TW202118783A - 抗il13抗原結合蛋白 - Google Patents

Abstract

本發明係關於針對IL-13的抗體和此類抗體之用途。例如，根據本發明，提供了針對IL-13之人單株抗體。提供了編碼以下的分離的多核苷酸序列、和包含以下的胺基酸序列：重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子，特別是與跨越框架區（FR）和/或互補決定區（CDR）的連續的重鏈和輕鏈序列對應的序列。另外地，還提供了使用該等抗體來治療患者之方法。

Description

抗IL13抗原結合蛋白

本發明係關於生物製藥領域。特別地，本發明係關於特異性結合人IL-13抗體的抗體及其IL-13結合片段及衍生物。本發明還關於用於治療炎性疾病的包含抗IL-13的藥物組成物以及製造此類抗體之方法。

IL-13係首先認識到它對B細胞和單核球的影響的細胞介素，其中它上調II類表現、促進IgE類別轉換並且抑制炎性細胞介素產生。IL-13受體與IL-4受體共用IL-4受體α鏈。結果，IL-13具有很多與IL-4類似的生物活性。

IL-13在體內抑制促炎細胞介素釋放並且具有抗炎性活性。IL-13在IgE介導的過敏反應中發揮作用並且是過敏性氣喘之中心介質（Wills-Karp M.，Curr. Opin. Pulm. Med.[肺醫學新見]，2003；9:21-27）。在肺中，它調節嗜酸性球炎症、黏液分泌、和氣道高反應性。除了氣喘，IL-13係關於大量疾病的發病機制（Wynn TA，Annu. Rev. Immunol.[免疫學年度評論] 2003，21:425-456）。

人抗體Ab731以高親和力結合人IL-13。然而，該等抗體以相對低親和力結合馬來猴（食蟹獼猴）IL-13（「cyIL-13」）。因為馬來猴通常用於評估抗體的臨床前安全性，期望具有也以高親和力結合馬來猴IL-13的抗人1L-13抗體。

期望治療性抗體展示與治療靶標的人和馬來猴同源物二者之高親和力結合。需要親和力空隙在10倍親和力窗口內，從而使得能夠進行毒理學研究。AMGN12抗體（源自XenoMouse®小鼠上的體內免疫接種）證明很多有利特性，包括與靶蛋白的人同源物的個位數pM親和力。然而，該抗體展示了與馬來猴中存在的同源物的200倍更弱的結合。此工作的目標係「接近」親和力空隙而不損害與人靶標的結合親和力，並且導致變體的鑒定，該變體在針對功能的生物測定中具有針對食蟹猴同源物超過100倍的親和力改善，以及10倍效力改善。解析了與靶標複合的最終變體抗體的高解析度晶體結構，並且說明藉由HuTARG平臺獲得的導致親和力改善之突變將是難以藉由電腦模擬進行事前設計的。

本發明係關於生物製藥領域。特別地，本發明係關於特異性結合人和食蟹猴IL-13抗體的抗體及其IL-13結合片段及衍生物。本發明還關於用於治療炎性疾病的包含抗IL-13的藥物組成物以及製造此類抗體之方法。

在實施方式中，抗IL-13抗體、抗原（IL-13）結合片段及衍生物（統稱為「抗原結合蛋白」）係關於生物製藥領域。本發明係關於抗IL-13抗體和其他特異性結合人IL-13的IL-13結合蛋白。本發明還關於用於治療炎性疾病的包含抗IL-13抗原結合蛋白的藥物組成物以及製造此類抗體之方法。

在本發明之實施方式中，Ab731之CDR的小胺基酸序列改變增加了與食蟹猴IL-13的結合。

本發明含有以下實施方式： 1.  一種特異性結合人IL-13的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含輕鏈免疫球蛋白可變區（VL1）和重鏈免疫球蛋白可變區（VH）， 其中VL1包含：(i) 包含SGDKLGDKYS之胺基酸序列之CDRL1；(ii) 包含HDSKRPS之胺基酸序列之CDRL2；以及 (iii) 包含胺基酸QAWDSSTYV之CDRL3； 以及包含以下的胺基酸序列的之VH1：(i) 包含SYAMS之胺基酸序列；(ii) 包含AFSGWDVSTYYADSVKG之胺基酸序列之CDRH2；以及 (iii) 包含DGLGPYFYNYGMDV之胺基酸序列之CDRH3。 2.  一種特異性結合人IL-13的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含輕鏈免疫球蛋白可變區（VL1）和重鏈免疫球蛋白可變區（VH）， 其中VL包含細胞623表現的抗體之CDR； 並且VH包含細胞623表現的抗體之CDRS pf。 3.  如實施方式1-2所述之抗原結合蛋白，其進一步包含作為細胞623表現的抗體之框架區。 4.  如實施方式1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。 5.  如實施方式1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體片段。 6.  如實施方式1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體衍生物，包括雙特異性抗體、融合蛋白。 7.  如實施方式1-6所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有人序列。 8.  如實施方式1-6所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合係單株抗體。 9.  如實施方式1-8所述之抗原結合蛋白，其中與如實施方式1-8所述之抗原結合蛋白具有95%同一性但是保留了如實施方式1-2所述之CDR。 10.      一種結合IL-13的人抗體，其中該人抗體以100-200 pM的K_D 結合IL-13。 11.      如實施方式1-10所述之人抗體，其中該人抗體以60-100 pM的K_D 結合IL-13。 12.      一種人抗體，該人抗體包含具有選自SEQ ID NO: 22-52的胺基酸序列之重鏈和輕鏈。

本發明之實施方式係關於結合IL-13的分離的抗體和使用那些抗體來治療人的疾病之方法。較佳的是，該等抗體係以高親和力、高效力、或二者結合IL-13的全人中和性單株抗體。在一個實施方式中，該等抗體或抗體片段特異性結合防止IL-13分子藉由IL-13受體複合物進行傳訊的IL-13分子之區域。

此外，本發明之實施方式包括使用該等抗IL-13抗體作為診斷劑或治療疾病之方法。例如，該等抗體可用於治療氣喘，包括過敏性的（異位性的）和非過敏性的（非異位性的）支氣管氣喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病（COPD）、花粉熱、鼻炎、蕁麻疹、血管性水腫，過敏性皮膚炎，包括接觸性皮炎、斯-約二氏（Stevens-Johnson）綜合症、過敏性休克、食物過敏、角膜炎、結膜炎、類固醇抗性腎病綜合症、肥大細胞增多症，纖維化疾病，例如肺纖維化，包括特發性肺纖維化、囊性纖維化、博萊黴素誘導的纖維化、肝纖維化和系統性硬化病，癌症，例如霍奇金氏病，B細胞增生性障礙，例如B細胞淋巴瘤，特別是縱膈腔大B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、卵巢癌、特徵在於非惡性B細胞增殖的疾病，例如全身性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、慢性活動性肝炎和冷凝球蛋白血症，高水平的自體抗體，例如溶血性貧血、血小板減少、磷脂綜合症和天皰瘡，炎性腸病和移植物抗宿主疾病。

與此類治療相關，本發明之實施方式包括：包含抗體的製品。本發明之實施方式係包含用於篩選與IL-13活性相關的疾病或障礙的IL-13抗體的測定套組（kit）。

藉由非限制性實例之方式，本文描述的核酸、及其片段和變體可以 (a) 用於指導作為重組的或異源的基因產物的相應編碼蛋白、多肽、片段和變體的生物合成，(b) 用作探針，該探針用於本文揭露的核酸的檢測和量化，(c) 用作序列模板，該序列模板用於製備反義分子，等等。以下更完全地描述了此類用途。

在一個方面，提供了鑒定該等抗體之方法。在一個實施方式中，該方法係關於嗜酸性球趨化因子釋放測定。

在一個方面，還提供了結合IL-13的變體之抗體。尤其相關的是那些抗體，該抗體結合在內源IL-13多肽的位置110處具有麩醯胺酸的IL-13變體。

在實施方式中，提供了針對人IL-13進行人源化的小鼠。此小鼠可用於測試受試者的氣道高反應性和黏液產生的抑制。 定義：

除非另外定義，否則結合本發明所使用的科學及技術術語將具有熟悉該項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。

通常，關於以下使用的命名和關於以下的技術：本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化學和雜交是本領域熟知的那些並且是常用的，如在不同通常的和更具體的參考文獻中描述，例如貫穿本說明書引用和討論的那些。參見例如Singleton等人， Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[ 微生物學與分子生物學詞典 ] ，第 2 版， J. Wiley & Sons[約翰•威利父子公司]（紐約, 紐約州，1994）；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]（第2d版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，Cold Spring Harbor（冷泉港），紐約（1989）），該等參考文獻藉由引用併入本文。標準技術用於重組DNA、寡核苷酸合成、以及組織培養和轉化（如電穿孔、脂質轉染）。酶促反應及純化技術係根據製造商的說明書、或如本領域中通常所實現或如本文中所描述來進行。標準技術還用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製物及遞送、以及治療患者。

如根據本揭露使用的，除非另外指明，否則以下術語應當被理解為具有以下含義：

「聚合酶鏈式反應」或「PCR」係指如1987年7月28日發佈的美國專利案號4,683,195中描述，其中擴增微量的具體段的核酸、RNA和/或DNA的程序或技術。通常，序列資訊來自目的地區域的末端或超過可用的需要，使得可以設計寡核苷酸引物；該等引物按序列將與待擴增的模板的相反股相同或相似。兩個引物的5’末端核苷酸可以與擴增材料的末端相一致。PCR可以用於擴增具體RNA序列、來自總基因組DNA的具體DNA序列、和從總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。通常參見Mullis等人， Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.[ 冷泉港定量生物學研討會 ] 51:263（1987）；Erlich編輯，PCR Technology [PCR 技術 ] （Stockton Pres [斯托克頓出版社]，紐約，1989）。如本文使用的，PCR被認為是用於擴增核酸測試樣本的核酸聚合酶反應方法的一個（但不是唯一的）實例，該方法包括使用核酸作為引物，並且使用核酸聚合酶來擴增或產生具體段的核酸。

「抗體」（Ab）和「免疫球蛋白」（Ig）是具有相同結構特性的糖蛋白。雖然抗體展現出對特定抗原的結合特異性，但免疫球蛋白既包括抗體也包括缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子。後一種多肽例如由淋巴系統以低水平產生並由骨髓瘤以增加的水平產生。

抗體係約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由以下組成：兩個相同的並且基本上全長的輕（L）鏈和兩個相同的並且基本上的重（H）鏈。每個輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，雖然二硫鍵之數量在不同免疫球蛋白同型的重鏈之間變化。每個重鏈和輕鏈也具有規則隔開的鏈內二硫橋鍵。每個重鏈在一個末端處具有可變結構域（VH），隨後是多個恒定結構域。每個輕鏈具有在一個末端處的可變結構域（VL）和在它的另一末端處的恒定結構域；將輕鏈的恒定結構域與重鏈的第一恒定結構域比對，並且將輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域進行比對。據信特定胺基酸殘基在輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域之間形成介面（Chothia等人，J. Mol. Biol .[分子生物學雜誌] 186:651（1985）；Novotny和Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A .[美國國家科學院院刊] 82:4592 （1985）；Chothia等人，Nature [自然] 342:877-883（1989））。

「抗體片段」包括結合靶抗原的抗體之片段。實例包括抗體片段之實例，包括Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段。

如本文所使用的「抗原結合蛋白」意指特異性結合指定抗原的蛋白，其源自抗體。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗體片段、抗體構建體、融合蛋白、雙特異性抗體、和scFv蛋白。

如經由表面電漿共振技術（例如BIACore，GE醫療集團（GE-Healthcare），烏普薩拉（Uppsala），瑞典）或動力學排除測定（KinExA，Sapidyne，博伊西（Boise），愛達荷州（Idaho））所測量，當抗原結合蛋白以 ≤ 10^-7 M的解離常數（KD）結合其抗原時，抗原結合蛋白被稱為「特異性結合」其抗原。

本發明之抗原結合蛋白可為中和性的並且抑制IL-13與傳訊受體（例如IL-13受體α-1（IL-13Rα1））的結合至少60%或80%，並且更通常大於約85%（如在體外競爭性結合測定中測量）。在實施方式中，抗體還抑制與誘餌受體IL-13Rα2的結合，而在其他實施方式中，在抗體結合IL-13後，維持IL-13結合IL-13Rα2之能力。

取決於它們的重鏈的恒定結構域之胺基酸序列，完整抗體可以分配至不同「類別」。存在五個主要類別的完整抗體。IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，並且該等中的幾種可以進一步分為「亞類」（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。對應於不同類別的抗體的重鏈恒定結構域分別是所謂的α、δ、ε、γ、和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是熟知的。

如本文所使用，術語「單株抗體」係指自基本上同源的抗體群獲得的一種抗體，即，構成該群體的個別抗體除以微量存在的可能天然存在的突變外為一致的。單株抗體係高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與包括針對不同決定區（表位）的不同抗體的多選殖抗體製劑相反，每種單株抗體針對抗原上的單一決定區。除了它們的特異性之外，單株抗體也是有優勢的，因為它們可以不被其他抗體污染地被合成。修飾語「單株」指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵，並且不應理解為要求藉由任何具體方法產生抗體。例如，根據本發明有待使用的單株抗體可以藉由Kohler等人,Nature [自然], 256:495（1975）首次描述的融合瘤方法，或可以藉由重組DNA方法（參見，例如美國專利案號4,816,567）製備。例如，還可以使用以下文獻中描述的技術，從噬菌體抗體庫分離「單株抗體」：Clackson等人， Nature [自然]， 352:624-628（1991）和Marks等人， J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌]，222:581-597（1991）。

「分離的」抗體係已經從其自然環境的組分鑒定並且分離和/或回收的抗體。其天然環境的污染組分是會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，並且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳的實施方式中，抗體將被純化 (1) 至藉由勞裡法確定的按抗體重量計大於95%，至藉由使用轉杯式定序儀發現的末端或內部胺基酸序列，或 (2) 至藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或較佳的銀染法發現的均質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為抗體的天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常的是，藉由至少一個純化步驟製備分離的抗體。

「中和抗體」係能夠消除或顯著減少其結合的靶抗原的效應子功能的抗體分子。因此，「中和性」IL-13抗體能夠藉由IL-13受體消除或顯著減少效應子功能，例如IL-13傳訊活性。在一個實施方式中，中和抗體將效應子功能減少1%-10%、10%-20%、20%-30%、30%-50%、50%-70%、70%-80%、80%-90%、90%-95%、95%-99%、99%-100%。

「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」係指細胞介導的反應，其中表現Ig Fc受體（FcR）的非特異性細胞毒性細胞（例如自然殺手（NK）細胞、嗜中性球、和巨噬細胞）識別靶細胞上結合的抗體並且隨後引起靶細胞之裂解。介導ADCC的主要細胞——NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表現總結在Ravetch和KinetAnnu. Rev. Immunol .[免疫學年度評論] 9:457-492 (1991) 第464頁的表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，例如美國專利案號5,500,362、或5,821,337中描述的測定。用於此類測定的有用效應細胞包括周邊血單核球（PBMC）和自然殺手（NK）細胞。可替代地或另外地，可以在動物模型中對感興趣的分子的ADCC活性進行體內評估，例如，Clynes等人，PNAS （USA ）[美國國家科學院院刊]，95:652-656 (1988)中揭露的動物模型。

術語「可變的」係指以下事實：可變結構域的某些部分在抗體之間在序列上差異很大，並且用於每種特定抗體針對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性在整個抗體的可變結構域中並不均勻分佈。它集中在三個區段中，稱為互補決定區（CDR）或高度變異區，二者都在Ig輕鏈和重鏈可變結構域中。可變結構域的更高度保守的部分稱為框架（FR）。天然的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區域，其主要採用β-片層構型，藉由三個CDR連接，這三個CDR形成環，該環連接β-片層結構並且在一些情況下形成β-片層結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由FR區域緊密靠近地保持在一起，並且與另一條鏈的CDR一起促進形成抗體的抗原結合位（參見Kabat等人，（1991））。恒定結構域並不直接係關於抗體與抗原的結合，但是展現出不同效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。

用酶（木瓜酶）消化抗體，生成兩個相同的抗原結合片段（也稱為「Fab」片段）和「Fc」片段（不具有抗原結合活性，但是具有結晶之能力）。用酶（胃蛋白酶）消化抗體，生成F(ab’)₂ 片段，其中抗體分子的兩個臂保持連接並且包含兩個抗原結合位。F(ab’)₂ 片段具有交聯抗原之能力。

當本文使用時，「Fv」係指保持抗原識別和抗原結合位二者的抗體的最小片段。

當本文使用時，「Fab」係指抗體的片段，其包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的CH1結構域。

「Fv」係含有完整抗原識別和結合位的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區域由以下組成：緊密的非共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以藉由柔性肽連接子（linker）共價連接，使得輕鏈和重鏈可以按與雙鏈Fv種類中的結構類似的「二聚的」結構締合。正是在這種構型中，每個可變結構域的三個CDR相互作用，以在VH-VL二聚體表面定義抗原結合位。總而言之，六個CDR賦予了抗體抗原結合特異性。然而，甚至單個可變結構域（或僅包含三個對抗原特異的CDR的Fv的一半）具有識別和結合抗原之能力，儘管其親和力低於整個結合位。

「融合蛋白」係指包含結合另一個蛋白的抗體片段的蛋白。

當本文使用時，術語「高度變異區」係指負責抗原結合的抗體的胺基酸殘基。高度變異區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基（例如輕鏈可變結構域中的殘基24-34（L1）、50-62（L2）、和 89-97（L3），和重鏈可變結構域中的殘基31-55（H1）、50-65（H2）和95-102（H3））；Kabat等人.,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, [免疫學目的蛋白的序列，第5版，公共衛生服務，美國國立衛生研究院], 貝塞斯達，馬里蘭州（Bethesda, MD.）(1991)和/或形成「高變環」的那些殘基（例如，輕鏈可變結構域中的殘基26-32（L1）、50-52（L2）和91-96（L3），和重鏈可變結構域中的殘基26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）；Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196:901-917（1987））。「框架區」或FR殘基係除如本文定義的高度變異區殘基之外的那些可變結構域殘基。

當本文使用時，「互補決定區」或「CDR」係指與具體配位基接觸並且決定其特異性的免疫受體的部分。免疫受體的CDR係受體蛋白的最可變的部分，給予受體其多樣性，並且在受體的可變結構域的遠端處的六個環上攜帶，三個環來自受體的兩個可變結構域中的每一個。

術語「表位」用於指蛋白抗原上的抗體的結合位。「表位決定區」通常由以下組成：分子例如胺基酸或糖側鏈的化學活性表面分組，並且通常具有具體的三維結構特徵、以及具體的電荷特徵。當分離常數 ≤ 1 μM，較佳的是 ≤ 100 nM並且最較佳的是 ≤ 10 nM時，抗體被稱為結合抗原。增加的或更大的平衡常數（「K_D 」）意指在表位和抗體之間存在更小的親和力。換言之，抗體和表位更不容易結合或更不容易保持結合在一起。更低的平衡常數的減小意指在表位和抗體之間存在更高的親和力。換言之，抗體和表位將更可能結合或保持結合在一起。具有「不超過」某個量的K_D 的抗體意指抗體將以給定親和力、或更強地（或緊密地）結合表位。

雖然K_D 描述了表位和抗體的結合特徵，「效力」描述了針對抗體的功能，抗體自身的有效性。較低K_D 並不自動意指高效力。因此，抗體可以具有相對低K_D 和高效力（例如它們很好結合並且強烈改變了功能）、相對高K_D 和高效力（例如，它們並不很好結合但是具有對功能的強烈影響）、相對低K_D 和低效力（例如它們很好結合，但是並不以有效改變特定功能的方式）或相對高K_D 和低效力，例如它們僅僅並不很好地結合靶標）。在一個實施方式中，高效力意指存在使用低濃度的抗體實現的高水平的抑制。在一個實施方式中，當抗體的IC₅₀ 係一個小的值，例如130-110、110-90、90-60、60-30、30-25、25-20、20-15、或更小的pM時，它是有效的或具有高效力。

除非結合另一個術語另外指明，「基本上」意指在實施方式的產生或實踐期間可能發生的測量中，值可以在可造成誤差的任何量的範圍內變化。「顯著的」意指只要值足以允許要求的發明發揮其預期用途的功能，它就可以變化。

如本文所使用，術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」係指如以下關於變體進一步描述的天然存在的L胺基酸或D胺基酸。本文使用胺基酸的常用的單或三字母縮寫（Bruce Alberts等人， Molecular Biology of the Cell [分子細胞生物學]，Garland Publishing, Inc.[加蘭德出版社], 紐約（第3版，1994））。

術語「mAb」係指單株抗體。

術語「人抗體」係指其中抗體的大部分序列（至少95%）源自人基因組的抗體。

術語「XENOMOUSE®」係指以下小鼠的品系：其已經被工程化而含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系構型片段，如在以下文獻中描述：Green等人，Nature Genetics[ 自然遺傳學 ] 7:13-21（1994），藉由引用併入本文。XENOMOUSE^® 品系可購自Abgenix, Inc.公司（菲蒙市，加利福尼亞州）。

術語「XENOMAX^® 」係指當與XENOMOUSE^® 動物一起使用時，「選擇的淋巴球抗體方法（Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]， 93:7843-7848（1996））」的使用。

術語「SLAM^® 」係指「選擇的淋巴球抗體方法」（Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]， 93:7843-7848（1996），和美國專利案號5,627,052），將這兩篇文獻藉由引用以其全文併入本文。

術語「疾病」、「疾病狀態」和「障礙」係指細胞或整個哺乳動物的生理狀態，其中已經發生細胞的或身體的功能、系統、或器官的中斷、終止、或障礙。

術語「症狀」意指障礙的物理的或可觀察的表現，無論它是否係該障礙的總體特徵。術語「症狀」可以意指所有此類表現或其任何子集。

術語「治療（treat或treatment）」係指治療性治療和預防的或預防性的措施二者，其中目標是防止或減慢（減輕）不希望的生理學變化或障礙，例如癌症的發展或擴散。出於本發明之目的，有益的或希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病嚴重程度的減小、穩定的（即不惡化）疾病狀態、延遲或減慢疾病進展、疾病狀態的改善或減輕、以及緩解（無論是部分的還是總體的），無論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可以意指與如果不接受治療的預期生存期相比，延長的生存期。需要治療的那些包括已經患有病症或障礙的那些，以及易於患有病症或障礙的那些，或其中要預防病症或障礙的那些。當結合疾病或症狀使用時，術語「抑制」可以意指抗體可以減小或消除疾病或症狀。

術語「患者」包括人和獸醫學的受試者。

出於治療的目的，「投與」意指遞送至患者。例如而非限制，此類遞送可為靜脈內、腹膜內、藉由吸入、肌內、皮下、口服、局部、經皮、或外科。

出於治療的目的，「治療有效量」意指可能由於其投與（單獨地或與其他治療組合），使得在患者的病症和/或症狀方面發生可觀察的改變之量。

出於治療的目的，「藥學上可接受的媒介物」係可以投與至患者的物理的實施方式。藥學上可接受的媒介物可以是但不限於丸劑、膠囊、錠劑、片劑、口服投與的流體、可注射流體、噴霧劑、氣溶膠、糖錠、營養食品、乳膏、洗液、油、溶液、糊劑、粉末、吸入劑、或液體。藥學上可接受的媒介物的一個實例係緩衝等張溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。

出於治療的目的，「中和」抑制部分或完全抑制化學的和/或生物的活性。

出於治療的目的，「下調」意指降低特定靶組成物的水平。

出於治療的目的，「哺乳動物」係指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、家養動物和家畜、和動物園動物、比賽動物、或寵物，例如猴、狗、馬、貓、牛、等。

如本文係關於的「多核苷酸」意指長度至少10個鹼基的核苷酸（核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式）的聚合物形式。術語包括單股和雙股形式的DNA。

如本文所使用，術語「分離的多核苷酸」應意指基因組的、cDNA、或合成來源或其一些組合的多核苷酸，憑藉其來源，「分離的多核苷酸」(1) 與其中「分離的多核苷酸」見於自然中的多核苷酸的全部或一部分無關，(2) 可操作地連接至在自然中未連接的多核苷酸，或 (3) 作為更大的並不存在於自然中的序列的一部分。

本文係關於的術語「寡核苷酸」包括藉由天然存在的、和非天然存在的寡核苷酸連接而連接在一起的天然存在的、和修飾的核甘酸。寡核苷酸為多核苷酸子集，通常包含200個鹼基或更少的長度。較佳的是，寡核苷酸長度係10至60個鹼基，並且最較佳的是長度係12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40個鹼基。寡核苷酸通常是單股的，例如用於探針；儘管寡核苷酸可以為雙股的，例如用於基因突變體的構建。寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。

如本文所使用，術語「天然存在的核苷酸」包括去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文係關於的術語「修飾的核苷酸」包括具有修飾的或取代的糖基團等的核苷酸。本文係關於的術語「寡核苷酸連接」包括寡核苷酸連接，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫基磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯、等。參見例如LaPlanche等人，Nucl. Acids Res. [核酸研究] 14:9081（1986）；Stec等人，J. Am. Chem. Soc. [美國化學會誌]106:6077（1984）；Stein等人，Nucl. Acids Res. [核酸研究] 16:3209（1988）；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design [抗癌藥物設計] 6:539（1991）；Zon等人，Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach [寡核苷酸和類似物：實踐方法]，87-108頁（F. Eckstein，編輯，Oxford University Press [牛津大學出版社]，牛津，英國（1991））；Stec等人，美國專利案號5,151,510；Uhlmann和Peyman,Chemical Reviews [化學綜述] 90:543（1990），將該等文獻的揭露內容藉由引用併入本文。如果希望，寡核苷酸可以包括用於檢測的標記。

本文係關於的術語「選擇性雜交」意指可檢測地並且特異性地結合。在將大量的與非特異性核酸的可檢測的結合最小化的雜交和洗滌條件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段與核酸股選擇性雜交。高嚴格條件可以用於實現如本領域已知的並且本文討論的選擇性雜交條件。通常，多核苷酸、寡核苷酸、或抗體片段和目的核酸序列之間的核酸序列同源性將是至少80%，並且更典型地具有至少85%、90%、95%、99%、和100%的較佳的是不斷增加的同源性。

如本文所使用，術語「控制序列」係指影響與它們連接的編碼序列的表現和加工所需的多核苷酸序列。此類控制序列的性質根據宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位、和轉錄終止序列；在真核生物中，通常此類控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語「控制序列」旨在至少包括其存在對於表現和加工而言是必需的所有組分，並且還可以包括其存在是有利的另外的組分，例如前導序列和融合配偶體序列。

如本文所使用，術語「可操作地連接」係指如此描述的組分的位置處於允許它們以其預期方式發揮功能的關係中。例如，「可操作地連接」至編碼序列的控制序列是以這樣一種方式連接，使得在與該控制序列相容的條件下實現該編碼序列的表現。

本文係關於的術語「分離的蛋白」意指cDNA、重組RNA、或合成來源或其一些組合的蛋白，憑藉其來源、或衍生的來源，「分離的蛋白」 (1) 與見於自然中的蛋白無關，(2) 不含來自相同來源的其他蛋白，例如，不含鼠蛋白，(3) 由來自不同物種的細胞表現，或 (4) 自然中並不存在。

術語「多肽」在本文用作通用術語，用來指多肽序列的天然蛋白、片段、或類似物。因此，天然蛋白、片段、和類似物係多肽屬的種類。根據本發明之多肽包含例如表21和SEQ ID NO: 2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、和83-105表示的人重鏈免疫球蛋白分子，和例如SEQ ID NO 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、和106-126表示的κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及藉由以下組合形成的抗體分子，該組合包含具有輕鏈免疫球蛋白分子（例如κ輕鏈免疫球蛋白分子）的重鏈免疫球蛋白分子，並且反之亦然，以及其片段和類似物。

除非另外說明，否則單股多核苷酸序列的左手端係5’末端；雙股多核苷酸序列的左手方向稱為5’。新生RNA轉錄物的5’至3’添加方向稱為轉錄方向；DNA股上與RNA具有相同序列的並且在RNA轉錄物5’末端的5’的序列區稱為「上游序列」；DNA股上與RNA具有相同序列的並且在RNA轉錄物3’末端的3’的序列區稱為「下游序列」。

如本文所使用，二十種常規胺基酸及其縮寫遵循常規用法。參見，Immunology-A Synthesis[免疫學-A合成], 第2版, (E. S. Golub和D. R. Green,編輯), 斯那路聯合出版社（Sinauer Associates）: 桑德蘭（Sunderland）, 麻塞諸塞州. (1991)，所述參考文獻藉由引用併入本文。二十種常規胺基酸的立體異構物（如D-胺基酸）、α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸等非天然胺基酸以及其他非常規胺基酸也可作為本發明多肽的合適組分。非常規胺基酸的實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸、和其他類似的胺基酸和亞胺基酸（例如，4-羥基脯胺酸）。本文使用的多肽標記法中，按照標準用法和慣例，左手方向係係胺基末端方向，右手方向羧基末端方向。

術語「對應於」在本文用於意指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分同源（即相同，並不嚴格演化上相關），或意指多肽序列與參考多肽序列相同。

相比之下，術語「互補」在本文用於意指互補序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分同源。為了說明，核苷酸序列「TATAC」對應於參考序列「TATAC」，並且與參考序列「GTATA」互補。

在那些術語中，以下術語用於描述兩個或更多個多核苷酸或胺基酸序列之間的關係：「參考序列」、「比較窗口」、「序列同一性」、「序列同一性的百分比」、「實質性同一性」、和「同源性」。「參考序列」係用作序列比較的基礎的定義的序列。參考序列可以為更大序列的子集，例如，為全長cDNA的區段或序列表中給出的基因序列，或可以包含完整cDNA或基因序列。通常，參考序列之長度係至少18個核苷酸或6個胺基酸，經常是長度至少24個核苷酸或8個胺基酸，並且通常是長度至少48個核苷酸或16個胺基酸。由於兩個多核苷酸或胺基酸序列可以各自 (1) 包含在兩個分子之間類似的序列（即完整多核苷酸或胺基酸序列的一部分），和 (2) 可以進一步包含在兩個多核苷酸或胺基酸序列之間多樣的序列，典型地藉由比較「比較窗口」上兩個分子的序列，進行兩個（或更多個）分子之間的序列比較，從而鑒定並且比較序列相似性的局部區域。

如本文所使用，「比較窗口」係指至少約18個連續的核苷酸位置或約6個胺基酸的概念區段，其中將多核苷酸序列或胺基酸序列與具有至少18個連續核苷酸或6個胺基酸序列的參考序列進行比較，並且其中與參考序列（不包含添加或缺失）相比，在比較窗口中的多核苷酸序列的一部分可以包括20百分比或更少的添加、缺失、取代等（即空隙），用於兩個序列的最佳比對。可以藉由以下演算法，進行用於比對比較窗口的序列的最佳比對：Smith和Waterman,Adv. Appl. Math . [應用數學進展] 2:482（1981）的局部同源性演算法，Needleman和Wunsch,J. Mol. Biol .[分子生物學雜誌] 48:443（1970）的同源性比對演算法，Pearson和Lipman,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A .[美國國家科學院院刊] 85:2444（1988）的相似性方法的檢索，該等演算法的電腦實現（威斯康辛遺傳學套裝軟體版本7.0（遺傳學電腦集團（Genetics Computer Group），威斯康辛州麥迪森科學路575號）、GENEWORKS™、或MACVECTOR^® 套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA），或藉由檢查，並且選擇藉由不同方法產生的最佳比對（即生成在比較窗口上的最高同源性百分比）。

術語「序列同一性」意指在比較窗口上兩個多核苷酸或胺基酸序列係相同的（即在核苷酸對核苷酸或殘基對殘基的基礎上）。「序列同一性的百分比」係藉由以下計算的：比較在比較的窗口上的兩個最佳地比對的序列，確定在兩個序列中存在的相同的核酸鹼基（例如A、T、C、G、U、或I）或胺基酸殘基所在的位置之數量，從而產生匹配的位置之數量，將匹配的位置之數量除以比較窗口中的位置之總數（即窗口大小），並且將結果乘以100，從而產生序列同一性之百分比。如本文所使用，術語「實質性同一性」表示多核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中與至少18個核苷酸（6個胺基酸）位置的比較窗口上、經常是在至少24-48個核苷酸（8-16個胺基酸）位置的窗口上的參考序列相比，該核苷酸或胺基酸包含具有至少85%序列同一性、較佳的是至少90%-95%序列同一性、更較佳的是至少99%序列同一性之序列，其中序列同一性之百分比係藉由以下計算的：在比較窗口上，比較參考序列與可以包括總計20%或更少的參考序列的缺失或添加的序列。參考序列可為更大序列的子集。

如果在兩個胺基酸序列或多核苷酸序列之間存在部分的或完全的同一性，則認為它們係「同源的」。例如，當比對兩個序列的最大匹配時，85%同源性意指85%的胺基酸係相同的。在將匹配最大化時，空隙（在匹配的兩個序列中的任一個中）係允許的；5或更小的空隙長度係較佳的，其中2或更小是更較佳的。可替代地並且較佳的是，如此術語在本文使用，如果使用具有突變數據矩陣和6或更大的空隙罰分的製程ALIGN，兩個蛋白序列（或長度至少約30個胺基酸的源自它們的多肽序列）具有超過5（按標準差單位）的比對得分，則它們是同源的。參見Dayhoff, M.O.，在Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白序列和結構圖集]，101-110頁（第5卷，國家生物醫學研究基金（1972））和此卷的增刊2，1-10頁中。如果當最佳地使用ALIGN製程進行比對時，兩個序列或其一部分的胺基酸係大於或等於50%相同，則它們更較佳的是同源的。

如應用於多肽，術語「實質性同一性」意指當最佳地比對時，例如藉由使用預設空隙權重的製程GAP或BESTFIT，兩個肽序列共用至少80%序列同一性，較佳的是至少90%序列同一性，更較佳的是至少95%序列同一性，並且最較佳的是至少99%序列同一性。較佳的是，不相同的殘基位置在保守胺基酸取代方面不同。保守胺基酸取代係指具有類似側鏈的殘基的互換性。例如，一組具有脂肪族側鏈之胺基酸係：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、和異白胺酸；一組具有脂肪族-羥基側鏈之胺基酸係絲胺酸和蘇胺酸；一組具有含醯胺側鏈之胺基酸係天冬醯胺和麩醯胺酸；一組具有芳香族側鏈之胺基酸係苯丙胺酸、酪胺酸、和色胺酸；一組具有鹼性側鏈之胺基酸係離胺酸、精胺酸、和組胺酸；和一組具有含硫側鏈之胺基酸係半胱胺酸和蛋胺酸。較佳的保守胺基酸取代組係：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸、和天冬醯胺-麩醯胺酸。

如本文所討論的，抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列中的微小變化被認為由本發明涵蓋，其條件係胺基酸序列中的變化維持在至少75%、更較佳的是至少80%、90%、95%，並且最較佳的是至少99%。特別地，考慮了保守胺基酸替換。保守替換係發生在其側鏈方面相關的胺基酸家族內的那些替換。遺傳編碼的胺基酸通常分為以下家族：(1) 酸性的 = 天冬胺酸、麩胺酸；(2) 鹼性的=離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3) 非極性的 = 丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸；以及 (4) 不帶電的極性的 = 甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。更較佳的家族係：絲胺酸和蘇胺酸係脂肪族-羥基家族；天冬醯胺和麩醯胺酸係含醯胺家族；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異白胺酸係脂肪族家族；並且苯丙胺酸、色胺酸、和酪胺酸係芳香族家族。

例如，合理地預期以下分離的替換：白胺酸替換為異白胺酸或纈胺酸、天冬胺酸替換為麩胺酸、蘇胺酸替換為絲胺酸，或以下類似的替換：胺基酸替換為結構上相關的胺基酸，這將對所得分子的結合或特性沒有大的影響，尤其是如果替換並不是關於框架位點內的胺基酸時。可以容易地藉由測定多肽衍生物的具體活性，確定胺基酸改變是否生成功能多肽。本文詳細描述該等測定。

熟悉該項技術者可以容易地製備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。片段或類似物的較佳的胺基和羧基末端存在於接近功能結構域之邊界。可以藉由比較核苷酸和/或胺基酸序列數據與公開的或專有的序列數據庫，鑒定結構和功能結構域。較佳的是，將電腦比較方法用於鑒定在已知結構和/或功能的其他蛋白中存在的序列模體或預測的蛋白構象結構域。用於鑒定折疊成已知三維結構的蛋白序列之方法係已知的。Bowie等人，Science [科學] 253:164（1991）。前述實例證明熟悉該項技術者可以識別可以用來定義根據本發明之結構和功能結構域的序列模體和結構構象。

較佳的胺基酸取代係滿足以下的那些：(1) 降低對蛋白水解的敏感性；(2) 降低對氧化的敏感性；(3) 改變用於形成蛋白複合物的結合親和力；(4) 改變結合親和力，和 (5) 賦予或改變此類的類似物的其他生理化學特性或功能特性。類似物可以包括除天然存在的肽序列之外的序列的不同突變蛋白。例如，可以在天然存在的序列中（較佳的是在形成分子間接觸的一個或多個結構域外的多肽部分中）進行單個或多個胺基酸取代（較佳的是為保守胺基酸取代）。保守胺基酸取代應基本上不改變親本序列的結構特性（例如替換胺基酸不應傾向於使親本序列中存在的螺旋斷裂，或破壞親本序列特徵性的其他類型二級結構）。技術公認的多肽二級和三級結構的實例描述於Proteins, Structures and Molecular Principles [蛋白質/結構和分子原理]（Creighton編輯, W. H. Freeman and Company [W.H.弗裡曼公司], 紐約 (1984)）；Introduction to Protein Structure [蛋白質結構簡介]（C.Branden和J. Tooze編輯, Garland Publishing [加蘭出版社], 紐約, 紐約州 (1991)）；以及Thornton等人 Nature [自然] 354:105 (1991)，將該等文獻各自藉由引用併入本文。

如本文所使用，術語「多肽片段」係指以下多肽，該多肽具有胺基末端和/或羧基末端缺失，但是其中剩餘胺基酸序列與例如從全長cDNA序列推導的天然存在的序列中的對應位置相同。片段典型地是至少5、6、8或10個胺基酸長，較佳的是至少14個胺基酸長，更較佳的是至少20個胺基酸長。在其他實施方式中，多肽片段是至少25個胺基酸長，更較佳的是至少50個胺基酸長，並且甚至更較佳的是至少70個胺基酸長。

肽類似物在醫藥工業中作為非肽類藥物被廣泛應用，其性質與模板肽類似。該等類型的非肽化合物被稱為「肽的模擬物（peptide mimetics）」或「肽模擬物（peptidomimetics）」。Fauchere, J., Adv. Drug Res.[藥物研究前沿], 15:29 (1986)；Veber和Freidinger, TINS [神經科學發展], 第392頁(1985)；以及Evans等人,J. Med. Chem .[藥物化學期刊], 30:1229 (1987)，將該等文獻藉由引用併入本文。通常在電腦化分子模型化的輔助下開發出此類化合物。在結構上類似於治療適用肽的肽模擬物可用於產生等效的治療或預防效應。通常，肽模擬物與範例多肽（即具有生物化學特性或藥理學活性的多肽）（例如人抗體）結構上類似，但是藉由本領域熟知之方法具有一個或多個肽連接視需要地被選自由以下組成之群組的連接替換：--CH₂ NH--、--CH₂ S--、--CH₂ -CH₂ --、--CH=CH--（順式及反式）、--COCH₂ --、--CH(OH)CH₂ --及-CH₂ SO--。用同一類型的D-胺基酸系統性取代共有序列的一個或多個胺基酸（例如D-離胺酸替代L-離胺酸）可用於產生更穩定的肽。此外，可以藉由本領域已知的方法產生包含共有序列或基本上相同的共有序列變化的受限肽（Rizo和GieraschAnn. Rev. Biochem [ 生物化學年鑒 ] 61:387（1992），將其藉由引用併入本文）；例如，藉由添加能夠形成使肽環化的分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基。

如本文所使用，術語「標記」或「標記的」係指摻入可檢測標記物，例如藉由摻入放射性標記的胺基酸或附著於生物素基部分的多肽（其可以藉由標記的抗生物素蛋白（例如含有螢光標誌物或可藉由光學或比色法檢測的酶活性的鏈黴親和素）檢測）。在某些情況下，標記或標誌物也可為治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法係本領域已知的並且可以使用。多肽標記的實例包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核素（例如³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I）、螢光標記（例如FITC、若丹明（rhodamine）、鑭系元素磷光體）、酶標記（例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶）、化學發光、生物素基團，由第二報導子識別的預定多肽表位（例如白胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位、金屬結合結構域、表位標籤）。在一些實施方式中，標記藉由不同長度的間隔子臂附接，從而減小潛在空間位阻。

如本文所使用，術語「藥學試劑或藥物」係指當適當地投與於患者時能夠誘導所需治療效果的化學化合物或組成物。根據本領域的常規用法使用的本文的其他化學術語如在以下文獻中示例：The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms[麥格勞-希爾化學術語詞典]（Parker, S.,編輯，McGraw-Hill [麥格勞希爾集團]，聖法蘭西斯科（1985）），將其藉由引用併入本文。

如本文所使用，「基本上純的」意指目標種類是存在的主要種類（即在莫耳基礎上，它比組成物中的其他單獨種類更豐富），並且較佳的是，基本上純的級分係一種組成物，其中目標種類包含存在的所有大分子種類的至少約50%（在莫耳基礎上）。通常，基本上純的組成物將包含組成物中存在的所有大分子種類的超過約80%，更較佳的是超過約85%、90%、95%、和99%。最較佳的是，將目標種類純化至基本均質（藉由常規檢測方法在該組成物中無法檢測到污染種類），並且其中該組成物基本由單一大分子種類組成。 抗體結構

已知基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈構成，每對具有一條「輕」鏈（約25 kDa）和一條「重」鏈（約50-70 kDa）。每條鏈的胺基末端部分包括約100至110個或更多個胺基酸的可變區，該可變區主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分限定恒定區，主要負責效應子功能。人類輕鏈分成κ和λ輕鏈。重鏈分成μ、δ、γ、α或ε，且將抗體的同型分別定義為IgM、IgD、IgA、和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區藉由約12個或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈還包括約10個以上的胺基酸的「D」區。一般參見， Fundamental Immunology [ 基礎免疫性 ] ,第7章（Paul, W., 編輯, 第2版. 紐約雷文出版社（Raven Press, Ny），(1989)）（出於所有目的，將所述文獻藉由引用以其全文併入本文）。各輕鏈/重鏈配對的可變區形成抗體結合位。

因此，完整抗體具有兩個結合位。除了雙功能的或雙特異性的抗體，這兩個結合位係相同的。

該等鏈均展現出由三個高度變異區（還稱作互補決定區或CDR）連接的相對保守框架區（FR）的相同的一般結構。來自每對的兩條鏈的CDR藉由框架區對齊，使得能夠結合具體的表位。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈二者包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個結構域的胺基酸的分配根據Kabat的定義，Sequences of Proteins of Immunological Interest[感興趣的免疫蛋白的序列]（國立衛生研究院（National Institutes of Health）, 貝塞斯達, 馬里蘭州(1987和1991)），或Chothia & Lesk,J. Mol. Biol .[分子生物學], 196:901-917 (1987)；Chothia等人 . ,Nature [自然], 342:878-883 (1989)。

雙特異性或雙功能性抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結合位的人工雜合抗體。雙特異性抗體可以藉由多種方法（包括融合瘤的融合或Fab'片段的連接）來產生。（參見，例如Songsivilai和Lachmann,Clin. Exp. Immunol .[臨床實驗免疫學] 79: 315-321 (1990), Kostelny等人.,J. Immunol .[免疫學雜誌], 148:1547-1553 (1992)）。與常規抗體的產生相比，雙特異性抗體的產生會是較費力之方法，並且雙特異性抗體的產量和純度通常都更低。雙特異性抗體並不以具有單結合位的片段（例如Fab、Fab’、和Fv）之形式存在。 人抗體和抗體的人源化

人抗體避免了與具有鼠或大鼠可變區和/或恒定區的抗體相關的一些問題。這種鼠或大鼠來源的蛋白的存在可以導致抗體的快速清除，或者可以導致患者生成針對抗體的免疫應答。為了避免利用鼠或大鼠衍生的抗體，可以藉由將人抗體功能引入到齧齒動物中以使齧齒動物產生完全人抗體來產生完全人抗體。

一種用於產生完全人抗體之方法係藉由使用XENOMOUSE^® 小鼠品系，該品系已經被工程化而含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系構型片段。參見Green等人，Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21（1994）。XENOMOUSE^® 品系可購自Abgenix, Inc.公司（菲蒙市，加利福尼亞州）。

在以下文獻中進一步討論和描繪了XENOMOUSE®的產生：1990年1月12日提交的美國專利申請案序號07/466,008，1990年12月8日提交的美國專利申請案序號07/610,515，1992年7月24日提交的美國專利申請案序號07/919,297，1992年7月30日提交的美國專利申請案序號07/922,649，1993年3月15日提交的美國專利申請案序號08/031,801，1993年8月27日提交的美國專利申請案序號08/112,848，1994年4月28日提交的美國專利申請案序號08/234,145，1995年1月20日提交的美國專利申請案序號08/376,279，1995年4月27日提交的美國專利申請案序號08/430,938，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/464,584，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/464,582，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/463,191，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/462,837，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/486,853，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/486,857，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/486,859，1995年6月5日提交的美國專利申請案序號08/462,513,1996年10月2日提交的美國專利申請案序號08/724,752，和1996年12月3日提交的美國專利申請案序號08/759,620，和美國專利案號6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本專利案號3068180B2、3068506B2、和3068507B2。還參見Mendez等人，Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156（1997）以及Green和JakobovitsJ. Exp. Med. [實驗醫學雜誌] 188:483-495（1998）。還參見1996年6月公佈授權的歐洲專利案號EP 0 463 151 B1，1994年2月3日公佈的國際專利申請號WO 94/02602，1996年10月31日公佈的國際專利申請號WO 96/34096，1998年6月11日公佈的國際專利申請號WO 98/24893，2000年12月21日公佈的國際專利申請號WO 00/76310。將上述專利、申請、和參考文獻中的每一篇的揭露內容藉由引用以其全文併入本文。

在替代性方法中，包括GenPharm國際公司在內的其他公司已經採用了「迷你基因座」方法。在迷你基因座方法中，藉由包含來自Ig基因座的碎片（單獨基因）來模擬外源Ig基因座。因此，一個或多個V_H 基因、一個或多個D_H 基因、一個或多個J_H 基因、mu恒定區和第二恒定區（較佳的γ恒定區）形成用於插入動物中的構建體。此方法描述於以下文獻中：Surani等人的美國專利案號5,545,807，和美國專利案號5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，每一篇都是Lonberg和Kay的，Krimpenfort和Berns的美國專利案號5,591,669和6,023.010，Berns等人的美國專利案號5,612,205、5,721,367、和5,789,215，和Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763，和1990年8月29日提交的真藥物國際公司（GenPharm International）美國專利申請案序號07/574,748，1990年8月31日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號07/575,962，1991年12月17日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號07/810,279，1992年3月18日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號07/853,408，1992年6月23日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號07/904,068，1992年12月16日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號07/990,860，1993年4月26日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/053,131，1993年7月22日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/096,762，1993年11月18日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/155,301，1993年12月3日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/161,739，1993年12月10日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/165,699，1994年3月9日提交的真藥物國際公司美國專利申請案序號08/209,741，將該等文獻的揭露內容藉由引用併入本文。還參見歐洲專利案號0 546 073 B1、國際專利申請號WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、和WO 98/24884、和美國專利案號5,981,175，將該等文獻的揭露內容藉由引用以其全文併入本文。進一步參見Taylor等人，1992，Chen等人，1993，Tuaillon等人，1993，Choi等人，1993，Lonberg等人，（1994），Taylor等人，（1994），和Tuaillon等人，（1995），Fishwild等人，（1996），將該等文獻的揭露內容藉由引用以其全文併入本文。

Kirin還證明了從小鼠中生成人抗體，在該小鼠中藉由微細胞融合已經引入了大的染色體碎片或整個染色體。參見歐洲專利申請號773 288和843 961，將該等文獻的揭露內容藉由引用以其全文併入本文。

人抗小鼠抗體（HAMA）應答也已引導該行業製備嵌合抗體或其他人源化抗體。雖然嵌合抗體具有人恒定區和鼠可變區，但是預期將觀察到某些人抗嵌合抗體（HACA）應答，特別是在抗體的慢性的或多劑量利用的情況下。因此，將期望提供完全人抗體，該等抗體針對多聚體酶，以便消除HAMA或HACA應答的問題和/或效應。 抗體之製備

如本文描述，使用XENOMOUSE^® 技術製備如本文描述的抗體。此類小鼠能夠產生人免疫球蛋白分子和抗體，並且在產生鼠免疫球蛋白分子和抗體方面係有缺陷的。在本文係關於的專利、申請、和參考文獻中揭露了用於實現這一點的技術。然而特別地，轉基因產生小鼠和來自轉基因小鼠的抗體的較佳的實施方式揭露在以下文獻中：1996年12月3日提交的美國專利申請案序號08/759,620，和1998年6月11日公佈的國際專利申請號WO 98/24893，以及2000年12月21日公佈的國際專利申請號WO 00/76310，將該等文獻的揭露內容藉由引用併入本文。還參見Mendez等人，Nature Genetics [自然遺傳學]15 :146-156（1997），將該等文獻之揭露內容藉由引用併入本文。

如以下詳細描述，藉由使用此類技術，產生了IL-13的完全人單株抗體。基本上，用人IL-13免疫小鼠的XENOMOUSE^® 品系，從表現抗體的小鼠回收淋巴球（例如B細胞），並且將回收的細胞系與髓型細胞系融合，從而製備永生融合瘤細胞系。篩選並且選擇該等融合瘤細胞系，從而鑒定產生特異性針對IL-13的抗體的融合瘤細胞系。此外，本文提供了由此類細胞系產生的抗體的表徵，包括此類抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和胺基酸序列分析。

可替代地，替代融合至骨髓瘤細胞從而產生融合瘤，可以進一步針對初始抗原（較佳的是人IL-13）的反應性，篩選分離自免疫的XENOMOUSE^® 小鼠品系的回收的細胞。此類篩選包括具有希望的IL-13蛋白的ELISA，和功能測定，例如IL-13誘導的嗜酸性球趨化因子-1產生。然後可以使用希望的IL-13特異性溶血蝕斑測定，分離分泌特異性結合IL-13的抗體的單個B細胞（Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [ 美國國家科學院院刊 ] ， i93:7843-7848（1996））。靶向裂解的細胞為包被有IL-13的綿羊紅血球（SRBC）。在分泌目的免疫球蛋白和補體的B細胞培養物存在下，斑塊之形成指示特異性IL-13介導的靶細胞裂解。

可以分離在斑塊的中心的單抗原特異性漿細胞，並且從單個血細胞分離編碼抗體的特異性的遺傳資訊。可以使用逆轉錄酶PCR，選殖編碼分泌的抗體的可變區的DNA。然後此類選殖的DNA可以插入適合的表現載體，較佳的是插入載體盒，例如pcDNA（Invitrogen[英傑公司]，卡爾斯巴德,加利福尼亞州），更較佳的是這樣一種含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結構域的pcDNA載體。然後產生的載體可以轉化到宿主細胞中，較佳的是CHO細胞中，並且在適當改善用於誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼所需序列的基因的常規營養培養基中培養。

本文描述了產生特異性針對IL-13的抗體的多種單個漿細胞的分離。此外，分離編碼特異性結合IL-13的抗體的遺傳物質，並且將該物質引入適合的表現載體並且之後轉染到宿主細胞中。

一般而言，由具有完全人IgG1或IgG2重鏈（該重鏈具有人κ輕鏈）的上述細胞系產生抗體。當藉由固相和溶液相之一測量時，抗體具有高親和力，典型地具有從約10^-9 至約10^-13 M之KD。

如上所提及，可以在除融合瘤細胞系之外的細胞系中表現抗IL-13抗體。編碼特定抗體的序列可以用於適合的哺乳動物宿主細胞（例如CHO細胞）的轉化。可以藉由用於將多核苷酸引入宿主細胞的任何已知方法進行轉化，包括例如將多核苷酸包裝到病毒中（或到病毒載體中），並且用病毒（或載體）轉導宿主細胞，或可以藉由本領域已知的轉染程序（例如由美國專利案號4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455示例（將該等專利藉由引用併入本文））進行轉染。所用的轉化程序取決於待轉化的宿主。用於將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為本領域中熟知的且包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、將一個或多個多核苷酸囊封於脂質體中和將DNA直接微注射至細胞核中。

可用作用於表現的宿主的哺乳動物細胞系係本領域中眾所周知的且包括很多可得自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）的永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、海拉（HeLa）細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、猴腎細胞（COS）、人肝細胞癌細胞（例如Hep G2）和多種其他細胞系。藉由確定哪種細胞系具有高表現水平並且產生具有IL-13結合特性的抗體，選擇特別優先的細胞系。 抗體序列

在序列表中提供了代表性人抗IL-13抗體的重鏈和輕鏈可變區核苷酸和胺基酸序列，其內容總結在下表1中。 [表1]

說明	序列	Seq ID NO:
MMAB7 HCD1	SYAMS	8
MMAB7 HCD2	AFSGWDVSTYYADSVKG	9
MMAB7 HCD3	DGLGPYFYNYGMDV	10
MMAB7 HLD1	SGDKLGDKYS	11
MMAB7 HLD2	HDSKRPS	12
MMAB7 HLD3	QAWDSSTYV	13

抗體治療劑

抗IL-13抗體具有用於治療係關於IL-13活性的症狀和病症之治療價值。IL-13已經係關於多種疾病和障礙，包括炎性疾病、癌症、纖維化疾病和特徵在於非惡性細胞增殖的疾病。在具體實施方式中，本文揭露的抗IL-13抗體用於治療炎性疾病或障礙，例如氣喘，包括過敏性的（異位性的）和非過敏性的（非異位性的）支氣管氣喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病（COPD）、花粉熱、鼻炎、蕁麻疹、血管性水腫、過敏性皮膚炎（包括接觸性皮炎）、斯-約二氏綜合症、過敏性休克、食物過敏、角膜炎、結膜炎、類固醇抗性腎病綜合症。在其他實施方式中，它們用於治療肥大細胞增多症。仍在其他實施方式中，它們用於治療纖維化疾病，例如肺纖維化，包括特發性肺纖維化、囊性纖維化、博萊黴素誘導的纖維化、肝纖維化和系統性硬化病。在另外的實施方式中，抗IL-13抗體用於治療癌症，例如霍奇金氏病，B細胞增生性障礙，例如B細胞淋巴瘤，特別是縱膈腔大B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、卵巢癌。

仍在另外的實施方式中，抗IL-13抗體用來治療特徵在於非惡性B細胞增殖的疾病，例如全身性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、慢性活動性肝炎和冷凝球蛋白血症；特徵在於高水平的自體抗體的疾病，例如溶血性貧血、血小板減少、磷脂綜合症和天皰瘡；炎性腸病；和移植物抗宿主疾病。

如果希望，例如，抗IL-13抗體的同型可以切換為利用不同同型的生物特性。例如，在一些情況下，可能期望針對IL-13的治療性抗體能夠固定補體並且參與補體依賴性細胞毒性（CDC）。存在能夠做到這一點的抗體的多種同型，包括但不限於以下：鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgG1、和人IgG3。應當認識到的是，產生的抗體不需要初始具有這樣的同型，而是如產生的抗體可以具有任何同型，並且抗體可為之後使用本領域熟知的技術進行切換的同型。此類技術尤其包括使用直接重組技術（參見例如美國專利案號4,816,397）、細胞-細胞融合技術（參見例如美國專利案號5,916,771和6,207,418）。

舉例來說，本文討論的抗IL-13抗體係人抗體。如果抗體具有希望的IL-13結合，則可以容易地將同型切換以產生人IgM、人IgG1、或人IgG3同型，雖然仍具有相同的可變區（其限定了抗體的特異性及其親和力的一部分）。然後此類分子將能夠固定補體並且參與CDC。

在細胞-細胞融合技術中，製備具有重鏈（該重鏈具有任何希望的同型）的骨髓瘤或其他細胞系，並且製備具有輕鏈的另一種骨髓瘤或其他細胞系。之後，此類細胞可以融合，並且可以分離表現完整抗體之細胞系。

因此，產生符合如以上討論的希望的「結構」屬性的抗體候選物，它們可以總體上被提供為具有藉由同型切換的至少某些希望的「功能」屬性。

較佳的是，結合IL-13的生物活性抗體用於無菌藥物製劑或配製物，用來減小IL-13的活性。較佳的是，抗IL-13抗體具有強有力地抑制IL-13活性至在靶治療範圍內的足夠親和力。較佳的是，抑制導致抗體干擾IL-13與傳訊受體（例如IL-13Ra1，（也稱為IL-13 Rα1、Rα1、IL-13Rα1、IL-13受體α1，或其他類似術語））的結合之能力。在其他實施方式中，抗體可以藉由干擾IL-13藉由受體（即使它能夠結合受體）進行傳訊之能力，抑制IL-13活性。例如，抗體可以阻止IL-13Ra1與傳訊必需的共受體（例如IL-4受體α鏈）的相互作用。在一些實施方式中，抗體能夠藉由傳訊受體阻止IL-13活性，同時允許IL-13結合誘餌受體，例如IL-13Ra2。在這種情況下，結合誘餌受體可以允許清除結合的IL-13，並且增強抗體抑制IL-13活性之能力。

當用於體內投與時，抗體配製物較佳的是無菌的。易於藉由本領域已知之方法（例如藉由：藉由無菌過濾膜進行過濾）實現這一點。抗體通常將以凍乾形式或以溶液儲存。可以在凍乾和重構之前或之後進行無菌過濾。

通常將治療性抗體置於具有無菌進入口的容器中，例如具有允許配製物的取回的連接器（例如可由皮下注射針刺穿的塞子）的靜脈內溶液袋或小瓶。

抗體投與的形式係根據已知方法，例如藉由以下的注射或輸注：皮下、靜脈內、腹膜內、腦內、皮內、肌內、眼內、動脈內、鞘內、或病灶內途徑，或藉由吸入，或藉由如以下所述之持續釋放系統。在一些情況下，較佳的是藉由輸注或藉由快速濃注，投與抗體。在其他情況下，可以藉由鼻或肺，較佳的是作為液體或粉末氣溶膠（凍乾的）投與包含抗體之治療組成物。還可以根據需要靜脈內、腸胃外或皮下地投與組成物。當全身性投與時，治療組成物應係無菌的、無熱源的，並且在具有適當考慮的pH、等張性、和穩定性的腸胃外可接受的溶液中。該等條件係熟悉該項技術者已知的。

如本文描述，典型地用併入配製物從而提供改善的轉移、遞送、耐受性等的適合的載體、賦形劑、和其他試劑來製備用於治療用途的抗體。簡而言之，藉由混合具有希望的純度的抗體與一種或多種生理上可接受的載體、賦形劑、或穩定劑，製備用於儲存或投與的本文描述的抗體之劑量配製物。例如，該等配製物可以包括粉末、糊劑、軟膏劑、果膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質（陽離子型或陰離子型）（例如Lipofectin^TM ）、DNA共軛物、無水吸收貼、水包油和油包水乳液、碳蠟（不同分子量的聚乙二醇）、半固體凝膠、和含有碳蠟的半固體混合物。配製物可以包括緩衝液，例如TRIS HCl、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其他有機酸鹽；抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量（小於約十個殘基）肽，例如聚精胺酸、蛋白，例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物（例如聚乙烯吡咯啶酮）；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或精胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物（包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精）；螯合劑，例如EDTA；糖醇（例如甘露糖醇或山梨糖醇）；相對離子，例如鈉和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。

其他可接受的載體、賦形劑和穩定劑係熟悉該項技術者熟知的。任何前述混合物可以適用於根據本發明之治療和療法，其條件係配製物中的活性成分並未被配製物滅活，並且配製物係與投與途徑生理上相容並且可耐受的。還參見Baldrick P. 「Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance[藥物賦形劑發展：臨床前指導的需要]」Regul. Toxicol. Pharmacol. [監管毒理學和藥理學] 32(2):210-8（2000），Wang W.，「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals [固體蛋白藥物的凍乾和開發]」，Int. J. Pharm. [國際藥物雜誌] 203(1-2):1-60 （2000），Charman WN, 「Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts[脂質、親脂性藥物和口服藥物遞送-些新興概念]」，J. Pharm. Sci. [藥物科學雜誌]， 89(8):967-78（2000），Powell等人，「Compendium of excipients for parenteral formulations[腸胃外配製物賦形劑彙編]」，PDA J. Pharm. Sci. Technol. [PDA藥物科學技術雜誌]， 52:238-311（1998）和其中針對另外資訊的引用。

可以如以下文獻描述，根據常規藥物實踐配製用於注射的無菌組成物：Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓:藥劑學的科學與實踐]（第20版，Lippincott Williams & Wilkens Publishers [利平科特·威廉姆斯和威爾肯斯出版社]（2003））。例如，活性化合物在媒介物（例如水或天然存在的植物油，如芝麻油、花生油、或棉籽油，或合成的脂肪媒介物，如油酸乙酯等）中的溶解或懸浮會為希望的。根據接受的藥物實踐，可以併入緩衝液、防腐劑、抗氧化劑等。

還可以按持續釋放製劑投與抗體，並且從持續釋放製劑隨時間釋放抗體。持續釋放製劑的適合實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半滲透性基質。該等基質可以處於成形物品、膜或微膠囊的形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如 聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，如以下文獻描述：Langer等人 .，J. Biomed Mater. Res. [生物醫學材料研究雜誌],（1981）15:167-277和Langer，Chem. Tech. [化學技術]，(1982)12:98-105，或聚(乙烯醇)），聚丙交酯（美國專利案號3,773,919、EP 58,481），L-麩胺酸和γ-L-麩胺酸乙酯的共聚物（Sidman等人， Biopolymers [生物聚合物]，(1983) 22:547-556），不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯（Langer等人 ，同上 ），可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON Depot^TM （由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate）構成的可注射微球體），以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸（EP 133,988）。

聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠在100天內釋放分子，而某些水凝膠在更短時間段內釋放蛋白質。當囊封的蛋白在體內保持較長時間，其可能由於在37°C下暴露於水分而變性或聚集，由此導致生物活性喪失和可能的免疫原性變化。取決於所係關於的機制，可以設計合理的策略實現蛋白穩定。舉例來說，若發現聚集機制係經由二硫化物交換而形成分子間S-S鍵，則可以藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑和產生特定聚合物基質組成物來實現穩定。

持續釋放組成物還包括在懸浮液中能夠維持晶體的適合的配製物中懸浮的抗體的晶體的製劑。當皮下或腹膜內注射時，該等製劑可以產生持續釋放效果。其他組成物還包括脂質體包裹的抗體。藉由本身已知的方法製備含有此類抗體的脂質體：美國專利案號DE 3,218,121；Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]，（1985）82:3688-3692；Hwang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]，（1980）77:4030-4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本專利申請83-118008；美國專利案號4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。

可以由主治醫生確定用於給予患者之抗體配製物之劑量。在確定適當劑量時，醫生可以考慮多種已知因素來改變治療劑之作用，該等因素包括例如疾病的嚴重性和類型、體重、性別、飲食、投與的時間和途徑、其他藥物和其他相關臨床因素。可以藉由體外或體內方法確定治療有效劑量。

例如，要在治療上採用的本文描述的抗體的有效量將取決於治療目標、投與途徑、和患者的狀況。因此，較佳的是，治療師滴定劑量並且根據需要修改投與途徑以獲得最佳治療效果。取決於上述因素，典型的日劑量範圍可以為約0.001 mg/kg至高達100 mg/kg或更高。典型地，臨床醫師將投與治療性抗體直至達到實現希望的效果之劑量。容易地藉由常規測定監測此療法的進展。

預期在治療源自或係關於IL-13的活性的症狀和病症之治療中，本文描述的抗體將具有治療效果。 其他治療劑的設計和產生

根據本發明並且基於本文關於IL-13產生並且表徵的抗體的活性，可以採用先進的抗體治療劑來治療具體疾病。該等先進的治療劑可以包括雙特異性抗體、免疫毒素、放射性標記的治療劑、肽治療劑、基因療法、特別是內抗體、反義治療劑、和小分子。

關於先進的抗體治療劑的產生，其中補體固定係期望之屬性，也許可能的是藉由使用例如雙特異性抗體、免疫毒素、或放射性標記回避依賴補體進行細胞殺傷。

例如，可以產生雙特異性抗體，其包含 (i) 共軛在一起的兩種抗體，一種具有針對IL-13的特異性，並且另一種具有針對第二分子的特異性，(ii) 具有特異性針對IL-13的一個鏈和特異性針對第二分子的第二鏈的單抗體，或 (iii) 具有針對IL-13和其他分子二者的特異性的單鏈抗體。可以使用本領域熟知的技術產生此類雙特異性抗體；例如，關於 (i) 和 (ii)，參見例如Fanger等人，Immunol Methods [免疫學方法] 4:72-81（1994），以及Wright和Harris，同上 ，並且關於 (iii)，參見例如 Traunecker等人，Int. J. Cancer [國際癌症雜誌]（增刊 l. ） 7:51-52（1992）。在每種情況下，可以根據需要製造第二特異性。例如，可以將第二特異性製造為重鏈激活性受體，包括但不限於CD16或CD64（參見例如Deo等人，18:127（1997）），或CD89（alerius等人，Blood [血液] 90:4485-4492（1997））。

在一些實施方式中，提供的製品包含容器，該容器包含：含有抗IL-13抗體的組成物，和指示該組成物可以用於治療由IL-13介導的疾病的包裝插頁或標記。較佳的是，哺乳動物，並且更較佳的是，人接受抗IL-13抗體。在較佳的實施方式中，待治療的疾病選自由以下組成之群組：氣喘，包括過敏性的（異位性的）和非過敏性的（非異位性的）支氣管氣喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病（COPD）、花粉熱、鼻炎、蕁麻疹、血管性水腫，過敏性皮膚炎，包括接觸性皮炎、斯-約二氏綜合症、過敏性休克、食物過敏、角膜炎、結膜炎、類固醇抗性腎病綜合症、肥大細胞增多症，纖維化疾病，例如肺纖維化，包括特發性肺纖維化、囊性纖維化、博萊黴素誘導的纖維化、肝纖維化和系統性硬化病，癌症，例如霍奇金氏病，B細胞增生性障礙，例如B細胞淋巴瘤，特別是縱膈腔大B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、卵巢癌、特徵在於非惡性B細胞增殖的疾病，例如全身性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、慢性活動性肝炎和冷凝球蛋白血症，高水平的自體抗體，例如溶血性貧血、血小板減少、磷脂綜合症和天皰瘡，炎性腸病和移植物抗宿主疾病。

在一些實施方式中，抗IL-13抗體用於治療氣喘。在特定實施方式中，抗體係本文描述的623抗體或其變體。在另一個特定實施方式中，抗體係本文描述的731抗體或其變體。 實例

以下實例，包括進行的實驗和實現的結果，僅提供解釋說明目的，並且不應被解釋為限制本文之教導。 實例1：抗體產生 IL-13和IL-13抗原製備

以下IL-13肽用於以下描述的實驗。

重組人IL-13 （R&D 213-IL-005 ；SEQ ID NO: 1 ）： GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN重組人IL-13 （Peprotech[ 派普泰克公司]200-13 ；SEQ ID NO: 2 ）： SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN重組人IL-13 （Peprotech[ 派普泰克公司]200-13A ；SEQ ID NO: 3 ）： MSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN人IL-13- 人Fc 融合蛋白（具有前導序列；SEQ ID NO: 4 ）： MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK人IL-13- 兔Fc 融合蛋白（具有前導序列；SEQ ID NO: 5 ）： MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNRYLDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK人IL-13- 小鼠IL-13 螺旋A （加底線；SEQ ID NO: 6 ）： MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPRSVSLPLTLKELIEELVNITQ NQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN人IL-13- 小鼠IL-13 螺旋B （加底線；SEQ ID NO: 7 ）： MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGGFCVALDSLT NVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN人IL-13- 小鼠IL-13 螺旋C （加底線；SEQ ID NO: 68 ）： MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIYRTQRILHGL CPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN人IL-13- 小鼠IL-13 螺旋D （加底線；SEQ ID NO: 69 ）： MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRH GQQFN

如熟悉該項技術者將理解的，僅一個子集的以上殘基可以實際係關於表位之形成。例如，在以上SEQ ID NO: 66-69，表位實際可以為每個肽（加底線的區段）的螺旋部分。 動物的免疫接種

針對IL-13的單株抗體係藉由免疫接種XenoMouse®小鼠（XenoMouse® XMG2L3和XenoMouse® XMG2，Abgenix, Inc.公司，菲蒙市，加利福尼亞州）開發的。將人IL-13-人Fc融合蛋白（SEQ ID NO: 64）或人IL-13-兔Fc融合蛋白（SEQ ID NO: 65）用作免疫原，以產生抗體。經由足墊投與途徑對每個小鼠進行免疫接種。在第0、4、7、11、14、18、21和25天對動物進行免疫接種。用CpG/Alum中的10 ug抗原/小鼠進行初始免疫接種。用CpG/Alum中的5 ug抗原/小鼠進行隨後的增強免疫。在第25天，用無佐劑PBS中的5 ug抗原/小鼠進行最終增強免疫。在第20天將動物放血，用來獲得血清，以便如以下描述確定滴定度。 滴定度分析

使用標準方案確定滴定度。簡而言之，在4°C，用IL-13兔Fc融合蛋白（SEQ ID NO: 65）或全長兔抗體包被Costar 3368板過夜。使用Titertek製程ADG9洗滌板，乾燥，並且用250 μl 1%無脂肪脫脂乳/1XPBS封閉。封閉後，再次使用Titertek製程ADGP洗滌板，並且乾燥。一式兩份從1 : 100初始稀釋豎直地1 : 2滴定待測試的血清。樣本按50ul/孔在1%無脂肪脫脂乳/1x PBS中運行，並且在室溫下孵育1 h。

使用Titertek製程ADG9洗滌並且乾燥後，在室溫下，使用在1%無脂肪脫脂乳/1xPBS中的具有與兔Fc的最小交叉反應性的與POD共軛的第二兔抗人Fc抗體（1 : 8000稀釋；50 μL/孔），將板孵育1小時。然後使用Titertek製程ADG9最後洗滌板一次並且乾燥。添加POD底物一步TMB溶液（50 μl/孔），並且允許在室溫下顯色30分鐘。用1 N HCL（50 μ/孔）停止反應，並且立即用Titertek酶標儀讀取光密度。

對於IL-13免疫原，如表2中所示，選擇三個具有高滴定度的動物用於收穫。 [表2]

小鼠	包被
IL-13 Rb Fc	RbIgG
1	3855	＜ 100
2	5444	＜ 100
3	＞ 6400	268
初治的	＜ 100	＜ 100

初始篩選

收穫超免疫動物，並且分離CD19+ B細胞用於隨後的B細胞培養。誘導細胞增殖並且最終分化成漿細胞。藉由ELISA篩選來自該等漿細胞的上清液，從而鑒定含有抗IL-13特異性抗體的初始孔。通常用50至500個CD19+ B細胞/孔運行培養物，從而允許鑒定單株抗原特異性B細胞培養物。

簡而言之，按1 ug/mL，將IL-13-RbFc包被到Costar 3368 96孔板上過夜。用dH₂ O洗滌每個板5次，並且將40 μL的PBS中的1%乳添加至板。隨後，將10 μL的B細胞上清液添加至每個孔。在室溫下一個小時後，用dH₂ O再次洗滌板5次。向每個孔添加50 μL的具有最小抗兔交叉反應性的兔抗人Fc-HRP（傑克遜實驗室（Jackson Laboratories）；1 : 8000稀釋）。在室溫下1小時後，再次用dH₂ O洗滌板5次，並且將50 μL的TMB底物（Neogen公司）添加至每個孔。30分鐘後，藉由添加50 μL的1 N鹽酸至每個孔停止反應，並且在波長450 nm下讀取板。

源自初始篩選的代表性數據顯示在下表3中。將陽性孔鑒定為發現具有至少為對照孔的信號的三倍的信號的那些孔。在初始篩選中鑒定了總計968個陽性抗原特異性B細胞孔。如以下描述，取所有該等孔用於繼續在功能測定中進行篩選。 [表3]

板	孔	初始O.D.
2357	G11	2.598
2361	G5	3.218
2372	B8	2.308
2383	H5	3.05
2398	C5	2.203
2401	G12	3.566
2413	G11	3.347
2384	G12	4.057
2388	A10	4.219
2407	G11	3.448

IL-13誘導的嗜酸性球趨化因子-1產生測定

在IL-13誘導的嗜酸性球趨化因子-1釋放測定中，篩選所有968個ELISA陽性孔兩次。如此進行測定，使得僅是含有高濃度的抗體的孔或含有高親和力抗體的孔被鑒定為中和性。在此測定中，總計78個中和抗體被鑒定為中和性。處於說明的目的，來自幾個目的孔的具體數據也顯示在表4中。

對於該測定，用50 μL的補充有低血清生長補充劑的培養基106中的4000個HDFa細胞/孔接種一半面積的96孔測定板（級聯反應）。然後在37°C下，在5% CO₂ 中，孵育該等板過夜。在分開的板中，將12.5 μL樣本抗體、陰性對照或陽性對照等分至無菌96孔測定板中。在培養基106中製備約600 pM的IL-13（4X最終濃度），並且在培養基106中製備約100 ng/mL TNF-α（2X最終濃度）。

為了開始測定，將12.5 μL的IL-13或培養基單獨添加至每個孔，並且允許在37°C下，在5% CO₂ 中孵育1 hr。在1 hr孵育後，使用多通道吸量管小心地移出HDFa細胞的培養基。將25 μL的TNF-α添加至每個孔。將25 μL 樣本/IL-13轉移至HDFa/TNF-α孔並且在37°C下，在5% CO₂ 中孵育細胞48 hr。

48 hr的孵育後，將來自HFDa測定的上清液收集到96孔VEE底板中。將樣本在1500 rpm下離心5 min。

根據具有以下修改的標準方案，在測定套組（R&D Systems [研究與診斷系統有限公司]）中測定30 μL的樣本的嗜酸性球趨化因子-1釋放。(1) 按2 μg/mL包被50 μL捕獲Ab；(2) 使用50 μL樣本或標準物（對於50 μL的最終體積，30 μL樣本 + 20 μL培養基）；(3) 按0.1 μg/mL使用50 μL的檢測Ab；(4) 按0.5 μg/mL使用50 μL鏈黴親和素-HRP；以及 (5) 使用50 μL底物溶液。 [表4]

板	孔	ELISA O.D.	嗜酸性球趨化因子濃度（pg/mL）	%抑制	ELISA O.D.	嗜酸性球趨化因子濃度（pg/mL）	%抑制
2357	G11	0.429	25	79	0.283	13	80
2361	G05	0.393	19	85	0.295	15	76
2372	B08	0.532	41	72	0.282	13	80
2383	H05	0.42	23	84	0.247	6	90
2398	C05	0.34	11	90	0.228	3	96
2401	G12	0.564	46	70	0.384	31	57
2413	G11	0.401	20	84	0.283	13	82
2384	G12	0.517	38	73	0.297	15	76
2388	A10	0.459	29	78	0.274	11	82
2407	G11	0.469	31	78	0.278	12	84

抗IL-13特異性B細胞培養孔的高抗原（HA）分析

使用ELISA方法，將上清液針對抗原特異性抗體的濃度歸一化。使用具有平行滴定的已知濃度的抗靶標（IL-13）抗體，產生標準曲線，並且將上清液中抗原特異性抗體之量與標準物進行比較，並且確定其濃度，參見下表5。 [表5]

板	孔	在不同抗體稀釋下確定的ELISA OD	基於抗IL-13標準曲線的Ab濃度（ng/ml）
2357	G11	3.944	1.769	0.708	0.424	386
2361	G5	4.483	2.345	0.794	0.438	532
2372	B8	3.209	1.238	0.552	0.373	240
2383	H5	4.389	2.361	0.768	0.438	523
2398	C5	2.057	0.752	0.383	0.324	114
2401	G12	4.312	2.285	0.796	0.441	521
2413	G11	3.977	1.783	0.648	0.415	360
2384	G12	4.639	3.132	1.072	0.528	856
2388	A10	4.689	3.23	1.261	0.612	1049
2407	G11	4.891	2.9	1.072	0.537	824

針對所述孔的中和數據，將每個孔中的抗原特異性抗體之量定量並且作圖，從而鑒定最高效力孔（圖1）。含有最高效力抗體的孔是以最低濃度的抗體具有最佳抑制的那些孔（圖的左上四分之一）。 抗IL-13特異性B細胞培養孔的限制性抗原（LA）分析

限制性抗原分析是相對於所有其他抗原特異性抗體，對在B細胞培養上清液中製備的抗原特異性抗體進行親和力排名之方法。在非常低的抗原的包被存在下，應只有最高親和力抗體能夠在平衡狀態下結合達到任何可檢測水平。（參見例如 PCT公開案WO 03/048730 A2，藉由引用併入本文）。

在這裡，在室溫下，在96孔培養板上，生物素化的IL-13按四種濃度（250 ng/mL；125 ng/mL；62 ng/mL；和31 ng/mL）結合鏈黴親和素板1小時。用dH₂ O洗滌每個板5次，並且將45 μL的具有0.05%疊氮化鈉的PBS中的1%乳添加至板。這之後，將5 μL的B細胞上清液添加至每個孔。在室溫下，在震盪器上18小時後，用dH₂ O再次洗滌板5次。按1 μg/mL，向每個孔添加50 μL的Gt抗人(Fc)-HRP。在室溫下1小時後，再次用dH₂ O洗滌板5次，並且將50 μL的TMB底物添加至每個孔。藉由添加50 μL的1 M磷酸至每個孔停止反應，並且在波長450 nm下讀取板。

然而，如在圖2中說明，如在最低抗原包被下用OD測量，包括2388A10和2357G11的多個孔明顯優異。圖2中呈現的結果證明在低抗原包被濃度下，不同抗體結合之能力。在此測定的條件下，給出最高OD信號的抗體具有最高親和力。藉由組合測量特異性抗體濃度的高抗原數據和有限的抗原輸出，進一步分析剩餘選殖。以此方式，可能在B細胞培養上清液中，在不同濃度下，比較抗體的親和力。含有最高親和力抗體的孔是在最低濃度的Ag特異性抗體的背景下，具有最高ELISA OD的那些。

基於所有篩選數據，鑒定表6中列出的孔用於進一步分析（斑塊測定和顯微操作、單細胞PCR和重組表現）。基於效力（抑制/總特異性Ab）選擇五個孔：2372B8、2383H5、2398C5、2401G12和2413G11。基於親和力和抑制選擇三個孔：2357G11、2361G5和2384G12，並且單獨基於中和數據選擇兩個孔：2388A10和2407G11。 [表6]

板	孔	在不同抗原包被下確定的ELISA OD
250 ng/ml	125 ng/ml	62 ng/ml	31 ng/ml
2357	G11	2.582	1.553	1.066	0.59
2361	G5	2.582	1.505	1.075	0.423
2372	B8	1.616	0.79	0.506	0.234
2383	H5	1.533	0.817	0.459	0.224
2398	C5	1.187	0.694	0.425	0.186
2401	G12	1.295	0.827	0.407	0.198
2413	G11	1.274	0.783	0.449	0.203
2384	G12	2.056	1.161	0.759	0.401
2388	A10	2.637	1.76	1.152	0.558
2407	G11	1.627	0.887	0.583	0.285

IL-13特異性溶血蝕斑測定

利用通常如以下文獻描述的IL-13異性溶血蝕斑測定分離分泌目的IL-13特異性抗體的細胞：Babcook 等人，（Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]， 93:7843-7848（1996），藉由引用併入本文）。在下表7中鑒定了分離的細胞。 綿羊紅血球（SRBC）的生物素化

將SRBC儲存在RPMI培養基中作為25%儲液。藉由將1.0 ml的儲液等分到微量離心管中，將細胞旋下（在離心管中，按8000 rpm（6800 rcf）脈衝旋轉），並且移出上清液，獲得250 μl SRBC填充的細胞沈澱。然後用1 ml的PBS pH 8.6洗滌細胞兩次。然後在15 ml管中，將細胞沈澱重新懸浮在4.75 ml PBS（pH 8.6）中。在單獨的50 ml管中，將2.5 mg的磺基-NHS生物素添加至45 ml的PBS（pH 8.6）中。一旦生物素完全溶解，添加5 ml的SRBC並且將管在RT下旋轉1小時。將SRBC在3000 g下離心5 min，抽出上清液，並且將SRBC重新懸浮在微量離心管中的1 ml PBS（pH 7.4）中。用1 ml PBS（pH 7.4）洗滌SRBC 3次。然後將SRBC重新懸浮在15 ml管中的4.75 ml免疫細胞培養基（具有10% FCS的RPMI 1640）中（5% B-SRBC儲液）。將儲液儲存在4°C下直至需要。 B-SRBC的鏈黴親和素（SA）包被

將1 ml的 5% B-SRBC儲液轉移到新鮮的微量離心管中。將B-SRBC沈澱，抽出上清液，將沈澱重新懸浮在1.0 ml PBS（pH 7.4）中，並且重複離心。將洗滌循環重複2次，並且然後將B-SRBC沈澱重新懸浮在1.0 ml的PBS（pH 7.4）中，從而給出5%（v/v）的最終濃度。添加10 μL的10 mg/ml鏈黴親和素（CalBiochem[卡比化學公司]，聖迭哥，加利福尼亞州）儲備溶液，並且將管混合，並且在RT下旋轉20 min。重複洗滌步驟並且將SA-SRBC重新懸浮在1ml PBS（pH 7.4）（5%（v/v））中。 SA-SRBC的人IL-13包被

按100 ug/ml，用光生物素化的人IL-13-RbFc融合物包被SA-SRBC，然後混合，並且在RT下旋轉20 min。如上所述，用1.0 ml的PBS（pH 7.4）洗滌SRBC兩次。將IL-13包被的SRBC重新懸浮在RPMI（+10% FCS）中至5%（v/v）的最終濃度。 藉由免疫螢光（IF）確定IL-13-SRBC之品質

將約10 μl的5% SA-SRBC和10 μl的5% IL-13包被的SRBC各自添加至單獨的新鮮的1.5 ml微量離心管中（每個管含有40 μl的PBS）。按45 μg/ml，將對照人抗IL-13抗體添加至SRBC的每個樣本中。將管在RT下旋轉20 min，並且用100 ul的PBS洗滌細胞三次。將細胞重新懸浮在50 μl的PBS中，並且與20 μg/mL的與Alexa488共軛的Gt抗人IgG Fc抗體（Molecular Probes[分子探針公司]，尤金，俄勒岡州）一起孵育。將管在RT下旋轉20 min，並且然後用100 μl PBS洗滌，並且將細胞重新懸浮在10 μl PBS中。將10 μl的染色的細胞點樣到清潔的載玻片上，用蓋玻片覆蓋，在螢光下觀察，並且在0-4的任意標度下得分。 漿細胞的製備

先前藉由以上描述的不同測定鑒定為含有分泌目的免疫球蛋白的B細胞選殖的單個B細胞培養物孔的內容物被收穫。使用100-1000 μL微量分注器，藉由添加37C RPMI（+10% FCS），回收孔的內容物。藉由移液並且然後轉移到新鮮的1.5 ml微量離心管中，重新懸浮細胞（最終體積約700-1000 μl）。在室溫下，將細胞在離心管中按2500 rpm離心1分鐘。然後將管旋轉180度並且再次按2500 rpm旋轉1分鐘。抽出冷凍培養基並且將免疫細胞重新懸浮在100 μL RPMI（10% FCS）中，然後離心。重複這一使用RPMI（+10% FCS）的洗滌過程，並且將細胞重新懸浮在75 μL RPMI（+10% FCS）中，並且儲存在冰上備用。 斑塊測定

向75 μL的細胞樣本添加75uL以下中的每一種：IL-13包被的SRBC（5%（v/v）溶液，視需要稀釋，如果SRBC苔太厚的話），在RPMI（+10% FCS）中製備的4x天竺鼠補充劑（Sigma[西格瑪公司]，奧克維爾，安大略省）儲液，以及4x增強血清儲液（RPMI（+10% FCS）中1 : 900）。將混合物（3 - 5 μL）點樣到TC板蓋（BD Biosciences [BD生命科學公司]，聖約瑟，加利福尼亞州）上，並且用未稀釋的石蠟油覆蓋斑點。在37°C下，將玻片孵育最少1小時。 [表7]

板	孔	單細胞（SC）數
2407	G11	SC-IL-13-557-576
2388	A10	SC-IL-13-577-596
2401	G12	SC-IL-13-597-616
2372	B8	SC-IL-13-617-636
2413	G11	SC-IL-13-637-657
2398	C5	SC-IL-13-658-670
2383	H5	SC-IL-13-671-690
2384	G12	SC-IL-13-691-710
2357	G11	SC-IL-13-711-730
2361	G5	SC-IL-13-731-750

選殖和表現

在分離單個漿細胞後，提取mRNA並且進行逆轉錄酶PCR，從而產生編碼由每個細胞分泌的抗體的可變重鏈和輕鏈的cDNA。將人可變重鏈區選殖到IgG2表現載體中。藉由將人IgG2的恒定結構域選殖到pcDNA3.1+/Hygro（Invitrogen[英傑公司]，伯靈頓，安大略省）的多選殖位點中，產生此載體。將人可變輕鏈區選殖到IgK或IgL表現載體中。藉由將人IgK或人IgL的恒定結構域選殖到pcDNA3.1+/Neo（Invitrogen[英傑公司]，伯靈頓，安大略省）的多選殖位點中，產生該等載體。

然後使用脂染胺，將重鏈和輕鏈表現載體共轉染到60 mm培養皿的70%匯合的人胚腎（HEK）293細胞中。轉染的細胞分泌具有與原始漿細胞相同特異性的重組抗體，持續24-72小時。從HEK 293細胞收穫3 mL的上清液，並且使用夾心ELISA（用來特異性檢測人IgG）來證明完整抗體之分泌。使用ELISA，藉由重組抗體與IL-13的結合，證實特異性。

如下進行分泌ELISA測試。用2 mg/mL山羊抗人IgG H+L包被對照板過夜，關於結合板，將IL-13包被到Costar Labcoat通用結合聚苯乙烯96孔板上，並且保持在4°C下過夜。用dH₂ O洗滌板五次。對於來自未稀釋的脂質轉染上清液的7個孔，1 : 2滴定重組抗體。用dH₂ O洗滌板五次。按1 μg/mL的最終濃度，添加山羊抗人IgG Fc特異性HRP共軛的抗體，RT下1小時，用於分泌和兩個結合測定。用dH₂ O洗滌板五次。添加TMB將板顯色30分鐘，並且藉由添加1 M磷酸停止ELISA。在450 nm下分析每個ELISA板，從而確定每個孔的光密度。 重組抗IL-13抗體的製備

對於更大規模生產，在十個70%匯合的100 mm培養皿中，將重鏈和輕鏈表現載體（2.5 μg的每個鏈/培養皿）脂質體轉染到HEK293細胞中。在37°C下，將轉染的細胞孵育4天，此時收穫上清液（6 mL），並且替換為6 mL的新鮮培養基。在第7天，伴隨初始收穫，移出並且合併上清液（總計來自10個板，120 mL）。

使用蛋白A瓊脂糖（Amersham Biosciences [安瑪西亞有限公司]，皮斯卡塔韋，新澤西州）親和層析法（1 mL），從上清液純化每種抗體。用500 mL的0.1 M甘胺酸（pH 2.5）從蛋白A柱析出抗體。將析出液在PBS（pH 7.4）中透析，並且過濾滅菌。藉由非還原SDS-PAGE分析抗體，從而評估純度和產量。還藉由UV分析在OD 280下測量濃度。 實例2：重組抗體表徵

如以上描述，在嗜酸性球趨化因子-1測定中，分析重組抗體之效力。將結果呈現在下表8中。還包括的是，此測定中測量的IC50是針對鼠IL-13受體α2/FC和人IL-13受體α2/Fc。圖3示出了與同型匹配的對照（例如不相關的IgG2單株抗體）相比，藉由重組抗體643和731對IL-13誘導的嗜酸性球趨化因子釋放的百分比抑制。 [表8]

	IC50（pM）
mAb ID	n = 1	n = 2	n = 3	平均值	標準差
731	11	19	17	16	4
713	21	21	19	21	1
mIL-13Rα2/Fc	29	39	29	32	6
643	44	28	33	35	8
623	31	40	35	36	4
693	38	69	53	54	16
602	80	53	ND	66	NA
353	99	123	80	101	22
hIL-13Rα2/Fc	128	147	119	131	14
785	223	144	160	176	42
11.18.3	213	304	217	245	51
157	260	207	306	258	50
176	233	ND	ND	233	NA
183	1040	1842	ND	1441	NA
264	293	313	284	297	15
243	253	ND	ND	253	NA
356	1087	913	ND	1000	NA

BiaCore親和力

針對六種抗體（602、623、643、693rep1、693rep2和7310），藉由BiaCore測定研究與人IL-13（R&D Systems [研究與診斷系統有限公司]）的親和力。首先，使用偶聯用於一次捕獲三個mAb的常規胺，在CM5 Biacore晶片上製備兩個高密度山羊α-人抗體表面。使用含有100 μg/ml BSA的HBS-P運行緩衝液，將所有mAb稀釋為約5 μg/Ml。使用Biacore 2000儀器，對於每一個IL-13注射週期，在不同流動池表面上，捕獲每種純化的mAb一分鐘。

對於mAb 693、713和731，按100.9、50.4、25.2、12.6、6.30、3.15、1.58和0.788 nM的濃度，並且對於mAb 602、623、和643，按25.2、12.6、6.30、3.15、1.58、0.788、和0.394 nM的濃度，使用KINJECT命令，注射IL-13（R&D Systems[研究與診斷系統有限公司]），在所有表面上持續1.5 min，隨後是20分鐘解離。在含有100 μg/ml BSA的HBS-P運行緩衝液中製備IL-13樣本。用穿插用於雙重參考的若干mAb捕獲/緩衝液KINJECT週期，一式兩份隨機注射所有樣本。

在每個週期後，用12秒脈衝的1/100稀釋的濃磷酸（146 mM，pH 1.5）再生高密度山羊α-人抗體表面。將mAb 693運行兩次，因為在最後一系列的平均解析度實驗期間，在儀器上可獲得額外流動池。

使用CLAMP，將數據擬合至具有用於傳質的項的1:1相互作用模型。針對六種抗體的數據顯示在表9中。 [表9]

抗體	ka （M-1 s-1 ）	kd （s-1 ）	KD （pM）
602	3.0 X 106	5.1 X 10-4	172
623	4.9 X 106	2.5 X 10-4	52
643	4.4 X 106	2.9 X 10-4	66
693 rep 1	2.0 X 106	3.8 X 10-4	189
693 rep 2	2.5 X 106	2.7 X 10-4	109
713	2.9 X 106	3.4 X 10-5	12
731	3.9 X 106	3.5 X 10-5	9

動力學分析

使用KinExA^® 方法評估所述抗體中幾個的動力學測量。此方法包括基於溶液，測量平衡狀態下的形式親和力測量。

將100 μg的每種mAb偶聯至CNBr激活的瓊脂糖4B或吖內酯珠粒。如製造商建議，封閉珠粒上的剩餘活性基團。然後用1 M Tris中的10 mg/ml BSA封閉珠粒，並且儲存在封閉溶液中。對於一些實驗，如製造商建議，將mAb直接吸附包被至PMMA珠粒，並且用PBS中的10 mg/ml BSA封閉，並且儲存在封閉溶液中。

使用自動化流動免疫測定系統KinExA 3000進行KinExA實驗，其中與相關mAb偶聯的珠粒用作固相。簡而言之，將根據標準方案藉由純化和刺激PBMC製備的恒定量的天然人或獼猴IL-13（10 - 650 pM）與在樣本緩衝液（具有0.1% BSA的PBS，用來減少非特異性結合）中按25 nM起始的滴定濃度的抗h-IL-13 mAb一起孵育。將抗原/抗體複合物在室溫下孵育48小時至168小時以達到平衡。使混合物穿過相應抗體偶聯的珠粒以累積未結合的抗原。變化混合物的體積和流速，視各實驗中獲得的特定信號而定。

使用含有第二Ab（結合另一表位的多選殖抗IL-13 Ab或單株Ab）和樣本緩衝液中第二抗體的Cy5共軛的抗物種Ig的溶液，檢測捕獲的IL-13。在一些情況下，使用SA-Cy5和結合除珠粒固定的Ab結合的表位之外的表位的生物素化抗體的混合物，檢測珠粒結合的IL-13。

在每個實驗中，改變第二抗體溶液的濃度、體積、和流速，從而優化信噪比。結合信號轉變成相對值，呈缺少hIL-13下對照的比例形式。針對所有平衡實驗，測量各樣本的三個複製物。使用KinExA軟體內含有的單點均一結合模型，自數據的非線性回歸分析獲得平衡解離常數（K_D ）。軟體計算K_D 且藉由將數據點與理論K_D 曲線擬合，確定95%置信區間。95%信賴區間提供為K_D 低及K_D 高形式。對於天然人IL-13，親和力總結在表10中，並且對於天然獼猴IL-13，親和力總結在表11中。 [表10]

抗體	KD	KD 低	KD 高
623	24 pM	6.6 pM	60 pM
643	13 pM	6.2 pM	25 pM
713	3.6 pM	1.1 pM	7.3 pM
731	8.9 pM	6.2 pM	12 pM

[表11]

抗體	KD	KD 低	KD 高
623	37 pM	18 pM	64 pM
731	1.6 nM	880 pM	2.2 nM

對於兩種抗體623和731，使用KinExA研究結合速率常數。將相同的IL-13偶聯的珠粒用作探針，並且使用「直接」或「注射」方法。關於抗原捕獲、抗原濃度和抗原檢測，該等方法與KinExA平衡測定相同。在直接方法中，預先混合抗原和抗體，並且然後在KinExA上運行。在注射方法中，在讀取前，將抗體和抗原的滴定混合在一起，持續設定時間。簡而言之，基於平衡實驗，將hIL-13與一個量的將結合約80%的抗原的mAb混合。重複探測樣本中存在的游離抗原，預平衡。由於結合信號與溶液中游離抗原成比例，信號隨時間減小，直至溶液達到平衡。取決於測試的mAb，抗原-mAb混合物和Cy5標記的第二抗體的體積和流速發生變化。利用KinExA分析軟體分析數據。此軟體以圖形方式表示結合信號隨時間減小，並且將收集的數據點擬合至結合動力學微分方程的精確解。從這一曲線確定k_on 的最優解（表12）。從k_on 和K_D 的解間接計算k_off 。 [表12]

抗體	方法	KD（pM）	kon （M-1 .s-1 ）	Konjieheon 結合	koff （s-1 ）	%誤差
kon 高	kon 低
623	動力學直接	24	1.1E+07	1.4E+07	5.1E+06	2.7E-04	1.37
623	動力學注射	24	1.5E+07	2.1E+07	1.1E+07	3.6E-04	5.46
731	動力學注射	8.9	4.7E+06	6.3E+06	3.4E+06	4.2E-05	4.96

結合IL-13變體蛋白

研究了抗體623和731結合IL-13變體蛋白之能力，在IL-13變體蛋白中，野生型精胺酸110被替換為麩醯胺酸（IL-13Q110R）。

簡而言之，藉由在4°C下，在1xPBS（pH 7.4）和.05%疊氮化物中孵育過夜，將板在IL-13RbFc（50 μL的2.5 μg/mL）中包被。然後用1xPBS洗滌板，並且在室溫下，用100 μL的1%無脂肪脫脂乳/1xPBS封閉30分鐘。

在室溫下，用抗IL-13抗體預孵育IL-13或IL-13Q110R 1 hr。豎直滴定的IL-13來自2000 ng/ml，具有30 μl/孔的最終體積。每孔按40 ng/ml（sc731、623）和80 ng/ml（sc693）添加30 μl的mAb，導致在滴定中的第一點，1000 ng/ml的IL-13的最終濃度，在滴定中的第一點，20 ng/ml的抗體623和731的最終濃度，以及在滴定中的第一點，40 ng/ml的抗體693之最終濃度。

在預孵育後，從預孵育溶液轉移50 μl/孔至用IL-13RbFc預包被的板，並且在室溫下孵育30分鐘。洗滌板，並且按200 ng/ml的濃度，添加兔抗Hu IgG Fc HRP。在另外30分鐘孵育和隨後的洗滌後，添加TMB並且再孵育30分鐘。用1N HCL停止反應，並且儘快在Powerwave X340 96孔酶標儀（Biotek [美國伯騰儀器有限公司]）上讀取板。

如在圖4中國可見，用IL-13預孵育抑制了抗體623和731二者與IL-13包被的ELISA板的結合，同時用IL-13變體IL-13Q110R預孵育以遠遠大於抑制623的結合的程度抑制了731的結合。 受體鏈競爭

研究了抗IL-13抗體阻斷IL-13結合受體IL-13Rα1和IL-13Rα2之能力。使用流式細胞儀分析樣本。結果呈現在圖5A和圖5B中。數據證明了Ab 643（圖5A）和Ab 731（圖5B）或同型對照抗體結合IL-13和結合過程中是關於的受體之能力。使用針對HDFa細胞上表現的所有可能的IL-13受體的中和抗體，確定結合IL-13並且允許抗體與細胞相互作用的特定受體（例如IL-13Ra2、IL-13Ra1、或IL-4R）。不同實驗和預測結果的總結展示在圖5C和圖5D中（如果接受這種改變，調整圖解）。

簡而言之，將HDFa細胞重新懸浮在FACS緩衝液中，從而產生約200 000個細胞/孔/100 μL，並且將100 μL的細胞等分到96孔VEE底板中。按兩倍最終濃度（10 μg/mL最終），在FACS緩衝液中稀釋中和抗受體抗體（抗人IL-13Ra1（R&D Systems [研究與診斷系統有限公司]）、抗人IL-13Ra2（R&D Systems[研究與診斷系統有限公司]）或抗人IL-4R（R&D Systems[研究與診斷系統有限公司]））。按2X最終濃度（1 μg/mL），如IL-13（人R&D[研究與診斷系統有限公司]；10 ng/mL最終）一樣，在FACS緩衝液中稀釋抗IL-13和對照Ab。

按180xg，將HDFa細胞的VEE底板離心7 min，並且藉由倒置移出上清液（板#1）。將細胞重新懸浮在50 μL FACS緩衝液中，並且將另外的50 μL的人IL-13Ra1、抗人IL-13Ra2、抗人IL-4R或FACS緩衝液（無受體Ab對照）添加至適當的孔中。然後在冰上孵育細胞和抗體約1.5 hr。

將第二VEE底板用於Ab/IL-13預孵育（板#2）。將60 μL的測試抗體等分到VEE底板中。將60 μL的IL-13添加到適當的孔中，並且將混合物在冰上孵育約1.5 hr。

孵育後，按180xg，將HDFa細胞離心7 min，並且藉由倒置移出上清液。將板#1中的細胞重新懸浮在100 μL FACS緩衝液或100 μL的Ab/IL-13中，並且再孵育1.5 hr。

在第二次孵育後，將細胞離心，用FACS緩衝液洗滌1X，並且將100 μL的FACS緩衝液、7AAD或2 μg/mL山羊抗Hu IgG-Fc-Cy5添加到適當的孔中。

將細胞和第二抗體在冰上孵育20分鐘，隨後用FACS緩衝液洗滌。然後將細胞重新懸浮在100 μL FACS緩衝液中，並且等分到含有300 μL冷FACS緩衝液的經預標記的管中。

使用流式細胞儀分析樣本。結果呈現在圖5A和圖5B中。每種抗體的以上方案和預測結果的總結顯示在圖5C和圖5D中。如圖5A所示，在Ab 623存在下，IL-13並不結合HDFa細胞。似乎Ab 623阻止IL-13結合在HDFa細胞上的其受體，如在圖5C的每個小圖中所示。如在圖5B中可見，對於Ab 731，不是這種情況。IL-13允許Ab731結合HDFa細胞。此結合並不被針對IL-13Rα1或IL-4R的Ab阻斷，而是被針對IL-13Rα2的抗體阻斷，指示Ab 731阻止IL-13結合IL-13Rα1或IL-4R，但是不阻止結合IL-13Rα2，如展示在圖5D中。

藉由使用抗受體抗體的FACS分析，確定HDFa細胞上的IL-13 Ra1、IL-13 Ra2和IL-4R表面表現之量。按5 μg/ml的濃度，將如以上描述製備的HDFa細胞與抗受體抗體一起在冰上孵育1 hr。將細胞用FACS緩衝液洗滌，並且與 2 μg/ml的Cy5第二（抗人）抗體在冰上孵育30 min。洗滌後，藉由流動式細胞測量術分析樣本。將結果呈現在下表13中。 [表13]

表位作圖

藉由以下三種方法分析抗體IL-13複合物的表位：1) SELDI，2) 隨機肽噬菌體展示文庫的篩選，和3) 嵌合人/小鼠IL-13分子的表現。這三種技術與IL-13的結構的知識組合產生了該等mAb的相對結合位和抗原區的一致觀點。這已經允許功能表位的鑒定，特別是針對傳訊受體的結合中是關於的區域。

作為初始檢驗，mAb結合IL-13純化蛋白的斑點印跡分析揭示哪種抗體結合表位的哪種形式（線性表位或構象表位）。mAb 693和785結合還原的變性抗原，線性表位。mAb 602、623、643、和713結合非還原的（構象表位）IL-13，但是不結合還原的變性抗原。mAb 763展示了沒有結合。這之後，使用隨機肽噬菌體展示文庫，將線性表位作圖。在針對噬菌體上表現的12-mer隨機肽文庫，淘選mAb 693兩輪後，將單特異性結合物定序並且與IL-13的殘基109-120（螺旋D）進行比對。（圖6A）。將IL-13抗體分組到3個不同的面元中，儘管面元並不總是關聯藉由其他方式確定的表位。挑選來自每個面元的一種抗體用於藉由SELDI進行作圖。表14證明了IL-13抗體的分組結果。 [表14]

Mab	VH	VL	分組
353	VH4-59/D2-21/JH3b	A30/JK3	1
713	VH3-23/D6-19/JH6b	V2-1/JL1	1
731	VH3-23/D6-19/JH6b	V2-1/JL1	1
602	VH3-15/D1-26/JH6b	V2-7/JL3	2
623	VH3-15/D1-26/JH6b	V2-7/JL3	2
643	VH3-15/D1-26/JH6b	V2-7/JL3	2
693	VH4-4/D5-5/JH6B	V2-14/JL2	3

使用SELDI的表位作圖

用高濃度的Lys-C和Asp-N消化抗體-抗原複合物。然後藉由SELDI確定表位並且藉由片段的質量進行鑒定。表15展示了用內蛋白酶Lys-C消化的肽之預測質量。 [表15]

質量	位置	空切（Mis. Cut）	肽序列	SEQ ID NO:
9442.7	21-108	3	GPVPPSTALRELIEELVNIT QNQKAPLCNGSMVWSINLTA GMYCAALES LINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFS SLHVRDTK	14
7829.9	21-93	2	GPVPPSTALRELIEELVNIT QNQKAPLCNGSMVWSINLTA GMYCAALESLINVSGCSAIE KTQRMLSGFCPHK	15
7729.8	45-116	3	APLCNGSMVWSINLTAGMYC AALESLINVSGCSAIEKTQR MLSGFCPHKVSAGQFSSLHV RDTKIEVAQFVK	16
6815.3	45-108	2	APLCNGSMVWSINLTAGMYC AALESLINVSGCSAIEKTQR MLSGFCPHKVSAGQFSSLHV RDTK	17

切割後鑒定的質量為6842.8（對於肽片段45-108）、7733.7（對於肽片段45-116）、和9461.4（對於肽片段21-108）。因此，mAb 713的結合位被確定在IL-13的殘基45-108內。 用於構象表位作圖的肽陣列

產生101（跨越IL-13序列的殘基21-132的12-mer肽）的肽陣列（SIGMA-Genosys公司）。每個連續肽從前一個肽偏移一個胺基酸，產生嵌套重疊文庫。用mAb 713探測陣列，並且藉由將PVDF膜與HRP共軛的第二抗體一起孵育隨後是增強化學發光，檢測mAb713與肽的結合。觀察到對應於IL-13的胺基酸70至80的兩個連續斑點，和對應於IL-13的胺基酸83至92的三個連續斑點。 使用小鼠IL-13嵌合分子之表位作圖

將螺旋A、螺旋B、螺旋C、和螺旋D的小鼠序列用人序列改組，產生四個新的小鼠嵌合體。螺旋的位置的表示顯示在圖6B中。mAb都不結合小鼠IL-13。四個嵌合體如下：

MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPRSVSLPLTLKELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN（SEQ ID NO: 18 ）； MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGGFCVALDSLTNVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN（SEQ ID NO: 19 ）； MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIYRTQRILHGLCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN（SEQ ID NO: 20 ）； MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGQQFN（SEQ ID NO: 21 ）。

然後表現嵌合體，並且在ELISA測定中檢測分泌的IL-13嵌合蛋白。結果總結在表16中，「*」表示在夾心ELISA中結合很弱。 [表16]

mAb	Hu IL-13	Mo螺旋A	Mo螺旋B	Mo螺旋C	Mo螺旋D	表位	分組
693	有	有	有	有	無	螺旋D	3
785	有	有	有	有	無	螺旋D
713*	有	有	有	無	有	螺旋C	1
731*	有	有	有	無	有	螺旋C	1
602	有	有	有	有	有		2
623	有	有	有	有	有		2
643	有	有	有	有	有		2

IL-13的表位的以上三個研究的結果總結在表17中。 [表17]

因此，似乎本文揭露的不同抗體使用多個不同的可能的表位位置。 抗體結合分析

藉由測量兩種抗體同時結合抗原之能力（一種抗體捕獲珠粒上的抗原，並且另一種抗體用於檢測），將抗IL-13抗體分組到三個不同的面元中。從抗原存在時獲得的信號減去在抗原不存在時珠粒上的信號。每種檢測抗體的信號除以捕獲抗體的信號從而確定結合的增加倍數，如圖7所示。然後基於捕獲抗體上的類似結合模式將抗體分組。對於測試的九種檢測抗體，數據鑒定了結合的抗體的三個面元的存在（圖7）。

簡而言之，將小鼠抗人IgG1、2、3、4（BD Pharmingen公司555784）共軛的珠粒添加至單個暗黑微量離心管中的捕獲抗體（353 & 11.18；5 ug/mL）。在4°C下，在黑暗中，將管旋轉過夜。將珠粒等分至濾板的每個孔中（每種珠粒2500個/孔），並且洗滌。

將IL-13-RbIg（5 μg/ml）和對照（僅培養基）添加至濾板（60μl/孔），然後在室溫下，在黑暗中，將濾板在震盪器上孵育1小時，並且隨後洗滌2次。

按60 μl/孔（1種抗體/孔）添加在培養基中稀釋的第二抗體。按以下濃度使用抗體（353B-5 g/ml；11.18.31-5μ g/ml；713-0.56μ g/ml；731-1.28μ g/ml；693-2.7μ g/ml；623-5.7μ g/ml；602-11μ g/ml；643-4.3μ g/ml；785-5.5μ g/ml；763-5.7μ g/ml；G2對照-5μ g/ml）。然後在室溫下孵育板兩小時，並且洗滌。

將在培養基中按5 μg/ml稀釋的生物素化Mo抗HuIg G1、2、3、4（BD Pharmingen公司# 555785）添加至每個孔（60 μl/孔），並且在室溫下，在黑暗中，將板在震盪器上孵育1小時。洗滌後，添加在培養基中稀釋的60 μl/孔鏈黴親和素-PE（5ug/mL；藥物# 554061）。在室溫下，在室溫下，在黑暗中，將板在震盪器上孵育20 min，並且洗滌2次。

藉由小心地上下抽吸幾次重新懸浮珠粒，將每個孔重新懸浮在80 μl儲存/封閉緩衝液（PBS，10 mg/ml BSA，0.05% w/v疊氮化鈉）中。藉由在具有8,400和14,500之間的門設置的Luminex上讀取，分析每個孔。

Luminex平臺係基於螢光珠粒的技術，它使得技術人員能夠同時運行多個測定。Luminex讀取器能夠確定不同的編碼的微球上的陽性傳訊事件。這允許技術人員分開包被每個珠粒，然後將差異包被的微球混合在一起，並且然後一步測定結合每種不同微球的抗體。為了將抗體分型，以這樣一種方式包被微球，使得每個珠粒能夠特異性結合特定重鏈或輕鏈同型。然後將微球混合在一起，並且添加針對每種抗體的融合瘤上清液。20分鐘孵育後，洗滌微球，並且使用螢光標記的第二抗體檢測結合的抗體。然後使用Luminex讀取器讀取微球。 實例3：臨床前體內數據 人源化IL-13小鼠

在Lexicon（伍德蘭，德克薩斯州），產生人源化IL-13小鼠，其中藉由插入編碼人IL-13的cDNA，破壞編碼鼠IL-13的基因。將小鼠回交到A/J系，從而確保小鼠易患如前所述之過敏原誘導的氣道高反應性（Ewert等人，（2000）Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.[美國呼吸細胞與分子生物學雜誌]）。

為了證明人源化IL-13僅產生人IL-13並且不產生鼠IL-13，將來自OVA特異性CD4⁺ T細胞（源自人源化IL-13小鼠，6-8 wk齡）的細胞介素產生與源自WT小鼠的CD4⁺ T細胞進行比較。藉由用0.9%無菌鹽水中的50 µg OVA/1 mg Imject Alum（Pierce[皮爾斯公司]，羅克福德，伊利諾州）或用PBS進行腹腔注射，來將小鼠敏化（每個處理3個小鼠）。敏化七天後，將小鼠處死，並且製備脾的單細胞懸浮液。將紅血球裂解，並且按 5 x 10⁶ 個細胞/ml將洗滌的脾細胞重新懸浮在由以下組成的完全培養基中：具有10%熱滅活的FCS的HL-1（BioWhittaker公司，沃克斯維爾，馬里蘭州）、2 mM L麩醯胺酸、和50 mg/L硫酸新黴素。在37°C下，在200 µg/ml OVA存在下，培養脾細胞4天，從而產生Ag反應性CD4⁺ T細胞。分離CD4⁺ T細胞（5 x 10⁵ 個細胞/孔），並且然後在96孔板中（250 µl/孔）在200 µg/ml OVA存在下與新鮮分離的絲裂黴素 C（25 µg/ml）處理的脾細胞（5 x 10⁵ 個細胞/孔，來自WT小鼠）在完全培養基中一起孵育96小時。

收集無細胞培養上清液，並且測試細胞介素產生。根據製造商的方案，藉由ELISA確定人和鼠IL-13（DuoSet，R&D Systems[研究與診斷系統有限公司]，明尼阿波里斯市，明尼蘇達州）濃度。如預期，源自體外OVA再刺激後的人源化IL-13小鼠的CD4⁺ T細胞產生人IL-13並且不產生鼠IL-13（圖8，小圖A）。相比之下，源自WT小鼠的CD4⁺ T細胞產生鼠IL-13並且不產生鼠IL-13（圖8，小圖B）。 氣道高反應性

使用以上描述的人源化IL-13小鼠，在OVA誘導的氣喘模型中，測試抗IL-13抗體731和623。為了測量對乙醯膽鹼的靜脈投與的氣道反應性，使用24天方案。簡而言之，藉由腹膜內注射PBS（0.2 ml）中的OVA（10 µg；粗品等級IV；Sigma[西格瑪公司]），將小鼠免疫接種。使用單獨PBS作為對照。免疫接種後，用克他明（ketamine）和甲苯噻𠯤（xylazine）的混合物[分別是45和8 mg/千克體重（mg/kg）]麻醉小鼠，並且用50 µl的1.5%OVA溶液或等體積的PBS（作為對照）氣管內投與來激發。

第一次抗原激發後七天，再次用OVA或PBS氣管內激發小鼠。在每次激發一天前，按100 μg/小鼠之劑量腹膜內投與731和623抗體（第13和20天）。對照小鼠接受PBS或不相關的作為同型對照的IgG2。最後一次氣管內激發後三天，用戊巴比妥鈉（90 mg/kg）麻醉小鼠，插管，按120次呼吸/min的速率，用恒定潮氣量的空氣（0.2 ml）通氣，並且用十烴溴銨（25 mg/kg）麻痹。在建立穩定的氣道壓力後，靜脈內注射乙醯膽鹼（50 µg/kg），並且測量動態氣道壓力5 min。測量對乙醯膽鹼激發的氣道高反應性（AHR）。藉由峰值氣道壓力中的時間積分上升限定對乙醯膽鹼激發的氣道高反應性[按釐米計的H₂ O氣道壓力時間指數（APTI）× 秒]。與OVA + IgG2對照組相比，*P ＜ 0.05[單向方差分析（ANOVA），隨後是費舍爾最小顯著差異檢驗，用於多重比較]。用731或623處理導致完全逆轉OVA誘導的AHR（圖9）。在此實例中，完全逆轉意指與OVA一起添加抗體導致與其中沒有OVA並且僅添加抗體（例如IgG2）的效果類似的效果。 OVA誘導的黏液產生

將18天方案用於測量OVA誘導的黏液產生。在第0和7天，用2 mg Imject Alum中的卵白蛋白（OVA，25 µg；粗品等級IV）（Sigma[西格瑪公司]）進行皮下致敏後，用異氟烷麻醉小鼠，並且在第14、15、和17天，用PBS中的OVA的50 µl 1.5%溶液進行鼻內激發。對照小鼠接受alum作為致敏，或PBS作為激發。

在第13、15、和17天，按100 μg/小鼠之劑量腹膜內投與731和632抗體。對照小鼠接受PBS。在第18天，將小鼠處死，並且在灌注後收集肺。將肺組織（包括中央和周邊氣道）在10%福馬林中固定，在70%乙醇中洗滌，脫水，在乙二醇甲基丙烯酸酯中包埋，切割成4 µM切片，安裝在載玻片上，並且用蘇木素和伊紅，加上過碘酸-雪夫氏（PAS）進行染色。在20×放大倍數下，檢查肺切片（每個動物一個切片）。隨機選擇五個視野，並且對於每個切片，在每個視野中將支氣管之數量計數。在從0至4的比例下將切片得分（0：＜ 5% PAS⁺ 杯狀細胞；1：5%至25%；2：25%至50%；3：50%至75%；4：＞ 75%）。為了獲得組織學杯狀細胞評分（表示為任意單位；U），將來自每個肺的氣道得分的總和除以檢查的支氣管之數量。在OVA處理組中，八個小鼠中的五個死亡。在其他組中，沒有小鼠死亡。投與731和623有效將氣道中含黏液細胞的OVA誘導增加逆轉（圖10）。數據為平均值 ± SE。n = 3，對於OVA/OVA/PBS組（初始n = 8）；N = 8，對於OVA/OVA/731組，n = 4，對於OVA/OVA/623組；n = 4，對於OVA/PBS/PBS 組，n = 5，對於Alum/OVA/PBS、和Alum/PBS/PBS組。藉由不成對學生t檢驗，*p ＜ 0.01，對比OVA/OVA/PBS組。 實例4：抗體的結構分析

將表1中顯示的抗體的可變重鏈和可變輕鏈定序，從而確定其DNA序列。在與本文一起提交的序列表中顯示了所有抗IL-13抗體的完整序列資訊，包括核苷酸和胺基酸序列。

表18示出了多種本文描述的IL-13抗體的重鏈基因之胺基酸序列。圖18還顯示了對應於每種抗體的CDR和框架區之胺基酸序列，伴隨與其種系序列進行比較。

表19示出了多種本文描述的IL-13抗體的κ輕鏈基因之胺基酸序列。圖19還顯示了對應於每種抗體的CDR和框架區之胺基酸序列，伴隨與其種系序列進行比較。

表20示出了多種本文描述的IL-13抗體的　輕鏈基因之胺基酸序列。圖20還顯示了對應於每種抗體的CDR和框架區之胺基酸序列，伴隨與其種系序列進行比較。 [表18]

單細胞	SEQ ID NO	V 重 /D/J	FR1	CDR1	FR2
-	22	種系	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
157	23	VH3-21/D1-26/JH3b	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
183	24		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
176	25		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
243	26		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
264	27		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
	28	種系	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS	GGSISSYYWS	WIRQPPGKGLEWIG
353	29	VH4-59/D2-21/JH3B	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS	GGSISTYYWS	WIRQPPGKGLEWIG
-	30	種系	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYAMS	WVRQAPGKGLEWVS
713	31	VH3-23/D6-19/JH6B	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYAMS	WVRQAPGKGLEWVS
731	32		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYAMS	WVRQAPGKGLEWVS
-	33	種系	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYAMS	WVRQAPGKGLEWVS
785	34	VH3-23/D3-3/JH4B	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYAMS	WVRQAPGKGLEWVS
-	35	種系	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS	GGSISSYYWS	WIRQPAGKGLEWIG
693	36	VH4-4/D5-5/JH4B	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVS	GGSISSYYWS	WIRQPAGKGLEWIG
-	37	種系	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSNAWMS	WVRQAPGKGLEWVG
623	38	VH3-15/D1-26/JH6B	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSNAWMS	WVRQAPGKGLEWVG
643	39		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSNAWMS	WVRQAPGKGLEWVG
602	40		EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSNAWMS	WVRQAPGKGLEWVG
-	41	種系	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS	GFTFSSYGMH	WVRQAPGKGLEWVA
11.18	42	VH3-33/D6-19/JH5B	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVAS	GFTFSSYDMH	WVRQAPGKGLEWVA
-	43	種系	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSSYSMN	WVRQAPGKGLEWVS
356	44	VH3-21/NA/JH6B	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS	GFTFSDYNMH	WVRQAPGKGLEWVS

[表18]（續）

單細胞	CDR2	FR3	CDR3	FR4
-	SISSSSSYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR		WGQGTMVTVSS
157	YISTSYNYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR	DQVGATLDAFDI	WGQGTMVTVSS
183	YISSSYNYIYYGDSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR	DQVGATLDAFDI	WGQGTMVTVSS
176	YISTSNSYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR	DQVGATLDAFDI	WGQGTMVTVSS
243	YISTSNSYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR	DQVGATLDAFDI	WGQGTMVTVSS
264	YISTSNSYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR	DQVGATLDAFDI	WGQGTMVTVSS
	YIYYSGSTNYNPSLKS	RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR		WGQGTMVTVSS
353	YIYYSGSTNYNPSLKS	RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR	DGGHYWDDAFDI	WGQGTMVTVSS
-	AISGSGGSTYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK		WGQGTTVTVSS
713	AFSGSGGSTYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVQ	DGLGPYFYNYGMDV	WGQGTTVTVSS
731	AFSGSGGSTYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVQ	DGLGPYFYNYGMDV	WGQGTTVTVSS
-	AISGSGGSTYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK		WGQGTLVTVSS
785	AISGSGGSTYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK	ADFWSGTLWGFDY	WGQGTLVTVSS
-	RIYTSGSTNYNPSLKS	RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR		WGQGTLVTVSS
693	RIYMTGRTNYNSSLKS	RVTMSIDTSKNQLSLKLSFMTAADTAVYYCAR	ESGSSYSYDY	WGQGTLVTVSS
-	RIKSKTDGGTTDYAAPVKG	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT		WGQGTLVTVSS
623	RIRSEIDGGTTNYAAPVKG	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAT	DQVGAYYGDYYGMDV	WGQGTLVTVSS
643	RIRSEIDGGTTNYAAPVKG	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRTEDTAVYYCAT	DQVGAYYGDYYGMDV	WGQGTLVTVSS
602	RIRSKIDGGTINYAAPVKG	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAT	DQVGAYYGDYYGMDV	WGQGTLVTVSS
-	VIWYDGSNKYYADSVKG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR		WGQGTLVTVSS
11.18	VIWYDGSNKYYADSVQG	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTS	EDSSGWYDGWFDP	WGQGTLVTVSS
-	SISSSSSYIYYADSVKG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR		WGQGTTVTVSS
356	SISYSSTYIYYADSVRG	RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVFYCAR	EDYYYYGLDV	WGQGTTVTVSS

[表19]

單細胞	輕 --Vκ/J	FR1	CDR1	FR2
	種系	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIRNDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
157	A30(Vk1)/JK3	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIGDDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
183		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIGDDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
176		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTC	RASQDITDDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
243		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTC	RASQDITDDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
264		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTC	RASQDITDDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
353		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIRNDLD	WYQQKPGKAPKRLIY
-	種系	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGISNYLA	WYQQKPGKVPKLLIY
11.18	A20/JK3	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGISNYLA	WYQQKPGKVPKVLIY
-	種系	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIRNDLG	WYQQKPGKAPKRLIY
356	A20/JK2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC	RASQGIRNDLG	WYQQKPGKAPKRLIY

[表19]（續）

單細胞	CDR2	FR3	CDR3	J
	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC		FGPGTKVDIK
157	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPFT	FGPGTRVDIK
183	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPFT	FGPGTKVDIK
176	AASSLQS	GVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPFT	FGPGTKVDIR
243	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPFT	FGPGTKVDIR
264	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPFT	FGPGTKVDIR
353	DASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHDSYPFT	FGPGTKVDIK
-	AASTLQS	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC		FGPGTKVDIK
11.18	AASTLQS	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC	QKYNSAPFT	FGPGTKVDIK
-	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC		FGQGTKLEIK
356	AASSLQS	GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC	LQHNSYPWT	FGQGTKVEIK

[表20]

單細胞	輕 —V　/J	FR1	CDR1	FR2
-	種系	SYELTQPPSVSVSPGQTASITC	SGDKLGDKYAC	WYQQKPGQSPVLVIY
713	V2-1/JL1	SYELTQPPSVSVSPGQTASITC	SGDKLGDKYTC	WFQQKPGQSPVLVIY
731		SYELTQPPSVSVSPGQTASITC	SGDKLGDKYAC	WFQQKPGQSPVLVIY
-	種系	SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC	GGNNIGSKSVH	WYQQKPGQAPVLVVY
693	V2-14/ JL2	SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC	GGNNIGSKGVH	WYQQKPGQAPVLVVY
785		SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC	GGNNIGNKIVH	WYQQKPGQAPVLVVY
-	種系	SYELTQPPSVSVSPGQTARITC	SGDALPKKYAY	WYQQKSGQAPVLVIY
623	V2-7/JL3	SYELTQPPSVSVSPGQTARITC	SGDALPEKYAY	WYQQKSGQAPVLVIY
643		SYELTQPPSVSVSPGQTARITC	SGDALPEKYAY	WYQQKSGQAPVLVIY
602		SYELTQPPSVSVSPGQTARITC	SGDALPEKYAY	WYQQKSGQAPVLVIY

[表20]（續）

單細胞	CDR2	FR3	CDR3	J
-	QDSKRPS	GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC		FGTGTKVTVL
713	HDSKRPS	GIPERFSGSNSGDTATLTISGTQAMDEADYYC	QAWDSSTYV	FGTGTKVTVL
731	HDSKRPS	GIPERFSGSNSGDTATLTISGTQAMDEADYYC	QAWDSSTYV	FGTGTKVTVL
-	DDSDRPS	GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC		FGGGTKLTVL
693	DDSDRPS	GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC	QVWVSSSDHHVV	FGGGTKLTVV
785	DDSDRPS	GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC	QVWDSSSDHVV	FGGGTKLTVL
-	EDSKRPS	GIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYC		FGGGTKLTVL
623	EDSKRPS	GIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYC	HSTDSSGNHGV	FGGGTKLTVL
643	EDSKRPS	GIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYC	HSTDSSGNHGV	FGGGTKLTVL
602	EDTKRPS	GIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYC	YSTDSSGNHGV	FGGGTKLTVL

實例5：抗IL-13抗體作為用於檢測樣本中的IL-13的診斷試劑的用途

可以開發用於檢測樣本中的IL-13的酶聯免疫吸附測定（ELISA）。在該測定中，用針對IL-13的第一完全人單株抗體，將微量滴定板（例如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板）的孔吸附幾個小時。將固定抗體用作可以存在於測試樣本中的IL-13的捕獲抗體。沖洗孔，並且用封閉劑（例如乳蛋白或白蛋白）進行處理，從而防止分析物的非特異性吸附。

隨後，用懷疑含有IL-13的測試樣本處理孔，或用含有標準量的抗原的溶液處理孔。

沖洗掉測試樣本或標準物後，用藉由共軛生物素進行標記的第二完全人單株抗IL-13抗體處理孔。將莖標記的抗IL-13抗體用作檢測抗體。在沖洗掉過量第二抗體後，用親和素共軛的辣根過氧化物酶（HRP）和適合的顯色底物處理孔。藉由與開發自標準樣本的標準曲線進行比較，確定測試樣本中的抗原濃度。 實例6：人中COPD之治療

鑒定了患有COPD之患者。藉由靜脈注射，將5 mg/kg劑量的抗IL-13抗體623和/或721投與至患者。三周後，並且之後每三週，給予增強投與。抗IL-13抗體引起黏液產生的抑制、支氣管上皮細胞增生的發展、和枝氣管平滑肌的痙攣。黏液產生的抑制和平滑肌收縮減小了氣道的阻斷，伴隨改善的通氣。 實例7：人中慢性支氣管炎之治療

鑒定了特徵在於慢性支氣管炎的患有COPD之患者。藉由靜脈注射，將5 mg/kg劑量的本文揭露的抗IL-13抗體（較佳的是623或731）投與至患者。三週後，並且之後每三週，給予增強投與。抗IL-13抗體引起黏液產生的部分或完全抑制和發炎的呼吸組織中枝氣管平滑肌收縮。黏液產生的抑制和平滑肌收縮減小了氣道的阻斷，伴隨改善的通氣。 實例8：人中肺氣腫之治療

鑒定了患有肺氣腫之患者。藉由靜脈內注射，將5 mg/kg劑量的IL-13抗體投與至患者。三週後，並且之後每三週，給予增強投與。IL-13抗體引起發炎的呼吸組織中的中性球趨化性的部分或完全抑制。中性球趨化性之抑制減小了由患者的免疫應答引起的肺和氣道的組織損傷的嚴重性。在導致肺氣腫中肺組織的破壞的蛋白酶誘導中，存在IL-13的直接作用（至少是假設的）。 實例9：人中「不可逆的」氣喘之治療

鑒定了患有氣喘之患者。藉由靜脈內注射，將5 mg/kg劑量的本文描述的抗IL-13抗體（較佳的是623或731）投與至患者。三週後，並且之後每三週，給予增強投與。抗IL-13抗體減小了由患者的免疫應答引起的肺和氣道的組織損傷的嚴重性。 實例10：MMAB7的變體

出於穩定性，將一些變體製造為在非CDR區中是Mmab7輕鏈和重鏈。那些變體列出在下表21中。 [表21]

說明	序列	Seq ID NO:
MmAB7輕鏈變體4534	MAWALLLLTLLTQGTGSWASYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYAFWFQQKPGQSPVLVIYHDAKRPSGIPERFSGSNSGDTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	22
MmAb7重鏈IgG1變體122160	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAGSWVRQAPGKGLEWVSAFSGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVQDGLGPYFYNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	23
MmAb7輕鏈變體124535	MAWALLLLTLLTQGTGSWASYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYAFWFQQKPGQSPVLVIYHDSKRPSGIPERFSGSNSGDTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDASTYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	24
MmAb7重鏈IgG1變體124535	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAGSWVRQAPGKGLEWVSAFSGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVQDGLGPYFYNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	25
MmAb7輕鏈變體124536	MAWALLLLTLLTQGTGSWASYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYAFWFQQKPGQSPVLVIYHDAKRPSGIPERFSGSNSGDTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDASTYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	26
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MmAb7重鏈IgG1變體124535124539	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAGSWVRQAPGKGLEWVSAFSGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKDGLGPYFYNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	52

藉由引用併入

本文引用的所有參考，包括專利、專利申請、論文、教科書等，以及其中引用的參考，在它們尚未的程度上，在此藉由引用以其全部內容結合在此。 等同物

前述書面說明書被認為滿足能使熟悉該項技術者實踐本發明。本發明之某些較佳的實施方式中詳細描述了前述描述和實例並描述了諸位發明人考慮之最佳模式。然而，將領會到的是，不論前述事項可以在文中看起來如何詳盡，本發明可以按多種方式進行實踐，並且應該依據所附申請專利範圍及其任何等同物來解釋。

無

將從詳細描述和附圖更好地理解本發明，該等詳細描述和附圖旨在說明並且不旨在限制本發明。

[圖 1 ]示出了針對每個孔的中和數據的相對抗體濃度之圖。數據用於鑒定具有最高效力抗體的孔。

[圖 2 ]係描繪了抗原包被的關係的圖-不，這係按31 ng/mL Ag包被的每種抗體樣本的ELISA OD對比抗體的濃度之圖。

[圖 3 ]係示出了與同型匹配的對照相比，藉由重組抗體643和731的IL-13誘導的嗜酸性球趨化因子釋放的百分比抑制之圖。

[圖 4 ]係比較IL-13或IL-13Q110R抑制731或623與IL-13包被的ELISA板的結合之能力之橫條圖。

[圖 5A ]係比較抗體643和同型對照之間的細胞上受體競爭之橫條圖。可能將這個做成圖5B。

[圖 5B ]係比較抗體731和同型對照之間的細胞上受體競爭之橫條圖。將這個做成圖5D。

[圖 5C ]係 描繪了來自圖5A的方案和不同預測結果之動圖。將這個做成圖5A。

[圖 5D ]係描繪了來自圖5B的方案和不同預測結果之動圖。將這個做成圖5C。該等改變使它更易於遵守。

[圖 6A ]示出了由抗體693和一部分IL-13序列識別的噬菌體展示來源肽之比對。

[圖 6B ]係圖表，示出IL-13的二級結構並且指示人IL-13的哪個區域被小鼠IL-13替換，以便構建嵌合蛋白。

[圖 7 ]係描繪了其中不同抗體可以被分組的不同面元（bin）之圖表。

[圖 8A 和圖 8B ]係示出來自人源化IL-13小鼠的CD4⁺ T細胞產生人IL-13而不是鼠IL-13之橫條圖。

[圖 9 ]係證明抗IL-13抗體731和623抑制氣道高反應性之圖。

[圖 10 ]係證明731和623抑制黏液產生之橫條圖。

無

Claims (11)

1. 一種特異性結合人IL-13之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含輕鏈免疫球蛋白可變區（VL1）和重鏈免疫球蛋白可變區（VH）， 其中VL1包含：(i) 包含SGDKLGDKYS之胺基酸序列之CDRL1；(ii) 包含HDSKRPS之胺基酸序列之CDRL2；以及 (iii) 包含胺基酸QAWDSSTYV之CDRL3； 以及包含以下的胺基酸序列之VH1：(i) 包含SYAMS之胺基酸序列；(ii) 包含AFSGWDVSTYYADSVKG之胺基酸序列之CDRH2；以及 (iii) 包含DGLGPYFYNYGMDV之胺基酸序列之CDRH3。
2. 一種特異性結合人IL-13之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含輕鏈免疫球蛋白可變區（VL1）和重鏈免疫球蛋白可變區（VH）， 其中VL包含細胞623表現的抗體之CDR； 並且VH包含細胞623表現的抗體之CDRS pf。
3. 如請求項1-2所述之抗原結合蛋白，其進一步包含：作為細胞623表現的抗體之框架區。
4. 如請求項1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
5. 如請求項1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體片段。
6. 如請求項1-3所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體衍生物，該抗體衍生物包含雙特異性抗體、融合蛋白。
7. 如請求項1-6所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有人序列。
8. 如請求項1-6所述之抗原結合蛋白，其中該抗原結合係單株抗體。
9. 一種結合IL-13的人抗體，其中該人抗體以100-200 pM之間的K_D 結合IL-13。
10. 該結合IL-13的人抗體，其中該人抗體以60-100 pM的K_D 結合IL-13。
11. 一種人抗體，該人抗體包含具有選自SEQ ID NO: 22-52的胺基酸序列之重鏈和輕鏈。

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