epítope. Se podría esperar que una mutación en el epítope dé como resultado la incapacidad del anticuerpo contra el epítope para unirse a IL-8. Dicha unión de un anticuerpo a IL-8 se puede detectar sometiendo la IL-8 mutante a electroforesis en gel con SDS-PAGE seguido por análisis inmunoblot.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos efectuados y los resultados logrados, se proveen con propósitos ilustrativos únicamente y no se deben considerar como limitativos. Salvo que se indique de otra manera, los protocolos se efectúan en forma convencional y los reactivos comercialmente disponibles se utilizan de conformidad con las instrucciones de los fabricantes.

EJEMPLO 1 Creación del anticuerpo Inmunización Se desarrollan anticuerpos monoclonales humanos contra IL-8 de humano inmunizando en forma secuencial ratones XENOMOUSE® (XenoMouse® XMG2, Abgenix, Inc. Fremont, CA) . Se inmunizan cohortes de ratones XENOMOUSE® XMG2 con interleucina-8 recombinante de humano (rhIL-8). La inmunización BIP inicial (base de la cola mediante inyección subcutánea e intraperitoneo) se efectúa con 50 ug de rhIL-8 mezclada 1:1 v/v con coadyuvante completo de Freund (CFA) por ratón. Se efectúan refuerzos subsiguientes con 50 ug de rhlL-8 mezclada 1:1 v/v con coadyuvante incompleto de Freund (IFA) por ratón. Los animales se inmunizan en los días 0, 14, 28, y el día 42. Después se continúan las inmunizaciones para algunos ratones con 50 ug de rhIL-8 en coadyuvante de oro Titermax por vía intraperitoneal (en los días 146, 160, y en el día 181) y después con 10 ug de rhIL-8 en PBS intraperitoneal en el día 205. Se aplica un refuerzo final con 10 ug de rhIL-8 en PBS intraperitoneal en el día 226 (para dos ratones) y en el día 234 (para dos ratones) . El suero se recolecta justo antes del refuerzo final y el título anti-hIL8 se determina mediante ELISA.

Selección de animales para recolección Los títulos de anticuerpo anti-IL-8 se determinan mediante ELISA. Para la prueba ELISA, se une IL-8 de humano modificada con biotina a placas de estreptavidina a 0.25 ug/ml durante 1 hora a temperatura ambiente en placas de 96 cavidades. Cada placa se lava 5 veces con dH20, antes que se agreguen 90 µl de leche al 1% en PBS con 0.05% de azida de sodio a la placa. Se titulan sueros XENOMOUSE® provenientes ya sea de animales inmunizados con IL-8, o de animales XENOMOUSE® no afectados, en leche al 1%/PBS a una dilución 1:2 por duplicado a partir de una dilución inicial de 1:100. La última cavidad se deja como blanco. Después de 1 hora a temperatura ambiente las placas se lavan de nuevo 5 veces con dH20. Se agrega un anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, Pierce, Rockford, IL) específico de FC, anti-IgG de humano a una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan cinco veces con dH20. Las placas se revelan con la adición de substrato cromogénico TMB (Gaithersburg, MD) durante 30 minutos y la prueba ELISA se detiene mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Los títulos de anticuerpo específicos de animales XENOMOUSE® individuales se determinan a partir de la densidad óptica a 450 nm y varían entre 1:32,000 y 1:256,000. El título representa el recíproco de la dilución del suero y por lo tanto mientras más alto sea el número mayor será la respuesta inmune humoral hacia IL-8. I Se seleccionan animales XENOMOUSE® con título anti-IL-8 altos para la recolección y creación de anticuerpos monoclonales .

EJEMPLO 2 Anticuerpos anti-IL-8 de humano Cultivo y selección de células B Se recolectan células B a partir de los animales y se cultivan en placas. Las cavidades se someten a tamizaje mediante ELISA como se describió anteriormente para identificar las células B que producen anticuerpos específicos para IL-8, se identificaron 1063 cavidades como positivas para unión a IL-8.

Prueba de antígeno limitado Los anticuerpos específicos para IL-8 se clasifican después por afinidad mediante análisis de antígeno limitado' como se describió anteriormente (Véase, por ejemplo, Publicación del PCT WO/03048730A2 titulada "IDENTIFICATION 0F| HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" publicada el 12 de junio de 2003) .

Aislamiento de células B específicas para IL-8 mediante prueba de placa hemolítica Después se aislan células B individuales que secretan los anticuerpos de interés utilizando una prueba de placa hemolítica específica de rhIL8 (Babcook et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 93:7843-7848, 1996), utilizando eritrocitos de oveja (SRBCs) revestidos con el antígeno rhlL-8. Las células B que secretan la inmunoglobulina de interés se identifican mediante lisis específica mediada por anti-rhIL8 de los SRBCs en presencia del complemento. La célula plasmática específica de hIL-8 individual en el centro de la placa se aisla mediante micromanipulación .

Expresión de anticuerpos anti-IL-8 recombinantes Después de aislar las células plasmáticas individuales, se extrae el ARNm y se efectúa PCR de transcriptasa inversa para generar el ADNc que codifica para las cadenas pesada y ligera variables. La región de cadena pesada variable de humano se clona en un vector de expresión de IgG2. Este vector se genera clonando el dominio constante de IgG2 de humano en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3. l+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON) . La región de cadena ligera variable de humano se clona en un vector de expresión de IgK. Estos vectores se generan clonando el dominio constante de IgK de humano en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3. l+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON) . Los vectores de expresión de la cadena pesada y de la cadena ligera se co-lipofectan después en una placa de 60 mm de células 293 de riñon embrionario de humano confluentes al 70% y se deja que las células transfectadas secreten un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica a la de la célula plasmática original durante 24-72 horas. El sobrenadante se recolecta a partir de las células HEK 293 y la secreción de un anticuerpo intacto se demuestra con una prueba ELISA en emparedado para detectar específicamente IgG de humano. La especificidad se evalúa a través de unión del anticuerpo recombinante a rhIL-8 utilizando ELISA como se describió anteriormente.

Purificación de anticuerpos anti-IL-8 recombinantes Para producción a escala más grande, los vectores de expresión de las cadenas pesada y ligera (2.5 µg de cada cadena/placa) se lipofectan en diez placas de 100 mm que están al 70% de confluencia con células HEK 293. Las células transfectadas se incuban a 37°C durante 4 días, se recolecta el sobrenadante (6 ml) y se reemplaza con 6 ml de medio nuevo. En el día 7, el sobrenadante se retira y se combina con la recolección inicial (120 ml totales a partir de las 10 placas) . Cada anticuerpo se purifica del sobrenadante utilizando una cromatografía por afinidad de Proteína-A Sefarosa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (1 mL) . El anticuerpo se eluye de la columna de Proteína-A con 500 µl de Glicina 0.1 M, pH 2.5. El eluato se dializa en PBS pH 7.4 y se esteriliza mediante filtración. El anticuerpo se analiza mediante SDS-PAGE no reductora para evaluar la pureza y rendimiento. La concentración también se mide mediante análisis UV a una D.O de 280 y mediante ELISA.

EJEMPLO 3 Análisis cinético Las mediciones cinéticas de los anticuerpos anti-IL-8 se efectúan utilizando el método KinExA®. Este método provee una determinación basada en solución de la afinidad formal en el equilibrio.

Preparación de glóbulos revestidos con antígeno Se copulan cincuenta µg de rhIL-8 con Sefarosa 4B activada con CNBr. De manera alternativa, se copulan 25 µg/ml o 100 µg/ml de rhIL-8 con sefarosa activada con NHS. Los I grupos activos remanentes en los glóbulos se bloquean en lai forma recomendada por el fabricante. Después, los glóbulos se bloquean finalmente con 10 mg/ml de BSA en Tris 1 M y sei almacenan en la solución para bloqueo.

Pruebas de equilibrio KinExA Los experimentos con KinExA se efectúan utilizando un sistema de prueba inmunológica de flujo automatizado, KinExA 3000 [Ohmura et al, Anal. Chem. 73:3392, 2001] en el cual los glóbulos copulados con rhIL-8 sirven como la fase sólida. Se incuba una cantidad constante de anticuerpo entre 0.67 y 5000 pM de concentración de sitio de unión activo con concentraciones para titulación de antígeno de rhIL-8 comenzando en 100 nM en solución reguladora para muestra (PBS con 0.1% de BSA) para reducir la unión no específica. Se incuban complejos de antígeno/anticuerpo a temperatura ambiente durante 36 horas hasta 144 horas para permitir que se llegue al equilibrio. La mezcla se hace pasar a través de los glóbulos copulados con rhIL-8 para acumular el anticuerpo no unido. El mAb anti-hIL-8 capturado es directamente proporcional a los sitios de unión libres remanentes y se detecta utilizando soluciones que contienen anti-anticuerpo humano secundario conjugado con Cy5 en solución reguladora para muestra. Se varían las concentraciones, volúmenes, y velocidades de flujo de las soluciones de anticuerpo secundario para optimizar la relación señal a ruido en cada experimento. Las señales unidas se convierten a valores relativos como una proporción de control en ausencia de rhlL-8. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se obtiene a partir del análisis de regresión no lineal de los datos utilizando un modelo de unión homogéneo de un sitio contenido dentro del software [Blake et Al., Anal. Biochem. 272:123, 1999; Jones et al., Bioconjug Chem 13:408, 2002]. El software calcula la Kd y determina el intervalo de confianza al 95% ajustando los puntos de datos a una curva de Kd teórica. El intervalo de confianza al 95%se da como Kd baja y Kd alta. Para determinar los datos de Kd en la Tabla 3, se mezclan diluciones en serie de rhIL-8 con los mAbs anti-hIL-8 respectivos y se permite que lleguen al equilibrio durante 36 horas. Se mide una cantidad proporcional de mAb libre presente en la mezcla en equilibrio haciendo fluir 0.25 ml a 3 ml de la muestra sobre rhIL-8 copulada con glóbulos de sefarosa activados con CNBr y se detecta utilizando 1.0 ml de anti-anticuerpo secundario específico de fragmento FC? de IgG de humano, de cabra, marcado con Cy5 a una concentración de 1.7 µg/ml. Cada muestra se corre por triplicado. La Kd se calcula utilizando el software KinExA y el intervalo de confianza al 95% se da como el intervalo de Kd.

TABLA 3 TABLA 3 (cont. ) Determinación de la señal Con el fin de efectuar una medición exacta de la Kd mediante KinExA, la concentración de sitio de unión de anticuerpo activo debe estar cerca o debajo de la Kd real. Para medir anticuerpos con afinidades muy altas (valores de Kd muy bajos) , es necesario trabajar a concentraciones picomolares bajas del sitio de unión del anticuerpo. A estas concentraciones bajas de anticuerpo se necesita optimizar adicionalmente la sensibilidad de la prueba. Para incrementar la sensibilidad de detección de los anticuerpos libres, se examinan las concentraciones de recubrimiento de los glóbulos, los parámetros de muestreo, así como marcadores diferentes .

Ajuste del recubrimiento de los glóbulos y del anticuerpo secundario marcado La inmovilización de algunos antígenos en glóbulos puede alterar su capacidad para unirse a los anticuerpos debido a impedimento estérico mediante recubrimiento pasivo o destrucción de epítopes mediante copulación reactiva de cadenas laterales. Para incrementar la señal en el paquete de glóbulos, se copula IL-8 a glóbulos de NHS-Sefarosa y se evalúa la saturación de glóbulo, como se describe (Ohmura et al., Anal . Chem . , 73:3392-9, (2001)). Se determina que no hay ganancia de señal por encima de una concentración de copulación de 100 µg/ml de antígeno. A 25 µg/ml de antígeno, se observa aproximadamente 70% de la señal máxima. Los glóbulos se copulan con 100 µg/ml de rhIL-8 para los experimentos de concentración baja de anticuerpo (Kd controlada) . Se copulan glóbulos de NHS-Sefarosa con 25 µg/ml de rhIL-8 para los experimentos de concentración alta de mAb y experimentos cinéticos para conservar antígeno. Se inspeccionan diferentes anti-anticuerpos secundarios de humano marcados con Cy5 para identificar uno que pudiera dar la relación señal a ruido más alta. Se examina una solución 100 pM de mAb anti-hIL-8 con varias marcas secundarias (marca específica de (H+L) anti-IgG de humano, de cabra, marca específica de fragmento Fcy o marca específica anti-Fab de humano, de ratón) . La relación señal a ruido más alta se genera utilizando la marca específica de Fcy (9.9 veces más alta que el fondo) . Este anti-anticuerpo secundario de humano, de cabra, específico de fragmento Fc? se utiliza para mediciones subsiguientes de equilibrio y cinética.

Determinación de volumen de la muestra y velocidad de flujo Debido a que el análisis de equilibrio inicial de unos cuantos mAbs anti-hIL-8 muestra valores de Kd picomolares bajas a sub-picomolares con intervalos de confianza al 95% más amplios (Tabla 3; mAb 809, 837, 861, 928), se manipulan entonces el volumen de la muestra y las velocidades de flujo. Se analiza la señal de 100 pM de mAb anti-hIL-8 ya sea haciendo fluir 0.5 ml a 0.25 ml/min o 3.0 ml a 1.5 ml/min durante 120 segundos. Se determina que al' incrementar el volumen de muestra y la velocidad de flujo se obtiene una señal aproximadamente 20% más alta. La concentración de mAb 928 anti-hIL-8 se reduce después a 2 pM y se efectúa una prueba de señal haciendo fluir 30 ml a 1.5 ml/min durante 1200 segundos. Se obtiene una buena señal.

Tiempo para alcanzar el equilibrio y viabilidad de ¡ la muestra j La concentración de sitio de unión de anticuerpo se i reduce a 1 pM, para medir las Kd picomolares bajas a sub-picomolares de los mAbs. A esta concentración muy baja de anticuerpo, las muestras requieren un intervalo de tiempo más largo para alcanzar el equilibrio. Utilizando la curva de Kd obtenida a una concentración baja de mAb y la kas0c medida ai I partir del experimento de cinética, se estima que el tiempo! . i I I mínimo necesario para alcanzar el equilibrio es de seis días, ¡ , ¡ ! utilizando el software para curva de teoría cinética de Sapidyne Instruments Inc. De lo contrario, se podría determinar experimentalmente si la mezcla antígeno-anticuerpo alcanza o no el equilibrio midiendo el mAb libre que queda en solución, el cual debe permanecer constante durante lasi mediciones por triplicado, si es que se ha alcanzado el! ? ' equilibrio. Después se inspecciona la viabilidad de mAb 928' anti-hIL-8 1 pM a tiempos de incubación de 0, 3 y 6 días y se encuentra que la actividad del anticuerpo no se reduce durante este periodo a temperatura ambiente. Posteriormente, se deja que todas las reacciones de equilibrio tomen lugar¡ I durante 6 días. i Mediciones de equilibrio de mAbs que tienen afinidad picomolar baja Se repiten las mediciones de Kd utilizando KinExA para los mAbs que tiene Kd menores de 20 pM e intervalos de confianza al 95% amplios con parámetros mejorados para copulación de glóbulos, volumen de muestra, velocidad de flujo marca-anticuerpo secundario. Para determinar los datos de Kd en la Tabla 4, se mezclan diluciones en serie de rhIL-8 con los mAbs anti-hIL-8 respectivos a las concentraciones de sitio de unión mostradas en la Tabla 4 y se deja que lleguen al equilibrio durante 36 horas para la concentración alta de sitio de unión de cada mAb, o durante 144 horas para la concentración baja de sitio de unión de cada mAb. Se mide una cantidad proporcional de mAb libre presente en la mezcla en equilibrio en KinExA bajo condiciones optimizadas. Por ejemplo, para las mezclas que contienen la concentración baja de mAb, se hacen fluir 18-36 ml de la muestra a través de rhIL-8 copulada a glóbulos de sefarosa activados con NHS y se detecta utilizando 1-2 ml de anti-anticuerpo secundario específico de fragmento Fc? de IgG de humano, de cabra, marcado con Cy5 a una concentración de 2.0 µg/ml. La Kd se calcula utilizando el software KinExA mediante el uso de la selección "análisis de curva n" . Esta selección de "análisis de curva n" permite que se pueda obtener un valor de Kd preciso (Tabla 4) ajustando todas las curvas dadas a un solo valor de Kd en forma simultánea y el intervalo de confianza al 95% se da como el intervalo de Kd. El análisis de curva n produce un valor preciso de Kd.

TABLA 4 Se efectúa un número de experimentos para análisis de curva n del mAb 928. En estos experimentos el mAb 928 se utiliza ya sea cerca de la concentración de Kd, o a una concentración de aproximadamente 15-20 veces más alta que la Kd. Mediante análisis de curva n, se determina que la Kd del mAb 928 es de 613 fM (Kd alta = 935 fM y Kd baja = 380 fM) , la cual es muy cercana a la Kd determinada mediante experimentos de concentración baja de mAb analizados en curvas individuales (590 ± 220 fM) . La distribución de Kd de mediciones individuales del mAb 928 se provee en la figura 3.

Pruebas cinéticas KinExA Para medir la constante de la velocidad de asociación utilizando KinExA, se utilizan los mismos glóbulos copulados a rhIL-8 como la sonda y se emplea el método "cinética, directo". Los experimentos "cinética, directo" utilizando KinExA son idénticos a las pruebas de equilibrio KinExA con respecto a la altura de columna de glóbulo, captura de anticuerpo, concentración de anticuerpo y detección de anticuerpo. Brevemente, el mAb se mezcla con una cantidad de antígeno que ligue aproximadamente el 80% del mAb en los experimentos de equilibrio y el anticuerpo libre presente en la muestra se sondea repetidamente, previo al equilibrio. Debido a que las señales de unión son proporcionales a la concentración de anticuerpo libre en la solución, las señales decrecen con el tiempo hasta que la solución se equilibra. Se varían los volúmenes y velocidades de flujo de las mezclas antígeno-mAb y del anticuerpo secundario marcado con Cy5 en función del mAb evaluado. Los datos se analizan utilizando el software para análisis KinExA que viene con el instrumento KinExA 3000. Este software representa en forma gráfica el decremento en las señales de unión con el tiempo, y ajustar los puntos de datos recolectados a una solución exacta de las ecuaciones diferenciales cinéticas para unión. A partir de esta curva, se determina una solución óptima para la kas?c- La kdlS0C se calcula indirectamente a partir de las soluciones para la kasoc y la Kd.

Mediciones de velocidad de asociación de mAbs de alta afinidad La medición de velocidad de asociación mediante KinExA no está limitada por la concentración del mAb utilizada en el experimento. Por lo tanto, las mediciones de kasoc para los anticuerpos de muy alta afinidad no requieren optimizaciones adicionales. La kasoc medida y la kdlsoc calculada se dan en la Tabla 5. La concentración de mAb utilizada para los experimentos de velocidad de asociación es la misma que aquella utilizada en los experimentos de unión en equilibrio. Se mezcla una cantidad de IL-8 que liga al 80% del mAb en experimentos de unión en equilibrio con el mAb. Se mide la cantidad de mAb libre que queda en la mezcla en KinExA haciendo fluir 1 ml de la mezcla repetidamente a través de rhIL-8 copulada a glóbulos de sefarosa activada con NHS y se detecta utilizando 1 ml de anti-anticuerpol secundario específico de fragmento FC? de IgG de humano, de cabra, marcado con Cy5 a una concentración de 2.0 µg/ml. La, kasoc se mide utilizando el software KinExA mediante el método "cinética, directo" y los intervalos de confianza al 95% se proveen como intervalo de kasoc. La kdlsoc para el mAb se calcula a partir de la kasoc y Kd medidas del mAb¡ I , respectivo.

TABLA 5 ¡ , EJ?MPLO 4 Análisis estructural de los anticuerpos Se determina la secuencia de las cadenas pesadas variables y de las cadenas ligeras variables para los anticuerpos mostrados en la Tabla 3 anterior para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para estos anticuerpos anti-IL-8 se muestra en el listado de secuencias enviado junto con la presente, incluyendo las secuencias de nucleótido y de aminoácido. La figura 4A es una comparación que muestra varias regiones de cadena pesada de anticuerpo derivadas de XENOMAX® para una región de cadena pesada de línea germinal particular. La figura 4B es una comparación que muestra varias regiones de cadena ligera de anticuerpo derivadas de XENOMAX® para una región de cadena ligera de línea germinal particular.

EJEMPLO 5 Identificación del epitope ligado por ABX-IL-8 Despliegue de fago Para determinar el epítope ligado por ABX-IL-8, se despliega una genoteca combinatoria de 12-meros de péptido aleatoria a partir de la proteína IL-8 en fago filamentoso. La inspección visual se efectúa en inmuno-tubos (Nunc Cat. No. 470319). Se utiliza el anticuerpo ABX-IL-8 (10 µg/ml) suspendido en una solución reguladora para revestimiento de ELISA para revestir los inmuno-tubos con agitación suave durante la noche a 4°C. Los tubos se bloquean después durante 1 hora con TBS, 2% de leche descremada, y 2 x 1012 fagos (Estuche de genoteca de péptido para despliegue de fago Ph.D. -12 de New England Biolabs, Inc.), se inspeccionan visualmente en un volumen total de 3 ml de TBS que contiene 2% de leche descremada y se agita suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente. El fago que no se une se elimina con 20 lavados que contienen TBS, 0.1% de Tween-20. El fago unido a inmuno-tubos revestidos con anticuerpo ABX-IL-8 se eluye con 1 ml de solución reguladora 0.1 M de glicina-HCl (pH 2.2).

Además, el eluato se neutraliza con 150 ml de Tris-HCl 1 M (pH 9.1) y se utiliza para infectar células ER2738 de E . coll para amplificación adicional del fago. Después de tres rondas de inspección visual para selección, se confirma la unión específica de clones de fago que despliegan el epítope a los anticuerpos ABX-IL-8 mediante una prueba ELISA para fago efectuada en las cavidades recubiertas con anticuerpo. Se efectúa la determinación automatizada de secuencia de ADN para identificar la secuencia de aminoácido de clones positivos que interactúan con los tubos recubiertos con anticuerpo ABX-IL-8. Las secuencias se alinean después hasta los residuos 15 a 21 de la proteína IL-8. La secuencia de aminoácido de consenso entre estas secuencias que se identifica es KPXPXF (SEQ ID NO. 63; FIG. 5) . El guión en la figura 5 no representa una secuencia conservada y solamente indica la ausencia de un aminoácido.

Espectrometría de masas Además, se efectúa la espectrometría de masas en fragmentos del antígeno de IL-8 que se pueden unir a los anticuerpos ABX-IL-8 inmovilizados. Para la inmovilización de los anticuerpos ABX-IL-8, se aplican como una mancha 3 µg del anticuerpo ABX-IL-8 en un chip PS2 (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA) y se incuban durante la noche en una cámara húmeda con agitación a 4°C.

Los sitios activos residuales se bloquean después con etanolamina 1 M, pH 8.0. Los chips se lavan dos veces con PBS que contiene 0.5% de Tritón-X 100 durante 5 minutos a temperatura ambiente. El chip lavado se incuba con Tris 0.1 M, pH 8.0 durante 30 minutos. El chip se incuba adicionalmente con NaCl 0.5 M en PBS durante 5 minutos y después con tres lavados que contienen PBS. La preparación de proteína IL-8 para análisis por espectrometría de masas incluye un número de pasos para asegurar la digestión óptima de la proteína mediante Glu-C. La proteína IL-8 se somete a desnaturalización, reducción, y metilación lo cual evita la formación de puentes de disulfuro entre los residuos cisteína en la proteína. Por consiguiente, la proteína IL-8 se desnaturaliza mezclando 10 µg de IL-8 (1 µg/µl) con clorhidrato de guanidina 8 M y se reduce agregando DTT 20 mM a la mezcla de IL-8. Para el mezclado apropiado de los reactivos, la mezcla se agita después a 75 rpm durante 30 minutos a 37°C. Para la metilación de IL-8, se agrega ácido yodoacético en NaOH 12.5% a la mezcla de IL-8. La mezcla se somete a acción de remolino suave y se incuba en el agitador a 75 rpm durante 30 minutos a 37°C en la oscuridad. La reacción se detiene con DTT 100 mM y se somete a acción de remolino suavemente. Para eliminar los reactivos de desnaturalización, reducción y metilación, la mezcla de IL-8 se somete a diálisis contra bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7.8 en un aparato para diálisis minidialyzer MWCO 3500 durante 3-4 horas. Se digieren 5 µg de la IL-8 desnaturalizada, reducida, y metilada IL-8 con 500 ng de Glu-C a una relación de Glu-C a proteína de 1:10. Se agregan 10 µl de Glu-C 0.1 µg/µl a 5 µg de proteína IL-8 en un volumen final de 60 µl. La mezcla se incuba durante la noche en un baño de agua a 25°C con agitación suave a 50 rpm. La reacción de digestión con enzima se detiene incubando la mezcla a 55°C durante 10 minutos. La IL-8 digerida, metilada se aplica después como una mancha sobre chips PS2 inmovilizados con ABX-IL-8. Para la unión, 5 µl de la proteína IL-8 metilada y digerida se aplican como mancha en el chip y se incuban en una cámara húmeda con agitación durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Las manchas no se lavan para obtener el mapa del i ! péptido completo, aunque algunas manchas se lavan con PBS que i contiene 0.16% de Tritón-XlOO, seguido por lavados con lavados de HPLC con el fin de identificar la secuencia del fragmento que se une específicamente a los anticuerpos ABX-IL-8. Una vez inmovilizado en el chip, el antígeno de IL-8 se1 digiere con Glu-C, una endoproteasa que corta específicamente los enlaces peptídicos en el lado carboxilo-terminal de los I residuos de aminoácido de ácido glutámico (E) . El chip se| I I lava con tres lavados con PBST para eliminar cualquier; producto no unido. Además, se analizan los fragmentos de IL-8¡ unidos y se identifican mediante SELDI tomando como base sus pesos moleculares.

Análisis basado en SELDI de IL-8 unida a los anticuerpos ABX-IL-8 inmovilizados Después que los fragmentos de IL-8 se incuban con los chips PS2 ligados con ABX-IL-8, las manchas no se lavan o se lavan con Tritón-XlOO al 0.16% en PBS seguido por lavados con agua para HPLC. Las manchas que no se lavan se utilizan para la identificación del mapa de péptido completo de los fragmentos de IL-8. Las manchas que se lavan se utilizan para identificar el fragmento o epítope de IL-8 que interactúa específicamente con los anticuerpos ABX-IL-8. Además, se disuelven 5 mg de molécula 1 absorbente de energía (EAM-1) en 0.25 ml de CH3CN al 50% que contiene 0.5% de TFA. Se efectúa una dilución 1:25 de la solución de EAM-1 en CH3CN al 10% que contiene 0.5% de TFA, y 0.5 µl de la solución diluida de EAM-1 se aplican como mancha sobre las manchas de IL-8 y se deja secar. Los fragmentos de péptido IL-8 se analizan mediante espectrometría de masas a una intensidad de 190 y 200. Se identifica una secuencia de 20 aminoácidos, localizada en los residuos 5 a 24 de la proteína IL-8, con una masa molecular de 2466.315 y la secuencia "LRCQCIKTYSKPFHPKFIKE" (SEQ ID NO: 62) como el fragmento que más fuertemente se une al anticuerpo ABX-IL-8. El análisis de espectrofotometría de masas de este fragmento se muestra en la figura 6. También se encuentra que otro fragmento relacionado KPFHPKFIKELR (SEQ ID NO: 84), el cual contiene varios aminoácidos en común con SEQ ID NO: 62 se une al anticuerpo ABX-IL-8. i Mutagénesis dirigida a sitio de IL-8 Para determinar si los aminoácidos específicos de la proteína IL-8 son necesarios o no para la interacción entre IL-8 y el anticuerpo ABX-IL-8, IL-8 se somete a mutación mediante mutagénesis dirigida a sitio y se analiza posteriormente mediante inmunoblot respecto a la capacidad para unirse al anticuerpo ABX-IL-8. Por ejemplo, se encontró que la prolina en la posición de aminoácido 16 de IL-8 es necesaria para la unión de los anticuerpos ABX-IL-8 a IL-8. Se genera una fusión de glutatión-S-transferasa (GST) que contiene IL-8 mutada en la posición de aminoácido 16. También se genera una fusión de GST que contiene IL-8 de tipo silvestre y se utiliza como un control positivo para estudios de unión. Las fusiones se expresan cada una en E. coli . Las células de E . coli que expresan las fusiones de GST se lisan y las fusiones de GST se purifican por afinidad con glutatión-Sefarosa y posteriormente, se somete a SDS-PAGE y análisis de inmunoblot. Los anticuerpos primarios utilizados para la detección de IL-8 puede ser cualquiera de anticuerpo anti-GST o anticuerpo ABX-IL-8, y los anticuerpos secundarios utilizados se copulan con peroxidasa de rábano. ' Los resultados del análisis de inmunoblot (FIG. 7) muestran que la mutación de la prolina en la posición de aminoácido 16 de IL-8 elimina la unión de los anticuerpos ABX-IL-8 a IL-8. La detección con alfa-GST da como resultado bandas tanto para el tipo silvestre como para el mutante de prolina. Sin embargo, la detección con ABX-IL-8 da como resultado bandas solamente para IL-8 de tipo silvestre, y ninguna banda para el mutante de prolina de IL-8 en la posición 16. La unión de los anticuerpos de GST a las fusiones de GST-IL-8 no se ven afectadas por la mutación de la prolina. Por consiguiente, el epítope para el anticuerpo ABX-IL-8 probablemente contiene la prolina en la posición de aminoácido 16 de IL-8.

EJEMPLO 6 Identificación del epitope ligado por varios anticuerpos ABXha-IL-8 También se determina el epítope para varios de los anticuerpos ABXha-IL-8. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 6. Brevemente, se preparan péptidos de IL-8 que se traslapan, los cuales son cada uno dos aminoácidos C-terminales con respecto al péptido previo (como se muestra en la figura 8) y se unen a una membrana. Después se agregan los anticuerpos y se deja que se unan a los péptidos.

TABLA 6 Como se puede observar a partir de los resultados en la tabla 6, los anticuerpos 809, 837, y 928 se unen a un epítope diferente que el de los anticuerpos descritos en el ejemplo 5 (o al epítope que está contenido dentro de SEQ ID NO: 84). Por lo tanto, parece ser que existen epítopes alternativos y que la secuencia de péptido ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) tiene un epítope o epítopes con afinidad especialmente alta. Además de determinar que los anticuerpos ABX-IL-8 y los anticuerpos ABXha-IL-8 se unen a péptidos, y por lo tanto a epítopes, relativamente diferentes también se determina si los diversos anticuerpos compiten o no entre sí. Se determina que mAb 837 compite con K221, mientras que los mAbs 809 y 928 compiten con ABX-IL-8. Por lo tanto, existe un número de epítopes de unión relativamente distintos para estos anticuerpos dentro de estos péptidos. También se examina la especificidad y singularidad de dos de los anticuerpos determinando si los péptidos que se unen a anticuerpos particulares (928 y 809) también pueden ser ligados por ABX-IL-8. Se determinó que existe un número de péptidos que pueden ser ligados por los mAbs 809 y 928 (ABXha-IL-8) , pero no por ABX-IL-8. La figura 9 muestra varios péptidos que pueden ser ligados por Ab 809, los cuales son inhibidos por IL-8, pero no son ligados por ABX-IL-8. La figura 10 muestra dos péptidos (y una secuencia de consenso) que pueden ser ligados por el Ab 928, los cuales son inhibidos por IL-8, pero no son ligados por ABX-IL-8. Por lo tanto, los epítopes entre ABX-IL-8 y ABXha-IL-8 parecen ser relativamente distintos.

EJEMPLO 7 Unión del anticuerpo ABXha-IL-8 a IL-8 de tipo silvestre y a IL-8 mutante Además de los ejemplos anteriores, se puede examinar la ubicación de los diversos epítopes en una manera alternativa. Por ejemplo, la alteración de un aminoácido y observando como éste afecta la unión de los diversos anticuerpos puede indicar no solamente si dicho aminoácido está implicado en el epítope, sino también si varios anticuerpos comparten el mismo epítope. Se cree que los anticuerpos 928 y 809, aunque probablemente muy sensibles a la mutación de prolina (debido a posibles cambios de configuración en el epítope) , pueden retener alguna cantidad pequeña de capacidad de unión, incluso con la deleción de una prolina en IL-8. Sin embargo, se cree que el anticuerpo 837 puede ser menos influenciado por una mutación de prolina, ya que se cree que se une a otro epítope que está más lejos del epítope de ABX-IL-8.

EJEMPLO 8 Inhibición de actividad quimiotáctica de neutrófilo en esputos de pacientes de COPD mediante anticuerpos anti-IL-8 El ejemplo demuestra que los anticuerpos funcionan en la inhibición de actividad quimiotáctica de neutrófilos en esputos provenientes de pacientes que tienen COPD. Se obtienen muestras de esputo a partir de pacientes que tienen COPD. Después se aislan neutrófilos a partir de la sangre periférica de donadores normales utilizando métodos previamente establecidos. (Véase Ferrante, A. y Thong, Y.H. A Rapid One-step Procedure for Purification of Mononuclear and Polymorphonuclear Leukocytes from Human Blood Using a Modification of the Hypaque-Ficoll Technique, J. Immunol . Methods 24:389-393 (1978)). Brevemente, se recolecta sangre en heparina y se tiende sobre Ficoll. Los neutrófilos se aislan y lavan cuatro veces antes de ser utilizados. Las células después se vuelven a suspender a 4 x 106/ml en medio RPMI que contiene 0.5% de seroalbúmina de bovino. La actividad quimiotáctica de los neutrófilos en el esputo se determina utilizando una cámara de Boyden. Se utilizan dos diluciones de esputo (1:10 y 1:100) y se colocan (por triplicado) dentro de las cámaras inferiores. Se colocan 50 µl de una suspensión de 4 x 106 neutrófilo/ml dentro de las cámaras superiores. Cada dilución de esputo se analiza sola y en presencia de 25 µg/ml del anticuerpo anti-IL-8 de humano, se determina una cantidad (para otros anticuerpos de IL-8) para neutralizar >90% de la actividad quimiotáctica generada con IL-8 10 nM. Se utiliza un filtro de policarbonato con tamaño de poro de 5 µl para separar las cámaras . Después de 45 minutos a 37 °C, las células no migratorias de la superficie superior del filtro se retiran mediante raspado y el lado inferior del filtro se tiñe con tinción Diff-Quik™. El número de células que migran se cuenta mediante microscopía de luz. La migración absoluta se determina restando cualquier migración aleatoria observada proveniente de aquellas cavidades que no contienen ningún esputo . Los resultados proveen datos para demostrar la quimiotaxis de neutrófilos como una función de la concentración del anticuerpo (µg/ml) para varias concentraciones de IL-8, (1 nM y 10 nM) . Esto también demuestra la concentración requerida para neutralizar la actividad quimiotáctica de neutrófilo.

EJEMPLO 9 Inhibición de inflamación de pulmón mediante administración in vivo de anticuerpos contra IL-8 Para evaluar la utilidad potencial de la administración sistémica de anticuerpos contra IL-8 (o "anticuerpos anti-IL-8") como un tratamiento para COPD, se puede establecer un modelo de inflamación pulmonar en rata, inducida por IL-8 mediante administración intra-traqueal (i.t.) de IL-8 de humano. Las ratas reciben un control de vehículo (PBS + 0.1% de seroalbúmina de bovino con bajo contenido de endotoxina), 0.3 microgramos de IL-8 de humano, 1 microgramo de IL-8 de humano, y 3 microgramos de IL-8 de humano por vía intra-traqueal. Cuatro horas después de la instilación i.t., se efectúa el lavado bronquioalveolar (BAL) utilizando 3 alícuotas de 5 ml de solución salina. El fluido del BAL se analiza respecto a la cuenta total y diferencial de leucocitos. La administración intra-traqueal de IL-8 de humano (0.3, 1, y 3 microgramos) induce una migración de neutrófilos dependiente de la dosis hacia las vías respiratorias de las ratas aún cuando las ratas no expresen IL-8. Tomando como base estos resultados, se selecciona una ? dosis de IL-8 de humano para los estudios posteriores debido a que esta dosis dará como resultado el nivel más alto de migración de neutrófilos hacia los pulmones. La administración por vía intravenosa de 5 mg/kg de un anticuerpo contra IL-8 puede dar como resultado inhibición significativa de migración y acumulación de neutrófilos hacia vías respiratorias inducida por IL-8 lo que indica que la exposición sistémica al anticuerpo contra IL-8 puede neutralizar IL-8 de vías respiratorias e inhibir la inflamación de vías respiratorias y de pulmones.

EJEMPLO 10 Tratamiento de COPD en humanos Se identifica un paciente que padezca de COPD. Se administra una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo anti-IL-8 mediante inyección intravenosa al paciente. Se aplica una administración de refuerzo tres semanas más tarde, y cada tres semanas después de ésta. El anticuerpo anti-IL-8 causa una inhibición parcial o completa de quimiotaxis de neutrófilo en los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de quimiotaxis de neutrófilo reduce la gravedad de daño al tejido a los pulmones y vías respiratorias ocasionado por la respuesta inmune del paciente.

EJ?MPLO 11 Tratamiento de bronquitis crónica en humanos Se identifica un paciente que padece de COPD caracterizada por bronquitis crónica. Se administra una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo anti-IL-8 mediante inyección intravenosa al paciente. Se aplica una administración de refuerzo tres semanas más tarde, y cada tres semanas después de ésta. El anticuerpo anti-IL-8 causa una inhibición parcial o completa de quimiotaxis de neutrófilo en los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de quimiotaxis de neutrófilo reduce la gravedad de daño al tejido a los pulmones y vías respiratorias ocasionado por la respuesta inmune del paciente.

EJEMPLO 12 Tratamiento de enfisema en humanos Se identifica un paciente que padece de COPD caracterizada porque enfisema. Se administra una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo anti-IL-8 mediante inyección intravenosa al paciente. Se aplica una administración de refuerzo tres semanas más tarde, y cada tres semanas después de ésta. El anticuerpo anti-IL-8 causa una inhibición parcial o completa de quimiotaxis de neutrófilo en los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de quimiotaxis de neutrófilo reduce la gravedad de daño al tejido a los pulmones y vías respiratorias ocasionado por la respuesta inmune del paciente .

EJEMPLO 13 Tratamiento de asma "irreversible" en humanos Se identifica un paciente que padece de COPD caracterizada por asma en etapa tardía o "irreversible". Se¡ administra una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo anti-IL-8 mediante inyección intravenosa al paciente. Se aplica una administración de refuerzo tres semanas más tarde, y cada tres semanas después de ésta. El anticuerpo anti-IL-8 causa una inhibición parcial o completa de quimiotaxis de neutrófilo en los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de quimiotaxis de neutrófilo reduce la gravedad de , daño al tejido a los pulmones y vías respiratorias ocasionado | I por la respuesta inmune del paciente. i EJEMPLO 14 Tratamiento de neumonía bacteriana Los neutrófilos migran hacia el pulmón en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo infección por Streptococcus pneumoniae . Para determinar si los anticuerpos anti-IL-8 de la presente invención pueden o no inhibir dicha migración de neutrófilo, y por lo tanto mejorar la inflamación en el pulmón, se puede utilizar un modelo de neumonía en conejo. Brevemente, a conejos blancos Nueva Zelanda anestesiados se les administran instilaciones intrabronquiales de Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, o Pseudomonas aeruginosa (3 x 109 organismos/ml) combinado con cualquiera de anticuerpo contra IL-8 o una IgG de control (concentración final 0.5 mg/ml) y carbón coloidal (5%) en un volumen total de 0.5 ml . Después de 3 horas y 50 minutos, los conejos pueden recibir una inyección intravenosa de microesferas radiomarcadas para medir el flujo sanguíneo pulmonar. A las 4 horas, se extirpa en corazón y pulmones y se separan los pulmones. La región neumónica (normalmente el lóbulo inferior izquierdo) y la región correspondiente en el pulmón contralateral se lavan utilizando solución salina regulada con fosfatos. Se obtienen cuentas de leucocitos totales utilizando un hemocitómetro en el fluido de lavado y las cuentas diferenciales se pueden efectuar en preparaciones de centrifugación citológica (cytospin) teñidas con tinción de Wright. El tratamiento con anticuerpos anti-IL-8 (por ejemplo, anticuerpos contra IL-8) puede reducir en forma significativa el número de neutrófilos presentes en el fluido del BAL en comparación con animales que se tratan con IgG de ratón de control de isotipo. Por lo tanto, los anticuerpos anti-IL-8 pueden reducir efectivamente la emigración de neutrófilo en el pulmón con neumonía. I Se considera que la descripción escrita anterior es I suficiente para permitir que un experto en la técnica lleve a la práctica la invención. La descripción y ejemplos anteriores presentan en forma detallada ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciará que sin importar qué tan detallado pueda parecer lo anterior en! i el texto, la invención se puede llevar a la práctica en, muchas maneras y la invención se debe considerar de conformidad con las reivindicaciones anexas y con cualesquiera equivalentes de los mismos. Todas las referencias citadas en la presente invención, incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en los mismos, hasta el grado en que éstas no estén ya incorporadas, quedan incorporadas en la presente invención para referencia en su totalidad.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a interleucina-8 , caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno se une con una Kd menor de 10 pM.

2.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno se une con una Kd menor de 1 pM.

3.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno se une con una Kd menor de 500 fM.

4.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno se une con una Kd menor de 10 fM según se determina mediante una prueba de exclusión cinética.

5.- Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a un epítope de un polipéptido, caracterizado porque el epítope comprende la secuencia de aminoácido ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) .

6.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se une a dicho epítope con una Kd menor de aproximadamente 1 pM.

7. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se une a dicho epítope con una Kd menor de aproximadamente 500 fM.

8. - Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a un polipéptido, caracterizado porque el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácido ELRCQCIKTYSK (SEQ ID NO: 79) .

9.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo reduce la unión de IL-8 a un receptor de IL-8.

10.- El uso de por lo menos un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1-9, 13 o 15-25 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con interleucina-8.

11.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el trastorno relacionado con interleucina-8 se selecciona a partir del grupo que consiste de: un tumor maligno, melanoma maligno de interleucina-8, carcinoma de célula renal (RCC), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tejido mamario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro y tumores del esófago, enfermedad inflamatoria, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino, trastorno pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática, enfermedades inflamatorias agudas, enfermedades gastrointestinales, neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, y fibrosis quística.

12.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el trastorno relacionado con interleucina-8 se selecciona a partir del grupo que consiste de: melanoma maligno de interleucina-8 , trastornos pulmonares, una condición inflamatoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino.

13.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo reduce la quimiotaxis mediante unión a IL-8 y eliminación de IL-8 desde un sitio de inflamación.

14.- Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 13 o 15-25.

15.- Un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-8, caracterizado porque dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, y porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, y una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una de dichas secuencias.

16.- Un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-8, caracterizado porque dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, y porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, y 45, y una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una de dichas secuencias.

17.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, y una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una de dichas secuencias.

18.- Un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-8, que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia CDRl de cadena pesada, una secuencia CDR2 de cadena pesada, y una secuencia CDR3 de cadena pesada, porque la secuencia CDRl de cadena pesada se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 26-35 de SEQ ID NO: 7, 11, 19, 15, 23, 35, 39, 31, 47, 3, 27, o 43; porque la secuencia CDR2 de cadena pesada se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 50-66 de SEQ ID NO: 7, 11, 19, 15, 23, 35, o 39, residuos de aminoácido 50-65 de SEQ ID NO: 31, 47, 3, 27, o 43; porque la secuencia CDR3 de cadena pesada se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 99-113 de SEQ ID NO: 7, u 11, residuos de aminoácido 99-112 de SEQ ID NO: 19, residuos de aminoácido 99-106 de SEQ ID NO: 15, 23, 35, o 39, residuos de aminoácido 98-106 de SEQ ID NO: 31, 47, 3, 27, o 43; y porque CDRl, CDR2, y CDR3 en la cadena pesada se seleccionan cada una a partir de una misma SEQ ID NO de región variable de cadena pesada.

19.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia CDRl de cadena ligera, una secuencia CDR2 de cadena ligera, y una secuencia CDR3 de cadena ligera, porque la secuencia CDRl de cadena ligera se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 24-34 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, o 17, o los residuos de aminoácido 24-40 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, o 45; porque la secuencia CDR2 de cadena ligera se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 50-56 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, o 17, o los residuos de aminoácido 56-62 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, o 45; porque la secuencia CDR3 de cadena ligera se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 89-97 de SEQ ID NO: 5, 29, o 17, residuos de aminoácido 89-98 de SEQ ID NO: 9, residuos de aminoácido 89-96 de SEQ ID NO: 13, 21, 33, o 37, residuos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO: 1, 25, o 41, o los residuos de aminoácido 95-102 de SEQ ID NO: 45; ' porque CDRl de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, y CDR3 de cadena ligera son cada una parte de una misma SEQ ID NO de región variable de cadena ligera; y porque la CDRl, CDR2, y CDR3 de las cadenas ligera) y pesada forman pares entre sí en una de las siguientes ' combinaciones: SEQ ID NO: 1/3, 5/7, 9/11, 13/15, 17/19, 21/23, 25/27, 29/31, 33/35, 37/39, 41/43, y 45/47. | !

20.- Un anticuerpo monoclonal o porción de unión a| antígeno del mismo que se une específicamente a IL-8, que comprende una región variable de cadena ligera y una región1 variable de cadena pesada, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia CDRl de cadena ligera, una secuencia CDR2 de cadena ligera, y una 1 secuencia CDR3 de cadena ligera, i porque la secuencia CDRl de cadena ligera se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 24-34 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, o 17, o los residuos del aminoácido 24-40 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, o 45; porque la secuencia CDR2 de cadena ligera se selecciona a partir de los residuos de aminoácido 50-56 de SEQ ID NO: 5, 9, 13, 21, 33, 37, 29, o 17, o los residuos de1 aminoácido 56-62 de SEQ ID NO: 1, 25, 41, o 45; porque la secuencia CDR3 de cadena ligera sei selecciona a partir de los residuos de aminoácido 89-97 de SEQ ID NO: 5, 29, o 17, residuos de aminoácido 89-98 de SEQ ID NO: 9, residuos de aminoácido 89-96 de SEQ ID NO: 13, 21, 33, o 37, residuos de aminoácido 95-103 de SEQ ID NO: 1, 25, o 41, o los residuos de aminoácido 95-102 de SEQ ID NO: 45; porque la CDRl de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, y CDR3 de cadena ligera son cada una parte de una misma SEQ ID NO de región variable de cadena ligera.

21.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia CDRl de cadena ligera son los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 33, porque la secuencia CDR2 de cadena ligera son los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 33; y porque la secuencia CDR3 de cadena ligera son los residuos 89-96 de SEQ ID NO: 33.

22.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia CDRl de cadena pesada, una secuencia CDR2 de cadena pesada, y una secuencia CDR3 de cadena pesada, porque la secuencia CDRl de cadena pesada son los residuos 26-35 de SEQ ID NO: 35; porque la secuencia CDR2 de cadena pesada son los residuos 50-66 de SEQ ID NO: 35; y porque la secuencia CDR3 de cadena pesada son los residuos 99-106 de SEQ ID NO: 35.

23.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia CDRl de cadena ligera son los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 21, porque la secuencia CDR2 de cadena ligera son los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 21; y porque la secuencia CDR3 de cadena ligera son los residuos 89-96 de SEQ ID NO: 21.

24.- El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia CDRl de cadena pesada, una secuencia CDR2 de cadena pesada, y una secuencia CDR3 de cadena pesada, porque la secuencia CDRl de cadena pesada son los residuos 26-35 de SEQ ID NO: 23; porque la secuencia CDR2 de cadena pesada son los residuos 50-66 de SEQ ID NO: 23; y porque la secuencia CDR3 de cadena pesada son los residuos 99-106 de SEQ ID NO: 23.

25.- Un anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a IL-8 con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 33.

26.- Una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, y 45, y una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una de dichas secuencias.

27.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, 2, 8, 6, 12, 10, 16, 14, 20, 18, 24, 22, 28, 26, 32, 30, 36, 34, 40, 38, 44, 42, 48, 46, y una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a una de dichas secuencias.

28.- Una molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1-9, 13 o 15-25.

29.- Una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo para IL-8, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende: una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDRl de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada, y una CDR3 de cadena pesada, en la cual cada CDR se selecciona a partir del grupo que consiste de: una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 4, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 8, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 12, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 16, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 20, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 24, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 28, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 32, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 36, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 40, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 44, y una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada dentro de SEQ ID NO: 48; una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CDRl de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera, y una CDR3 de cadena ligera, en la cual cada CDR se selecciona a partir del grupo que consiste de: una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 2, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 6, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 10, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 14, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 18, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 22, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 26, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 30, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 34, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 38, una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 42, y una secuencia de ácido nucleico para CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera dentro de SEQ ID NO: 46; en la cual cada una de las CDRs de cadena pesada provienen de una misma SEQ ID NO; en la cual cada una de las CDRs de cadena ligera provienen de una misma SEQ ID NO; y en la cual la secuencia de ácido nucleico para las CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera forman pares entre sí en una de las siguientes combinaciones: SEQ ID NO: 2/4, 6/8, 10/12, 14/16, 18/20, 22/24, 26/28, 30/32, 34/36, 38/40, 42/44, y 46/48.

30.- Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-8, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico se selecciona a partir de la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 26-29.

31.- El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-interleucina-8 de humano o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-29 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con interleucina-8.

32.- El uso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el trastorno relacionado con interleucina-8 se selecciona a partir del grupo que consiste de: un tumor maligno, melanoma maligno de interleucina-8, carcinoma de célula renal (RCC) , cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tejido mamario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de ovario y cáncer de cerebro y tumores del esófago, enfermedad inflamatoria, psoriasis, artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino, trastorno pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad inflamatoria aguda, enfermedades gastrointestinales, neumonía bacteriana, asma, colitis ulcerante, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, deficiencia de inmunoglobulina, y fibrosis quística.