KR101456728B1 - 인간화 항-ｃｄ19 항체, 및 이것의 종양학, 이식 및 자가면역 질환의 치료에서의 용도 - Google Patents

인간화 항-ｃｄ19 항체, 및 이것의 종양학, 이식 및 자가면역 질환의 치료에서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키메라 및 인간화 양태의 항-CD19 마우스 단클론 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 B 세포 질환 및 장애, 예컨대 B 세포 악성 종양(이에 국한되는 것은 아님)의 치료를 위한, 자가면역 질환의 치료 및 예방을 위한, 그리고 인간 이식 수령자에서의 이식편대숙주 질환(GVHD), 체액성 거부반응 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방을 위한, 인간 CD19 항원에 결합하고 ADCC, CDC, 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있는 치료 항체를 이용하는 약학적 조성물, 면역요법 조성물, 및 방법에 관한 것이다.
Figure R1020097007247
항-CD19 마우스 단클론 항체, B 세포 악성 종양, 자가면역 질환

Description

인간화 항-ＣＤ19 항체, 및 이것의 종양학, 이식 및 자가면역 질환의 치료에서의 용도{HUMANIZED ANTI-CD19 ANTIBODIES AND THEIR USE IN TREATMENT OF ONCOLOGY, TRANSPLANTATION AND AUTOIMMUNE DISEASE}
1. 도입
본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는, 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 보체-의존성 세포-매개 세포독성(CDC), 항원-의존성 세포-매개-세포독성(ADCC) 및 예정된(programmed) 세포 사멸(아포프토시스) 중 하나 이상을 매개할 수 있는 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IgG1 및/또는 IgG3 인간 이소타입의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물, 및 인간 ADCC, CDC 또는 아포프토시스를 매개할 수 있는, IgG2 및/또는 IgG4 인간 이소타입의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 CD19 항원에 결합하는 치료적 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 이용한, B 세포 악성 종양을 비롯한, 인간 대상의 B 세포 장애 또는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는 치료적 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 이용하는, 자가면역 질환의 치료 및 예방 방법, 및 인간 이식 수령자의 이식편대숙주 질환(GVHD), 체액성 거부반응 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.
2. 배경기술
B 세포는 그것의 분화 및 증식 동안 세포 표면 분자들의 광범위한 배열을 발현한다. 그 예에는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커가 포함된다. 이 마커들은 일반적으로 B 세포 악성 종양, 자가면역 질환, 및 이식편 거부반응과 같은 B 세포 장애 또는 질환의 치료를 위한 치료적 표적으로서 제시되어 왔다. 그것들에 특이적으로 결합하는 항체가 개발되었고, 일부는 질환 및 장애의 치료를 위한 치료제로서 시험되었다.
예를 들어, 성숙 B 세포 및 이들의 악성 대응부(malignant couterpart)에 대해 특이적인 CD20 세포 표면 분자에 대해 지정된 키메라 또는 방사선표지 단클론 항체(mAb)-기초한 요법이 비호지킨 림프종의 생체내 치료에 효과적인 것으로 나타났다(문헌 [Tedder et al., Immunol. Today 15:450-454(1994)]; 문헌 [Press et al., Hematology:221-240(2001)]; 문헌 [Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329:459-465(1993)]; 문헌 [Weiner, Semin. Oncol. 26:43-51(1999)]; 문헌 [Onrust et al., Drugs 58:79-88(1999)]; 문헌 [McLaughlin et al., Oncology 12:1763-1769(1998)]; 문헌 [Reff et al., Blood 83:435-445(1994)]; 문헌 [Maloney et al., Blood 90:2188-2195(1997)]; 문헌 [Malone et al., J. Clin. Oncol. 15:3266-3274(1997)]; 문헌 [Anderson et al., Biochem. Soc. Transac. 25:705- 708(1997)]). 항-CD20 단클론 항체 요법은 또한 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 루푸스, 특발성 혈소판감소 자반증 및 용혈성 빈혈, 및 기타 면역-매개 질환의 증상을 경감시키는 데 부분적으로 효과적인 것으로 밝혀졌다(문헌 [Silverman et al., Arthritis Rheum. 48:1484-1492(2002)]; 문헌 [Edwards et al., Rheumatology 40:1-7(2001)]; 문헌 [De Vita et al., Arthritis Rheumatism 46:2029-2033(2002)]; 문헌 [Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888(2002)]; 문헌 [Leandro et al., Arthritis Rheum. 46:2673-2677(2001)]). 항-CD20(IgG1) 항체인 리툭산(RITUXAN)은, 성인 면역 혈소판감소 자반증, 류마티스성 관절염 및 자가면역 용혈성 빈혈과 같은 특정 질환의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다(Cured 등의 WO 00/67796). 이러한 요법들의 유효성에도 불구하고, B 세포 고갈(cell depletetion)은 B 세포가 CD20을 발현하지 않거나 (예를 들어, 예비-B 세포 또는 미성숙 B 세포 상에서) 낮은 수준으로 발현하는 경우, 또는 CD20 면역요법 후에 CD20 발현을 소실한 경우, 덜 효과적이다(문헌 [Smith et al., Oncogene 22:7359-7368(2003)]).
쥐과 동물 단클론 항-CD19 항체가 당업계에 기재되었는데, 그 예로는 다음과 같다: HD37(IgG1, 카파)(다코 노쓰아메리카 인코포레이티드(DAKO North America, Inc.), 미국 캘리포니아주 카르핀테리아 소재), BU12(문헌 [Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7(1992)]), 4G7(IgG1)(문헌 [Meeker et al., Hybridoma, 3(4):305-20(1984 Winter)]), J4.119(벡크만 코울터(Beckman Coulter), 독일 크레펠트 소재), B43(파밍젠(PharMingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SJ25C1(BD 파밍젠, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), FMC63(IgG2a)(문헌 [Zola et al., Immunol. Cell. Biol. 69(PT6): 411-22(1991)]; 문헌 [Nicholson et al., Mol. Immunol., 34:1157-1165(1997)]; 문헌 [Pietersz et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60(1995)]), 89B(B4)(IgG1)(벡크만 코울터, 미국 플로리다주 마이애미 소재; 문헌 [Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250(1983)]), 및/또는 HD237(IgG2b)(문헌 [Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989]; 및 문헌 [Pezzutto et al., J. Immunol., 138(9):2793-2799(1987)]). 항-CD19 항체 또는 그것의 접합체는 또한 B 세포 장애 및 질환의 각종 동물 모델들에서 치료 가능성을 나타냈다(문헌 [Falvell et al., Br. J. Hematol. 134(2):157-70(2006)]; 문헌 [Vallera et al., Clin. Cancer Res. 11(21):7920-8(2005)]; 문헌 [Yazawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(42): 15178-83(2005)]).
특히, 인간화 CD19 항체의 이용은 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 같은 B-세포 질환의 치료에 대해 기재되었다(Hansen의 미국 특허 출원 공보 제US2005/0070693호 참조).
최근 암 요법에 있어서의 진전에도 불구하고, B 세포 악성 종양, 예컨대 B 세포 서브타입의 비호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병이 암-관련 사망의 주요 기여 인자이다. 따라서, B 세포 악성 종양의 치료를 위한 더욱 개선된 치료 방안이 매우 필요하다.
현재 세포성(T 세포-매개) 및 체액성(항체, B 세포-매개) 면역이 이식편 거부반응에서 상당한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이식편 거부반응에서의 T 세 포-매개 면역의 중요성이 잘 확립되어 있으나, 급성 및 만성 거부반응에서의 체액성 면역의 중요 역할만이 단지 최근에 명백하게 되었다. 결과적으로 이식편 거부반응의 치료 및 예방에 있어서의 대부분의 진전은 T 세포 활성화를 표적으로 하는 치료제로부터 개발되었다. 이식편 거부반응의 치료를 위해 FDA 승인을 받은 첫 번째 치료적 단클론 항체는 T 세포의 CD3 수용체에 대해 지정된, 쥐과 동물의 단클론 항체인 오르토클론(ORTHOCLONE)-OKT3™(뮤로모납-CD3)이었다. OKT3은 단클론 항-CD52 캄파쓰(CAMPATH)™항체인, 캄파쓰-1G, 캄파쓰-1H(알렘투주맙) 및 캄파쓰-1M), 및 다클론 항-흉선세포 항체 제제(항-흉선세포 글로불린. 또는 "티모글로빈" 또는 "티모글로불린"으로도 불리는 "ATG"로도 칭해짐)를 비롯한, 다수의 기타 항-림프구 지정 항체에 의해 결합되었다. 이식편 거부반응의 예방을 위해 승인된 기타 T 세포 항체에는 키메라 단클론 항체 시물렉트(SIMULECT)™(바실릭시맙) 및 인간화 단클론 항체 제나팍스(ZENAPAX)™(다클리주맙)이 포함되고, 이 양자 모두 활성화 T 세포의 고친화도 IL-2 수용체를 표적으로 한다.
이식편 거부반응에 있어서의 체액성 면역의 중요성은 초기에 초급성 거부반응에 국한되는 것으로 사료되었고(여기서, 이식 수령자는 이식 전에 항-도너 HLA 항체를 가짐), 그 결과 항체 억제에 효과적인 치료 처방의 부재시 이식편의 급속 파괴가 초래된다. 최근, 체액성 면역이 또한 급성 및 만성 거부반응 모두를 매개하는 중요 인자이기도 하다는 것이 명백해졌다. 예를 들어, 임상적 관찰은, I류 또는 II류 항-HLA 동종항체("항-MHC 동종항체"로도 칭해짐)를 발생할 수 있는 환자 내 이식편 생존이 그러한 항체를 발달시킬 수 없는 환자내 이식편 생존에 비해 감소되 었음을 입증하였다. 임상 데이터 및 실험 데이터도 또한 다른 도너-특이적 동종항체 및 자가항체가 거부반응의 중요 매개자임을 가리킨다. 동종이식편 거부반응에 있어서의 도너-특이적 항체에 대한 역할을 지지하는 증거에 대한 현재 검토를 위해, 문헌 [Rifle et al., Transplantation, 79:S14-S18(2005)]을 참조한다. 따라서, 급성 및 만성 이식편 거부반응에 있어서의 체액성 면역의 역할이 비교적 최근에 인식됨에 따라, 체액성 면역을 표적화하기 위한 현행 치료제 및 전략법이 세포성 면역을 표적화하기 위한 것들에 비해 보다 덜 개발되어 있다. 따라서, 인간 이식 수령자의 이식편 거부반응, 즉 이식편대숙주 질환(GVHD), 체액성 거부반응 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방을 위한 개선된 시약 및 방법에 대한 필요성이 해당 기술 분야에서 대두되고 있다.
자가면역 질환은 전반적으로 유의적 이환율 및 장애를 유발한다. 1965년 내지 1995년에 수집된 발병 데이터에 기초해 볼 때, 대략 1백2십만명의 사람들이 다음 5년에 걸쳐 새로운 자가면역 질환을 발병할 것으로 평가되었다. Jacobsen 등(문헌 [Clin Immunol. Immunopathol. 84:223(1997)])은 130건의 공개 연구에 대해 평가하였고, 1996년에 8백5십만명(인구의 3.2%)의 미국인들이 이 연구에서 조사된 24종의 자가면역 질환들 중 적어도 하나를 갖는 것으로 평가하였다. 공중 보건에 대한 자가면역 질환의 주요 영향을 고려해볼 때, 이러한 장애의 부담을 해소하기 위한 효과적이고 안전한 치료가 요구된다. 따라서, 자가면역 질환을 치료하기 위한 개선된 시약 및 방법에 대한 필요성이 해당 기술 분야에 대두되고 있다.
3. 개요
본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체, 및 그 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 키메라 및 인간화 양태의 항-CD19 마우스 단클론 항체, HB12A 및 HB12B를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12A(클론 B410F12-2-A6-C2는 2005년 2월 11일자로 "ATCC"(American Type Culture Collection)에 기탁됨(ATCC 특허 기탁 표시명: PTA-6580)), 또는 HB12B(클론 B43H12-3-B2-B6이 2005년 2월 11일자로 "ATCC"에 기탁됨(ATCC 특허 기탁 표시명: PTA-6581))의 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 전체 6개를 포함한다.
카밧(Kabat)에 따라 정의되는 HB12A의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10으로 각기 확인된다. 카밧에 따라 정의되는 HB12A의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16으로 각기 확인된다.
카밧에 따라 정의되는 HB12B의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 22, 서열 번호 24 및 서열 번호 26으로 각기 확인된다. 카밧에 따라 정의되는 HB12B의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32로 각기 확인된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 이하 표 1에 열거된 CDR의 아미노산서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
[표 1]
상응하는 HB12B 모 CDR의 아미노산 서열과 상이한 잔기는 밑줄 그어진 굵은 체로 표시되어 있다. 일치(consensus) CDR 서열(서열 번호 230-235) 내의 소정의 가변 위치에 상응하는 아미노산 잔기는 괄호 안에 열거되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 CDR은 CDR 내의 가변 위치에 상응하는 개별 아미노산 잔기의 임의의 순열(permutation)을 포함할 수 있다.
Figure 112009021231361-pct00001
Figure 112009021231361-pct00002
Figure 112009021231361-pct00003
Figure 112009021231361-pct00004
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12A 또는 HB12B의 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체(예를 들어, VH3-72, JH4, VkA10 또는 Jk4와 같은 인간 배선 항체 서열)로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크(FW: framework) 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 인간 프레임워크 영역은 인간 FW 잔기가 모 마우스(예를 들어, HB12A 또는 HB12B) 중쇄 또는 경쇄 내에 존재하는 상응하는 잔기에 대해 교환되는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR를 포함할 수 있고, HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34)로 표시되는 VH 영역의 하나 이상의 중쇄 프레임워크(FW) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하고, HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34)로 표시되는 VH 영역의 하나 이상의 중쇄 프레임워크(FW) 영역을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR를 포함할 수 있고, HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52)로 표시되는 VK 영역의 하나 이상의 경쇄 프레임워크(FW) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하고, HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52)로 표시되는 VK 영역의 하나 이상의 경쇄 프레임워크(FW) 영역을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR, HB12B-(A10-Jk4)로 표시되는 VK 영역의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 영역, 및 HB12B-(3-72/JH4)로 표시되는 VH 영역의 하나 이상의 중쇄 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR, HB12B-(A10-Jk4)로 표시되는 VK 영역의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 영역, 및 HB12B-(3-72/JH4)로 표시되는 VH 영역의 하나 이상의 중쇄 프레임워크영역을 포함한다.
예를 들어, 한 실시양태에서 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 FW1은 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, FW2는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하며, FW3은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, FW4는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 FW1은 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, FW2는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하며, FW3은 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, FW4는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 인간화 항-CD19 단클론 항체는 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 FW1은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하고; FW2는 서열 번호 56, 서열 번호 64 및 서열 번호 72로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; FW3은 서열 번호 58 및 서열 번호 66으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; FW4는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 단클론 항체는 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 FW1는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하고; FW2는 서열 번호 56, 서열 번호 64 및 서열 번호 72로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; FW3은 서열 번호 58 및 서열 번호 66으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; FW4는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 237의 아미노산을 포함하는 VH 또는 서열 번호 238의 아미노산을 포함하는 VL을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항체는 인간 CD19 항원에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 237의 아미노산을 포함하는 VH 및 서열 번호 238의 아미노산을 포함하는 VL을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12B VK(서열 번호 20), HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52), HB12B-364987(서열 번호 62), HB12B-3649(서열 번호 68), HB12B-36(서열 번호 70), HB12A VK(서열 번호 4), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5 VK(서열 번호 111), 15D1 VK(서열 번호 112), 16C9 VK(서열 번호 113), 3C3 VK(서열 번호 193), 3E5 VK(서열 번호 194), 3D4 VK(서열 번호 195), 3F1 VK(서열 번호 196), 5B5 VK(서열 번호 197), 6F7 VK(서열 번호 198), 1C11 VK(서열 번호 199), 2B11 VK(서열 번호 200), 2D10 VK(서열 번호 201), 5C11 VK(서열 번호 202), 5D4 VK(서열 번호 203), 6C11 VK(서열 번호 204), 9G7 VK(서열 번호 205), 1H4 VK(서열 번호 206) 및 5C4 VK(서열 번호 207)로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 HB12B VH(서열 번호 18), HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34), HB12A VH(서열 번호 2), 7E12 VH(서열 번호 102), 14H5 VH(서열 번호 103), 15D1 VH(서열 번호 104), 15D7 VH(서열 번호 105), 16C4 VH(서열 번호 106), 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108), 14H5-LG(서열 번호 109), 1A7 VH(서열 번호 191), 3C3 VH(서열 번호 191), 6C11 VH(서열 번호 191), 9G7(서열 번호 191), 3B4 VH(서열 번호 236) 및 3F11 VH(서열 번호 192)로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 항체에 관한 것이다.
한 특별한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12B-3649(서열 번호 68) 경쇄 가변 영역 및 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 인간화 항-hCD19 VH HB12B-(3-72/JH4)를 포함하는 DNA 클론은 2006년 10월 26일자로 "ATCC"에 기탁되었다. 인간화 항-hCD19 VK HB12B-3649를 포함하는 DNA 클론은 2006년 10월 26일자로 "ATCC"에 기탁되었다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는 마우스 단클론 항체 HB12A 및/또는 HB12B의 친화도에 필적하는 친화도로, 또는 HB12B VH(서열 번호 18) 및 HB12B VK(서열 번호 20)를 포함하는 chHB12B 항체의 친화도에 필적하는 친화도로 인간 CD19에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체 또는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에, 본원에 정의된 바와 같이, 엄격한 혼성화(hybridization) 조건 또는 보다 낮은 엄격도의 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체 또는 그것의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체 또는 그것의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 포함된 단리된 세포에 관한 것이다.
본원에 기재된 키메라, 인간 및 인간화 항-CD19 단클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 인간 이소타입의 그러한 항체들을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포-매개 세포독성(CDC), 및/또는 아포프토시스를 매개한다.
다른 한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 자극 B 세포 증식을 억제한다.
본 발명은 또한 키메라, 인간 및 인간화 항-CD19 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 기타 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 단클론 항체를 B 세포 악성 종양의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 B 세포 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 단클론 항체를 자가면역 질환 또는 장애의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 자가면역 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 단클론 항체를 체액성 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 이식 환자의 체액성 거부반응을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
3.1. 정의
본원에 사용되는 용어 "항체" 및 "항체"(면역글로불린)는 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 적어도 2개의 비변형(intact) 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화(camelised) 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 디설피드-연결 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 항-Id 항체 내지 본 발명의 항체 포함), 인트라바디(intrabody), 및 상기 항체들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적 활성 단편을 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
네이티브 항체는 통상 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설피드에 의해 중쇄에 연결되고, 한편 디설피드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적 간격의 사슬내 디설피드 가교를 가진다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH)을 가지고, 이에 다수의 불변 도메인이 이어진다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고, 다른 한 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 경쇄는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열 상에 기초한 람다 사슬 또는 카파 사슬로서 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 또한 본원에서 VK로 나타내어질 수 있다. 용어 "가변 영역"은 또한 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 특별한 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 판단된다. 그러한 항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이 및 마우스를 포함하나 이에 국한되지 않는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광위적으로 상이하고, 특별한 항원에 대한 각 특별한 항체의 결합 특이성에 대한 원인이 된다는 사실을 지칭한다. 본래, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통해 균일하게 분포되지 않는다. 그것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서의 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 분절에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 더 보존적인 부분은 프레임워크 영역(FW)으로 불린다. 네이티브 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각기, 대체로 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체배치를 채택하고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 4개의 FW 영역을 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FW 영역에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)] 참조). 불변 도메인은 일반적으로 항원 결합에 직접 관련되지 않으나, 항원 결합 친화도에 영향을 줄 수 있고, 각종 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, CDC 및/또는 아포프토시스에서의 항체의 관여를 나타낼 수 있다
본원에 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원에 대한 결합과 관련된 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)]), 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그러한 잔기(예를 들어, 잔기 26-32(L1), 경쇄 가변 도메인의 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FW" 잔기는 CDR에 인접한(flanking) 그러한 가변 도메인 잔기이다. FW 잔기는 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체, 디아바디(diabody), 백시바디(vaccibody), 선형 항체 및 이중특이적 항체 내에 존재한다.
본원에 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 개체군을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대해 지정된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 통상적 (다클론) 항체와는 대조적으로 각 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지정된다. 그 특이성에 부가하여, 단클론 항체는, 그것이 다른 면역글로불린 생성 세포에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 세포에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 대안적 생성 방법은 당업계에 숙련된 자에게 공지되어 있고, 예를 들어 단클론 항체는 단클론 항체를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 유전자에 의해 안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 세포에 의해 생성될 수 있다.
수식어 "단클론"은 항체의 실질적으로 균질한 개체군으로부터 수득되는 항체의 특성을 가리키고, 이는 임의의 특별한 방법에 의해 항체의 조작(engineering)을 필요로 하는 것으로 간주되어서는 안된다. 용어 "단클론"은 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯한 세포의 클론성 개체군으로부터 유래되는 항체를 지칭하기 위해 본원에 사용되며, 항체를 조작하기 의한 방법은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495(1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)] 및 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터의 단리를 비롯한 임의의 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은 단클론 포유동물, 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체, 디아바디, 백시바디, 선형 항체, 및 이중특이적 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 한 부분이 한 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 일치하거나 이에 상동하고, 사슬(들)의 적어도 하나의 다른 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류, 및 그러한 항체의 단편에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그 서열과 상동적인 항체를 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)]). 본원의 해당 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 예컨대 비비, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열(미국 특허 제5,693,780)을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
비인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분에 있어, 인간화 항체는 네이티브 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 가지는 비인간 종(도너 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 상응하는 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수령자 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 FW 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수령자 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이 변형들은 항체 성능을 더욱 개량하기 위해 행해진다. 일반적으로 인간화 항체 중쇄 또는 경쇄는 적어도 하나 이상의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 CDR의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, FW의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 상세내용에 대해, 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525(1986)]; 문헌 [Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988)]; 및 문헌 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)]을 참조한다.
"인간 항체"는 인간 항체, 또는 항원성 도전에 대한 반응으로 특이적 인간 항체를 생성하도록 "조작된" 유전자도입 유기체로부터 수득된 항체일 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 특정 기법에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌(loci)의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 포함하는 배아 줄기 세포로부터 유리된 유기체의 종에 도입된다. 유전자도입 유기체는 인간 항원에 대해 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 유기체는 인간 항체-분비 하이브리도마를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 인간 항체는 또한 중쇄 및 경쇄가 인간 DNA의 하나 이상의 공급원으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체일 수 있다. 완전 인간 항체는 또한 유전적 또는 염색체성 형질감염 방법, 및 파지 표시 기술 또는 시험관내 활성화 B 세포에 의해 작제될 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는, 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후, 그 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 한 실시양태에서, 그러한 세포는 인간 세포이다. 어떠한 특별한 작용 기작에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, ADCC를 매개하는 이 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 일차적 세포인 NK 세포는 FcγRIII를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 그러한 검정법을 수행할 수 있다. 그러한 검정법을 위한 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 부가적으로 해당 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656(1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서, 생체내 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 활성화를 개시하고 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계(C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합화된 분자(예를 들어, 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163(1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정법을 수행할 수 있다.
"이펙터 세포"는, 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 적절하게는, 세포는 적어도 FcγRI, FCγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함된다.
용어들 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. 한 실시양태에서, FcR은 네이티브 서열 인간 FcR이다. 게다가, 특정 실시양태에서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 수용체이고, 이에는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcγRIV 하위부류의 수용체, 및 이들 수용체의 대립형질 변이체(allelic variant) 및 대안적으로 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA("활성화 수용체")와 FcγRIIB("억제 수용체")가 포함되는데, 이들은 세포질 도메인에서 일차적으로 구별되는 유사한 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프(ITAM)를 가진다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프(ITIM)를 보유한다(문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetech and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]; 문헌 [Capel et al., Immunomethods, 4:25-34(1994)]; 및 문헌 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995)]에서 검토된다. 향후 확인되는 것들을 비롯한, 기타 FcR도 본원에서의 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 그 용어에는 또한 모계 IgG의 태아로의 전달에 대한 원인이 되는 신생아 수용체인 FcRn도 포함된다(문헌 [Guyer et al., Immunol., 117:587(1976)]; 문헌 [Kim et al., J. Immunol., 24:249(1994)]).
"Fv"는 완전 항원-인식과 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 탄탄하게 비-공유 또는 공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 배열에서는, 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로 6개의 CDR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 제공한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 덜한 친화도이기는 하나, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
본원에 기재된 치료(들)에 사용되는 에피토프에 대한 항체의 "친화도"는 당업계에 잘 이해되어지는 용어이고, 에피토프에 대한 항체의 결합 정도 또는 강도를 의미한다. 친화도는 평균 해리 상수(KD 또는 Kd), 겉보기 평균 해리 상수(KD' 또는 Kd'), IC50(경쟁 검정법에서 50% 억제를 달성하기 위해 필요한 양)을 비롯한 당업계에 공지된 각종 방법으로 측정되고/되거나 표시될 수 있다. 본 발명의 목적 상, 친화도는 에피토프에 결합하는 특정한 항체 개체군에 대한 평균 친화도인 것으로 이해된다. ㎖ 당 IgG ㎎ 또는 ㎎/㎖의 단위로 본원에 보고되는 KD' 수치는 혈청(단, 혈장도 사용될 수 있음) ㎖ 당 Ig ㎎을 가리킨다. 항체 친화도가 본원에 기재된 치료 방법의 적용 또는 본원에 기재된 치료 방법의 선택을 위한 기초로서 이용되는 경우에, 항체 친화도는 치료 전에 및/또는 중에 측정될 수 있고, 수득된 값은 인간 환자가 치료에 적합한 후보인지를 평가할 때 임상의에 의해 이용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "화합력(avidity)"은 항체가 항원에 결합하는 전체 결합 강도(즉, 양 항체 암(antibody arms))의 척도이다. 항체 화합력은 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 문헌 [Gray et al., J. Virol. Meth, 44:11-24.(1993)]에 의해 기재된 바와 같은 간접적인 형광 항체의 변형에 의해, 항원 과잉(antigen excess)에서 항원-항체 결합의 해리를 측정함으로써 결정될 수 있다.
"에피토프"는 당업계에 공지된 용어이고, 항체에 특이적인 결합을 나타내는 임의의 화학적 부분(moiety)을 의미한다. 또한, "항원"은 에피토프를 보유하고, 이에 따라 항체에 특이적으로 결합하는 부분 또는 분자이다.
본원에서 사용되는 "B 세포 표면 마커"는 자체에 결합하는 제제로 표적화될 수 있는 B 세포의 표면 상에 발현된 항원이다. B 세포 표면 마커에는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커가 포함된다. 특별한 해당 B 세포 표면 마커는 포유동물의 다른 비-B 세포 조직에 비해 B 세포 상에 우선적으로 발현되고, 전구체 B 세포와 성숙 B-계통 세포 모두에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 바람직한 마커는 CD19이며, 이는 분화의 각종 단계들에서 B-세포에서 발견된다.
본원에 사용되는 용어 "항체 반감기"는 "투여 이후에 항체 분자의 평균 생존 시간의 척도인 항체의 약동학적 성질을 의미한다. 항체 반감기는 예를 들어 혈청 또는 혈장에서 측정되는, 또는 다른 조직에서의 환자의 신체 또는 그것의 특정 구획으로부터 공지된 양의 면역글로불린의 50%를 제거하기 위해 필요한 시간, 즉 순환 반감기로서 표시될 수 있다. 반감기는 면역글로불린 또는 면역글로불린 부류마다 다양할 수 있다. 일반적으로 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대한 순환 중의 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 초래한다.
용어 "이소타입"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 분류를 의미한다. 항체의 불변 도메인은 항원에 대한 결합에 관여하지 않지만, 각종 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 주어진 인간 항체 또는 면역글로불린은 면역글로불린의 5가지 주요한 부류 중의 하나로 지정될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. 이들 부류는 하위부류(이소타입), 예를 들어 IgG1(감마 1), IgG2(감마 2), IgG3(감마 3), IgG4(감마 4), IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 종류의 면역글로불린의 구조 및 3차원 형태가 공지되어 있다. 각종 인간 면역글로불린 부류 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 인간에 있어 ADCC를 매개하는 것으로 알려져 있다. 인간 경쇄 불변 영역은 2가지 주요 부류, 즉 카파 및 람다로 분류될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "면역원성(immunogenicity)"은, 화합물이 면역 반응(특정 항체의 생산 및/또는 특정 T 세포의 증식의 자극)을 촉발할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "항원성(antigenicity)"은 화합물이 항체에 의해 인식되거나, 또는 항체에 결합하고 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
용어들 "치료하다(treat)", "치료하는 것(treating)" 또는 "~의 치료(또는 이와 문법적으로 균등한 용어)"는, 대상의 상태의 중증도(severity)가 감소되거나, 적어도 부분적으로 개선되거나 완화되는 것 및/또는 적어도 하나의 임상적 증상의 상당의 경감, 완화 또는 감소가 달성되고/되거나, 상태의 진행의 억제 또는 지연 및/또는 질환 또는 병의 발병의 예방 또는 지연이 있다는 것을 의미한다. 따라서, 용어들 "치료하다", "치료하는 것" 또는 "~의 치료 (또는 이와 문법적으로 균등한 용어)"는 예방 및 치료 처방을 모두 의미한다.
본원에 사용되는, "충분량" 또는 특정한 결과를 달성하기 위한 "충분량"은 임의적으로 치료 효과인 원하는 효과(즉, 치료적 유효량의 투여에 의한 효과)를 생성시키는 데 유효한, 본 발명의 항체 또는 조성물의 양을 지칭한다. 예를 들어, "충분량" 또는 "~를 위해 충분한 양"은 B 세포를 고갈시키는 데 유효한 양일 수 있다.
본원에 사용되는 "치료 유효"량은 대상에게 상당의 개선 또는 이익을 제공하는 양이다. 다른 방식으로 말하자면, "치료적 유효량"은 적어도 하나의 임상적 증상의 상당한 경감, 완화 및/또는 감소를 제공하는 양이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 장애와 관련된 임상적 증상은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 당업자는 상당의 이익이 대상에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요가 없음을 인지할 것이다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1A-B: (A) HB12B VK(서열 번호 20), HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52), HB12B-364987(서열 번호 62), HB12B-3649(서열 번호 68) 및 HB12B-36(서열 번호 70) 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 배열. 서열 잔기는 카밧에 준해 넘버링된다. 카밧에 따라 정의되는 CDR 잔기는 상자로 표시되어 있다. HB12B VK(서열 번호 20)의 베니어(Vernier), 사슬간 및 정준(Canonical) 잔기는 밝은 회색으로 강조되어 있다. 이식된 항체 HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52) 대비의 HB12B-364987(서열 번호 62)(Y40F, K53H, Y91F), HB12B-3649(서열 번호 68)(Y40F, K53H) 및 HB12B-36(서열 번호 70)(Y40F)의 아미노산 치환은 암회색으로 강조되어 있다. (B) HB12B VH(서열 번호 18), HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 및 HB12B-9m(서열 번호 44) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 배열. 서열 잔기는 카밧에 준해 넘버링되어 있다. 카밧에 따라 정의되는 CDR 잔기는 상자로 표시되어 있다. HB12B VH의 베니어, 사슬간 및 정준 잔기는 밝은 회색으로 강조되어 있다. 이식된 항체 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 가변 도메인 대비의 HB12B-9m(서열 번호 44)(L20I, F27Y, T28A, R38I, V49I, F67A, R71A, L80M, 191Y)의 아미노산 치환이 암회색으로 강조되어 있다.
도 2. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34) 및 HB12B-364987 VK(서열 번호 62)을 포함하는 인간화 항-CD19 항체 #1의 결합 프로파일. 인간화 항-CD19 항체 #1에 대한 OD450 리딩이 개방 사각형으로 표시되어 있다. HB12B VH(서열 번호 18) 및 HB12B VK(서열 번호 20)을 포함하는 키메라 HB12B 항체를 기준 표준(폐쇄 원형)으로 사용하였다. 무관 특이성의 인간 IgG1 항체를 음성 대조군(개방 원형)으로 검정법에 포함시켰다. 인간화 항-CD19 항체 #1의 결합 프로파일이 키메라 항-CD19 항체의 결합 프로파일에 밀접히 정합된다(matched).
도 3. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 인간화 항-CD19 항체 #1, #2 및 #3의 결합 프로파일. 인간화 항-CD19 항체 #1는 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34) 및 HB12B-364987 VK(서열 번호 62)를 포함한다. 인간화 항-CD19 항체 #2는 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34) 및 HB12B-3649 VK(서열 번호 68)를 포함한다. 인간화 항-CD19 항체 #3은 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34) 및 HB12B-36 VK(서열 번호 70)을 포함한다. 인간화 항-CD19 항체 #1, #2 및 #3의 결합 프로파일은 개방 사각형, 개방 원형 및 폐쇄 원형으로 각기 표시되어 있다. HB12B VH(서열 번호 18) 및 HB12B VK(서열 번호 20)를 포함하는 키메라 HB12B 항체를 기준 표준(폐쇄 사각형)으로 표시되어 있다. 인간화 항-CD19 항체 #1 및 #2의 결합 프로파일은 키메라 항-CD19 항체의 결합 프로파일에 밀접히 정합된다. 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 인간화 항-CD19 항체 #3의 결합은 키메라 HB12B 항체의 결합보다 유의적으로 더 약하다.
도 4. 정제된 항-hCD19 항체의 쿠마씨로 염색된 SDS/PAGE. 1 및 5 마이크로그램의 푸코실화(3649) 및 비푸코실화(3649-aFuc) 정제된 인간화 항-CD19 항체 #2를 SDS/PAGE에 의해 분석하였다. 정제된 제제는 오염 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다.
도 5. (A) 상이한 농도의 인간화 항-CD19 항체 #2와 함께 항온 배양된, 면역염색된 다우디(Daudi) 세포의 평균 형광 강도. 다우디 세포를 상이한 농도의 푸코실화(3649) 또는 비푸코실화(3649 aFuc-1 및 3649 aFuc-2) 항-CD19 항체 #2와 함께 항온 배양하였다. 후속하여, 세포를 RPE 접합 염소 항-인간 IgG F(ab)'2로 염색하고, 표준 프로토콜에 따라 유세포분석기로 분석하였다. 항-CD20 항체와 함께 항온 배양한 다우디 세포를 양성 대조군으로 포함시켰다. 인간화 항-CD19 항체 #2의 푸코실화 및 비푸코실화 제제는 중첩 염색 프로파일을 표시한다. 항-CD19 염색 세포의 평균 형광 강도는 시험한 모든 항체 농도들에서 항-CD20 염색 세포의 평균 형광 강도보다 낮다. (B) 인간화 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. 인간화 항-CD19 항체 #2의 푸코실화(3649) 및 비푸코실화(3649-aFuc1 및 3649-aFuc2) 제제의 시험관내 ADCC 활성을 제조자의 사용설명서에 따라 사이톡스(CytoTox) 96™ 키트(프로메가(Promega))를 이용하여 검정하였다. 다우디 세포를 표적으로 사용하였다. 검정법을 또한 양성 대조군 항-CD20 항체를 이용하여 수행하였다. 인간화 항-CD19 항체 #2 및 양성 대조군 항-CD20 항체의 양 비푸코실화 제제 모두가 유사한, 강한 ADCC 활성을 나타냈다. 푸코실화 항-CD19 항체 #2의 ADCC 활성이 사용 조건 하에서 보다 낮다.
도 6. 인간화 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. 푸코실화(3649) 및 비푸코실화(3649-aFuc) 인간화 항-CD19 항체 #2의 시험관내 ADCC 활성을 제조자의 사용설명서에 따라 사이톡스 96™ 키트(프로메가)를 사용하여 검정하였다. 다우디 세포가 표적으로 작용하였다. 항-CD20 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. 표시된 ADCC를 갖는 항-CD19 항체 #2의 Fc 변이체(3649-TM)를 음성 대조군으로 사용하였다. 비푸코실화 인간화 항-CD19 항체 #2(3649-aFuc) 및 양성 대조군 항-CD20 항체는 유사한, 강한 ADCC 활성을 나타냈다. 푸코실화 인간화 항-CD19 항체 #2(3649)의 ADCC 활성이 사용 조건 하에서 보다 낮다. 음성 대조군 Fc 변이 항-CD19 항체 #2는 사용 조건 하에서 ADCC 활성을 나타내지 않았다.
도 7. 라지(Raji), 라모스(Ramos), 다우디 및 나말와(Namalwa) 세포의 CD19, CD20 및 CD22 발현 프로파일. 라지, 라모스, 다우디 및 나말와 세포를 항-CD19, 항-CD20 또는 항-CD22 일차 및 PE 접합 염소 항-마우스 IgG 이차 항체로 면역염색한 후, 유세포분석기에서 분석하였다. 막대 그래프는, 면역염색되고 이차 항체로만 염색된 대조군 샘플로 수득된 평균 채널 형광의 비를 나타낸다. CD19, CD20 또는 CD22를 발현하지 않는 RPMI 8226 다발성 골수종 세포주를 음성 대조군으로 포함시켰다. 3개 모든 분자의 유의적 표면 발현이 라지, 라모스 및 다우디 세포에서 검출된다. 나말와 세포는 CD19 및 CD22는 나타내나, 세포 표면 상에 CD20을 나타내지 않는다.
도 8. 항-CD19 #2 매개 ADCC에 대한 라지(A), 다우디(B), 라모스(C) 및 나말와(D) 세포 감수성. 제조자의 사용설명서에 따라 사이톡스 96™ 키트(프로메가)를 사용하여 ADCC 검정법을 수행하였다. 사용 항체는 하기와 같다: (i) 비푸코실화 항-CD19 #2(3649-aFuc), (ii) 항-CD19 #2의 3M Fc 변이체(3649-3M) 및 (iii) 항-CD20 대조군. 이펙터 대 표적 비는 2.5 대 1이었다. 4개 세포주 모두는 항-CD19 #2 매개 ADCC에 대해 감수성을 가진다. 단지 라지, 다우디 및 라모스 세포만이 항-CD20 매개 ADCC에 대해 감수성을 가진다.
도 9. 항-CD19 #2 매개 ADCC에 대한 신선 편도 B 세포 감수성. 제조자의 사용설명서에 따라 ADCC 검정법을 사이톡스 96™ 키트(프로메가)를 사용하여 검정하였다. 사용 항체는 하기와 같다: (i) 비푸코실화 항-CD19 #2(3649-aFuc), (ii) 항-CD19 #2의 3M Fc 변이체(3649-3M) 및 (iii) 항-CD20 대조군. 이펙터 대 표적 비는 2 대 1이었다. 편도 B 세포는 3개 항체 모두에 의해 매개되는 ADCC에 대해 감수성을 가진다.
도 10. 순환 림프구를 C57B16 hCD19 tg+/-, C57B16 hCD19 tg+/+, Balb/c hCD20 tg+/- 및 Balb/c 마우스로부터 단리하였다. 단리된 세포를 PerCP 접합 항-마우스 CD19(α-mCD19), PE 접합 항-CD3, Alexa488 접합 항-인간 CD19(α-hCD19) 및 Alexa647 접합 항-인간 CD20 항체(α-hCD20)로 염색한다. n은 각 군으로부터 분석된 동물의 수이다. (A) hCD19, hCD20 및 mCD19 특이적 채널에서 측정된 CD3-세포의 평균 형광 강도가 막대 그래프 형식으로 제시된다. (B) 각종 유전적 배경 내 CD3-mCD19+ 림프구의 백분율.
도 11. 항-CD19 항체 #2에 의한 생체내 B 세포 고갈. (A) C57B16 hCD19 tg+/+ 및 (B) C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 250 또는 50 ㎍의 항-CD19 항체 #2(3649)의 단일 i.v. 용량으로 처리하였다. 사용한 음성 대조군 항체는 (i) #2의 ADCC 절충 Fc 변이체(3649 TM) 및 (ii) 무관 특이성의 항체(R347)이다. 순환 림프구를 처리 후 7일에 단리하였다. 세포를 PerCP 접합 항-마우스 CD19(α-mCD19) 및 PE 접합 항-CD3 항체로 염색하였다. mCD19+ CD3-B 세포의 백분율이 표시된다. n은 각 군으로부터 분석된 동물의 수이다. 항-CD19 항체 #2의 단일 용량으로의 처리는 B 세포의 근완전 고갈을 초래하였다.
도 12. 항-CD19 항체 #2에 의한 생체내 B 세포 고갈. C57B16 hCD19 tg+/+ 및 C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 250 또는 50 ㎍의 단일 i.v. 용량의 항-CD19 항체 #2(3649)로 처리하였다. 사용한 음성 대조군 항체는 (i) #2의 ADCC 절충 Fc 변이체(3649 TM) 및 (ii) 무관 특이성의 항체(R347). 비장 세포를 처리 후 7일에 단리하였다. 세포를 PerCP 접합 항-마우스 CD19(α-mCD19) 및 PE 접합 항-CD3 항체로 염색하였다. 비장 림프구 중 B 세포(mCD19+ CD3-)의 백분율이 표시되고, n은 각 군으로부터 분석된 동물의 수이다. 단일 용량의 항-CD19 항체 #2를 이용한 처리는 B 세포의 근완전 고갈을 초래하였다.
도 13. 항-CD19 항체 #2는 생체내 모델 시스템 내 종양 성장을 유의적으로 감소시킨다. CB17 SCID 마우스의 뒷옆구리에 제1일에 5×106개 라지 세포를 s.c. 주사하였다. 동물을 제4일부터 시작하여 격주 5회 용량의 10 mg/kg 항체로 처리하였다. 사용한 항체는 하기와 같다: (i) 항-CD19 #2(3649), (ii) 감소된 ADCC 활성을 갖는 항-CD19 #2의 Fc 변이체(3649-TM), (iii) 항-CD20, 및 (iv) 무관 특이성의 이소타입 대조군(R347). 대조군 동물의 군에 단지 PBS만을 주입하였다. 종양 크기를 표준 절차를 이용하여 주 2회 측정하였다.
도 14. 항-CD19 항체 #2는 생체내 모델 시스템 내 종양 성장을 유의적으로 감소시킨다. CB17 SCID 마우스의 뒷옆구리에 제1일에 5×106개 라지 세포를 s.c. 주사하였다. 동물을 제4일부터 시작하여 격주 5회 용량의 10 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 항체로 처리하였다. 사용한 항체는 하기와 같다: (i) 10 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 항-CD19 #2(3649 10 mg/kg 및 3649* 2.5 mg/kg), (ii) 10 mg/kg의 감소된 ADCC 활성을 갖는 항-CD19 #2의 Fc 변이체(3649-TM), (iii) 10 mg/kg의 증진된 인간 ADCC 활성을 갖는 CD19 #2의 Fc 변이체(3649-3M), (iv) 10 mg/kg의 항-CD20, 및 (v) 10 mg/kg의 무관 특이성의 이소타입 대조군(R347). 대조군 동물의 군에 단지 PBS만을 주입하였다. 종양 크기를 표준 절차를 이용하여 주 2회 측정하였다.
도 15. ELISA에 의해 결정되는, FcγRIIIA의 158V 대립형질에 대한 3649, 3649-3M 및 3649-aFuc 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 항-CD20 항체를 기준 대조군으로 검정법에 포함시켰다. FcγRIIIA에 대한 3649-3M Fc 변이 항체 및 3649-aFuc 비푸코실화 항체의 결합 친화도는 푸코실화 3649 항체의 결합 친화도보다 훨씬 더 높다. 3649 및 항-CD20 항체는 동일한 결합 프로파일을 가진다.
도 16. 이펙터 세포의 FcγRIIIA 유전자형은 항-CD19#2 항체의 시험관내 ADCC 활성에 영향을 준다. 제조자의 사용설명서에 따라 ADCC 검정법을 사이톡스 96™ 키트(프로메가)를 사용하여 검정하였다. 사용한 항체는 하기와 같다: (i) 비푸코실화 항-CD19 #2(3649-aFuc), (ii) 항-CD19 #2의 3M Fc 변이체(3649-3M), 및 (iii) 항-CD20 대조군. 다우디 세포가 표적으로 작용하였다. NK 세포주(A) 또는 새로 단리된 NK 세포(B-E) 중 하나를 이펙터 세포로 사용하였다. V158/V158(C), V158/F158(D), 및 F158/F158(E) FcγRIIIA 유전자형을 갖는 NK 세포를 시험하였다. 높은 친화도 이소형의 FcγRIIIA 수용체(V 158/V 158 및 V158/F 158 유전자형)의 적어도 하나의 복사체를 포함하는 NK 세포는 낮은 친화도 대립형질(F158/F158 유전자형)에 대해 동형인 NK 세포보다 보다 효율적인 이펙터 세포이다. V158/V158 또는 V158/F158 NK 세포(C, D)에 의해 매개되는 푸코실화 항체(3649)의 관찰된 ADCC 활성은 F158/F158 NK 세포(E)에 의해 매개되는 비푸코실화 항체(3649-aFuc)의 ADCC 활성에 필적한다.
도 17. 세포 표면 항원 발현 표현형에 기초한 (A) 순환, (B) 비장, (C) 골수, 및 (D) 복강 B 세포 부분집합의 동정 방식. 형광 염색된, 단리된 세포 개체군을 유세포분석기에서 분석하였다. B 세포 부분집합을 확인하여, 게이트의 순차 사용을 통해 측정하였다. 공정 흐름은 굵은 체의 회색 화살표로 나타나 있다. 예를 들어, 비장의 여포성 B 세포를 하기와 같이 확인하였다: (i) 생세포를 저 7AAD 염색에 기초하여 게이팅하고, (ii) 생세포 분획으로부터의 림프구를 그것의 특징적 FSC 및 SSC 표현형에 기초하여 확인하며, (iii) 생 림프구 중의 B 세포를 항-mCD19 및 항-B220 염색을 이용하여 확인하고, (iv) B1a 세포를 B220 발현의 차이에 기초하여 B 세포로부터 분리하며, (v) 성숙 및 이행 B 세포 개체군을 CD93의 차별적 발현에 기초하여 서로 간에 구별하고, (vi) 성숙 B 세포의 여포성 B 세포 부분개체군을 CD23 발현의 차이에 기초하여 변연부 B 세포 분획으로부터 분리한다.
도 18. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체 Fab 단편의 결합 프로파일. VH CDR3에서 단일 아미노산 치환을 포함하는 Fab의 대표적 샘플로 수득된 결과가 도시되어 있다. 3649 항-CD19 Fab(3649 peri)를 기준 표준물로 사용하였다. 4G6 및 4B7 Fab의 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도는 대조군 3649 Fab의 친화도보다 유의적으로 높다. 시험한 다른 모든 Fab는 대조군 3649 Fab의 친화도와 유사한 친화도를 가진다.
도 19. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체 Fab 단편의 결합 프로파일. 여기서 특징화된 Fab를 이전 CDR 특이적 스크린에서 동정된 유익한 단일 아미노산 치환의 모든 가능한 조합을 포함하는 라이브러리로부터 동정하였다. 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 최대 친화도를 갖는 6개 Fab의 결합 프로파일이 도시되어 있다. 3649 항-CD19 Fab(3649 peri)를 기준 표준물로 사용하였다. 6개의 모든 친화도 성숙 Fab의 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도는 대조군 3649 Fab의 친화도보다 높다.
도 20. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 16C9 IgG의 결합 프로파일은 3649 대조군 항체의 결합 프로파일과 유사하다. 14H5, 15D1, 15D7, 16C4 및 7E12 친화도 성숙 항체의 결합 친화도는 대조군 3649 항체의 결합 친화도보다 높다.
도 21. 세포 기초 ELISA 검정법에서 CD19 발현 라지 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 6개의 모든 항체(14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 및 7E12)의 결합 친화도는 대조군 3649 항체의 결합 친화도보다 높다.
도 22. 세포 기초 ELISA 검정법에서 CD19 발현 다우디 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 6개의 모든 항체(14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 및 7E12)의 결합 친화도는 대조군 3649 항체의 결합 친화도보다 높다.
도 23. 세포 기초 ELISA 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 14H5-YG, 14H5-DG, 및 14H5-LG는 14H5 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 단일 아미노산 치환 변이체이다. 14H4 및 16C4 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 14H5-YG, 14H5-DG, 및 14H5-LG 항체의 결합 친화도는 14H5 및 16C4 대조군 항체의 결합 친화도보다 높다.
도 24. 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 역학 오프레이트 비교. (A) 라모스 세포를 친화도 성숙 항-CD19 항체와 함께 항온 배양하고 세정하며, 37℃에서 0, 30, 또는 60분 동안 추가 항온 배양하였다. 세포를 항온 배양 기간 종료 시에 형광 이차 항체로 염색하고, 유세포분석기에서 분석하였다. 0, 30, 및 60분 항온 배양 후의 세포의 평균 형광 강도가 도시되어 있다. 제0 시간에 관찰된 평균 형광 강도(MFI)를 각 연구 항체에 대해 100%로 설정한다. 3649 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 세포 표면으로부터의 6개의 모든 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체(14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 및 7E12)의 제거율은 기준 표준의 제거율보다 낮다. (B) 라모스 세포를 Alexa 647 접합 HB12B, 3649, 또는 16C4 항-CD19 항체로 염색하고, 세정하며, 37℃에서 0, 30, 또는 60분 동안 추가 항온 배양하였다. 세포를 항온 배양 기간 종료 시에 유세포분석기에서 분석하였다. 직접 접합된 항-CD20 항체를 기준 대조군으로 실험에서 포함시켰다. 각종 항온 배양 기간 후에 검출된 평균 형광 강도(MFI)는 제0 시간에 보여지는 MFI의 비로 표시된다. 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체로 염색한 후의 MFI의 손실은 3649 및 HB12B 항-CD19 항체로 염색한 후의 MFI의 손실보다 훨씬 더 낮다.
도 25. 다우디 세포에 대한 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 다우디 세포를 14H5, 15D1, 15D7, 16C4, 16C9 또는 7E12 친화도 성숙 항-CD19 항체 및 형광 표지 이차 항체로 염색하였다. 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 염색된 세포를 유세포분석기에서 분석하였다. 각종 항체 농도에서 관찰된 중위 형광 강도(중위 FI)가 차트에 제시되어 있다. 친화도 성숙 3649 항-CD-19 항체에 대한 중위 FI는 기준 표준의 중위 FI보다 높았다.
도 26. 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. (A) 14H5, 14H5-DG 및 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 다우디 표적 세포를 이용하여 검정하였다. 3649 항-CD-19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체의 ADCC 활성은 낮은 항체 농도(0.01 및 0.1 ㎍/㎖ 항체)에서 기준 표준의 ADCC 활성보다 높다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체의 ADCC 활성은 높은 항체 농도(1 및 10 ㎍/㎖ 항체)에서 기준 표준의 ADCC 활성과 병렬하다. (B) 비푸코실화 16C4 항체(16C4-aFuc)의 ADCC 활성을 다우디 표적 세포를 이용하여 시험관내 검정법에서 결정하였다. 16C4-aFuc의 ADCC 활성은 기준 대조군 3649-aFuc, 항-CD20 및 푸코실화 16C4 기준 항체의 ADCC 활성보다 유의적으로 더 높다.
도 27. 친화도 성숙 항-CD19 항체의 쿠마씨로 염색된 IEF-PAGE. 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG, 및 3649 항체의 등전점은 각기 7.83, 8.04, 7.69, 7.76, 7.61, 7.72, 7.48, 및 7.75이다.
도 28. 비푸코실화 3649 항-CD19 항체에 의한 생체내 B 세포 고갈. C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 10, 50, 또는 250 ㎍의 단일 i.v. 용량의 푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649) 또는 비푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649-aFuc)로 처리하였다. 음성 대조군 동물을 (i) 3649 항-CD19 항체의 ADCC 절충 Fc 변이체(3649 TM), 또는 (ii) 무관 특이성의 항체(R347)로 처리하였다. 순환 림프구(A) 또는 비장 림프구(B)를 항체 처리 후 7일에 단리하였다. 단리된 세포를 표 5에 기재된 바와 같이 면역염색하여, 각종 B 세포 개체군을 확인하였다. B220+ CD19+ B 세포의 백분율이 표시되어 있다. 비푸코실화 3649 항-CD19 항체는 동일한 양의 푸코실화 항-CD19 항체보다 B 세포의 유의적으로 더 높은 고갈을 달성한다. 3649TM 대조군 항체 처리 동물에서는 고갈 B 세포 고갈이 검출되지 않는다.
도 29. 비푸코실화 3649 항-CD19 항체 처리 마우스에서의 증진된 NK 세포 활성화. C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 10 ㎍의 단일 i.v. 용량의 푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649) 또는 비푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649-aFuc)로 처리하였다. 음성 대조군 동물을 동일한 양의 무관 특이성의 이소타입 정합 항체(R347)로 처리하였다. 순환 림프구를 항체 처리 후 7일에 단리하였다. 단리된 세포를 형광 표지 항-NK1.1, 항-DX5, 및 항-CD107a 항체로 염색하였다. NK1.1+, DX5+ 게이팅된 생 림프구의 CD107a 대 NKl.1 플롯이 표시되어 있다. 비푸코실화 3649 항-CD19 항체 처리 동물로부터 단리된 NK 세포의 보다 높은 백분율은 푸코실화 3649 항-CD19 항체 처리 동물로부터 단리된 NK 세포보다 세포 표면 상에서 CD107a를 표시한다.
도 30. 비푸코실화 항-CD19 항체 #2(3649-aFuc)는 생체내 모델 시스템에서 종양 성장을 유의적으로 감소시킨다. CB17 SCID 마우스의 뒷옆구리에 제1일에 5×106개 라지 세포를 s.c. 주사하였다. 동물을 제4일부터 시작하여 격주 5회 용량의 10 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 항체로 처리하였다. 사용한 항체는 하기와 같다: (i) 10 mg/kg의 푸코실화 항-CD19 #2(3649), (ii) 10 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 비푸코실화 항-CD19 #2(3649-aFuc), (iii) 10 mg/kg의 항-CD20, 및 (iv) 10 mg/kg의 무관 특이성의 이소타입 대조군 항체(R347). 대조군 동물의 군에 단지 PBS만을 주입하였다. 종양 크기를 표준 절차를 이용하여 주 2회 측정하였다.
도 31. 16C4 및 14H5 친화도 성숙 항-CD19 항체를 이용한 생체내 B 세포 고갈. C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 10, 50, 또는 250 ㎍의 단일 i.v. 용량의 푸코실화 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체(16C4) 또는 14H5DG 친화도 성숙 항-CD19 항체(14H5DG)로 처리하였다. 기준 대조군 동물을 (i) 3649 항-CD19 항체(3649), (ii) 3649 항-CD19 항체의 ADCC 증진된 Fc 변이체(3649 3M), 및 (iii) 비푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649-aFuc)로 처리하였다. 음성 대조군 동물을 (i) 3649 항-CD19 항체의 ADCC 절충 Fc 변이체(3649 TM) 또는 (ii) 무관 특이성의 항체(R347)로 처리하였다. 순환 림프구(A) 또는 비장 림프구(B)를 항체 처리 후 7일에 단리하였다. 단리된 세포를 표 5에 기재된 바와 같이 면역염색하여, 각종 B 세포 개체군을 확인하였다. B220+ CD19+ B 세포의 백분율이 표시되어 있다. 비푸코실화 3649 항-CD19 항체는 동일한 양의 푸코실화 항-CD19 항체보다 B 세포의 약간 더 높은 고갈을 달성하였다. 3649-aFuc 및 3649 3M 항체는 16C4 친화도 성숙 항체보다 더 양호한 고갈을 달성하였다. 14H5DG 친화도 성숙 항-CD19 항체는 3649 항-CD19 모 항체보다 B 세포 고갈에 덜 효율적이다. 패널 (A) 내의 값은 주어진 항체에 의해 달성되는 고갈율 %의 값이다.
도 32. 세포 기초 결합 검정법에서 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 64D4 친화도 성숙 Fab의 결합 활성(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 64D4는 VH CDR2에서 단일 아미노산 치환을 포함하는 16C4 항-CD19 항체의 변이체이다. 16C4 및 3649 항-CD19 Fab(각기 16C4 sup 및 3649 sup)를 기준 표준물로 사용하였다. 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 64D4 Fab의 친화도는 대조군 16C4 및 3649 Fab의 친화도보다 유의적으로 더 높다.
도 33. 조합 파지 표시 라이브러리로부터 단리된 친화도 성숙 변이 항-CD19 Fab의 특징화. 세포 표면에 표시된 인간 CD19 항원에 대한 16C4 Fab의 친화도 성숙 변이체의 결합 프로파일을 (A) 300B4 및 (B) 라지 세포를 이용한 세포 기초 결합 검정법으로 측정하였다(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 16C4 및 3649 항-CD19 Fab(각기 16C4sup 및 3649sup)를 기준 표준물로 사용하였다. 300B4 및 라지 세포에 대한 6C11, 2B11, 3B4, 5C11, 3C3, 9G7, 1H4, 및 5C4 친화도 성숙 Fab의 결합 친화도는 대조군 3649 및 16C4 Fab의 결합 친화도보다 높다. (C) 친화도 성숙 Fab 클론의 아미노산 서열을 표준 실험실 방법을 이용하여 결정하였다. 특유의 Fab 클론의 CDR 서열이 제시되어 있다. 모 16C4 서열의 아미노산 잔기와 상이한 아미노산 잔기를 단일 문자 아미노산 코드를 이용하여 프린팅하고; 모 서열과 동일한 자기는 "-"로 표시한다.
도 34. 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 2B11, 3C3, 5C4, 6C11, 6F7, 및 9G7 친화도 성숙 IgG 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 결합 활성을 세포 기초 검정법을 이용하여 측정하였다(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 16C4 및 3649 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 300B4 세포에 대한 시험 친화도 성숙 항-CD19 항체의 결합 친화도는 기준 16C4 및 3649 항체보다 높다.
도 35. (A) 라지 세포 및 (B) 다우디 세포에 대한 친화도 성숙 16C4 항-CD19 항체의 결합 프로파일. 세포를 3C3, 6C11, 또는 9G7 친화도 성숙 항-CD19 항체 및 형광 표지 이차 항체로 염색하였다. 16C4 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 염색된 세포를 유세포분석기에서 분석하였다. 각종 항체 농도에서 관찰된 중위 형광 강도(중위 FI)가 제시되어 있다. 친화도 성숙 16C4 변이 항-CD19 항체에 대한 중위 FI는 0.0625 내지 0.125 ㎍/㎖ 일차 항체 농도에서 기준 표준의 중위 FI보다 높다. 친화도 성숙 항체를 이용하여 수득된 중위 FI는 0.25 내지 10 ㎍/㎖ 범위의 기준 항체에 대한 중위 FI와 실질적으로 동일하였다.
도 36. 친화도 성숙 16C4 변이 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. 3C3, 6C11, 또는 9G7 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 라지 표적 세포를 이용하여 검정하였다. 16C4 항-CD19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체의 ADCC 활성은 모든 시험 농도(0.01 내지 10 ㎍/㎖)에서의 기준표준물질의 ADCC 활성과 실질적으로 동일하다.
도 37. 친화도 성숙 16C4 변이 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. 3C3, 6C11, 또는 9G7 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 다우디 표적 세포를 사용하여 검정하였다. 16C4 항-CD-19 항체를 기준 표준물로 사용하였다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체의 ADCC 활성은 시험한 모든 농도(0.01-10 ㎍/㎖)에서 기준 표준의 ADCC 활성과 실질적으로 동일하다.
도 38. 단일 용량의 i.v. 투여 비푸코실화 16C4 항-CD19 항체를 이용한 B 세포 고갈 후의 혈청 면역글로불린 수준 및 B 세포의 장기 회수 (A) 실험 프로토콜. 4마리 또는 5마리 huCD19 tg+/- 마우스의 군에 250, 50, 또는 10 ㎍의 단일 i.v. 용량의 비푸코실화 16C4 항-CD19 항체(16C4 aFuc)를 투여하였다. 대조군을 PBS 또는 250 ㎍의 무관 특이성의 대조군 항체(R347)로 처리하였다. 동물을 격주 1회 채혈하였고; 제1 채혈은 고갈 항체를 투여하기 7일 전에 행하였다. 처음 11주로부터 얻은 결과가 패널에 요약되어 있다. (B) 모든 군에서의 동물 체중은 정상으로 남았다. 혈액 B 세포 수준을 혈액 마이크로리터 당, (C) 림프구 분율 또는 (D) B 세포 수로 표시한다. 3개의 모든 16C4 aFuc 항체 용량은 완전 B 세포 고갈을 달성하였다. B 세포 회수는 10 및 50 ㎍의 16C4 aFuc 항체를 각기 주입한 동물에서 제5주 및 제9주에 완전하였다. B 세포 회수는 250 ㎍ 16C4 aFuc 항체를 투여 후 11주에 여전히 불완전하였다. 50 또는 250 ㎍의 16C4 aFuc 투여 후에 혈청 (E) IgM, (F) IgG1, 및 (G) IgG2b는 변화하지 않았다. 혈청 면역글로불린 수준은 10 ㎍의 16C4 aFuc 항체 또는 대조군 항체 R347 또는 PBS의 투여 후에 증가하였다. 데이터는, 16C4 aFuc가 지속되는 면역글로불린 생산은 억제하였으나, 혈청 내 기존 면역글로불린에 대한 영향은 최소였음을 가리킨다.
도 39. 항-CD19 항체는 세포내 신호전달을 유도하였다. (A-B) 3649, 3649-TM, 3649-3M, 3649-aFuc 또는 16C4 항체 처리는 라지 세포 내 CD19의 티로신 인산화 수준을 유의적으로 증가시킨다. (C-D) 항-CD19 항체 처리는 항-IgM 처리 유도 ERK 1/2 인산화를 억제하지 않는다.
도 40. 항-CD19 항체 처리는 항-IgM/CD40 매개 B 세포 증식을 억제한다.
도 41. 항-CD19 항체 처리는 정제된 말초 B 세포의 항-IgM/CpG 유도 증식을 억제한다. (A) 항-IgM(1 ㎍/㎖) 및 CpG(2 ㎍/㎖)의 존재 하에 4일간 항온 배양한 후의 CFSE로 염색된, 정제된 말초혈 B 세포의 형광 강도 프로파일. 비자극 제1 대조군 세포 개체군 및 단독의 CpG 자극 제2 대조군 세포 개체군의 CFSE 프로파일을 기준 표준물로 포함시킨다. (B) 16C4 항-CD19 또는 R347 대조군 항체의 존재 하에 항-IgM/CpG로 4일간 자극한 후의 B 세포의 CFSE 프로파일. 항-IgM/CpG 유도 B 세포 증식은 16C4 항체의 존재 하에 유의적으로 감소된다.
도 42. 3649-3M Fc 변이 항-CD19 항체는 3649-TM Fc 변이 항체보다 더 효과적인 항-IgM/CpG 유도 B 세포 증식의 억제제이다. (A) R347 대조군, (B) 3649-TM 항-CD19, 또는 (C) 3649-3M 항-CD19 항체의 존재 하에 항-IgM/CpG로 4일간 자극한 후의 B 세포의 CFSE 프로파일.
도 43. CD19 및 Fc감마RIIB 수용체를 통한 3649-3M 항체 유도 신호전달은 항-IgM/CpG 매개 B 세포 증식을 상승효과적으로 억제한다.
도 44. 표면 결합된 항-CD19 항체는 라지 세포에 의해 효율적으로 내재화된다. 표면 결합 16C4의 35% 및 표면 결합 HB12B 및 3649 항-CD19 항체의 55%가 37℃에서 60분간 항온 배양한 후에 내재화된다.
도 45. CD19의 표면 발현은 24시간 동안 항-CD19 항체 처리한 후에 유의적으로 감소된다. CD19의 세포 표면 발현은 3649, 3649-TM, 3649-3M, 3649-aFuc, 또는 16C4 항-CD19 항체의 존재 하에 24시간 동안 항온 배양한 후에 (A) 라지 세포 및 (B) 정제된 말초 B 세포에서 55 내지 90% 감소된다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 CD19 항원에 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체, 및 그 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체는 항원-의존성-세포-매개-세포독성(ADCC)을 매개할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 IgG1 및/또는 IgG3 인간 이소타입의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 조성물, 및 인간 ADCC, CDC, 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있는, IgG2 및/또는 IgG4 인간 이소타입의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 자극 B 세포 증식을 억제할 수 있다.
본 발명은 키메라 및 인간화 양태의 항-CD19 마우스 단클론 항체 HB12A 및 HB12B를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는 HB12A 또는 HB12B의 결합 친화도에, 또는 키메라 HB12B 항체의 결합 친화도에 필적하는 친화도로 인간 CD19에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 단클론 항체는 VH 및 VK를 포함할 수 있으며, 여기서 VH는 V3-72의 인간 배선 VH 분절의 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2 및 FW3(문헌 [Tomlinson, I. M. et al.(1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798]에서 DP29로 기재됨) 및 인간 배선 JH4 분절의 FW4(문헌 [Mattila, P. S. et al.(1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582]); 및 HB12B 항체의 3개의 VH CDR 서열, CDR1(서열 번호 22), CDR2(서열 번호 24) 및 CDR3(서열 번호 26)을 포함하고; VK는 인간 배선 V 카파 분절 A10의 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3(문헌 [Straubinger, B. I et al.(1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607]) 및 인간 배선 면역글로불린 카파 J4 분절의 FW4(문헌 [Hieter, P. A. et al.(1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522]); 및 HB12B 항체의 3개의 VK CDR 서열, CDR1(서열 번호 28), CDR2(서열 번호 30) 및 CDR3(서열 번호 32)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 및 VK를 포함할 수 있으며, 여기서 VH는 V3-72의 인간 배선 VH 분절의 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2 및 FW3(문헌 [Tomlinson, I. M. et al.(1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798]에서 DP29로 기재됨) 및 인간 배선 JH4 분절의 FW4(문헌 [Mattila, P. S. et al.(1995) Eur. J. Immunol., 25, 2578-2582]); 및 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하고; VK는 인간 배선 V 카파 분절 A10의 4개의 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3(문헌 [Straubinger, B. I et al.(1988) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 601-607]) 및 인간 배선 면역글로불린 카파 J4 분절의 FW4(문헌 [Hieter, P. A. et al.(1982) J. Biol. Chem., 257, 1516-1522]); 및 상기 표 1에 열거된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 이 항체는 Y40F, K53H 및 Y91F로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 VK 프레임워크 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, VK 프레임워크 영역은 각각의 점 돌연변이 Y40F, K53H 및 Y91F를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VK 프레임워크 영역은 단지 Y40F 및 K53H 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VK 프레임워크는 단지 Y40F 점 돌연변이만을 포함할 수 있다.
5.1.1. 항-CD19 항체의 CDR 영역
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 24 및 서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH을 포함할 수 있고; 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 24 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있고, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 116 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있고, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 208, 서열 번호 116 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있고, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 208, 서열 번호 210 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있고, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VH CDR1, VH CDR2 또는 VH CDR3의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있고; 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40 및 서열 번호 42로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 24 및 서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다.
부가적 실시양태에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 24 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 22, 서열 번호 116 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 208, 서열 번호 116 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 208, 서열 번호 210 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VH CDR1, VH CDR2 또는 VH CDR3의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 항체들 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2 또는 VH CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-CD19 항체는 경쇄 가변 영역, VL를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 항체들 중 어느 하나의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, VL을 포함할 수 있다. 본 발명의 항-CD19 항체는 중쇄 가변 영역, VH를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 항체들 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34)로 표시되는 인간화 VH의 VH 도메인 서열을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 서열 번호 103, 106, 191, 및 192로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VH 도메인의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역, VH를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있고, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 서열 번호 125 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있고, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 211, 서열 번호 218 및 서열 번호 222로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있고, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 서열 번호 220 및 서열 번호 229로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있고, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 215, 서열 번호 221 및 서열 번호 222로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있고, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VK CDR1, VK CDR2 또는 VK CDR3의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 영역, VK을 포함할 수 있고; 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 FW 영역을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 30 및 32로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 12, 14 및 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 서열 번호 125 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 211, 서열 번호 218 및 서열 번호 222로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 28, 서열 번호 220 및 서열 번호 229로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 서열 번호 215, 서열 번호 221 및 서열 번호 222로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역, VK를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VK CDR1, VK CDR2 또는 VK CDR3의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 영역, VK을 포함할 수 있다
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52), HB12B-364987(서열 번호 62), HB12B-3649(서열 번호 68), HB12B-36(서열 번호 70), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5 VK(서열 번호 111), 16C9 VK(113), 15D1 VK(서열 번호 112), 3C3 VK(서열 번호 193), 6C11 VK(서열 번호 204) 및 9G7 VK(서열 번호 205)로 구성된 군으로부터 선택되는 인간화 VK 도메인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 인간 CD19에 결합할 수 있는, 본원에 기재된 VH 도메인, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VK 도메인, VK CDR1, VK CDR2 또는 VK CDR3의 유도체를 포함하는, 인간 CD19에 결합하는 항체를 포함한다(예를 들어, 상기 표 1에 열거된 변이체들 참조). 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하여, 돌연변이(예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 도입할 수 있고, 그것의 예에는 아미노산 치환을 발생시키기 위해 통상 사용되는 PCR-매개 돌연변이유발 및 부위-지정 돌연변이유발이 포함된다. 한 실시양태에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 HB12A 또는 HB12B 항-CD19 항체의 원래의 VH 및/또는 VK CDR에 대한, 25개 미만, 20개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만 또는 1개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기(즉, 항체가 인간 CD19에 특이적으로 결합하기 위해 중요하지 않은 아미노산 잔기) 상에서 행해진 보존적 아미노산 치환(예를 들어 상기 치환)를 가질 수 있다. 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해, VH 및/또는 VK CDR 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성되는 돌연변이체를 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여, 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 돌연변이유발 후에, 코딩된 항체가 발현될 수 있고, 항체의 활성이 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 항체는 미국 20050070693A1에 기재된 hA19 항체의 VH CDR1 및 VH CDR2를 배제할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 상기 표 1에 열거된 VH CDR들중 어느 하나의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변이 VH CDR은 아미노산 치환을 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VH CDR의 변이체를 포함하며, 여기서 상기 변이 VH CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VH CDR1의 위치 32에 있는 트레오닌(T), VH CDR2의 위치 60에 있는 티로신(Y), VH CDR2의 위치 60에 있는 아스파르트산(D), VH CDR2의 위치 60에 있는 류신(L), VH CDR2의 위치 61에 있는 알라닌(A), VH CDR2의 위치 61에 있는 발린(V), VH CDR3의 위치 100B에 있는 티로신(Y), VH CDR3의 위치 100B에 있는 아르기닌(R), 및 VH CDR3의 위치 100B에 있는 아스파라긴(N)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VH CDR의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변이 VH CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VH CDR1의 위치 33에 있는 글루탐산(E), VH CDR1의 위치 33에 있는 류신(L), VH CDR1의 위치 35에 있는 페닐알라닌(F), VH CDR1의 위치 35에 있는 티로신(Y), VH CDR1의 위치 35에 있는 아스파르트산(D), VH CDR1의 위치 35에 있는 류신(L), VH CDR2의 위치 57에 있는 세린(S), VH CDR2의 위치 57에 있는 프롤린(P), VH CDR2의 위치 57에 있는 아스파라긴(N), VH CDR3의 위치 100B에 있는 히스티딘(H), VH CDR3의 위치 100B에 있는 페닐알라닌(F), 및 VH CDR3의 위치 99에 있는 프롤린(P)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VH CDR의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변이 VH CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VH CDR1의 위치 32에 있는 발린(V), 및 VH CDR2의 위치 52A에 있는 류신(L)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VK CDR의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 VK CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VK CDR1의 위치 27D에 있는 히스티딘(H), VK CDR1의 위치 33에 있는 이소류신(I), VK CDR2의 위치 50에 있는 글루탐산(E), VK CDR3의 위치 91에 있는 트레오닌(T), 및 VK CDR3의 위치 96에 있는 이소류신(I)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VK CDR의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 VK CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VK CDR1의 위치 27C에 있는 이소류신(I), VK CDR1의 위치 30에 있는 류신(L), VK CDR1의 위치 33에 있는 아르기닌(R), VK CDR1의 위치 33에 있는 트레오닌(T), VK CDR2의 위치 50에 있는 티로신(Y), VK CDR2의 위치 54에 있는 트레오닌(T), VK CDR2의 위치 54에 있는 프롤린(P), VK CDR2의 위치 55에 있는 티로신(Y), 및 VK CDR3의 위치 96에 있는 아스파라긴(N)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VK CDR의 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 VK CDR은 하기 천연 또는 치환된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함한다: VK CDR2의 위치 54에 있는 아르기닌(R), VK CDR2의 위치 54에 있는 트레오닌(T), VK CDR2의 위치 54에 있는 알라닌(A), 및 VK CDR3의 위치 89에 있는 알라닌(A)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
본 발명은 또한 인간 CD19에 결합하는 항체를 포함하며, 상기 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 CDR을 포함하며, 여기서 상기 CDR은 HB12A 또는 HB12B 항-CD19 항체 중 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 두 아미노산 서열의 동일성 %는 BLAST 단백질 검색을 포함하나 이에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
5.1.2. 항-CD19 항체의 프레임워크 영역
한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 단클론 항체의 VH는 약 64% 내지 약 100% 범위 내의, HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34)의 상응하는 프레임워크 영역과의 아미노산 서열 동일성(즉, 항체 Y의 FW1 대비 항체 X의 FW1)을 가지는 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 이 실시양태의 특정 측면에서, 본원에 기재된 항체의 인간 또는 인간화 VH 프레임워크 영역은 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34)와 적어도 64%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
특별한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체의 인간 또는 인간화 VH 프레임워크 영역은 87개 아미노산 중 적어도 56개(56/87)의, HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34)의 상응하는 프레임워크 영역과의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다, 특별한 실시양태에서, VH 프레임워크 아미노산 서열 동일성은 적어도 56/87, 57/87, 58/87, 59/87, 60/87, 61/87, 62/87, 63/87, 64/87, 65/87, 66/87, 67/87, 68/87, 69/87, 70/87, 71/87, 72/87, 73/87 74/87, 75/87, 76/87, 77/87, 78/87, 79/87, 80/87, 81/87, 82/87, 83/87, 84/87, 85/87, 86/87, 또는 87/87 아미노산일 수 있다. 본원에 기재된 항-CD19 항체의 VH 서열은 HB12B-(3-72/JH4)의 베니어 아미노산 잔기와의 높은 서열 동일성, 예를 들어 16개 중 적어도 10개(10/16), 적어도 11/16, 적어도 12/16, 적어도 13/16, 적어도 14/16, 또는 적어도 15/16 베니어 잔기의 베니어 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 베니어 아미노산 잔기의 부정합(mismatch)은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환인 부정합은, 부정합된 아미노산이 베니어 아미노산과 물리적 및 화학적 성질을 유사한 것, 예를 들어 부정합된 잔기가 베니어 잔기와 극성(극성 또는 비극성), 산도(산성 또는 염기성), 측쇄 구조(예를 들어, 분지형 또는 선형, 또는 페닐 환, 히드록실 부분, 또는 황 부분 포함)의 특성이 유사한 것이다.
다른 실시양태에서, 베니어 아미노산 잔기의 부정합은 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 비보존적 아미노산 치환인 부정합은 부정합된 아미노산이 베니어 아미노산과 물리적 및 화학적 성질을 가지지 않는 것, 예를 들어 부정합된 잔기가 치환되는 베니어 잔기와 상이한 극성, 산도, 또는 측쇄 구조(예를 들어, 분지형 또는 선형, 또는 페닐 환, 히드록실 부분 또는 황 부분 포함)을 가지는 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 또는 인간화 항-CD19 항체는 VH 프레임워크 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 VH 프레임워크 영역은 하기 잔기들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 프레임워크 영역 1의 위치 20에 있는 류신(L), 프레임워크 영역 1의 위치 27에 있는 페닐알라닌(F), 프레임워크 영역 1의 위치 28에 있는 트레오닌(T), 프레임워크 영역 2의 위치 38에 있는 아르기닌(R), 프레임워크 영역 2의 위치 48에 있는 발린(V), 프레임워크 영역 3의 위치 67에 있는 페닐알라닌(F), 프레임워크 영역 3의 위치 71에 있는 아르기닌(R), 프레임워크 영역 3의 위치 80에 있는 류신(L), 및 프레임워크 영역 3의 위치 91에 있는 티로신(Y) (이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
카밧 넘버링은 문헌 [Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publication No. 91-3242, published as a three volume set by the National Institutes of Health, National Technical Information Service](이후 "카밧")의 중요 연구에 기초한다. 카밧은 다수의 종 항체 이소타입으로부터의 면역글로불린 사슬의 다중 서열 배열을 제공한다. 배열된 서열은 카밧 넘버링 시스템인 단일 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 카밧 서열은 1991년 공개 이후에 업데이트되었고, 전자 서열 데이터베이스(최근 다운로드가능한 버전 1997)으로 이용가능하다. 임의의 면역글로불린 서열은 카밧 기준 서열로 배열을 수행함으로써 카밧에 준해 넘버링될 수 있다. 따라서, 카밧 넘버링 시스템은 면역글로불린 사슬을 넘버링하기 위한 균일한 시스템을 제공한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 모든 면역글로불린 아미노산 서열은 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 유사하게, 본원에 지칭되는 모든 단일 아미노산 위치는 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
다른 특별한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체의 인간 또는 인간화 VH 프레임워크 영역은 하기 베니어, 계면 또는 정준 잔기 위치 중 하나 이상에서 동일성 또는 보존적 부정합을 위해 선택되는 프레임워크 영역을 가질 수 있다: 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 39, 45, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 73, 78, 80, 90, 91, 92, 93, 94 및 103. 부정합된 베니어, 계면 및 정준 잔기 중 하나 이상은, 예를 들어 돌연변이유발에 의해 변화되어, HB12A 또는 HB12B VH 프레임워크 영역의 상응하는 아미노산 잔기에 정합될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체의 인간 또는 인간화 VK 프레임워크 영역은 약 65% 내지 약 100% 범위 내에서 HB12B-(A10-Jk4) VK(서열 번호 52)의 프레임워크 영역과 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 이 실시양태의 특정 측면에서, 본원에 기재된 항체의 인간 또는 인간화 VK 프레임워크 영역은 HB12B-(A10-Jk4) 항체와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
특별한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 인간 또는 인간화 VK 프레임워크 영역은 80개 아미노산 중 적어도 52개(52/80)의, HB12B-(A10-Jk4) VH(서열 번호 52)의 상응하는 프레임워크 영역과의 아미노산 서열 동일성(즉, 항체 Y의 FW1 대비 항체 X의 FW1)을 가질 수 있다. 특별한 실시양태에서, VH 프레임워크 아미노산 서열 동일성은 적어도 52/80, 53/80, 54/80, 55/80, 56/80, 57/80, 58/80, 59/80, 60/80, 61/80, 62/80, 63/80, 64/80, 65/80, 66/80, 67/80, 68/80, 69/80, 70/80, 71/80, 72/80, 73/80 74/80, 75/80, 76/80, 77/80, 78/80, 79/80, 또는 80/80, 아미노산일 수 있다. 본원에 기재된 항-CD19 항체의 VK 서열은 HB12B의 베니어 아미노산 잔기와 높은 서열 동일성(도 1 참조), 예를 들어 14개 중 적어도 9개(9/14), 적어도 10/14, 적어도 11/14, 적어도 12/14, 적어도 13/14 베니어 잔기의 베니어 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 베니어 아미노산 잔기의 부정합은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환인 부정합은, 부정합된 아미노산이 베니어 아미노산과 물리적 및 화학적 성질을 유사한 것, 예를 들어 부정합된 잔기가 베니어 잔기와 극성(극성 또는 비극성), 산도(산성 또는 염기성), 측쇄 구조(예를 들어, 분지형 또는 선형, 또는 페닐 환, 히드록실 부분, 또는 황 부분 포함)의 특성이 유사한 것이다.
다른 실시양태에서, 베니어 아미노산 잔기의 부정합은 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 비보존적 아미노산 치환인 부정합은 부정합된 아미노산이 베니어 아미노산과 물리적 및 화학적 성질을 가지지 않는 것, 예를 들어 부정합된 잔기가 치환되는 베니어 잔기와 상이한 극성, 산도, 또는 측쇄 구조(예를 들어, 분지형 또는 선형, 또는 페닐 환, 히드록실 부분 또는 황 부분 포함)을 가지는 것이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 인간 또는 인간화 VK 프레임워크 영역은 하기 잔기들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 프레임워크 영역 2의 위치 36에 있는 페닐알라닌(F), 프레임워크 영역 2의 위치 49에 있는 히스티딘(H), 및 프레임워크 영역 3의 위치 87에 있는 페닐알라닌(F)(이상은 카밧에 준해 넘버링됨).
다른 특별한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체의 인간 또는 인간화 VH 프레임워크 영역은 하기 베니어, 계면 또는 정준 잔기 위치 중 하나 이상에서 동일성 또는 보존적 부정합을 위해 선택되는 프레임워크 영역을 가질 수 있다: 2, 3, 4, 23, 35, 36, 38, 44, 56, 47, 48, 49, 64, 66, 68, 69, 71, 87, 88 및 98. 부정합된 베니어, 계면 및 정준 잔기 중 하나 이상은, 예를 들어 돌연변이유발에 의해 변화되어, HB12A 또는 HB12B 프레임워크 영역의 상응하는 아미노산 잔기에 정합될 수 있다.
특별한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 VH를 포함하는 중쇄는 본 발명의 인간화 VK를 포함하는 경쇄와 함께 발현되어, 인간화 항-CD19 항체를 생산할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는, HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34), 7E12 VH(서열 번호 102), 14H5 VH(서열 번호 103), 15D1 VH(서열 번호 104), 15D7 VH(서열 번호 105), 16C4 VH(서열 번호 106), 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108), 14H5-LG(서열 번호 109), 1A7 VH(서열 번호 191), 3C3 VH(서열 번호 191), 6C11 VH(서열 번호 191), 9G7(서열 번호 191), 3B4 VH(서열 번호 236) 및 3F11 VH(서열 번호 192)로 표시되는 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 VH 서열을 포함할 수 있고; HB12B-(A10/JK4)(서열 번호 52); HB12B-364987 (또는 364987)(서열 번호 62); HB12B-3649(또는 3649)(서열 번호 68); HB12B-36 (또는 36)(서열 번호 70), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5(서열 번호 111), 15D1(서열 번호 112), 16C9(서열 번호 113), 3C3 VK(서열 번호 193), 3E5 VK(서열 번호 194), 3D4 VK(서열 번호 195), 3F1 VK(서열 번호 196), 5B5 VK(서열 번호 197), 6F7 VK(서열 번호 198), 1C11 VK(서열 번호 199), 2B 11 VK(서열 번호 200), 2D10 VK(서열 번호 201), 5C11 VK(서열 번호 202), 5D4 VK(서열 번호 203), 6C11 VK(서열 번호 204), 9G7 VK(서열 번호 205), 1H4 VK(서열 번호 206) 및 5C4 VK(서열 번호 207)로 표시되는 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 VK 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 특별한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 항체는 VH 서열 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 및 VK 서열 HB12B-364987(서열 번호 62)을 포함할 수 있다. 한 특별한 실시양태에서, 인간화 항-CD19 항체는 VH 서열 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 및 VK 서열 HB12B-3649(서열 번호 68)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항-CD19 항체는 VH 서열 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34) 및 VK 서열 HB12B-36(서열 번호 70)를 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 7E12 VH(서열 번호 102) 및 VK 서열 7E12 VK(서열 번호 110)을 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 14H5 VH(서열 번호 103) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 14H5-YG VH(서열 번호 107) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 14H5-DG VH(서열 번호 108) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 14H5-LG VH(서열 번호 109) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 14H5 VH(서열 번호 103) 및 VK 서열 16C9 VK(서열 번호 113)을 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 15D1 VH(서열 번호 104) 및 VK 서열 15D1 VK(서열 번호 112)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 15D7 VH(서열 번호 105) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 16C4 VH(서열 번호 106) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 3C3 VK(서열 번호 193)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 3E5 VK(서열 번호 194)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 3D4 VK(서열 번호 195)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 5B5 VK(서열 번호 197)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 6F7 VK(서열 번호 198)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 2D10 VK(서열 번호 201)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 5C11 VK(서열 번호 202)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 9G7 VK(서열 번호 205)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 1H4 VK(서열 번호 206)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 1A7 VH(서열 번호 191) 및 VK 서열 5C4 VK(서열 번호 207)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 3B4 VH(서열 번호 236) 및 VK 서열 14H5 VK(서열 번호 111)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 3F11 VH(서열 번호 192) 및 VK 서열 3F11 VK(서열 번호 196)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 16C4 VH(서열 번호 106) 및 VK 서열 1C11 VK(서열 번호 199)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 16C4 VH(서열 번호 106) 및 VK 서열 2B11 VK(서열 번호 200)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 16C4 VH(서열 번호 106) 및 VK 서열 5D4 VK(서열 번호 203)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 16C4 VH(서열 번호 106) 및 VK 서열 6F7 VK(서열 번호 198)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 VH 서열 3F11 VH(서열 번호 192) 및 VK 서열 6C11 VK(서열 번호 204)를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VH 및 VL의 임의의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는, 본 발명의 인간화 VK를 포함하는 경쇄는 인간화 VH를 포함하는 중쇄와 발현되어, 인간화 항-CD19 항체를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 HB12B-(A 10/JK4)(서열 번호 52); HB12B-364987 (또는 364987)(서열 번호 62); HB12B-3649(또는 3649)(서열 번호 68); HB12B-36 (또는 36)(서열 번호 70), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5(서열 번호 111), 15D1(서열 번호 112), 16C9(서열 번호 113), 3C3(서열 번호 193), 3E5(서열 번호 194), 3D4(서열 번호 195), 3F11(서열 번호 196), 5B5(서열 번호 197), 6F7(서열 번호 198), 1C11(서열 번호 199), 2B11(서열 번호 200), 2D10(서열 번호 201), 5C11(서열 번호 202), 5D4(서열 번호 203), 6C11(서열 번호 204), 9G7(서열 번호 205), 1H4(서열 번호 206) 및 5C4(서열 번호 207)로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 VK 서열을 포함한다. 상기 VK 서열은 서열 번호 36, 38, 40 및 42로 구성된 군으로부터 선택되는 그것의 프레임워크 영역 내에 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열과 쌍을 형성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 VH를 포함하는 중쇄는 본 발명의 인간화 VK의 경쇄와 발현되어, 인간화 항-CD19 항체를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34), 7E12 VH(서열 번호 102), 14H5 VH(서열 번호 103), 15D1 VH(서열 번호 104), 15D7 VH(서열 번호 105), 16C4 VH(서열 번호 106), 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108), 14H5-LG(서열 번호 109), 1A7(서열 번호 191), 3C3 VH(서열 번호 191), 6C11 VH(서열 번호 191), 9G7(서열 번호 191), 3B4 VH(서열 번호 236) 및 3F11 VH(서열 번호 192)로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 VH 서열을 포함한다. 상기 VH 서열은 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 64, 서열 번호 58, 서열 번호 66 및 서열 번호 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 그것의 프레임워크 영역 내에 아미노산 서열을 포함하는 VK 서열과 쌍을 형성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 모 HB12A 또는 HB12B 하이브리도마로부터 유래된 인간화 VH 또는 VK는 키메라 면역글로불린 경쇄 또는 키메라 면역글로불린 중쇄로서 발현되어, 키메라 항-CD19 항체를 생산할 수 있다. 한 특별한 실시양태에서, 인간화 VH는 HB12A VK(서열 번호 4) 또는 HB12B VK(서열 번호 20)를 포함하는 키메라 항체로서 발현될 수 있다. 또 다른 특별한 실시양태에서, 인간화 VK는 HB12A VH(서열 번호 2) 또는 HB12B VH(서열 번호 18)를 포함하는 키메라 항체로서 발현될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 항-CD19 항체는 HB12A VK(서열 번호 4) 또는 HB12B VK(서열 번호 20)를 VK 서열을 포함할 수 있고, HB12A VH(서열 번호 2) 또는 HB12B VH(서열 번호 18)의 VH 서열을 추가로 포함할 수 있다.
한 특별한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 VH는 MGDNDIHF AFLSTGVHS(서열 번호 83)의 리더 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간화 VK는 인간 VKI-L12 유전자의 리더 펩티드로부터 선택된 리더 서열 MDMRVP AQLLGLLLL WLPGAKC(서열 번호 84)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항-CD19 항체는 인간 CD19(hCD19) 항원에 대한 높은 결합 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체는 적어도 2×105 M-1S-1, 적어도 5×105 M-1S-1, 적어도 106 M-1S-1, 적어도 5×106 M-1S-1, 적어도 107 M-1S-1, 적어도 5×107 M-1S-1, 또는 적어도 108 M-1S-1의 해리 속도 상수, 즉 kon 속도(항체(Ab) + 항원(Ag)kon → Ab-Ag)를 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 5×10-1 s-1 미만, 10-1 s-1 미만, 5×10-2 s-1 미만, 10-2 s-1 미만, 5×10-3 s-1 미만, 10-3 s-1 미만, 5×10-4 s-1 미만, 또는 10-4 s-1 미만의 koff 속도((Ab-Ag)koff → 항체(Ab) + 항원(Ag))를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 5×10-5 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5×10-6 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5×10-7 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5×10-8 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5×10-9 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 또는 10-10 s-1 미만의 koff를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 적어도 102 M-1, 적어도 5×102 M-1, 적어도 103 M-1, 적어도 5×103 M-1, 적어도 104 M-1, 적어도 5×104 M-1, 적어도 105 M-1, 적어도 5×105 M-1, 적어도 106 M-1, 적어도 5×106 M-1, 적어도 107 M-1, 적어도 5×107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 5×108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 5×109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 5×1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 5×1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 5×1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 적어도 5×1013 M-1, 적어도 1014 M-1, 적어도 5×1014 M-1, 적어도 1015 M-1, 또는 적어도 5×1015 M-1의 친화도 상수, 즉 Ka(konkoff)를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 5×10-2 M 미만, 10-2 M 미만, 5×10-3 M 미만, 10-3 M 미만, 5×10-4 M 미만, 10-4 M 미만, 5×10-5 M 미만, 10-5 M 미만, 5×10-6 M 미만, 10-6 M 미만, 5×10-7 M 미만, 10-7 M 미만, 5×10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 5×10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 5×10-10 M 미만, 10-10 M 미만, 5×10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 5×10-12 M 미만, 10-12 M 미만, 5×10-13 M 미만, 10-13 M 미만, 5×10-14 M 미만, 10-14 M 미만, 5×10-15 M 미만, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 ka(koff/kon)를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 본 발명의 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 방법(예를 들어, 바이아코어(BIAcore) 검정, ELISA) (바이아코어 국제 AB, 스위스 웁살라 소재)으로, 3000 pM 미만, 2500 pM 미만, 2000 pM 미만, 1500 pM 미만, 1000 pM 미만, 750 pM 미만, 500 pM 미만, 250 pM 미만, 200 pM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 미만의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 본 발명의 항 CD-19 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 방법(예를 들어, 바이아코어 검정, ELISA)으로, 25 내지 3400 pM, 25 내지 3000 pM, 25 내지 2500 pM, 25 내지 2000 pM, 25 내지 1500 pM, 25 내지 1000 pM, 25 내지 750 pM, 25 내지 500 pM, 25 내지 250 pM, 25 내지 100 pM, 25 내지 75 pM, 25 내지 50 pM의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 본 발명의 항체는 hCD19에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 방법(예를 들어, 바이아코어 검정, ELISA)으로, 500 pM, 100 pM, 75 pM 또는 50 pM의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체 또는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 hCD19에 결합하는 본원에 기재된 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은, 엄격하거나 보다 낮은 엄격도의 혼성화 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
엄격한 혼성화 조건은 약 45℃에서 6× 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 필터-결합 DNA에 혼성화한 후, 약 50 내지 65℃에서 0.2× SSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세정하는 것, 엄격한 혼성화 조건, 예컨대 약 45℃에서 6× SSC에서 필터-결합 DNA에 혼성화한 후, 약 60℃에서 0.1X SSC/0.2% SDS에서 1회 이상 세정하는 것, 당업계에 공지된 임의의 다른 엄격한 혼성화 조건을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Ausubel, F. M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY, 제6.3.1 내지 6.3.6면 및 제2.10.3면] 참조).
폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 간략히 항체를 코딩하는 서열의 부분을 포함하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 그 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 및 이에 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 수반하는, (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242(1994)]에 기재된 바와 같은) 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리될 수 있다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수도 있다. 특별한 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 이용가능하지 않으나 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산이 화학적으로 합성되거나, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 혹은 예를 들어 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 동정하기 위해 특별한 유전 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 클로닝함으로써, 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 핵산을 발현하는 임의의 조직, 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 그러한 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 polyA+RNA)로부터 수득될 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 이어서 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내에 클로닝될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체의 VH 및 VK 프레임워크 영역 및 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 포유동물 세포 내 그것의 효율적 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 hCD19 유전자도입 마우스 모델 시스템 내 재조합 인간 CD19 분자를 발현하는 B 세포를 효율적으로 고갈시킬 수 있는 항체를 제공한다(문헌 [Yazawa et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA. 102(42): 15178-83(2005)]). 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD-19 항체는 HB12B 단클론 항체에 의해 달성되는 고갈에 대해, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%의 B 세포 고갈을 달성할 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12B 항체에 의해 달성되는 고갈에 비해 더 완전한 B 세포 고갈을 달성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 복강 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 전구(progenitor) B 세포, 초기 프로(전구)(pro) B 세포, 후기 프로 B 세포, 대형 프리(예비)(pre) B 세포, 소형 프리 B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극 B 세포, 및/또는 형질 세포를 고갈시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5 일 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 또는 적어도 30일 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 또는 적어도 10주 동안 지속될 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월 또는 적어도 12개월 동안 지속될 수 있다.
본 발명은 또한 인간 대상 내 B 세포를 효율적으로 고갈시킬 수 있는 항체를 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD-19 항체는 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100% B 세포 고갈을 달성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 인간 대상 내 B 세포 부분집합을 고갈시킬 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 복강 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 고갈시킬 수 있다. CD19는 모든 발생 단계의 B 세포의 표면 상에 존재한다. 그러므로, 항-CD19 항체는 모든 발생 단계의 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 항 본 발명의 항-CD19 항체는 전구 B 세포, 초기 프로 B 세포, 후기 프로 B 세포, 대형 프리 B 세포, 소형 프리 B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극 B 세포, 및/또는 형질 세포를 고갈시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5 일 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 또는 적어도 30일 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 또는 적어도 10주 동안 지속될 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월 또는 적어도 12개월 동안 지속될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 순환 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 혈액 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%을 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 비장 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%을 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 변연부 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 여포성 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 복강 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 골수 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 전구세포 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 전기 전구-B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 후기 전구-B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 대형 예비-B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 소형 예비-B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 미성숙 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 성숙 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 항원 자극 B 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 형질 세포의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%를 고갈시킨다. B 세포의 고갈은 연장 시간 동안 지속될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5 일 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 또는 적어도 30일 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 또는 적어도 10주 동안 지속될 수 있다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월 또는 적어도 12개월 동안 지속될 수 있다.
B 세포 악성 종양은 특정 B 세포 부분집합의 병리학적 확장에 의해 특징화되는데, 예를 들어 전구체 B 세포 급성 림프구모구성 백혈병은 전구-B 세포/예비-B 세포 발생 단계에 상응하는 B 세포의 이상 확장에 의해 특징화된다. 악성 B 세포는 정상 B 세포 마커, 예컨대 CD19의 세포 표면 발현을 유지시킨다. 그러므로, 항-CD19 항체는 인간 대상 내 악성 B 세포를 고갈 시킬 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 인간 대상 내 악성 B 세포의 고갈을 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포-매개 세포독성(CDC), 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항-CD19 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 증진된 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 증진된 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 변이 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은, Asn297에 연결된 복합 N-글리코시드 연결 당 사슬을 가지는 변이 Fc 영역을 포함하는데, 여기서 상기 Fc 영역은 증진된 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.
본 발명은 또한 시험관내 자극 B 세포 증식을 효율적으로 억제할 수 있는 항-CD19 항체를 제공한다. 단리된 말초 B 세포의 증식은 각종 자극, 예를 들어 이에 국한되는 것은 아니나 항-IgM 항체, CD40 또는 CpG에 의한 자극에 의해 유도될 수 있다. 이 자극은 단독으로 또는 상호 조합되어 전달될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 시험관내 자극 B 세포 증식을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 또는 항-IgM/CD40 자극에 의해 유도되는 시험관내 B 세포 증식을 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 시험관내 자극 B 세포 증식을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 75% 억제한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 또는 항-IgM/CD40 자극에 의해 유도되는 시험관내 B 세포 증식을 억제하며, 여기서 상기 Fc 변이체는 비교 비변이 분자에 비해 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 변경된 결합 친화도를 가진다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 또는 항-IgM/CD40 자극에 의해 유도되는 시험관내 B 세포 증식을 억제하는데, 여기서 상기 Fc 변이체는 비변이 Fc 도메인에 비해 Fc 감마 수용체 IIB에 대한 증진된 결합을 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이 항-CD19 항체는 시험관내 자극 B 세포 증식을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 75%를 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이 항-CD19 항체는 시험관내 자극 B 세포 증식을 억제하는데, 여기서 상기 변이 Fc 도메인은 비교 비변이 Fc 도메인의 Fc 감마 수용체에 대한 친화도에 비해, 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 큰 Fc 감마 수용체에 대한 친화도를 가진다.
본 발명은 또한 인간 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포-매개 세포독성(CDC), 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있는 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 순환 B 세포를 고갈시키기에 충분한 양으로 B 세포 악성 종양의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 B 세포 악성 종양의 치료 방법에 관한 것이다. 한 특별한 측면에서, 본 발명은 또한 IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입의 것인 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체의 치료 유효 처방을 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 B 세포 악성 종양의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 ADCC, CDC 및/또는 아포프토시스를 매개할 수 있는 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 순환 B 세포를 고갈시키기에 충분한 양으로 자가면역 질환 또는 장애의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 자가면역 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입의 것인 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체의 치료 유효 처방을 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 자가면역 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 순환 본 발명의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를, B 세포, 또는 순환 면역글로불린, 또는 양자 모두를 고갈시킬 수 있는 양으로 체액성 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 인간 이식 수령자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 이식 수령자의 체액성 거부반응의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 이식 전에 이식편을, 이식편으로부터의 B 세포를 고갈시킬 수 있는 양의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 이식편 거부반응 또는 이식편대숙주 질환의 예방이 필요한 인간 이식 수령자의 이식편 거부반응 또는 이식편대숙주 질환의 예방 방법을 제공한다.
5.2. 인간화 항-CD19 항체의 생성
본원에 기재된 인간화 항체는, CDR-이식(예를 들어, 유럽 특허 제EP 239,400호; 국제 공보 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(예를 들어, 유럽 특허 제EP 592,106호 및 제EP 519,596호; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498]; 문헌 [Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814]; 및 문헌 [Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973](이들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조), 사슬 셔플링(chain shuffling)(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호(이는 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조) 및 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, 국제 공보 제WO 9317105호, 문헌 [Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25(2002)], 문헌 [Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60(2000)], 문헌 [Morea et al., Methods, 20(3):267-79(2000)], 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84(1997)], 문헌 [Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904(1996)], 문헌 [Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp): 5973s-5977s(1995)], 문헌 [Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22(1995)], 문헌 [Sandhu JS, Gene, 150(2):409-10(1994)] 및 문헌 [Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73(1994)](이들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 개시된 기법을 포함하나 이에 국한되지 않는, 당업계에 공지된 각종 기법들을 이용하여 생성될 수 있다. 종종, FW 영역 내의 FW 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 바람직하게는 개선시키기 위하여 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이 FW 치환은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항원 결합에 중요한 FW 잔기를 동정하기 위한 CDR과 FW 잔기 간의 상호작용의 모델링 및 특별한 위치에 있는 예외적인 FW 잔기를 동정하기 위한 서열 비교에 의해 동정된다(예를 들어, Queen et al.의 미국 특허 제5,585,089호; 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323](이는 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조)).
인간화 항-CD19 항체에는 비인간 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종, "수입" 잔기로 지칭되는데, 이들 잔기는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린 분자로부터 하나 이상의 CDR 및 인간으로부터 프레임워크 영역을 포함한다. 항체의 인간화는 당업계에 공지되어 있고, 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써, 즉 CDR-이식(EP 239,400; PCT 공보 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제4,816,567호; 제6,331,415호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제6,548,640호(이들의 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 의해, Winter 및 그의 동료의 방법(문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525(1986)]; 문헌 [Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988)]; 및 문헌 [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)])에 따라 수행될 수 있다. 그러한 인간화 키메라 항체에서, 비변형 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 비인간 종으로부터 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기, 또한 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터 잔기로 치환된 인간 항체이다. 항-CD19 항체의 인간화는 베니어링 또는 리서피싱(EP 592,106; EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498]; 문헌 [Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814(1994)]; 및 문헌 [Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:969-973(1994)]) 또는 사슬 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)(이들의 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 의해 달성될 수 있다.
인간화 항체를 만드는 데 이용되는 경쇄와 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위한 것이다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열을 항원 결합, 적합한 구조 형성 및/또는 의도된 인간화 mAb의 안정성에 대해 중요할 수 있는 특정 잔기의 존재에 대해 스크리닝한다(문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296(1993)]; 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901(1987)](이들의 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)). 이어서, 원하는 기준에 정합되는 생성되는 FW 서열을 인간화 항체를 위한 인간 도너 FW 영역으로서 사용한다.
또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 부분군의 모든 인간 항체의 일치 서열로부터 유래된 특별한 FW을 이용한다. 수가지 상이한 인간화 항-CD19 항체를 위해 동일한 FW가 사용될 수도 있다(문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Vresta et al., J. Immunol., 151:2623(1993)](이들의 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)).
항-CD19 항체는 CD19에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화될 수 있다. 본 발명의 한 측면에 따라, 인간화 항체는 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 이용한 모 서열과 각종 개념적 인간화 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 이용가능하고, 당업자에게 자명하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능 역할의 분석, 즉, CD19에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FW 잔기는 원하는 항체 특성, 예를 들어 CD19에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수령자와 수입 서열로부터 선택되고 결합될 수 있다. 일반적으로 CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 데 직접적으로 또한 가장 실질적으로 관련된다.
"인간화" 항체는 원래의 항체와 유사한 항원 특이성, 즉 본 발명에서는 인간 CD19 항원에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 그러나, 특정 인간화 방법을 사용하는 경우, 인간 CD19 항원에 대한 항체의 결합의 친화도 및/또는 특이성은 문헌 [Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151(1999)](이의 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재된 바와 같이, "지정된 진화(directed evolution)"의 방법을 사용하여 변경될 수 있다.
본원에 기재된 인간화 항-CD19 항체는 HB12A 또는 HB12B 상보성 결정 영역의 이식을 위한 구분된 인간 프레임워크 영역, 또는 하기 단락에 기재되는 바와 같은 "CDR"의 선택에 의해 작제될 수 있다. 본 발명은 다수의 인간화 양태의 마우스 HB12A 및 HB12B 항체, 및 chHB12A 및 chHB12B로 표시되는 키메라 양태를 포함한다.
5.3. 단클론 항-CD19 항체
단클론 항-CD19 항체는 인간 CD19 항원에 대한 결합 특이성을 나타내고, 인간 ADCC, CDC 및/또는 아포프토시스 기작을 매개할 수 있다. 그러한 항체는 하이브리도마, 재조합, 파지 표시 기술, 또는 이들의 조합의 이용을 비롯한 당업계에 공지된 각종 기법들을 이용하여 생성될 수 있다. 항체는 단일 항원 부위에 매우 특이적이고, 그 부위에 대해 지정된다. 조작된 항-CD19 항체는 이하 기재되는 기법 및 그 기법의 개량법을 포함하나 이에 국한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 대규모 고수율 생산은 전형적으로 조작된 항-CD19 항체를 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 배양액으로부터 항-CD19 항체를 회수하는 단계를 수반한다.
5.3.1. 하이브리도마 기법
단클론 항체는, 당업계에 공지되고 예를 들어 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; 문헌 [Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)](상기 문헌은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 교시되어 있는 기법들을 비롯한 하이브리도마 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 마카쿠 원숭이(macaque monkey)는 면역화되어, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 림프구는 또한 시험관내 면역화될 수도 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이와 같이 생성된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지 내에 접종되어, 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포에서 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 이들 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 예방하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
특정 실시양태는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적이고 높은 수준의 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 이용한다. 이 골수종 세포주 중에는 쥐과 동물 골수종 세포주, 예를 들어 [살크 인스티튜트 세포 분배 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)]로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 ATCC(미국 메릴랜드주 로크빌 소재)로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포로부터 유래된 것들이 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포주도 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 기재되었다(문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984)]; 문헌 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 인간 CD19 항원을 지향하는 단클론 항체의 생산을 검사한다. 적절하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내에서 결합 측정, 예를 들어 방사면역검정법(RIA) 또는 효소-연결 면역흡수 검정법(ELISA)으로 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 이들 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법으로 성장된다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 그러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI 1640 배지이다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수(ascite) 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
이 서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해, 배양 배지, 복수 체액 또는 혈청으로부터 적당하게 분리된다.
5.3.2. 재조합 DNA 기법
본원에 기재된 항-CD19 항체를 코딩하는 DNA를, 통상적 절차를 이용하여(예를 들어, 항-CD19 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 용이하게 단리하고, 시퀀싱한다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터 내에 놓일 수 있고, 이 벡터는 E. 콜라이(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 다른 방식으로라면 면역글로불린을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포 내에서 항-CD19 항체의 합성을 달성한다.
파지 표시(phage display) 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수반하는 파지 입자의 표면 상에서 표시된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 병든 조직의 인간 또는 쥐과 동물 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고, 파지미드 벡터(phagemid vector) 내로 클로닝된다. 상기 벡터는 E. 콜라이 내로 전기천공되고, 상기 E. 콜라이는 보조 파지로 감염된다. 이들 방법에 사용된 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 비롯한 섬유성 파지이고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합 방식으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예를 들어 표지된 항원, 또는 고체 표면이나 비드(bead)에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선택되거나 동정될 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 표시 방법의 예에는 문헌 [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; 문헌 [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186]; 문헌 [Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958]; 문헌 [Persic et al., 1997, Gene, 187:9-18]; 문헌 [Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57:191-280]; 국제 출원 제PCT/GB91/01134호; 국제 공개 제WO 90/02809호, WO 91/10737호, 제WO 92/01047호, 제WO 92/18619호, 제WO 93/11236호, 제WO 95/15982호, 제WO 95/20401호, 및 제WO97/13844호; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 개시된 방법들이 포함된다.
상기 참조문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 이후, 상기 파지로부터 항체 코딩 영역은 단리되고, 인간 항체를 비롯한 전체 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원-결합 단편을 생성시키는 데 사용되며, 예를 들어 아래에 기재된 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 원하는 숙주 내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 제WO 92/22324호; 문헌 [Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6):864-869]; 문헌 [Sawai et al., 1995, AJRI, 34:26-34]; 및 문헌 [Better et al., 1988, Science, 240:1041-1043](상기 참조문헌은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 개시된 방법들과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 Fab, Fab', F(ab')2 단편을 재조합 방식으로 생산하는 기술 역시 당업계에 공지되어 있다.
항체는 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성한 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)] 및 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에서는 각각 파지 라이브러리를 이용하여 쥐과 동물 및 인간 항체의 단리를 기재하고 있다. 사슬 셔플링이 높은 친화도(nM 범위) 인간 항체의 생산에 사용될 수 있고(문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783(1992)]), 조합 감염과 생체내 재조합이 대규모 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 사용될 수 있다(문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993)]). 따라서, 이 기법들은 항-CD19 항체의 단리를 위한 전형적인 단클론 항체 하이브리도마 기술에 실행가능한 대안이다.
전체 항체를 생성하기 위하여, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열을 보유하는 PCR 프라이머, 제한 부위 및 상기 제한 부위를 보호하는 측면(flanking) 서열이 scFv 클론 내에서 VH 또는 VL 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기법을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 VH 불변 영역, 예를 들어 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 적절하게는, VH 또는 VL 도메인을 발현하는 벡터는 EF-1α 프로모터, 분비 신호, 가변 도메인에 대한 클로닝 부위, 불변 도메인 및 네오마이신과 같은 선택 마커를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터 내로 클로닝될 수도 있다. 이어서, 중쇄 전환 벡터와 경쇄 전환 벡터는 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, 세포주 내로 동시-형질감염되고, 전장 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정적 또는 일시적 세포주를 생성시킨다.
DNA는 또한 예를 들어, 상동성 쥐과 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수도 있다.
5.4. 키메라 항체
본원의 항-CD19 항체에는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 분류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 일치하거나 이에 상동하고, 사슬의 다른 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 분류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 일치하거나 이에 상동하는 키메라 항체(면역글로불린) 및 이들 항체의 단편(단, 이들은 원하는 생물학적 활성을 보임)이 포함된다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)]). 해당 키메라 항체에는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, 예컨대 비비, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 포함된다(미국 특허 제5,693,780호).
5.5. 변경된 항체/돌연변이 항체
본원에 기재된 조성물 및 방법의 항-CD19 항체는 돌연변이 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 "항체 돌연변이" 또는 "변경된 항체"는 항-CD19 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 항-CD19 항체의 아미노산 서열 변이체를 가리킨다. 항-CD19 항체의 아미노산 서열의 변형에는 항원에 대한 항체의 친화도 또는 화합력을 개선시킬 수 있는 서열에 대한 변형 및/또는 이펙터 기능을 개선시킬 수 있는 항체의 Fc 부분에 대한 변형이 포함된다.
그러므로, 본 발명은 본원에 개시된 인간, 인간화 및 키메라 항-CD19 항체, 및 그것의 변경/돌연변이 유도체에 관한 것으로, 이에는 변경된 인간 CD19 결합 특성; 예를 들어 변경된 결합 상수 kON, 해리 상수 kOFF, 및/또는 평형 상수 또는 결합 친화도, KD을 나타내는 것들이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체, 또는 그것의 변경/돌연변이 유도체의 KD는, 인간 CD19의 경우, 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 또는 10-9 M 이하일 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 그것의 변경/돌연변이 유도체의 그러한 결합 특성을 결정하기에 적합한 방법 및 시약이 당업계에 공지되어 있고/있거나, 상업적으로 입수가능하다(상기 문헌, 예를 들어 미국 특허 제6,849,425호, 미국 특허 제6,632,926호, 미국 특허 제6,294,391호 및 미국 특허 제6,143,574호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조). 또한, 그러한 역학적 분석을 위해 고안된 장비 및 소프트웨어도 상업적으로 입수가능하다(예를 들어 바이아코어
Figure 112009021231361-pct00005
A100, 및 바이아코어
Figure 112009021231361-pct00006
2000 기기; 바이아코어 국제 AB, 스웨덴 웁살라 소재).
변형은 임의의 공지된 항-CD19 항체 또는 본원에 기재된 바와 같이 동정된 항-CD19 항체에 대해 행해질 수 있다. 그러한 변경된 항체는 필연적으로 공지된 항-CD19 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 가진다. 예로서, 변경된 항체는 본원에 기재된 항-CD19 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 약 25% 내지 약 95% 동일성 또는 유사성 범위 내인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 변경된 항체는 본원에 기재된 항-CD19 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변경된 항체는 본원에 기재된 항-CD19 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 변경된 항체는 인간 CD19 결합 능력을 유지할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34), HB12A VH(서열 번호 2), HB12B VH(서열 번호 18), 7E 12 VH(서열 번호 102), 14H5 VH(서열 번호 103), 15D1 VH(서열 번호 104), 15D7 VH(서열 번호 105), 16C4 VH(서열 번호 106), 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108), 14H5-LG(서열 번호 109), 1A7 VH, 3C3 VH, 3E5 VH, 3D4 VH, 9G7 VH(서열 번호 191), 3B4 VH(서열 번호 236), 3F11 VH 또는 6C11 VH(서열 번호 192)의 아미노산 서열과 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 VH를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 표 1에 열거된 VH 도메인, VL 도메인 또는 CDR의 아미노산 서열과 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 VH를 포함할 수 있다 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변경된 항체는 HB12B-(3-72/JH4)(서열 번호 34), HB12A VH(서열 번호 2), HB12B VH(서열 번호 18), 7E 12 VH(서열 번호 102), 14H5 VH(서열 번호 103), 15D1 VH(서열 번호 104), 15D7 VH(서열 번호 105), 16C4 VH(서열 번호 106), 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108), 14H5-LG(서열 번호 109), 1A7 VH, 3C3 VH, 3E5 VH, 3D4 VH, 9G7 VH(서열 번호 191), 3B4 VH(서열 번호 236), 3F11 VH 또는 6C11 VH(서열 번호 192)의 FW1, FW2, FW3 또는 FW4 영역의 아미노선 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변경된 항체는 표 1에 열거된 VH 또는 VL 도메인 중 임의의 것의 FW1, FW2, FW3 또는 FW4 영역의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변경된 항체는 본원에 기재된 항-CD19 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 HB12A VK(서열 번호 4), HB12B VK(서열 번호 20), HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52), HB12B-364987 (또는 364987)(서열 번호 62), HB12B-3649(또는 3649)(서열 번호 68), HB12B-36 (또는 36)(서열 번호 70), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5(서열 번호 111), 15D1(서열 번호 112), 16C9(서열 번호 113), 3C3 VK(서열 번호 193), 3E5 VK(서열 번호 194), 3D4 VK(서열 번호 195), 3F1 VK(서열 번호 196), 5B5 VK(서열 번호 197), 6F7 VK(서열 번호 198), 1C11 VK(서열 번호 199), 2B11 VK(서열 번호 200), 2D10 VK(서열 번호 201), 5C11 VK(서열 번호 202), 5D4 VK(서열 번호 203), 6C11 VK(서열 번호 204), 9G7 VK(서열 번호 205), 1H4 VK(서열 번호 206) 또는 5C4 VK(서열 번호 207)의 아미노산 서열과 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 VL를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변경된 항체는 HB12A VK(서열 번호 4), HB12B VK(서열 번호 20), HB12B-(A10-Jk4)(서열 번호 52), HB12B-364987 (또는 364987)(서열 번호 62), HB12B-3649(또는 3649)(서열 번호 68), HB12B-36 (또는 36)(서열 번호 70), 7E12 VK(서열 번호 110), 14H5(서열 번호 111), 15D1(서열 번호 112), 16C9(서열 번호 113), 3C3 VK(서열 번호 193), 3E5 VK(서열 번호 194), 3D4 VK(서열 번호 195), 3F1 VK(서열 번호 196), 5B5 VK(서열 번호 197), 6F7 VK(서열 번호 198), 1C11 VK(서열 번호 199), 2B 11 VK(서열 번호 200), 2D10 VK(서열 번호 201), 5C11 VK(서열 번호 202), 5D4 VK(서열 번호 203), 6C11 VK(서열 번호 204), 9G7 VK(서열 번호 205), 1H4 VK(서열 번호 206), 또는 5C4 VK(서열 번호 207)의 FW1, FW2, FW3 또는 FW4 영역의 아미노산 서열과 적어도 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
서열과 대한 동일성 또는 유사성은 최대 서열 동일성 %을 달성하기 위하여 후보 서열 내에 아미노산 잔기와 항-CD19 항체 잔기를 정렬하고, 필요한 경우에 갭(gap)을 도입한 이후, 항-CD19 항체 잔기에 동일한 잔기 또는 유사한 잔기(즉, 동일한 측쇄 특성에 기초한 동일한 군으로부터 아미노산 잔기, 하기 참조)의 비율로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 가변 도메인의 외부에서 내부 신장, 결실 또는 항체 서열 내로 삽입은 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 주는 것으로 간주되지 않는다.
당업계에 공지된 바와 같이, "동일성 %"는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드를 비교함으로써 결정되는, 이들 두 서열 사이의 관계의 척도이다. 일반적으로 비교하고자 하는 2개의 서열을 이들 서열 사이에 최대 상관관계를 제공하도록 정렬한다. 두 서열의 정렬을 검사하고, 이들 사이에 아미노산 또는 뉴클레오티드가 정확하게 일치하는 위치의 총수를 결정하고, 이를 정렬의 전체 길이로 나누고 여기에 100%을 곱하여 동일성 % 수치를 얻는다. 이 동일성 % 수치는 동일하거나 매우 유사한 길이를 보유하고 매우 상동적인 서열에 특히 적합한, 비교하고자 하는 서열의 전장에서 결정될 수 있거나, 불균형 길이를 보유하거나 상동성 수준이 보다 낮은 서열에서는 보다 짧은 한정된 길이에서 결정될 수 있다.
예를 들어, 서열은 ".aln" 확장자를 갖는 파일을 생성시키는 Unix 하의 소프트웨어 clustalw로 정렬될 수 있고, 상기 파일은 .aln 파일을 여는 바이오에디트(Bioedit) 프로그램(문헌 [Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence allignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98]) 내로 불러올 수 있다. 바이오에디트 윈도우에서, 개별 서열(한번에 2개)을 선택하고 이들을 정렬할 수 있다. 이러한 방법으로 전체 서열의 비교가 가능하다.
2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 위스콘신 서열 분석 팩키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 9.1(문헌 [Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984], 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로부터 입수가능한 프로그램이 이용가능하다. 두 서열 사이에서 동일성 비율의 결정은 수학 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP을 이용하여, 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에 동일성 % 및 2개의 폴리펩티드 서열 사이에 동일성 %를 결정할 수 있다. BESTFIT는 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman)의 "국소 상동성(local homology)" 알고리즘(문헌 [Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981])을 이용하고 두 서열 사이에 유사성의 최적 단일 영역을 찾는다. BESTFIT는 길이가 상이한 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열을 비교하는 데 더욱 적합한데, 상기 프로그램은 짧은 서열이 긴 서열의 일부라고 가정한다. 이에 비해, GAP는 2개의 서열을 정렬하여 니들만(Neddleman) 및 분쉬(Wunsch)의 알고리즘(문헌 [J. Mol. Biol., 48:443-354, 1970])에 따라 "최대 유사성"을 찾는다. GAP는 대략적으로 동일한 길이를 보유하고 전체 길이에서 정렬이 예상되는 서열을 비교하는 데 더욱 적합하다. 적절하게는, 각 프로그램에 사용되는 "갭 가중(Gap Weight)"과 "길이 가중(Length Weight)"은 각각 폴리뉴클레오티드의 50 및 3이고, 폴리펩티드의 경우에는 12 및 4이다. 적절하게는, 동일성 %와 유사성 %는 비교되는 두 서열이 최적으로 정렬될 때 결정된다.
서열 사이에 동일성 및/또는 유사성을 결정하는 다른 프로그램도 또한 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어 BLAST 계열의 프로그램(문헌 [Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268]; 문헌 [Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877], 미국립 생물과학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information(NCB), 미국 메릴랜드주 베세다 소재)로부터 입수가능함); NCBI의 홈페이지: www.ncbi.nlm.nih.gov)이다. 이 프로그램들은 두 서열의 비교에 사용되는 수학 알고리즘의 바람직한 비제한적 예다. 그러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 통합된다. NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드 길이(wordlength) = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본 발명의 항-CD19 항체의 전체 또는 일부를 코딩하는 핵산 분자에 상동한 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동한 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭(gap)이 있는 정렬을 수득하기 위하여, 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 갭 BLAST를 이용할 수 있다. PSI-Blast를 또한 이용하여, 분자 사이에 원연 관계를 검출하는 반복 검색(iterated search)을 수행할 수 있다. BLAST, 갭 BLAST, PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우에, 개별 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
당업계에 공지된 서열 간의 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 프로그램의 다른 비제한적 예는 FASTA(문헌 [Pearson W.R. and Lipman DJ., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988](위스콘신 서열 분석 팩키지의 일부로 입수가능함)이다. 적절하게는, BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스(문헌 [Henikoff S. and Henikoff J.G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992])가 폴리펩티드 서열 비교에 사용되는데, 여기서 뉴클레오티드 서열은 먼저 비교 전에 상기 아미노산 서열로 번역된다.
아미노산 서열 사이에 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 당업계에 공지된 프로그램의 또 다른 비제한적 예는 SeqWeb 소프트웨어(GCG 위스콘신 팩키지에 대한 웹 기재 인터페이스: Gap 프로그램)인데, 이는 상기 프로그램의 디폴트 알고리즘과 파라미터 설정: blosum62, 갭 가중 8, 길이 가중 2로 이용된다.
두 서열 사이에 동일성 %는 갭을 허용하거나 허용하지 않는, 상기 기재된 것들과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 %를 계산함에 있어, 전형적으로 정확한 정합(match)이 계수된다.
바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 질의(query) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 %를 결정하는 데 프로그램 베스트피트(BESTFIT)가 사용되는데, 상기 질의 서열과 기준 서열은 최적으로 정렬되고 상기 프로그램의 파라미터는 디폴트 수치로 설정된다.
변경된 항체를 생성시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 종-의존성 항체의 하나 이상의 초가변 영역 내에 도입된다. 프레임워크 영역 잔기의 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환)도 또한 항-CD19 항체 내에 도입될 수 있는데, 여기서 이들은 두 번째 포유동물 종으로부터 항원에 대한 이러한 항체 변이체의 결합 친화성을 개선시킨다. 변형되는 프레임워크 영역 잔기의 예는 항원에 비-공유적으로 직접 결합하는 프레임워크 영역 잔기(문헌 [Amit et al., Science, 233:747-753(1986)]); CDR의 배열과 상호작용하거나 이에 영향을 주는 프레임워크 영역 잔기(문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917(1987)]); 및/또는 VL-VH 인터페이스(EP 239 400B1)에 참여하는 프레임워크 영역 잔기이다. 특정 실시양태에서, 그러한 하나 이상의 프레임워크 영역 잔기의 변형은 두 번째 포유동물 종으로부터 항원에 대한 이러한 항체 변이체의 결합 친화도를 개선시킨다. 예를 들어, 약 1 내지 5개의 프레임워크 잔기가 본 발명의 이 실시양태에서 변경될 수 있다. 경우에 따라, 이는 초가변 영역 잔기 중에서 어느 것도 변경되지 않은 경우에도 전임상 시험에서 이용하기 적합한 항체 변이체를 생성시키는 데 충분할 수 있다. 그러나, 정상적으로는 변경된 항체는 부가적인 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다.
변형되는 초가변 영역 잔기는 무작위로 바뀔 수 있는데, 특히 이 때 두 번째 포유동물 종으로부터 항원에 대한 항-CD19 항체의 출발 결합 친화도는 그러한 무작위로 생성된, 변경된 항체가 용이하게 스크리닝될 수 있도록 한다.
그러한 변경된 항체를 생성시키는 데 유용한 한 가지 절차는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)"(Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085(1989))이라 한다. 여기서, 하나 이상의 초가변 영역 잔기(들)는 아미노산과 두 번째 포유동물 종으로부터 항원의 상호작용에 영향을 주기 위하여 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기로 치환된다. 그 치환에 기능적 감수성을 나타내는 그 초가변 영역 잔기(들)는 이어서 치환 부위에 부가적이거나 다른 돌연변이를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이의 성격은 미리 결정될 필요가 없다. 이러한 식으로 생성된 Ala-돌연변이는 본원에 기재된 바와 같이 그것의 생물학적 활성에 대해 선별된다.
그러한 변경된 항체를 생성시키기 위한 또 다른 절차는 파지 표시를 이용한 친화도 성숙이다(문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896(1992)]; 문헌 [Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837(1991)]). 간략히, 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시키기 위하여 여러 개의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 돌연변이화된다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체는 각 입자 내에서 팩키징된 M13의 유전자 III 산물에 융합체로서 섬유성 파지 입자로부터 일가 방식으로 전시된다. 이들 파지-전시된 돌연변이체는 이후, 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)을 스크리닝한다.
항체 서열 내에서 돌연변이에는 치환, 내부 결실을 비롯한 결실, 융합 산물을 생성시키는 부가를 비롯한 부가, 또는 아미노산 서열 내에서 및/또는 아미노산 서열에 인접하여 "침묵" 변화(여기서, 변화는 기능적으로 균등한 항-CD19 항체를 생성시킴)를 초래하는 아미노산 잔기의 보존성 치환이 포함될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 관련되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친화도에서 유사성에 기초하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되며; 양으로 하전된(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함되고; 음으로 하전된(음성) 아미노산에는 아스파라긴산 및 글루타민산이 포함된다. 또한, 글리신과 프롤린은 사슬 방향(chain orientation)에 영향을 줄 수 있는 잔기이다. 비-보존성 치환은 이들 중에서 한 분류의 구성원을 다른 분류로의 교체에 관계할 것이다. 또한, 원하는 경우에, 비통상적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유도체가 치환 또는 부가로서 항체 서열 내에 도입될 수 있다. 비통상의 아미노산에는 통상적인 아미노산의 D-이성질체, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 변형을 위해 선택되는 부위는 파지 표시를 이용하여 친화도 성숙이다(상기 참조).
항체 서열 내에서 아미노산 치환(들)을 달성하거나, 조작을 더욱 용이하게 하기 위한 제한 부위를 발생/결실시킬 목적으로 DNA 서열 내에서 개별 뉴클레오티드를 변형하기 위하여 당업계에 공지된 임의의 돌연변이유발 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술에는 화학적 돌연변이유발, 시험관내 부위 직접 돌연변이유발(문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488(1985)]; 문헌 [Hutchinson, C. et al., J. Biol. Chem., 253:6551(1978)]), 올리고뉴클레오티드-직접 돌연변이유발(문헌 [Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463(1985)]; 문헌 [Hill et al., Methods Enzymol., 155:558-568(1987)]), PCR-기초 오버랩 신장(문헌 [Ho et al., Gene, 77:51-59(1989)]), PCR-기초 메가프라이머 돌연변이유발(문헌 [Sarkar et al., Biotechniques, 8:404-407(1990)]) 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 변형은 이중-가닥 디데옥시 DNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 융합 단백질, 즉 이종성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 융합된 항체 또는 단편을 생산하기 위하여 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체의 일부분에 융합된 단백질은 항체-지정 효소 프로드러그 요법(ADEPT)의 효소 성분이다. 항-CD19 항체와의 융합 단백질로서 조작될 수 있는 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 예에는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균 장독소(Staphylococcal enterotoxin)-A, 섬자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질, 젤로닌(gelonin), 디프테리아 독소(diphtherin toxin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 및 슈도모나스 내독소(Pseudomonas endotoxin)와 같은 독소가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Pastan et al., Cell, 47:641(1986)]; 문헌 [Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43(1994)]를 참조한다. 이용될 수 있는 효소 활성 독소와 그것의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, PAP-S), 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제물질, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토젤린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecene)이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
부가적 융합 단백질은 유전자-셔플링(gene-shuffling), 모티프-셔플링(motif-shuffling), 엑손-셔플링(exonshuffiing) 및/또는 코돈-셔플링(codon-shuffling)(집합적으로 "DNA 셔플링"으로 칭해짐)의 기법을 통하여 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 또는 그것의 단편(예를 들어, 더욱 높은 친화도 및 더욱 낮은 해리 속도를 보유하는 항체 또는 그것의 단편)의 활성을 변경하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 제5,837,458호; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33]; 문헌 [Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82]; 문헌 [Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol., 287:265-76]; 문헌 [Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313])(이들 특허 및 공보는 각기 전체적으로 본원에 참조 인용됨). 항체는 또한 미국 특허 공개 제20030118592호, 미국 특허 공개 제200330133939호, 및 PCT 공개 제WO 02/056910호(Ledbetter et al.)에 기재된 바와 같이 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다(이들 공보는 각각 전체적으로 본원에 참조 인용됨).
5.6. 도메인 항체
본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체는 도메인 항체, 예를 들어 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 상응하는, 항체의 소형 기능적 결합 단위를 보유하는 항체일 수 있다. 도메인 항체의 예에는 치료 표적에 특이적인, 도만티스 리미티드(Domantis Limited)(영국 캠브리지 소재)와 도만티스 인코포레이티드(Domantis Inc.)(미국 메사츄세츠주 캠브리지 소재)로부터 구입가능한 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다(예를 들어, WO04/058821; WO04/003019; 미국 특허 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,696,245호; 및 제6,593,081호 참조). 도메인 항체의 상업적으로 입수가능한 라이브러리는 항-CD19 도메인 항체를 동정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 CD19 기능적 결합 단위 및 Fc 감마 수용체 기능적 결합 단위를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-CD19 도메인 항체는 HB12A 또는 HB12B 단클론 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-CD19 도메인 항체는 HB12A 또는 HB12B 단클론 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 포함된 CDR의 임의의 조합과 함께 HB12A 또는 HB12B VH의 CDR3을 포함할 수 있다. 항-CD19 도메인 항체는 또한 HB12A 또는 HB12B 단클론 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 포함된 CDR의 임의의 조합과 함께 HB12A 또는 HB12B VK의 CDR3도 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-CD19 도메인 항체는 HB12A 또는 HB12B VH의 CDR3을 포함할 수 있다. 항-CD19 도메인 항체는 또한 HB12A 또는 HB12B VK의 CDR3을 포함할 수 있다.
5.7. 디아바디
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 "디아바디"이다. 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 내에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성이 허용되지 않는 링커를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)]에서 더욱 충분히 기재되어 있다.
5.8. 백시바디
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 백시바디이다. 백시바디는 이량체 폴리펩티드이다. 백시바디의 각 단량체는 힌지 영역 및 Cγ3 도메인을 통하여 두 번째 scFv에 연결된 APC 상에 표면 분자에 대한 특이성을 갖는 scFv로 구성된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, scFv의 항-CD19 항체 단편 중에서 하나를 포함하는 백시바디는 파괴되는 B 세포 및 ADCC를 매개하는 이펙터 세포를 병치하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Bogen et al.의 미국 특허 출원 공개 제20040253238호를 참조한다.
5.9. 선형 항체
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 선형 항체이다. 선형 항체는 한 쌍의 항원-결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬식 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062(1995)]를 참조한다.
5.10. 모 항체
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 모 항체이다. "모 항체"는 본원에 기재된 변형된 항체/돌연변이 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 내에서 또는 인접하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여되어 있거나 결핍될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 모 항체는 본원에 기재된 항체 변이체의 상응하는 초가변 영역보다 짧은 초가변 영역을 가질 수 있다. 모 폴리펩티드는 네이티브 항체 서열(즉, 천연 발생, 이는 천연 발생 대립형질 변이체 포함), 또는 천연 발생 서열의 선재 아미노산 변형(예를 들어, 다른 삽입, 결실 및/또는 치환)을 가지는 항체 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
5.11. 항체 단편
"항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 그것의 항원 결합이나 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
전형적으로 이들 단편은 본래 항체의 단백분해 절단을 통하여 유래되었다(예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117(1992)]; 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81(1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 언급된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. Fab'-SH 단편은 또한 E. 콜라이로부터 직접적으로 회수되고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌 [Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167(1992)]). 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택되는 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다. 예를 들어, WO 93/16185를 참조한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Fab 단편이 아니다.
5.12. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 B 세포 표면 마커의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 그러한 다른 항체는 첫 번째 B 세포 마커에 결합하고, 추가로 두 번째 B 세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 항-B 세포 마커 결합 팔(binding arm)은 또한 B 세포에 세포 방어 기전을 집중시키기 위하여, 백혈구 상에 촉발 분자(triggering molecule), 예를 들어 T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 팔과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 B 세포에 국소화하기 위해 사용될 수 있다. 이 항체는 B 세포 마커-결합 팔 및 세포독성제(예를 들어, 사포린(saporin), 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메톨라엑세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 팔을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab'): 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539(1983)]; 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)]; 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986)]; 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992)]; 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)]; 문헌 [Gruber et al, J. Immunol., 152:5368(1994)]; 미국 특허 제4,474,893호, 제4,714,681호, 제4,925,648호, 제5,573,920호, 제5,601,81호, 제95,731,168호, 제4,676,980호, 제4,676,980호; WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; 및 EP 03089 참조).
본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체가 이중특이적인 한 실시양태에서, 항-CD19 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있고, 인간 CD19 및 T 세포 상에 에피토프에 대한 특이성을 가질 수 있거나, 예를 들어 세포 사멸을 실행하는 단핵구/대식세포 및/또는 자연 살해 세포와 같은 인간 이펙터 세포에 결합할 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체인데, 여기서 상기 제1 항원은 인간 CD19이고, 상기 제2 항원은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIV로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 감마 수용체이다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 인간 CD19 및 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 인간 CD19 및 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다.
5.13. 변이 Fc 영역
본 발명은 변이 Fc 영역, 즉 비-천연 발생 Fc 영역, 예를 들어 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 단백질의 제형물을 제공한다. 또한, 본 발명의 변이 Fc 영역에는 아미노산 결실, 부가 및/또는 변형을 보유하는 Fc 영역이 포함된다.
본원에 사용되는 Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한 폴리펩티드를 포함함이 이해되어질 것이다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 또는 IgE와 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 이들 도메인의 N-말단에 유연성 힌지를 지칭한다. IgA와 IgM의 경우에, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우에, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2와 C감마3(Cγ2와 Cγ3) 및 C감마1(Cγ1)과 C감마2(Cγ2) 사이에 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계가 변화할 수 있으나, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 카르복시-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 한정되는데, 여기서 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA]에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. "카밧에 열거된 EU 인덱스"는 문헌 [Kabat et al., 이하 상기와 동일함]에 기재된 바와 같은, 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. Fc는 분리되거나, 또는 항체, 항체 단편 또는 FC 융합 단백질 내에서 상기 영역을 지칭할 수 있다. Fc 변이 단백질은 항체, Fc 융합체, 또는 Fc 영역을 포함하는 임의의 단백질이나 단백질 도메인일 수 있다. 특히, 변이 Fc 영역을 포함하는 단백질이 바람직한데, 이들은 Fc의 비-천연 발생 변이체이다. 카밧 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 비롯한 다수의 Fc 위치에서 다형성(polymorphism)이 관찰되었고, 따라서 제시된 서열과 종래 기술의 서열 사이에 약간의 차이가 존재할 수 있음을 주목한다.
본 발명은 비교 단백질(예를 들어, 야생형 Fc 영역을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 보유하는 단백질)과 비교하여 Fc 리간드(예를 들어, Fc 수용체, C1q)에 대한 변경된 결합 특성을 갖는 Fc 변이 단백질을 포함한다. 결합 성질의 예에는 결합 특이성, 평형 해리 상수(KD), 해리 속도 및 결합 속도(각기 Koff 및 Kon), 결합 친화도 및/또는 화합력이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로 낮은 KD를 갖는 결합 분자(예를 들어, 항체와 같은 Fc 변이 단백질)는 높은 KD를 갖는 결합 분자보다 바람직할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, kon 또는 koff의 수치가 KD의 수치보다 더욱 적절할 수도 있다. 당업자는 어떤 동력학적 파라미터가 소정의 항체 적용에 가장 중요한 지를 결정할 수 있다.
리간드에 대한 Fc 도메인의 친화도 및 결합 성질은 Fc-FcγR 상호작용, 즉 FcγR에 Fc 영역의 특이적인 결합을 측정하기 위한 당업계에 공지된 각종 시험관내 검정법(생화학적 또는 면역학적 기초 검정법), 예를 들어 평형 방법(예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정법(ELISA), 또는 방사선면역검정법(RIA)), 또는 반응 속도(예를 들어, 바이아코어
Figure 112009021231361-pct00007
분석) 및 간접적인 결합 검정법, 경쟁 억제 검정법), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 겔 전기영동, 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)를 비롯한 다른 방법으로 결정될 수 있다. 이들 방법 및 기타 방법들은 검사되는 하나 이상의 성분에서 표지를 이용하고/하거나 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 비롯한 각종 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화도와 반응 속도에 관한 상세한 설명은 항체-면역원 상호작용에 중점을 둔 문헌 [Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia(1999)]에서 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여, 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 증진된 결합을 가진다. 또 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 높은, Fc 리간드에 대한 친화도를 가진다. 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 Fc 수용체에 대한 증진된 결합을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 증진된 결합을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 증진된 결합을 가진다. 또 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 Fc 수용체 FcRn에 대한 증진된 결합을 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 C1q에 대한 증진된 결합을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 비변이 Fc 도메인과 비교하여 Fc 감마 수용체 IIB에 대한 증진된 결합 친화도를 가지는 변이 Fc 도메인을 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체는 비교 비변이 Fc 도메인에 대한 친화도보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 높은, Fc 감마 수용체 IIB에 대한 친화도를 가진다.
Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 혈청 반감기를 가진다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 이어서 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성의 한가지 형태를 지칭한다. 표적 세포의 표면을 지향하는 특이적인 고-친화도 IgG 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고 그러한 살해에 절대적으로 필요하다. 표적 세포의 용해는 세포외에서 진행되고, 직접적인 세포-세포 접촉을 필요로 하며, 보체가 관여하지 않는다. 항체 이외에, Fc 영역을 포함하는 다른 단백질, 구체적으로 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 Fc 융합 단백질이 세포-매개 세포독성을 달성할 수 있을 것으로 생각된다. 간략히 말하자면, Fc 융합 단백질의 활성에 기인하는 세포-매개 세포독성은 또한 본원에서 ADCC 활성으로 지칭된다.
ADCC로 표적 세포의 용해를 매개하는 임의의 특별한 Fc 변이 단백질의 능력을 검정할 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여, 목적하는 Fc 변이 단백질은 표적 세포의 세포용해를 유도하는 항원-항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 면역 이펙터 세포와 조합으로, 표적 세포에 부가된다. 세포용해는 일반적으로 용해된 세포로부터 표지(예를 들어, 방사성 물질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출된다. 그러한 검사에 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)와 자연 살해(NK) 세포이다. 시험관내 ADCC 검정법의 구체예는 문헌 [Wisecarver et al., 1985 79:277-282]; 문헌 [Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361]; 문헌 [Wilkinson et al., 2001, J. Immunol. Methods 258:183-191]; 문헌 [Patel et al., 1995 J. Immunol. Methods 184:29-38]에 기재되어 있다. 해당 Fc 변이 단백질의 ADCC 활성은 또한 예를 들어 문헌 [Clynes et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656]에 기재된 바와 같은 동물 모델 내에서 평가될 수도 있다.
한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 ADCC 활성을 가진다. 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 높은 ADCC 활성을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 결합 및 증진된 ADCC 활성을 가진다. 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 ADCC 활성 및 증진된 혈청 반감기 모두를 가진다.
한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 감소된 ADCC 활성을 가진다. 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 낮은 ADCC 활성을 가진다. 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 감소된 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 결합 및 감소된 ADCC 활성을 가진다. 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 감소된 ADCC 활성 및 증진된 혈청 반감기를 가진다.
"보체 의존성 세포독성"과 "CDC"는 보체의 존재에서 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 임의의 분자, 예를 들어 동계 항원과 복합된 항체에 대한 보체계(C1q)의 첫 번째 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기재된 CDC 검사가 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 CDC 활성을 가진다. 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 높은 CDC 활성을 가진다. 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 증진된 CDC 활성 및 증진된 혈청 반감기 모두를 가진다.
한 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자와 비교하여 감소된 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 결합을 가진다. 또 다른 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자의 Fc 리간드에 대한 친화도에 비해 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은 Fc 리간드에 대한 친화도를 가진다. 한 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 감소된 Fc 수용체에 대한 결합을 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 감소된 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 결합을 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 변이체는 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도에 비해 적어도 약 5배 더 적은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도를 가지는데, 여기서 상기 Fc 변이체는 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도의 약 2배 이내인 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도를 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 감소된 Fc 수용체 FcRn에 대한 결합을 가진다. 또 다른 특정 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 비교 분자에 비해 감소된 C1q에 대한 결합을 가진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 당업자에게 공지된 부가적 및/또는 대안적 위치에 비천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공보 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 및 WO 06/020114 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 제형물을 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 당업자에게 공지된 부가적 및/또는 대안적 위치에 비천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공보 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 및 WO 06/020114 참조).
한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 당업자에게 공지된 부가적 및/또는 대안적 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공보 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217 참조).
한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 변이 단백질을 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 당업자에게 공지된 부가적 및/또는 대안적 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; PCT 특허 공보 WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 및 WO 05/040217 참조).
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239, 330 및 332로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252, 254 및 256으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 부가적 비천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산, 및 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235F 및 331S 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235Y 및 331S 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 임의적으로 Fc 영역은 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252, 254 및 256으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 부가적 비천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산, 및 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239, 330 및 332로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252, 254 및 256로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 부가적 비천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하고, 하나 이상의 위치에 있는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다. 임의적으로 Fc 영역은 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252, 254 및 256으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 부가적 비천연 발생 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산을 포함하고, 하나 이상의 위치에 있는 적어도 하나의 비천연 발생 아미노산이 카밧에서 나와 있는 바와 같은 EU 인덱스에 의한 넘버링에 준해 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 변이 단백질 제형물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 문헌 [Ghetie et al., 1997, Nat . Biotech. 15:637-40]; 문헌 [Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564]; 문헌 [Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662]; 문헌 [Lund et al., 1992, Mol. Immunol. 29:53-59]; 문헌 [Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543]; 문헌 [Hutchins et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:11980-11984]; 문헌 [Jefferis et al., 1995, Immunol. Lett. 44:111-117]; 문헌 [Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119]; 문헌 [Jefferis et al., 1996, Immunol. Lett. 54:101-104]; 문헌 [Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-4969]; 문헌 [Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613-2624]; 문헌 [Idusogie et al., 2000, J. Immunol. 164:4178-4184]; 문헌 [Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933]; 문헌 [Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200:16-26]; 문헌 [Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575]; 문헌 [Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604]; 문헌 [Jefferis et al., 2002, Immunol. Lett. 82:57-65]; 문헌 [Presta et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490)]; 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; 및 WO 04/063351에 개시된 것들과 같은 다른 공지된 Fc 변이체와 조합될 수 있다. 또한, 본 발명에는 결실, 부가 및/또는 변형을 보유하는 Fc 영역이 포함된다. Fc 도메인의 다른 변형/치환/부가/결실이 당업자에게 자명할 것이다.
비-천연 발생 Fc 영역을 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실은 부위 직접 돌연변이유발(문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492(1985)]), PCR 돌연변이유발(뮨헌 [Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183(1990)]), 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis)(문헌 [Wells et al., Gene 34:315-323(1985)])을 비롯한 돌연변이유발 방법에 의해 달성될 수 있다. 적절하게는, 부위 직접 돌연변이유발은 오버랩-신장 PCR 방법(문헌 [Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70(1989)])에 의해 수행된다. 또한, 오버랩-신장 PCR 기술(Higuchi, ibid.)은 표적 서열(출발 DNA) 내로 원하는 돌연변이를 도입하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 오버랩-신장 방법에서 첫 번째 PCR은 외부 프라이머(프라이머 1)와 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3) 및 이와 별개로, 두 번째 외부 프라이머(프라이머 4)와 내부 프라이머(프라이머 2)로 표적 서열을 증폭하여 2개의 PCR 분절(분절 A와 B)을 생성시키는 과정을 수반한다. 내부 돌연변이유발 프라이머(프라이머 3)는 원하는 돌연변이를 열거하는 표적 서열에 부정합을 보유하도록 설계된다. 두 번째 PCR에서, 첫 번째 PCR의 산물(분절 A와 B)은 2가지 외부 프라이머(프라이머 1과 4)를 이용한 PCR로 증폭된다. 생성된 전장 PCR 분절(분절 C)은 제한 효소로 절단되고, 생성된 제한 단편은 적합한 벡터 내로 클로닝된다. 돌연변이유발의 첫 번째 단계로서, 출발 DNA(예를 들어, Fc 융합 단백질, 항체 또는 단순히, Fc 영역을 코딩)가 돌연변이유발 벡터 내로 작동가능하게 클로닝된다. 프라이머는 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 설계된다. 변이 Fc 영역의 생성에 사용되는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,277,375호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호 및 PCT 공보 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 참조).
일부 실시양태에서, Fc 변이 단백질은 하나 이상의 조작된 단백당형(glycoform), 즉 Fc 영역을 포함하는 분자에 공유 부착된 탄수화물 조성물을 포함한다. 조작된 단백당형은 이펙터 기능을 증진시키거나 감소시키는 것을 비롯하여 각종 목적에 유용할 수 있다. 조작된 단백당형은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로, 예를 들어 조작된 또는 변이 발현 균주를 이용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)과의 공동-발현에 의해, 각종 생물체 또는 각종 생물체로부터 세포주 내에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현함으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후에 탄수화물을 변화시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 단백당형을 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있는데, 여기에는 문헌 [Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180]; 문헌 [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; 문헌 [Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; 문헌 [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473, 미국 특허 제6,602,684호; 미국 특허 일련 번호 제10/277,370호; 미국 특허 일련 번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140Al; PCT WO 02/30954A1; 포틸레전트(Potillegent)™ 기술(바이오와 인코포레이티드(Biowa, Inc.), 미국 뉴저지주 프린스턴 소재); 글리코맙(GlycoMAb)™ 당화 조작 기술(glycosylation engineering technology)(글리카트 바이오테크놀로지 아게((GLYCART biotechnology AG), 스위스 쮜리히 소재))]에 기재된 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, WO 00061739; EA01229125; 미국 20030115614; 문헌 [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]를 참조한다.
본원에 기재된 Fc 변이체는 하기의 항체들이 포함되나, 이에 국한되지 않는 당업계에 기재된 임의의 항체로부터 발생되거나, 본원에 기재된 변이 Fc 영역이 상기 항체에 도입될 수 있는 것으로 고려된다: 항-플루오레신 단클론 항체, 4-4-20(문헌 [Kranz et al., 1982 J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995]), 인간화 항-TAG72 항체(CC49)(문헌 [Sha et al., 1994 Cancer Biother. 9(4): 341-9]), PCT 공개 제WO 04/014292호, 제WO 03/094859호 및 미국 특허 출원 일련 번호 제10/863,729호에 개시된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는 Eph 수용체에 특이적으로 결합하는 항체, LM609(Scripps), 쥐과 동물 단클론 LM609(PCT 공개 WO 89/015155 및 미국 특허 제5,753,230호)를 포함하나 이에 국한되지 않는 인테그린 αVβ3에 특이적으로 결합하는 항체; 인간화 단클론 항체 MEDI-522(a.k.a. 비탁신(VITAXIN)
Figure 112009021231361-pct00008
, 메드이뮨 인코포레이티드(Medimmune Inc.)(미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)]; 문헌 [Wu et al., 1998, PNAS USA 95(11): 6037-6042]; PCT 공개 WO 90/33919 및 WO 00/78815), WO/2005/05059106에 개시된 바와 같은 인터페론 알파에 대한 항체, WO/2006/059106에 개시된 바와 같은 인터페론 수용체 1에 대한 항체, 에르비툭스(Erbitux)™(IMC-C225로도 알려짐)(임클론 시스템즈 인코포레이티드(ImClone Systems Inc.)), EGFR에 대한 키메라화 단클론 항체; 전이 유방암을 앓는 환자의 치료를 위한 인간화 항-HER2 단클론 항체인 헤르셉틴
Figure 112009021231361-pct00009
(트라추주맙)(미국 캘리포니아주 제넨테크 소재); 응고 형성의 방지를 위한 혈소판 상의 항-당단백질 IIb/IIIa 수용체인 레오프로(REOPRO)
Figure 112009021231361-pct00010
(아브식시맙)(센토코르(Centocor)); 급성 신장 동종이식편 거부반응의 예방을 위한 면역억제성 인간화 항-CD25 단클론 항체인 제나팍스
Figure 112009021231361-pct00011
(다클리주맙)(로쉐 파마슈티칼즈(Roche Pharmaceuticals)(스위스). 다른 예는 인간화 항-CD18 F(ab')2(제넨테크); 인간화 항-CD18 F(ab')2인 CDP860(셀테크(Celltech)(영국 소재)); CD4와 융합된 항-HIV gp120 항체인 PRO542(프로제닉스(Progenics)/젠자임 트랜스제닉스(Genzyme Transgenics)); 항-CD14 항체인 C14(ICOS 팜(ICOS Pharm)); 인간화 항-VEGF IgG1 항체(제넨테크); 쥐과 동물 항-CA 125 항체인 오바렉스(OVAREX)™(알타렉스(Altarex)); 쥐과 동물 항-17-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체인 파노렉스(PANOREX)™(글락소 웰컴(Glaxo Wellcome)/센토코르); 키메라 항-EGFR IgG 항체인 IMC-C225(임클론 시스템); 인간화 항-αVβ3 인테그린 항체인 비탁신(VITAXIN)™(어플라이드 몰레큘러 에볼류션(Applied Molecular Evolution)/메드이뮨); 인간화 항-CD52 IgG1 항체인 캄파쓰 1H/LDP-03(류코사이트(Leukosite)); 인간화 항-CD33 IgG 항체인 스마트(Smart) M195(프로틴 디자인 랩(Protein Design Lab)/가네보(Kanebo)); 키메라 항-CD20 IgG1 항체인 리툭산™ (IDEC 팜(IDEC Pharm)/제넨테크, 로쉐(Roche)/제티야쿠(Zettyaku)); 인간화 항-CD22 IgG 항체인 림포사이드(LYMPHOCIDE)™(이뮤노메딕스(Immunomedics)); 인간화 항-HLA 항체인 스마트 ID10(프로틴 디자인 랩); 방사선표지 쥐과 동물 항-HLA DR 항체인 온콜림(ONCOLYM)™(림-1(Lym-1))(테크니클론(Techniclone)); 인간화 IgG1 항체인 항-CD11a(제넨테크/조마(Xoma)); 인간화 항-ICAM3 항체인 ICM3(ICOS 팜); 영장류화 항-CD80 항체인 IDEC-114(IDEC 팜/미츠비시(Mitsubishi)); 방사선표지 쥐과 동물 항-CD20 항체인 제발린(ZEVALIN)™(IDEC/쉐링 아게(Schering AG)); 인간화 항-CD40L 항체인 IDEC-131(IDEC/에이사이(Eisai)); 영장류화 항-CD4 항체인 IDEC-151(IDEC); 영장류화 항-CD23 항체인 IDEC-152(IDEC/세이카가쿠(Seikagaku)); 인간화 항-CD3 IgG인 스마트 항-CD3(프로틴 디자인 랩); 인간화 항-보체 인자 5(C5) 항체인 5Gl.1(알렉시온 팜(Alexion Pharm)); 영장류화 항-CD4 IgG1 항체인 IDEC-151(IDEC 팜/스미쓰클라인 비캄(SmithKline Beecham)); 인간 항-CD4 IgG 항체인 MDX-CD4(메다렉스/에이사이(Eisai)/젠맙(Genmab)); 인간화 항-TNF-α IgG4 항체인 CDP571(셀테크(Celltech)); 인간화 항-α4β7 항체인 LDP-02(류코사이트(LeukoSite)/제넨테크); 인간화 항-CD4 IgG 항체인 오르토클론 OKT4A(오르토 바이오테크(Ortho Biotech); 인간화 항-CD40L IgG 항체인 안토바(ANTOVA)™(바이오젠(Biogen)); 인간화 항-VLA-4 IgG 항체인 안테그렌(ANTEGREN)™(엘란(Elan)); 인간 항-CD64(FcγR) 항체인 MDX-33(메다렉스/센테온(Centeon)); 인간화 항-IgE IgG1 항체인 rhuMab-E25(제넨테크/노르바티스(Norvartis)/타녹스 바이오시스템(Tanox Biosystem)); 영장류화 항-CD23 항체인 IDEC-152(IDEC 팜); 쥐과 동물 항-CD-147 IgM 항체인 ABX-CBL(아비제닉스(Abgenix)); 래트 항-CD2 IgG 항체인 BTI-322(메드이뮨/바이오 트랜스플랜트(Bio Transplant)); 쥐과 동물 항-CD3 IgG2a 항체인 오르토클론/OKT3(오르토 바이오테크); 키메라 항-CD25 IgG1 항체인 시물렉트™(노바르티스 팜(Novartis Pharm)); 인간화 항-β2-인테그린 항체인 LDP-01(류코사이트(LeukoSite)); 쥐과 동물 항-CD18F(ab')2인 항-LFA-1(파스퇴르-메리욱스(Pasteur-Merieux)/이뮤노테크(Immunotech)); 인간 항-TGF-β2 항체인 CAT-152(캠브리지 Ab 테크(Cambridge Ab Tech)); 및 키메라 항-Factor VII 항체인 코르세빈(Corsevin) M(센토코르).
본원에 기재된 Fc 변이 영역을 포함할 수 있는 부가적 항체는 예를 들어, KS 1/4 부-암종 항원(문헌 [Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667]; 문헌 [Bumal, 1988, Hybridomal 7(4): 407-415]), 난소 암종 항원(CA125) (문헌 [Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2): 468-475]), 프로스탄산 인산염(문헌 [Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928]), 프로스테이트 특이적 항원(문헌 [Henttu 및 Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903-910]; 문헌 [Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230]), 흑색종-관련 항원 p97(문헌 [Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446]), 흑색종 항원 gp75(문헌 [Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380]), 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA)( 문헌 [Natali et al., 1987, Cancer 59: 55-63]; 문헌 [Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144]), 프로스테이트 특이적 막 항원, 암배아성 항원(CEA)( 문헌 [Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294]), 다형상피점액소 항원, 인간 유 지방구 항원, 결장직장 종양-관련 항원, 예컨대: CEA, TAG-72(문헌 [Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408]), CO17-1A(문헌 [Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53: 751-758]); GICA 19-9(문헌 [Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135]), CTA-1 및 LEA, 버키트 림프종 항원-38.13, CD19(문헌 [Ghetie et al., 1994, Blood 83: 1329-1336]), 인간 B-림프종 항원-CD20(문헌 [Reff et al., 1994, Blood 83:435-445]), CD33(문헌 [Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430]), 흑색종 특이적 항원, 예컨대 강글리오시드 GD2(문헌 [Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398]), 강글리오시드 GD3(문헌 [Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380]), 강글리오시드 GM2(문헌 [Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044]), 강글리오시드 GM3(문헌 [Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244-5250]), 종양-특이적 이식 형의 세포-표면 항원(TSTA), 예컨대 T-항원 DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원을 포함하는 바이러스 유도 종양 항원, 종양태아 항원-알파-페토단백질, 예컨대 결장, 방광 종양 종양태아 항원의 CEA(문헌 [Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188]), 분화 항원, 예컨대 인간 폐 암종 항원 L6, L20(문헌 [Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923], 섬유육종의 항원, 인간 백혈병 T 세포 항원-Gp37(문헌 [Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141: 1398-1403], 네오당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원, 예컨대 EGFR(내피 성장 인자 수용체), HER2 항원(p185HER2), 다형상피점액소(PEM)(문헌 [Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359]), 악성 인간 림프구 항원-APO-1(문헌 [Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304]), 분화 항원(문헌 [Feizi, 1985, Nature 314: 53-57]), 예컨대 태아 적혈구에서 발견되는 I 항원, 성인 적혈구에서 발견되는 일차 내배엽 I 항원, 착상전 배, 장 선암에서 발견되는 I(Ma), 유방 상피에서 발견되는 M18, M39, 골수성 세포에서 발견되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장직장 암에서 발견되는 D156-22, TRA-1-85(혈액 군 H), 고환 및 난소암에서 발견되는 SCP-1, 결장 선암에서 발견되는 C14, 폐 선암에서 발견되는 F3, 장암에서 발견되는 AH6, Y 합텐, 배아 암종 세포에서 발견되는 Ley, TL5(혈액 군 A), A431 세포에서 발견되는 EGF 수용체, 췌장암에서 발견되는 E1 계열(혈액 군 B), 배아 암종 세포에서 발견되는 FC10.2, 장 선암 항원, 선암에서 발견되는 CO-514(혈액 군 Lea), 선암에서 발견되는 NS-10, A431 세포의 EGF 수용체에서 발견되는 CO-43(혈액 군 Leb), 결장 선암에서 발견되는 G49, MH2(혈액 군 ALeb/Ley), 결장암에서 발견되는 19.9, 장암 점액, 골수성 세포에서 발견되는 T5A7, 흑색종에서 발견되는 R24, 배아 암종 세포에서 발견되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 및 M1:22:25:8, 및 4 내지 8-세포 단계 배아에서 발견되는 SSEA-3 및 SSEA-4를 포함하나 이에 국한되지 않는 암 또는 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 피부 T 세포 림프종으로부터의 T 세포 수용체 유래 펩티드이다(문헌 [Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62] 참조).
본원에 기재된 Fc 변이체가 임의의 항체로부터 발생되거나, 본원에 기재된 변이 Fc 영역이 임의의 항체에 도입될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 변이 Fc 영역을 이용하여, Fc 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 따라서, 실질적으로 임의의 분자는 하기 목록의 단백질 및 하위단위를 포함하나 이에 국한되지 않는, 본원에 기재된 Fc 변이체, 도메인, 모티프 및 하기 목록의 단백질에 속하는 에피토프를 포함하는 항체 및/또는 Fc 융합 단백질에 의해 표적화되고/되거나 그것에 도입될 수 있다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루칸; 응고 인자, 예컨대 인자 VII, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자(TF) 및 폰 빌레브란트(von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 플라스미노겐 활성화제(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 용혈성 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 무엘리언-억제 물질; 렉사신(relaxin) A-사슬; 렉사신 B-사슬; 프로렉사신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 악틴; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자, 예를 들어 EGFR, VEGFR에 대한 수용체; 인터페론, 예컨대 알파 인터페론(α-IFN), 베타 인터페론(β- IFN) 및 감마 인터페론 (γ-IFN); 인터페론 수용체 성분, 예컨대 인터페론 수용체 1; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골 유래 신경영양성 인자(BDNF), 신경영양인자-3,-4,-5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자; 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및βFGF; 내피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 또는 TGF-5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 및 CD147; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및-감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-13; TNFα, HMGB1; HMGB2; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부, 예를 들어 gp120; 수송 단백질; 호밍 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 세포 접착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac 1, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 및 VCAM, a4/p7 인테그린, 및 a 또는 그것의 서브유닛, 인테그린 알파 서브유닛, 예컨대 CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, 알파7, 알파8, 알파9, 알파D, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, 알파IIb, 알파IELb; 인테그린 베타 서브유닛, 예컨대, CD29, CD18, CD61, CD104, 베타5, 베타6, 베타7 및 베타8; αVβ3, αVβ5 및 α4β7을 포함하나, 이에 국한되지 않는 인테그린 서브유닛을 유도하는 Xv/p3 인테그린; 아포프토시스 경로의 구성원; IgE; 혈액 군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C; 키타나제 또는 키타나제-유사 분자, 예컨대 YKL-40 및 AMCase; Eph 수용체, 예컨대 EphA2, EphA4, EphB2 등; 인간 백혈구 항원(HLA), 예컨대 HLA-DR; 보체 단백질, 예컨대 보체 수용체 CR1, C1Rq 및 기타 보체 인자, 예컨대 C3 및 C5; 당단백질 수용체, 예컨대 GpIbα, GPIIb/IIIa 및 CD200; 보조자극 분자, 예컨대 CD28/CTLA-4, ICOS/AILIM, PD-1.
본원에 기재된 변이 Fc 영역을 포함할 수 있는 부가적 분자는, ALK 수용체(다기능인자(pleiotrophin) 수용체), 다기능인자, KS 1/4 부-암종 항원; 난소 암종 항원(CA125); 프로스탄산 인산염; 프로스테이트 특이적 항원(PSA); 흑색종-관련 항원 p97; 흑색종 항원 gp75; 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA); 프로스테이트 특이적 막 항원; 암배아성 항원(CEA); 다형상피점액소 항원; 인간 유 지방구 항원; 결장직장 종양-관련 항원, 예컨대: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA; 버키트 림프종 항원-38.13; CD19; 인간 B-림프종 항원-CD20; CD33; 흑색종 특이적 항원, 예컨대 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2 및 강글리오시드 GM3; 종양-특이적 이식 유형 세포-표면 항원(TSTA); 바이러스-유도 종양 항원 결합 T-항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원; 종양태아 항원-알파-페토단백질, 예컨대 결장의 CEA, 5T4 종양태아 영양세포 당단백질 및 방광 종양 종양태아 항원; 분화 항원, 예컨대 인간 폐 암종 항원 L6 및 L20; 섬유육종의 항원; 인간 백혈병 T 세포 항원-Gp37; 네오당단백질; 스핑고지질; 유방암 항원, 예컨대 EGFR(내피 성장 인자 수용체); NY-BR-16; NY-BR-16 및 HER2 항원(p185HER2);다형상피점액소(PEM; 성 인간 림프구 항원-APO-1; 분화 항원, 예컨대 태아 적혈구에서 발견되는 I 항원, 성인 적혈구에서 발견되는 일차 내배엽 I 항원; 착상전 배, 장 선암에서 발견되는 I(Ma); 유방 상피에서 발견되는 M18, M39; 골수성 세포에서 발견되는 SSEA-1; VEP8, VEP9; MyI; VIM-D5; 결장직장 암에서 발견되는 D156-22, TRA-1-85(혈액 군 H), 결장 선암에서 발견되는 C14; 폐 선암에서 발견되는 F3; 장암에서 발견되는 AH6; Y 합텐;배아 암종 세포에서 발견되는 Ley; TL5(혈액 군 A); A431 세포에서 발견되는 EGF 수용체; 췌장암에서 발견되는 E1 계열(혈액 군 B); 배아 암종 세포에서 발견되는 FC 10.2; 장 선암 항원; 선암에서 발견되는 CO-514(혈액 군 Lea); 선암에서 발견되는 NS-10; A431 세포의 EGF 수용체에서 발견되는 CO-43(혈액 군 Leb); 결장 선암에서 발견되는 G49, MH2(혈액 군 ALeb/Ley); 결장암에서 발견되는 19.9; 장암 점액; 골수성 세포에서 발견되는 T5A7; 흑색종에서 발견되는 R24; 배아 암종 세포에서 발견되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 및 M1:22:25:8, 및 4 내지 8-세포 단계 배아에서 발견되는 SSEA-3 및 SSEA-4; 피부 T 세포 림프종 항원; MART-1 항원; 시알릴(Sialy) Tn(STn) 항원; 결장 암 항원 NY-CO-45; 폐 암 항원 NY-LU-12 변이체 A; 선암 항원 ART1; 부종양성 관련 뇌-고환-암 항원(종양신경 항원 MA2; 부종양성 뉴런 항원); 신경-종양 배쪽 항원 2(NOV A2); 간세포성 암종 항원 유전자 520; 종양-관련 항원 CO-029; 종양-관련 항원 MAGE-C1(암/고환 항원 CT7), MAGE-B1(MAGE-XP 항원), MAGE-B2(DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b 및 MAGE-X2; 암-고환 항원(NY-EOS-1); YKL-40 및 상기 열거된 폴리펩티드들 중 임의의 것의 단편을 포함하나 이에 국한되지 않는, 암 항원에 특이적으로 결합하는 것들이다.
5.14. 항체의 당화(glycosylation)
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체의 당화가 변형된다. 예를 들어, 비당화 항체가 만들어질 수 있다(즉, 상기 항체는 당화가 부재함). 당화는 예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위하여 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내에서 하나 이상의 당화 부위를 변형함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 당화 부위를 제거하여 상기 부위에서 당화를 배제하는 하나 이상의 아미노산 치환이 달성될 수 있다. 그러한 비당화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에서 더욱 상세하게 기재되어 있다. Fc 영역 내에 존재하는 당화 부위(예를 들어, IgG의 아스파라긴 297)를 제거하는 하나 이상의 아미노산이 또한 만들어질 수 있다. 또한, 비당화 항체는 필요한 당화 기구(glycosylation machinery)가 부재하는 세균 세포 내에서 생산될 수도 있다.
변경된 유형의 당화를 갖는 항체, 예를 들어 감소된 양의 푸코실 잔기를 보유하는 하이포푸코실화 항체 또는 증가된 이등분(bisecting) GIcNAc 구조를 보유하는 항체가 제조될 수 있다. 그러한 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 당화 기구를 보유하는 숙주 세포 내에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 당화 기구를 보유하는 세포는 기존 문헌에 기재되었고, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변형된 당화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]; 문헌 [Umana et al.(1999) Nat. Biotech. 17:176-1]; 및 미국 특허 제US6,946,292호; 유럽 특허 제EP 1,176,195호; PCT 공보 WO 03/035835; 및 WO 99/54342(이들은 각기 전체적으로 본원에 참조 인용됨)를 참조한다.
5.15. 이펙터 기능 조작
예를 들어 B 세포 악성 종양을 치료함에 있어서 항체의 효능을 증진시키기 위해, 본 발명의 항-CD19 항체를 항체의 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역 내에 도입될 수 있고 이로써 이 영역 내에 사슬간 디설피드가 형성되게 된다. 이렇게 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 능력(internalization capability) 및 증가된 보체-매개 세포 살해 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195(1992)] 및 문헌 [Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922(1992)]를 참조한다. 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565(1993)]에 기재된 바와 같이, 이종이중성 가교-결합제 역시 이용하여, 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체를 제조할 수도 있다. 이중 Fc 영역을 가지고, 이로써 증진된 보체 용해(complement lysis)와 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 또한 조작될 수 있다. 예를 들어,문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230(1989)]를 참조한다.
이펙터 기능을 변경하기 위해 항체의 Fc 영역을 조작하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, FCγRIIA에 대한 결합 친화도에 비하여 FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 증진시키기 위한 Fc 영역의 변경을 기재하고 있는 미국 특허 공보 제20040185045호 및 PCT 공보 제WO 2004/016750호(Koenig et al.)를 참조하고; 또한 PCT 공보 제WO 99/58572호(Armour et al.), 제WO 99/51642호(Idusogie et al.), 미국 특허 제6,395,272호(Deo et al.)(이들 개시 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)를 참조한다. FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 감소시키기 위하여 Fc 영역을 변형하는 방법도 역시 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 공보 제20010036459호 및 PCT 공보 제WO 01/79299호(양 특허 모두 Ravetch et al. 출원). 야생형 Fc 영역에 비하여 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대하여 증진된 결합 친화도를 갖는 변이 Fc 영역을 포함하는 변형된 항체도 역시 기재되었다(예를 들어, PCT 공보 제WO 2004/063351호(Stavenhagen et al.)(이의 개시 내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)).
당업계에 공지된 시험관내 검정법을 이용하여, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체가 ADCC, 예컨대 본원에 기재된 것들을 매개할 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다.
5.16. 항-CD19 항체의 제조/생산
일단 원하는 항-CD19 항체가 조작되면, 그러한 항-CD19 항체는 항체의 대규모 제조를 위한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상업적 규모로 생산될 수 있다. 예를 들어, 이는 비제한적으로 이하 기재되는 것들과 같은 재조합 발현 시스템을 이용하여 달성될 수 있다.
5.17. 재조합 발현 시스템
항체 또는 그것의 변이체의 재조합 발현은 일반적으로 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 작제를 필요로 한다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그것의 일부분(바람직하게는, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 보유)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 상기 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 당업계에 공지된 기술을 이용한 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,331,415호 참조). 따라서, 항체 코딩 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 항체 코딩 서열 및 적합한 전사와 번역 제어 신호를 보유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법에는 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 분자; 항체의 중쇄 또는 경쇄; 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 그것의 일부분; 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능 벡터를 제시한다. 그러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역(국제 공보 제WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄의 발현을 위하여 상기 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체는 항-CD19 항체의 전체 또는 일부를 생성시키는 표적화된 상동성 재조합을 이용하여 제조될 수 있다(미국 특허 제6,063,630호, 제6,187,305호, 제6,692,737호 참조). 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 항-CD19 항체의 전체 또는 일부를 생성시키는 무작위 재조합 기법을 이용하여 만들어질 수 있다(미국 특허 제6,361,972호, 제6,524,818호, 제6,541,221호, 제6,623,958호 참조). 항-CD19 항체는 또한 Cre-매개 부위-특이적 상동성 재조합을 이용하여, 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 세포의 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포 내에서 생산될 수도 있다(미국 특허 제6,091,001호 참조). 숙주 세포주는 인간, 또는 마우스 및 중국 햄스터를 포함하나 이에 국한되지 않는 비인간 종으로부터 유래될 수 있다. 인간 또는 인간 항체 생산이 요망되는 경우에, 숙주 세포는 인간 세포주여야 한다. 유리하게는, 이들 방법은 항체 분자를 영구적으로 발현하는 안정적인 세포주를 조작하기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터가 통상적 기법에 의해 숙주 세포에 전달되면, 형질감염된 세포는 이애 통상적인 기술에 의해 배양되어, 본 발명의 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명에는 이질성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편, 또는 그것의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그것의 일부분, 또는 본 발명의 단쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 숙주 세포가 포함된다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 코딩하는 벡터는 아래에 상세하게 기재된 바와 같이, 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위하여 숙주 세포 내에서 공동-발현될 수 있다.
항-CD19 항체의 조작 및 생성에 사용될 수 있는 본 발명의 항-CD19 항체 또는 그것의 일부를 발현하는데 각종 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다(미국 특허 제5,807,715호 참조). 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포는 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)로부터 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(문헌 [Foecking et al., Gene, 45:101(1986)]; 문헌 [Cockett et al., Bio/Technology, 8:2(1990)]). 또한, 삽입된 항체 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 특정한 방식으로 항체 유전자 산물을 변형시키고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이런 변형(예를 들어, 당화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포는 단백질과 유전자 산물의 번역후 처리와 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 가진다. 발현되는 항체 또는 그것의 일부분의 정확한 변형과 처리를 담보하기 위하여 적합한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위하여, 일차 전사체의 적합한 처리, 당화, 유전자 산물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 그러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(면역글로불린 사슬을 내인성으로 생산하지 않는 쥐과 동물 골수종 세포주), CRL7O3O, HsS78Bst 세포가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
한 실시양태에서, 인간 림프구를 영속화시킴으로써 발달된 인간 세포 세포주는 단클론 인간 항-CD19 항체를 재조합 방식으로 생산하는 데 이용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단클론 인간 항-CD19 항체를 재조합 방식으로 생산하기 위하여 인간 세포주 PER.C6.(크루셀(Crucell), 네덜란드 소재)이 이용될 수 있다
세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 항체 분자의 의도된 목적에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 그러한 항체가 다량으로 생산되는 경우에, 항-CD19 항체를 함유하는 약학적 조성물의 생성을 위하여, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물의 높은 수준의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터에는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO, 12:1791(1983))(여기서 항체 코딩 서열은 벡터 내에 개별적으로 lac Z 코딩 영역과 인 프레임(in frame)으로 결찰되어 융합 단백질을 생성하게 됨); pIN 벡터(문헌 [Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109(1985)]; 문헌 [Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509(1989)]) 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. pGEX 벡터도 역시 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로 그러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡수와 결합 및 이후, 유리 글루타티온의 존재에서 용리에 의해, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 부분(moiety)으로부터 방출될 수 있도록 트롬빈(thrombin) 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 보유하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다각체병(nuclear polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)는 외래 유전자를 발현하는 벡터로서 이용된다. 상기 바이러스는 담배나방(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 AcNPV 프로모터(예를 들어, 다각체 프로모터)의 제어 하에, 상기 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 다각체 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고 배치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우, 해당 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터와 3부분 리더 서열에 결찰된다. 이어서, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3) 내에 삽입은 감염된 숙주 내에서 생존하고 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래한다(예를 들어, 문헌 [Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359(1984)] 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위하여 특정 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이들 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한, 개시 코돈은 일반적으로 전체 삽입체의 번역을 담보하기 위하여 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임(reading frame)과 인-프레임에 위치해야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 각종 기원으로부터 유래될 수 있다. 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등의 포함에 의해 증진된다(예를 들어, 문헌 [Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)] 참조).
재조합 단백질의 장기적인 고-수율 생산을 위해 안정적 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 생성될 수 있다. 숙주 세포는 적합한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능 마커를 포함하는, 적절히 조작된 벡터로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 세포는 농축된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장할 수 있고, 이어서 선택 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 내에서 선택가능 마커는 이러한 선택에 내성을 부여하고 세포가 상기 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정적으로 통합하고 성장하여 좌위를 형성할 수 있도록 하는데, 상기 좌위는 세포주 내로 클로닝되고 확장될 수 있다. 항-CD19 항체를 코딩하는 플라스미드는 배양액 내 생산에 적합한 임의의 세포주 내로 유전자/cDNA를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(문헌 [Wigler et al., Cell, 11:223(1977)]), 하이폭산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 48:202(1992)]), 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Lowy et al., Cell, 22:8-17(1980)]) 유전자를 포함하나 이에 국한되지 않는 다수의 선택 시스템이 각각 tk-, hgprt- 또는 aprT- 세포에 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(문헌 [Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77:357(1980)]; 문헌 [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527(1981)]); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(문헌 [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072(1981)]); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(문헌 [Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95(1991)]; 문헌 [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596(1993)]; 문헌 [Mulligan, Science 260:926- 932(1993)]; 문헌 [Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217(1993)]; 문헌 [May, TIB TECH 11(5):155-215(1993)]); 및 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 내성을 부여하는 hygro(문헌 [Santerre et al., Gene, 30:147(1984)]). 재조합 DNA 기술의 당업계에 공지된 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하는 데 관례대로 적용될 수 있는데, 이들 방법은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993)]; 문헌 [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)]; 문헌 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY(1994)]; 및 문헌 [Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1](이들은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. Academic Press, New York(1987)] 참조). 이러한 벡터 시스템 발현 항체 내에서 마커가 증폭가능하면, 숙주 세포의 배양액 내에 존재하는 억제물질의 수준 증가는 마커 유전자의 사본수를 증가시킨다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되기 때문에, 항체의 생산 역시 증가한다(문헌 [Grouse et al., Mol. Cell. Biol., 3:257(1983)]). 항체 발현 수준은 활성 인공 전사 도메인의 형태로 주변 크로마틴(chromatin)을 개조하고 도입유전자 발현을 증진시키는 기술을 비롯하여 재조합 단백질 생산의 분야에서 통상적 지식을 가진 자에게 공지된 재조합 방법과 도구의 이용을 통하여 증폭될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터로 공동-형질감염될 수 있는데, 이 때 첫 번째 벡터는 중쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩하고 두 번째 벡터는 경쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩한다. 이들 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능 마커를 포함할 수 있다. 또한, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두 코딩하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수도 있다. 그러한 상황에서, 경쇄는 독성 유리 중쇄의 과잉을 피하기 위하여 중쇄 앞에 놓인다(문헌 [Proudfoot, Nature 322:562-65(1986)]; 문헌 [Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:2197(1980)]). 이들 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
항체가 재조합 발현에 의해 생산된 경우, 그것은 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히, 특이적인 항원 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 친화도, 크기 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편은 정제를 용이하게 하기 위하여 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
5.17.1. 항체 정제 및 단리
재조합 기술을 이용하는 경우에, 항체는 세포내에서 또는 세포질 공간 내에서 생산되거나, 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되면, 첫 번째 단계로서, 미립자 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167(1992)]에서는 E. 콜라이의 세포질 공간 내로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 기술한다. 요약하건대, 세포 덩어리는 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 페닐메틸술포닐플로라이드(PMSF)의 존재에서 대략 30분간 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거될 수 있다. 항체 변이체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이런 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로 상업적으로 구입가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 단위를 이용하여 먼저 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 임의의 전술한 단계에서 PMSF와 같은 프로테아제 억제물질이 포함될 수 있고, 우발성 오염물질의 성장을 예방하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 단독으로 또는 다른 정제 단계와 조합으로, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및/또는 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 A의 친화도 리간드로서 적합성은 항체 변이체 내에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종류와 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄로 구성되는 항체를 정제하는 데 이용될 수 있다(문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Methods, 62:1-13(1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입과 인간 γ3의 경우에 권장된다(문헌 [Guss et al., EMBO J., 5:15671575(1986)]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 처리 시간이 가능하다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX 수지(J.T. 베이커(J.T. Baker, 미국 뉴저지주 필스버그 소재))가 정제에 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파라긴산 칼럼) 상의 세파로스(SEPHAROSE) 크로마토그래피, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술도 역시 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 이후, 해당 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물은 대략 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충액을 이용하여, 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
5.18. 치료 항-CD19 항체
본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 B 세포 계통을 매개할 수 있는 인간 ADCC를 매개하는 인간 항체 또는 인간화 항체이거나, B 계통 세포 아포프토시스 및/또는 인간 ADCC를 매개하는 공지된 항-CD19 항체로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 키메라 항체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항-CD19 항체는 단클론 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입의 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 개체군에서 발견되는 임의의 IgG1 또는 IgG 3 대립형질일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 IgG2 또는 IgG4 인간 이소타입의 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 인간 개체군에서 발견되는 IgG2 또는 IgG4 대립형질일 수 있다.
그러한 항체는 상기 기재된 기술을 이용하여 생성될 수 있기는 하나, 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 쥐과 동물 항체 HB12A 및 HB12B 및 다른 상업적으로 구입가능한 항-CD19 항체는 키메라 또는 인간화 항체이거나, 또는 인간 항체로 제조될 수 있다.
예를 들어, 사용될 수 있는 공지된 항-CD19 항체에는 HD37(IgG1 카파)(다코(DAKO), 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재), BU12(문헌 [Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992)]), 4G7(IgG1)(문헌 [Meeker et al, Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter)]), J4.119(벡크만 코울터(Beckman Coulter), 독일 크레펠트 소재), B43(파밍젠(PharMingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SJ25C1(BD 파밍젠, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), FMC63(IgG2a)(문헌 [Zola et al, Immunol. Cell. Biol. 69(PT6): 411-22 (1991)]; 문헌 [Nicholson et al., Mol. Immunol, 34:1157-1165 (1997)]; 문헌 [Pietersz et al, Cancer Immunol. Immunotherapy, 41 :53-60 (1995))]), 89B(B4)(IgG1)(벡크만 코울터, 미국 플로리다주 마이애미 소재), 문헌 [Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250(1983)] 및/또는 HD237(IgG2b)(문헌 [Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989]; 및 문헌 [Pezzutto et al., J. Immunol., 138:2793-2799(1987)])이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 항체는 상기 기재된 것들과 같은 공지된 항체(예를 들어, IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입에 대한)의 이소타입 전환된 변이체이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 네이키드 항체(naked antibody), 면역접합체 또는 융합 단백질일 수 있다. 적절하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 상기 기재된 항-CD19 항체는 이들로 치료된 인간에서 B 세포와 순환 면역글로불린을 감소 또는 고갈시킬 수 있다. B 세포의 고갈은 순환 B 세포, 또는 골수, 비장, 장-관련 림프양 조직 및/또는 림프절과 같은 특정 조직 내에서 나타날 수 있다. 그러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식의 억제 및/또는 B 세포 사멸(예를 들어, 아포프토시스를 통한)의 유도와 같은 각종 기전을 통하여 달성될 수 있다. B 세포의 "고갈"이란 적어도 약 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의, 순환 B 세포 및/또는 특정 조직(들) 내 B 세포의 감소를 의미한다. 특정 실시양태에서, 거의 모든 검출가능 B 세포는 순환계 및/또는 특정 조직으로부터 고갈된다. 순환 면역글로불린(Ig)의 "고갈"은 적어도 약 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 감소를 의미한다. 특별한 실시양태에서, 거의 모든 검출가능 Ig는 순환계로부터 고갈된다.
5.18.1. 인간 CD19 결합에 대한 항체의 스크리닝
인간 CD19 항원에 결합하는 항체를 확인하기 위해 결합 검정법이 이용될 수 있다. 결합 검정법은 직접적인 결합 검정법 또는 경쟁-결합 검정법으로서 수행될 수 있다. 결합은 표준 ELISA 또는 표준 유세포분석법을 이용하여 검출될 수 있다. 직접 결합 검정법에서, 후보 항체는 인간 CD19 항원에 대한 결합이 검사된다. 특정 실시양태에서, 스크리닝 검정법은 두 번째 단계에서, 인간 CD19를 발현하는 B 세포의 세포 사멸 또는 아포프토시스를 유도하는 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 한편, 경쟁-결합 검정법은 공지되어 있는 항-CD19 항체 또는 인간 CD19에 결합하는 다른 화합물과 경쟁하는 후보 항체의 능력을 평가한다.
직접 결합 검정법에서, 인간 CD19 항원은 인간 CD19 항원에 후보 항체의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 후보 항체와 접촉된다. 결합은 용액 내에서 또는 고체 표면 상에서 일어날 수 있다. 후보 항체는 검출을 위하여 미리 표지되었을 수 있다. 임의의 검출가능 화합물은 발광, 형광, 또는 방사성 동위원소 또는 이를 보유하는 작용기, 또는 비-동위원소 표지, 예를 들어 이에 국한되는 것은 아니나, 효소 또는 염료와 같은 표지(labelling)를 위해 사용될 수 있다. 결합이 발생할 만큼 충분한 배양 기간 이후, 시약은 과량의 또는 비-특이적으로 결합된 항체를 제거하는 조건과 조작에 노출된다. 전형적으로 이는 적합한 완충액으로 세정하는 것을 수반한다. 최종적으로 CD19-항체 복합체의 존재를 검출한다.
경쟁-결합 검정법에서, 후보 항체는 인간 CD19 항원에 대한 공지되어 있는 항-CD19 항체(또는 다른 화합물)의 결합을 억제하거나 대체하는 능력을 평가한다. CD19의 표지된 공지의 결합제는 후보 항체와 혼합되어, 후보 항체가 추가되거나 이런 추가됨 없이, 이들 사이에 상호작용이 정상적으로 발생하는 조건 하에 놓일 수 있다. 인간 CD19에 결합하는 CD19의 표지된 공지의 결합제의 양은 후보 항체의 존재 또는 부재에서 결합된 양과 비교될 수 있다.
한 실시양태에서, 결합 검정법은 항체 항원 복합체 형성과 검출을 용이하게 하기 위해, 고체 표면 상에 고정된 하나 이상의 성분으로 수행된다. 각종 실시양태에서, 고체 지지체에는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 유리, 니트로셀룰로스, 덱스트란, 나일론, 폴리아크릴아미드 및 아가로스가 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 지지체 형태에는 비드, 막, 마이크로입자; 마이크로역가 평판, 시험관 또는 다른 반응 용기와 같은 반응 용기의 내부 표면이 포함될 수 있다. 인간 CD19, 또는 다른 성분의 고정화는 공유 또는 비-공유 부착을 통하여 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 부착은 간접적, 즉 부착된 항체를 통한 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 인간 CD19 항원 및 음성 대조군에 에피토프, 예를 들어 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)로 부착되고, 이에 따라 항-GST(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))와 같은 상업적으로 구입가능한 항체에 의해 고체 표면에 대한 부착이 매개될 수 있다.
예를 들어, 그러한 친화도 결합 검정법은 고체 지지체에 고정된 인간 CD19 항원을 이용하여 수행될 수 있다. 전형적으로 결합 반응의 비-고정된 성분, 본 발명의 경우에, 후보 항-CD19 항체는 검출이 가능하도록 표지된다. 발광, 발색, 형광, 또는 방사성 동위원소 또는 이를 보유하는 작용기, 비-동위원소 표지, 예를 들어 효소 또는 염료와 같은 각종 표지 방법이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 후보 항-CD19 항체는 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC, 시그마 케미칼즈(Sigma Chemicals), 미국 세인트루이스 소재)와 같은 형광단(fluorophore)으로 표지된다. 그러한 친화도 결합 검정법은 고체 표면 상에 고정화된 인간 CD19 항원을 이용하여 수행될 수 있다. 이어서 항-CD19 항체를 항원과 함께 항온 배양하여, 항체의 특이적 결합을 바이아코어 분석, ELISA, FMET 및 RIA 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는, 당업계에 공지된 방법에 의해 검출한다.
최종적으로 고체 표면에 남아있는 표지는 당업계에 공지된 임의의 검출 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 후보 항-CD19 항체가 형광단으로 표지될 경우, 형광분광광도계(fluorimeter)를 이용하여 복합체를 검출할 수 있다.
인간 CD19 항원은 인간 CD19 항원을 발현하는 비변형 세포, 또는 인간 CD19 항원을 포함하는 분리된 막의 형태로 결합 검사물에 첨가될 수 있다. 따라서, 인간 CD19 항원에 직접적인 결합은 후보 항-CD19 항체의 존재 및 부재 하에, 배양액 내 또는 동물 모델 내 비변형 세포에서 검정될 수 있다. 표지된 후보 항-CD19 항체는 인간 CD19 항원을 발현하는 세포, 또는 이런 세포로부터 수득된 가공되지 않은 추출물과 혼합되고, 후보 항-CD19 항체가 첨가될 수 있다. 단리된 막은 인간 CD19와 상호작용하는 후보 항-CD19 항체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 막을 이용한 전형적인 실험에서, 세포는 인간 CD19 항원을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 막은 표준 기술로 수거되고, 시험관내 결합 검정에 사용될 수 있다. 표지된 후보 항-CD19 항체(예를 들어, 형광 표지된 항체)는 막에 결합되고 비활성이 검사되고; 특이적인 결합은 과량의 표지되지 않은 (냉) 후보 항-CD19 항체의 존재에서 수행된 결합 측정과의 비교에 의해 결정된다. 가용성 인간 CD19 항원은 또한 재조합 방식으로 발현되어, 인간 CD19 항원에 결합하는 항체를 확인하는 비-세포 기초 검정에 사용될 수 있다. 재조합 방식으로 발현된 인간 CD19 폴리펩티드는 비-세포 기초 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 인간 CD19 항원의 하나 이상의 결합 부분에 상응하는 펩티드, 또는 인간 CD19 항원의 하나 이상의 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이 또한 인간 CD19 항원의 일부분에 결합하는 항체를 확인하는 비-세포 기초 측정 시스템에 사용될 수 있다. 비-세포 기초 검정법에서, 재조합 방식으로 발현된 인간 CD19는 당업자에게 공지되어 있는 수단에 의해, 시험관, 마이크로역가 웰 또는 칼럼과 같은 고형 기재에 부착된다(문헌 [Ausubel et al., 이하 상기와 동일함] 참조). 이어서, 이들 검사 항체는 인간 CD19 항원에 결합하는 능력이 검사된다.
결합 반응이 또한 용액에서 수행될 수 있다. 이 검정법에서, 표지된 성분은 용액 내에서 결합 상대(들)와 상호작용하게 된다. 표지된 성분과 그것의 결합 상대(들) 사이에 크기 차이가 분리를 가능하게 하면, 그러한 분리는 결합되지 않은 표지된 성분이 통과하나, 결합 상대(들) 또는 결합 상대(들)에 결합된 표지된 성분이 통과하지 못하는 세공을 보유하는 한외여과막을 통하여 결합 반응의 산물을 통과시킴으로써 달성될 수 있다. 분리는 또한 용액으로부터 표지된 성분의 결합 상대, 예를 들어 결합 상대에 대한 항체 등을 포획할 수 있는 임의의 시약을 이용하여 달성될 수도 있다.
한 실시양태에서, 예를 들어 파지 라이브러리는 고체 상, 예를 들어 플라스틱 비드에 연결된 정제된 인간 CD19 항원, 또는 그것의 유도체, 유사체, 단편, 또는 도메인을 포함하는 칼럼을 통하여 연속 파지 표시 라이브러리로부터 파지를 계대배양함으로써 스크리닝될 수 있다. 세정 완충액의 엄격도(stringency)를 변경시킴으로써, 인간 CD19 항원에 대한 높은 친화도를 갖는 펩티드를 발현하는 파지를 농축하는 것이 가능하다. 칼럼으로부터 분리된 파지는 클로닝되고, 친화도가 직접적으로 측정될 수 있다. 어떤 항체 및 이들의 아미노산 서열이 인간 CD19 항원에 대한 가장 강한 결합을 공여하는 지를 인지하는 경우에, 컴퓨터 모델을 이용하여 CD19 항원과 후보 항체 사이에 분자 접촉을 확인할 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, 고체 지지체는 마이크로역가 접시에 부착된 인간 CD19 항원을 포함하는 막이다. 예를 들어, 후보 항체는 마이크로역가 접시 내에 라이브러리 구성원의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양된 라이브러리 항체를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 인간 CD19에 결합하는 라이브러리 막이 회수된다. 그러한 방법은 일반적으로 문헌 [Parmley and Smith, 1988, Gene, 73:305-318]; 문헌 [Fowlkes et al., 1992, BioTechniques, 13:422-427]; PCT 공보 제WO94/18318호 및 이들 문헌에 언급된 참조문헌에 기재되어 있다. 인간 CD19 항원에 결합하는 것으로 확인된 항체는 상기 기재된 임의 유형의 항체 또는 변형체일 수 있다.
5.18.2. 인간 ADCC 이펙터 기능에 대한 항체의 스크리닝
혈청 내에서 긴 반감기와 같은 기능적 특성을 갖고 각종 이펙터 기능을 매개할 수 있어, 인간 IgG 분류의 항체가 본 발명의 특정 실시양태에 사용된다(문헌 [Monoclonal antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1(1995)]). 인간 IgG 분류 항체는 하기 4가지 하위부류, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 더욱 분류된다. IgG 분류 항체의 이펙터 기능으로서 ADCC 및 CDC에 대한 대다수의 연구가 수행되었는데, 인간 IgG 분류의 항체 중에서, IgG1 하위부류가 인간에서 가장 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는 것으로 기재되었다(문헌 [Chemical Immunology, 65, 88(1997)]).
인간 IgG1 하위부류 항체의 ADCC 활성 및 CDC 활성의 발현은 일반적으로 살해 세포, 자연 살해 세포 또는 활성화된 대식세포와 같은 이펙터 세포의 표면 상에 존재하는, 항체에 대한 수용체(이후, "FcγR"로 칭해짐)에 항체의 Fc 영역의 결합을 수반한다. 각종 보체 성분이 결합될 수 있다. 이러한 결합과 관련하여, 항체의 힌지 영역과 C 영역의 두 번째 도메인(이후, "Cγ2 도메인"으로 칭해짐) 내에서 여러 아미노산 잔기가 중요하고(문헌 [Eur. J. Immunol., 23, 1098(1993), Immunology, 86, 319(1995), Chemical Immunology, 65, 88(1997)]), Cγ2 도메인 내 당 사슬도 또한 중요한 것(문헌 [Chemical Immunology, 65, 88(1997)])으로 제안되었다.
항-CD19 항체는 항체의 이펙터 기능과 관련하여, 예를 들어 ADCC 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진시키기 위하여 변형될 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성된다. 이 영역 내에 사슬간 디설피드 형성을 위하여 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역 내에 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 개선된 내재화 능력 및 증가된 보체-매개 세포 살해 및 ADCC를 가질 수 있는 동종이량체성 항체가 생산될 수 있다(문헌 [Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195(1992)]; 및 문헌 [Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922(1992)]). 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체를 생성시키기 위하여 이종이중성 가교-결합제 역시 사용될 수 있다(문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565(1993)]). 항체는 증진된 보체 용해(complement lysis)와 ADCC 능력을 초래하는 2개 이상의 Fc 영역을 포함하도록 조작될 수 있다(문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, (3)219-230(1989)]).
이펙터 기능을 변화시키기 위하여 항체의 Fc 영역을 조작하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, FCγRIIA에 대한 결합 친화도에 비하여 FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 증진시키기 위한 Fc 영역의 변형을 기재하는 미국 특허 공보 제20040185045호 및 PCT 공보 제WO 2004/016750호(양자 모두 Koenig et al.)를 참조하고; 또한 PCT 공보 제WO 99/58572호(Armour et al.), 제WO 99/51642호(Idusogie et al.), 및 미국 특허 제6,395,272호(Deo et al.))(상기 공보의 개시내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)를 참조한다. FcγRIIB에 대한 결합 친화도를 감소시키기 위하여 Fc 영역을 변형하는 방법도 역시 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 공보 제20010036459호 및 PCT 공보 제WO 01/79299호(양자 모두 Ravetch et al.)(상기 공보의 개시내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨). 야생형 Fc 영역에 비하여 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 비해 증진된 결합 친화도를 갖는 변이 Fc 영역을 포함하는 변형된 항체도 역시 기재되었다(예를 들어, PCT 공보 제WO 2004/063351호(Stavenhagen et al.)(상기 공보의 개시내용은 전체적으로 본원에 참조 인용됨).
적어도 4가지 상이한 유형의 FcγR이 발견되었는데, 이들은 각각 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIV로 불린다. 인간에서, FcγRII와 FcγRIII은 각각 FcγRIIa와 FcγRIIb 및 FcγRIIIa와 FcγRIIIb로 더욱 분류된다. FcγR은 면역글로불린 대과에 속하는 막 단백질이고, FcγRII, FcγRIII, 및 FcγRIV는 2개의 면역글로불린-유사 도메인을 보유하는 세포외 영역을 포함하는 α 사슬이고, FcγRI는 구성 요소로서 3개의 면역글로불린-유사 도메인을 보유하는 세포외 영역을 가지는 α 사슬을 가지고, α 사슬은 IgG 결합 활성에 관여한다. 또한, FcγRI 및 FcγRIII은 α 사슬과 관련하여 신호 전달(signal transduction) 기능을 갖는 구성 요소로서 γ 사슬 또는 ζ 사슬을 가진다(문헌 [Annu. Rev. Immunol., 18, 709(2000)], 문헌 [Annu. Rev. Immunol., 19, 275 (2001)]). FcγRIV는 문헌 [Bruhns et al., Clin. Invest. Med., (Canada) 27:3D (2004)]에 기재되었다.
해당 항-CD19 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에서 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 활성 검정법을 이용할 수 있다. 검정법은 또한 상업적으로 입수가능한 키트, 예를 들어 사이톡스 96
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(프로메가)를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 검정법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포 및 NK 세포주가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 유전자도입 Fc 수용체(예를 들어 CD16)를 발현하는 NK 세포주 및 관련 신호전달 폴리펩티드(예를 들어 FCεRI-γ)가 또한 이펙터 세포로 작용할 수 있다(예를 들어 WO 2006/023148 A2(Campbell) 참조). 예를 들어, 보체 활성화 및/또는 ADCC에 의한 표적 세포의 용해를 매개하는 임의의 특정 항체의 능력을 평가할 수 있다. 해당 세포는 시험관내에서 성장되고 표지되고; 항체는 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 면역 세포; 즉 ADCC 반응에 관여하는 이펙터 세포와 조합하여 세포 배양액에 첨가된다. 항체는 또한 보체 활성화에 대해 시험될 수 있다. 어떠한 경우에서도, 표적 세포의 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지의 방출에 의해 검출된다. 표적 세포용해 정도는 또한 세포질 단백질(예를 들어 LDH)의 상등액으로의 방출을 검출함으로써 결정될 수 있다. 실제로, 항체는 보체 및/또는 면역 세포의 공급원으로서 환자의 자기 혈청을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 시험관내 검사에서 인간 ADCC를 매개할 수 있는 항체는 특정 환자의 치료에 사용될 수 있다. 해당 분자의 ADCC 활성을 생체내, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 게다가, 항체의 ADCC 수준 및 임의적으로 CDC 활성을 조절하는(즉, 증가 또는 감소시키는) 기법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호를 참조한다. 본 발명의 항체는 ADCC 및/또는 CDC을 유도할 수 있거나, 이러한 반응을 유도하는 능력을 갖도록 변형되었을 수 있다. ADCC 기능을 결정하는 검정법은 인간 ADCC 기능을 평가하는 인간 이펙터 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 검정법에는 또한 괴사 및/또는 아포프토시스 기작에 의해 세포 사멸을 유도, 매개, 증진 또는 차단하는 항체에 대해 스크리닝하도록 의도된 검정법들이 포함될 수 있다. 생육성 염료를 이용하는 검정법, 카스파제를 검출하고 분석하는 방법, 및 DNA 절단물을 측정하는 검정법을 포함한 상기 방법들을 이용하여, 해당 항-CD19 항체와 함께 시험관내 배양된 세포의 아포프토시스 활성을 평가할 수 있다.
예를 들어, 아넥신(Annexin) V 또는 TdT-매개 dUTP 닉-말단 표지화(TUNEL) 검정법을 문헌 [Decker et al., Blood (USA) 103:2718-2725(2004)]에 기재된 바대로 수행하여, 아포프토시스 활성을 검출할 수 있다. TUNEL 검정법은 해당 세포를 플루오레신-표지 Dutp와 함께 배양하여 DNA 가닥 절단물 내에 도입하는 것을 수반한다. 이어서, 세포를 유세포분석법에 의해 분석하도록 가공한다. 아넥신 V 검정법은 노출된 PS 분자를 특이적으로 인식하는 플루오레신-접합 아넥신 V를 이용하여 아포프토시스 세포의 원형질막의 외부측에 포스파티딜 세린(PS)의 출현을 검출한다. 이와 동시에, 요오드화프로피듐과 같은 생육성 염료를 사용하여, 후기 아포프토시스 세포를 배제할 수 있다. 세포를 표지된 아넥신 V로 염색하여, 유세포분석법에 의해 분석한다.
5.18.3. 면역접합체 및 융합 단백질
본 발명의 특정 측면에 따라, 치료제 또는 독소는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 키메라, 인간, 또는 인간화 항-CD19 항체에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 접합체는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 치료제 및 독소의 예에는 엔다이인(enediyne) 계통의 분자, 예를 들어 칼리케아마이신(calicheamicin)과 에스페라마이신(esperamicin)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 화학적 독소는 듀오카르마이신(duocarmycin)(예를 들어, 미국 특허 제5,703,080호 및 미국 특허 제4,923,990호 참조), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티넘, 에토포시드, 블레오마이신, 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 또한, 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레(도세탁셀), 부설판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신 및 에스페라마이신(미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란, 및 다른 관련된 질소 머스타드(nitrogen mustard)가 포함된다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 성장억제성, 세포독성 또는 면역억제성제제에 접합되는데, 여기서 세포독성제는 엔다이인, 렉시트롭신, 듀오카르마이신, 탁산, 퓨로마이신, 돌라스타틴, 마이탄시노이드 및 빈카 알카로이드로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정의 더욱 구체적인 실시양태에서, 세포독성제는 파클리탁셀, 도세탁셀, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 마이탄신, DM-1, 아우리스타틴 E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE(미국 특허 출원 제10/983,340호), 또는 네트롭신이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체-세포독성제 접합체의 세포독성제는 항-튜불린제이다. 특정 실시양태에서, 세포독성제는 빈카 알카로이드, 포도파일로톡신, 탁산, 바카틴 유도체, 크립토파이신, 마이탄시노이드, 콤프레스타틴 및 돌라스타틴으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 세포독성제는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노크렐빈, VP-16, 캄프토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 A, 에피틸론 B, 노코다졸, 코이키신, 콜시미드, 에스트라무스틴, 세마도틴, 디스코데르몰리드, 마이탄신, DM-1, AEFP, 아우리스타틴 E, AEB, AEVB, AEFP, MMAE 또는 엘레우테로빈이다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체는 링커를 통해 세포독성제에 접합되는데, 여기서 링커는 펩티드 링커이다. 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체는 링커를 통해 세포독성제에 접합되는데, 여기서 링커는 val-cit 링커, phe-lys 링커, 히드라존 링커, 또는 디설피드 링커이다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체-세포독성제 접합체의 항-CD19 항체는 링커를 통해 세포독성제에 접합되는데, 여기서 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해가능하다. 한 특정 실시양태에서, 링커는 5.0 미만의 pH에서 가수분해가능하다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체-세포독성제 접합체의 항-CD19 항체는 링커를 통해 세포독성제에 접합되는데, 여기서 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 한 특정 실시양태에서, 프로테아제는 리소좀 프로테아제이다. 다른 실시양태에서, 프로테아제는 특히 막-관련 프로테아제, 세포내 프로테아제, 또는 엔도좀 프로테아제이다.
본 발명의 면역접합체에 사용될 수 있는 다른 독소에는 유독성 렉틴(lectin); 식물성 독소, 예를 들어 리신, 아브린, 모데신, 보툴리나, 및 디프테리아 독소가 포함된다. 당연하게, 다양한 독소의 조합 역시 하나의 항체 분자에 결합되어 다양한 세포독성을 도모할 수 있다. 본 발명의 복합 요법에 적절하게 이용되는 독소의 예에는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균 장독소-A, 섬자리공 항-바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소가 포함된다. 예를들어, 문헌 [Pastan et al., Cell, 47:641 (1986)]; 문헌 [Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43(1994)]를 참조한다. 이용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그것의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
적합한 독소 및 화학요법제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995)] 및 문헌 [Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)]에서 기재되어 있다. 다른 적합한 독소 및/또는 화학요법제는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 진단 목적에 적합한 방사능 제제를 포함하거나 이에 접합된 항체(이의 항체 단편 또는 변이체 포함)를 포함한다. 적합한 방사능 물질의 예에는 요오드(121I, 123I, 125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(111In, 112In, 113mln, 115mln), 테크네튬(99Tc, 99mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh 및 97Ru가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
또한 본 발명의 항-CD19 항체(이의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성된 scFv 또는 기타 분자 포함)는 치료적 목적을 위해 이용되는 방사능 금속 이온에 결합되거나 접합될 수 있다. 적합한 방사능 이온의 예에는 알파-발광자, 예컨대 213Bi, 또는 기타 방사성 동위원소, 예컨대 103Pd, 135Xe, 131I, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 90Y, 117Tin, 186Re, 188Re 및 166Ho가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그것의 단편은 177Lu, 90Y, 166Ho 및 153Sm을 포함하나 이에 국한되지 않는 방사성금속 이온을 폴리펩티드에 킬레이트화하는 마크로시클릭 킬레이터에 부착된다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산(DOTA)이다. 다른 특정 실시양태에서, DOTA는 링커 분자를 통해 본 발명의 항체 또는 그것의 단편에 부착된다. DOTA를 폴리펩티드에 접합하는 데 유용한 링커 분자의 예가 당업계에 통상적으로 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [DeNardo et al., Clin caner Res 4(10):2483-90, 1998]; 문헌 [Peterson et al., Bioconjug Chem 10(4):553-7, 1999]; 및 문헌 [Zimmerman et al., Nucl Med Biol 26(8):943-50, 1999](이들은 전체적으로 본원에 참조 인용됨)을 참조한다.
본 발명의 항-CD19 항체는 또한 프로드러그(예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)를 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드러그-활성화 효소에 상기 항체를 접합시킴으로써 ADEPT에도 이용될 수 있다(예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조). ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는 프로드러그에 그러한 방식으로 작용하여 상기 프로드러그를 활성 세포독성 형태로 전환시키는 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소에는 인산염-함유 프로드러그를 유리 형태로 전환시키는 데 유용한 알칼리성 포스파타제; 황산염-함유 프로드러그를 유리 형태로 전환시키는 데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암제, 5-플루오로우라실로 전환시키는 데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 써몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제, 카텝신(예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 보유하는 프로드러그를 전환시키는 데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 당화된 프로드러그를 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제와 뉴라미니다제; α-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페녹시아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 당업계에서 "항체 효소(abzyme)"로도 또한 알려져 있는, 효소 활성을 갖는 항체가 본 발명의 프로드러그를 유리 활성 약물로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 항체-항체 효소 접합체는 B 세포 악성 종양을 앓는 인간의 요망되는 신체 일부로 항체 효소의 전달을 위하여 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 논의된 이종이중성 가교연결 시약의 이용과 같은 당업계에 공지된 기술로 항체에 공유 결합될 수 있다. 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 항-CD19 항체의 적어도 항원-결합 영역을 포함하는 융합 단백질이 또한 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)] 참조).
본 발명의 항-CD19 항체의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들은 적용가능한 경우, 항체의 화학적 합성에 의해, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항-CD19 항체의 다른 유형의 공유 변형은 상기 항체의 표적된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄, 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내에 도입된다.
시스테닐(cysteinyl) 잔기는 통상적으로 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 유사하게, 요오드-시약도 또한 사용될 수 있다. 또한, 시스테닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미다조일)프로피온산, 인산클로로아세틸, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드, 메틸 2-피리딜 디설피드, p-클로로머쿠리벤조에이트, 2-클로로머쿠리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응으로 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카보네이트와의 반응으로 유도체화되는데, 그 이유는 상기 제제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브로마이드도 또한 역시 유용하고; 반응은 pH 6.0에서 0.1 M 나트륨 카코딜레이트에서 수행될 수 있다.
리실 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 제제를 이용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 반전시키는 효과를 가진다. α-아미노-함유 잔기 및/또는 ε-아미노-함유 잔기를 유도체화시키는 데 적합한 다른 시약에는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르, 인산피리독살, 피리독살, 클로로보로하이드리드, 트리니트로벤젠설폰산, 0-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온 및 글리옥시레이트와의 트랜스아미나아제-촉매된 반응 등이 포함된다.
아르기닐 잔기는 하나 이상의 통상적인 시약, 특히 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린과의 반응으로 변형된다. 아르기닐 잔기의 유도체화는 일반적으로 구아니딘 작용기의 높은 pKa로 인하여 알칼리성 조건하에 수행되어야 한다. 또한, 이들 시약은 리신의 ε-아미노 기 및 아르기닌 엡실론-아미노 기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특정 변형은 특히 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응으로 티로실 잔기 내로 스펙트럼 표지를 도입하는 것과 관련하여 수행될 수 있다. 가장 통상적으로 N-아세틸이미디아졸 및 테트라니트로메탄은 각각 O-아세틸 티로실 잔기 및 3-니트로 유도체를 형성하는 데 이용된다. 티로실 잔기는 방사선면역검정법에 사용되는 표지된 단백질을 제조하기 위해 125I 또는 131I를 이용하여 요오드화된다.
카르복실 측기(아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드(R--N=C=N--R')과의 반응으로 임의적으로 변형되는데, 여기서 R 및 R'는 상이한 알킬 기, 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드이다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응으로 아스파라기닐과 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게, 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 전환된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범주 내에 속한다.
다른 변형에는 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화(문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화 등이 포함된다.
다른 유형의 공유 변형은 항체에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 결합시키는 과정에 관계한다. 이들 절차는 N- 또는 O-연결 당화를 위한 당화 능력을 갖는 숙주 세포 내에서 항체의 생산을 요하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용된 결합 양식(coupling mode)에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌과 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 설피드릴 기, 예를 들어 시스테인의 유리 설피드릴 기, (d) 유리 히드록실 기, 예를 들어 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실 기, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
5.19. 화학요법 복합법
다른 실시양태에서, 항-CD19 mAb는 하나 이상의 부가적 화학요법제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어 "CVB"(1.5 g/㎡ 시클로포스파미드, 200 내지 400 ㎎/㎡ 에토포시드, 및 150 내지 200 ㎎/㎡ 카르무스틴)가 본 발명의 복합 요법에 사용될 수 있다. CVB는 비-호지킨 림프종을 치료하는 데 이용되는 처방이다(문헌 [Patti et al., Eur. J. Haematol., 51:18 (1993)]). 다른 적합한 복합 화학요법 처방은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Freedman et al., "Non-Hodgkin's lymphomas", in Cancer Medicine, Volume 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds.), pp. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)]를 참조한다. 예시로서, 중간-등급 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 1세대 화학요법 처방에는 C-MOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카르바진 및 프레드니손)와 CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)가 포함된다. 유용한 2세대 화학요법 처방은 m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린)이고, 적합한 3세대 처방은 MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)이다. 다른 유용한 약물에는 페닐 부티레이트 및 브로스타틴-1이 포함된다.
본 발명에 따라, 암 또는 그것의 하나 이상의 증상은 하나 이상의 요법, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법 및/또는 생물학적 요법/면역요법의 투여와 조합하여, 항-CD19 mAb를 투여함으로써 예방, 치료, 관리 또는 경감될 수 있다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 안지오스타틴(플라스미노겐 단편); 항혈관신생 안티트롬빈 III; 안지오자임; ABT-627; 베이(Bay) 12-9566; 베네핀; 베바시주맙; BMS-275291; 연골-유래 억제제(CDI); CA1; CD59 보체 단편; CEP-7055; Col3; 콤브레타스타틴 A-4; 엔도스타틴(콜라겐 XVIII 단편); 피브로넥틴 단편; 그로-베타; 할로푸기논; 헤파리나제; 헤파린 헥사사카라이드 단편; HMV833; 인간 융모성선자극 호르몬(hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도성 단백질(IP-10); 인터류킨-12; 크링글(Kringle) 5(플라스미노겐 단편); 마리마스타트; 메탈로프로테나제 억제제(TIMP); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270(CGS 27023 A); MoAb IMC-IC11; 네오바스타트; NM-3; 판젬; PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 혈소판 인자-4(PF4); 프리노마스타트; 프로락틴 16kD 단편; 프로리페린-관련 단백질(PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드; 솔리마스타트; 스쿠알라민; SS 3304; SU 5416; SU 6668; SU11248; 테트라히드로코르티졸-S; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도마이드; 트롬보스폰딘-1(TSP-1); TNP-470; 형질전환 성장 인자-베타(TGF-b); 바큘로스타틴; 바소스타틴(칼레티쿨린 단편); ZD6126; ZD 6474; 파르네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI); 및 비스포스포네이트(예컨대, 이에 국한되는 것은 아니나 알렌드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트, 이반드로네이트, 파미드로네이트, 리세드로네이트, 틸루드로네이트 및 졸레드로네이트)를 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 이상의 혈관신생 길항제의 투여를 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 화학요법제 및 비화학요법 면역조절제를 포함하나 이에 국한되지 않는 면역조절제의 투여를 포함한다. 화학요법제의 비제한적 예에는 메토트렉세이트, 시클로스포린 A, 레플루노마이드, 시스플라틴, 이포스파미드, 탁산, 예컨대 탁솔 및 파클리탁솔, 토포이소머라제 I 억제제(예를 들어, CPT-11, 토포테칸, 9-AC 및 GG-211), 젬시타빈, 비노렐빈, 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 류코보린, 비노렐빈, 테모달, 사이토할라신 B, 그라미시딘 D, 에메타인, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀올 및 퓨로마이신 동종체, 및 사이톡산이 포함된다. 비화학요법 면역조절제의 예에는 항-T 세포 수용체 항체(예를 들어, 항-CD4 항체(예를 들어, cM-T412(베링거(Boeringer)), IDEC-CE9.1
Figure 112009021231361-pct00013
(IDEC 및 SKB), mAB 4162W94, 오르토클론 및 OKTcdr4a(얀센-실락(Janssen-Cilag)), 항-CD3 항체(예를 들어, 누비온(Nuvion)(프로덕트 디자인 랩스(Product Design Labs))), OKT3 (존슨 앤드 존슨(Johnson & Johnson)), 또는 리툭산(IDEC)), 항-CD5 항체(예를 들어, 항-CD5 리신-연결 면역접합체), 항-CD7 항체(예를 들어, CHH-380(노르바티스(Novartis)), 항-CD8 항체, 항-CD40 리간드 단클론 항체(예를 들어, IDEC-131 (IDEC)), 항-CD52 항체(예를 들어, 캄파쓰 1H(일렉스(Ilex))), 항-CD2 항체(예를 들어, MEDI-507(메드이뮨 인코포레이티드), 국제 공개 제WO 02/098370호 및 제WO 02/069904호), 항-CD11a 항체(예를 들어, 잔넬림(Xanelim)(제넨테크)) 및 항-B7 항체(예를 들어, IDEC-114) (IDEC)); 항-사이토카인 수용체 항체(예를 들어, 항-IFN 수용체 항체, 항-IL-2 수용체 항체(예를 들어, 제나팍스(프로틴 디자인 랩스(Protein Design Labs))), 항-IL-4 수용체 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-IL-10 수용체 항체 및 항-IL-12 수용체 항체), 항-사이토카인 항체(예를 들어, 항-IFN 항체, 항-TNF-α 항체, 항-IL-1β 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-8 항체(예를 들어, ABX-IL-8(아브제닉스(Abgenix))), 항-IL-12 항체 및 항-IL-23 항체)); CTLA4-면역글로불린; LFA-3TIP(바이오젠, 국제 공보 제WO 93/08656호 및 미국 특허 제6,162,432호); 가용성 사이토카인 수용체(예를 들어, TNF-α 수용체의 세포외 도메인 또는 그것의 단편, IL-1β 수용체의 세포외 도메인 또는 그것의 단편, 및 IL-6 수용체의 세포외 도메인 또는 그것의 단편); 사이토카인 또는 그것의 단편(예를 들어, 인터류킨(IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-23, TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ 및 GM-CSF); 및 항-사이토카인 항체(예를 들어, 항-IL-2 항체, 항-IL-4 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-10 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL-15 항체, 항-TNF-α 항체 및 항-IFN-γ 항체) 및 종양-관련 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 헤르셉틴(Herceptin)
Figure 112009021231361-pct00014
)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 면역조절제는 화학요법제 이외의 면역조절제이다. 다른 실시양태에서, 면역조절제는 사이토카인 또는 조혈제, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, TNF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, M-CSF, G-CSF, IL-3 또는 에리트로포이에틴 이외의 면역조절제이다. 또 다른 실시양태에서, 면역조절제는 화학요법제 및 사이토카인 또는 조혈 인자 외의 제제이다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 항-염증성 제제, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 스테로이드성 항-염증성 약물, 베타-작용자, 항콜린성 제제, 및 메틸 잔틴의 투여를 포함한다. NSAID의 예에는 아스피린, 이부프로펜, 셀렉코십(셀레브렉스(CELEBREX)™), 디클로페낙(볼타렌(VOLTAREN)™), 에토돌락(로딘(LODINE)™), 페노프로펜(날폰(NALFON)™), 인도메타신(인도신(INDOCIN)™), 케토랄락(토라돌(TORADOL)™), 옥사프로진(데이프로(DAYPRO)™), 나부멘톤(렐라펜(RELAFEN)™), 술린닥(클리노릴(CLINORIL)™), 톨멘틴(톨렉틴(TOLECTIN)™), 로페콕십(비옥스(VIOXX)™), 나프록센(알레브(ALEVE)™, 나프로신(NAPROSYN)™), 케토프로펜(악트론(ACTRON)™) 및 나부메톤(레라펜(RELAFEN)™)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 그러한 NSAID은 시클로옥시나제 효소(예를 들어, COX-1 및/또는 COX-2)를 억제함으로써 기능한다. 스테로이드성 항-염증성 약물의 예에는 글루코코르티코이드, 덱사메타존(데카드론(DECADRON)™), 코르티존, 히드로코르티존, 프레드니존(델타존(DELTASONE)™), 프레드니졸론, 트리암시놀론, 아주피딘 및 에이코사노이드, 예컨대 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 항바이러스제(예를 들어, 아만타딘, 리바비린, 리만타딘, 시클로비르, 파미시클로비르, 포스카르넷, 간시클로비르, 트리플루리딘, 비다라빈, 디다노신, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘, 인터페론), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(구명: 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 항-구토제(예를 들어, 알프라졸람, 덱사메토아존, 돔페리돈, 드로나비놀, 드로페리돌, 그라니세트론, 할로페리돌, 할로페리돌, 이오라제팜, 메틸프레드니졸론, 메토클로프라미드, 나빌론, 온단세트론, 프로클로페라진), 항-진균제(예를 들어, 암포테리신, 클로트리마졸, 에코나졸, 플루코나졸, 플루사이토신, 그리세오풀빈, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸 및 나이스타틴), 항-기생충제(예를 들어, 데히드로에메틴, 딜록사니드 푸로에이트, 에메틴, 메플로퀸, 멜라르소프롤, 메트로니다졸, 니푸르티목스, 파로모마이신, 펜타비딘, 펜타미딘 이세티오네이트, 프리마퀸, 퀴나크린, 퀴니딘) 또는 이들의 조합의 투여를 포함한다.
약학적 조성물 및 투약 형태 및 키트를 비롯한, 본 발명의 각종 실시양태에서 사용될 수 있는 항암제의 구체예에는 아시비신, 아크라루비신(aclarubicin), 염산아코다졸(acodazole hydrochloride), 아크로닌(acronine), 아도젤레신(adozelesin), 알데스루킨(aldesleukin), 알트레트아민(altretamine), 암보마이신(ambomycin), 아세트산아메탄트론(ametantrone acetate), 아미노글루테티미드, 암사크린(amsacrine), 아나스트로졸(anastrozole),안트라마이신(anthramycin),아스파라기나제(asparaginase), 아스펄린(asperlin), 아자시티딘(azacitidine), 아제테파(azetepa), 아조토마이신(azotomycin), 베티마스타트(batimastat), 벤조데파(benzodepa), 비칼루타미드, 염산비스안트렌(bisantrene hydrochloride), 비스나피드 디메실레이트(bisnafide dimesylate), 바이젤레신(bizelesin), 황산블레오마이신(bleomycin sulfate), 브레키나르 나트륨(brequinar sodium), 브로피리민(bropirimine), 부술판(busulfan), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼루스테론(calusterone), 카라세마이드(caracemide), 카르베타이머(carbetimer), 카르보플라틴, 카르무스틴, 염산카루비신(carubicin hydrochloride), 카르젤레신(carzelesin), 세데핀골(cedefingol), 클로암부실(chlorambucil), 시롤레마이신(cirolemycin), 시스플라틴, 클라드리빈(cladribine), 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate), 사이클로포스파미드, 시타라빈(cytarabine), 다카르바진, 닥티노마이신(dactinomycin), 염산다우노루비신(daunorubicin hydrochloride), 데카르바진(decarbazine), 데시타빈(decitabine), 덱소르마플라틴(dexormaplatin), 데자구아닌(dezaguanine), 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate), 디아지퀴온(diaziquone), 도세탁셀, 독소루비신, 염산독소루비신, 드롤옥시펜(droloxifene), 시트르산드롤옥시펜(droloxifene citrate), 프로피온산드로모스타놀론(dromostanolone propionate), 두아조마이신(duazomycin), 에다트렉스에이트(edatrexate), 염산에플로니틴(eflornithine hydrochloride), 엘사미트루신(elsamitrucin), 엔로플라틴(enloplatin), 엔프로메이트(enpromate), 에피프로피딘(epipropidine), 염산에피루비신, 에르부로졸, 염산에소루비신, 에스트라무스틴, 에스트라무스틴 인산염 나트륨, 에타니다졸(etanidazole), 에토포시드, 인산에토포시드, 에토프린(etoprine), 염산파드로졸(fadrozole hydrochloride), 파자라빈(fazarabine), 펜레티나이드(fenretinide), 플록수리딘(floxuridine), 인산플루다라딘(fludarabine phosphate), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루오로시타빈(flurocitabine), 포스퀴돈(fosquidone), 포스트리에신 나트륨(fostriecin sodium), 겜시타빈(gemcitabine), 염산겜시타빈(gemcitabine hydrochloride), 히드록시우레아(hydroxyurea), 염산이다루비신(idarubicin hydrochloride), 이포스파미드(ifosfamide), 일모포신(ilmofosine), 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-Ia, 인터페론 감마-Ib, 이프로플라틴(iproplatin), 염산이리노테칸, 아세트산란레오타이드(lanreotide acetate), 레트로졸(letrozole), 아세트산루프롤리드, 염산리아로졸(liarozole hydrochloride), 로메트렉솔 나트륨(lometrexol sodium), 로무스틴, 염산로속산트론 (losoxantrone hydrochloride), 마소프로콜(masoprocol), 메이탄신(maytansine), 염산메클로레타민(mechlorethamine hydrochloride), 아세트산메게스트롤(megestrol acetate), 아세트산멜렌게스트롤(melengestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 메노가릴(menogaril), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토트렉세이트 나트륨(methotrexate sodium), 메토프린(metoprine), 메트레데파(meturedepa), 미틴도마이드(mitindomide), 미토카르신(mitocarcin), 미토크로민(mitocromin), 미토길린(mitogillin), 미토말신(mitomalcin), 미토마이신, 미토스퍼(mitosper), 미토테인(mitotane), 염산미톡산트론(mitoxantrone hydrochloride), 미코페놀산(mycophenolic acid), 니트로소우레아(nitrosoureas), 노코다졸(nocodazole), 노갈라마이신(nogalamycin), 올마플라틴(ormaplatin), 옥시수란(oxisuran), 파클리탁셀, 페가스파르가제(pegaspargase), 펠리마이신(peliomycin), 펜타무스틴(pentamustine), 황산페플로마이신(peplomycin sulfate), 퍼포스파미드(perfosfamide), 피포브로만(pipobroman), 피포술판(piposulfan), 염산피록산트론(piroxantrone hydrochloride), 플리카마이신(plicamycin), 플로메스탄(plomestane), 포르피머 나트륨, 포르피로마이신(porfiromycin), 프레드니무스틴(prednimustine), 염산프로카르바진(procarbazine hydrochloride), 프로마이신(puromycin), 염산프로마이신(puromycin hydrochloride), 피라조퓨린(pyrazofurin), 리보프린(riboprine), 로글레티딘(rogletimide), 사핀골(safingol), 염산사핀골(safingol hydrochloride), 세무스틴(semustine), 심트라진(simtrazene), 스파르포세이트 나트륨(sparfosate sodium), 스파르소마이신(sparsomycin), 염산스피로게르마늄(spirogermanium hydrochloride), 스피로무스틴(spiromustine), 스피로플라틴(spiroplatin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 술로페너(sulofenur), 탈리소마이신(talisomycin), 테코갈란 나트륨(tecogalan sodium), 테가퍼(tegafur), 염산텔록산트론(teloxantrone hydrochloride), 테모포르핀(temoporfin), 테니포시드(teniposide), 테록시론(teroxirone), 테스톨락톤(testolactone), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 티아조퓨린(tiazofurin), 티라파자민(tirapazamine), 시트르산토레미펜(toremifene citrate), 아세트산트레스톨론(trestolone acetate), 인산트리시리빈(triciribine phosphate), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트리메트렉세이트 글루크로네이트(trimetrexate glucuronate), 트립토레린(triptorelin), 염산튜불로졸(tubulozole hydrochloride), 우라실 머스타드(uracil mustard), 유레데파(uredepa), 베프레오타이드(vapreotide), 베르테포르핀(verteporfin), 황산빈블라스틴, 황산빈크리스틴, 빈데신(vindesine), 황산빈데신(vindesine sulfate), 황산비네피딘(vinepidine sulfate), 황산빈글리시네이트(vinglycinate sulfate), 황산빈루로신(vinleurosine sulfate), 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate), 황산빈로시딘(vinrosidine sulfate), 황산빈졸리딘(vinzolidine sulfate), 보로졸(vorozole), 제니플라틴(zeniplatin), 지노스타틴(zinostatin), 염산조루비신(zorubicin hydrochloride)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 다른 항암 약물에는 20-에피-1,25 디히드록시 비타민 D3, 5-에티닐우라실(5-ethynyluracil), 아비라테론(abiraterone), 아클라루비신(aclarubicin), 아실풀베인(acylfulvene), 아데시페놀(adecypenol), 아도젤레신(adozelesin), 알데스루킨(aldesleukin), 모든-TK 길항제, 알트레트아민(altretamine), 암바무스틴(ambamustine), 아미독스(amidox), 아미포스틴(amifostine), 아미노루블린산(aminolevulinic acid), 암루비신(amrubicin), 암사크린(amsacrine), 아나그라이드(anagrelide), 아나트로졸(anastrozole), 안드로그라폴리드(andrographolide), 신생혈관생성억제제, 길항제 D, 길항제 G, 안타레릭스(antarelix), 항-배방화 형태형성 단백질-1, 항안드로젠제, 항에스트로겐, 항네오플라스톤, 아피디콜린 글리시네이트(aphidicolin glycinate), 아포프시스 유전자 조절자(apoptosis gene modulators), 아포프시스 조절자(apoptosis regulators), 아퓨린산(apurinic acid), ara-CDP-DL-PTBA, 아르기닌 디아미나제(arginine deaminase), 아술아크린(asulacrine), 아타메스탄(atamestane), 아트리무스틴(atrimustine), 악시나스타틴(axinastatin) 1, 악시나스타틴 2, 악시나스타틴 3, 아자세트론(azasetron), 아자톡신(azatoxin), 아자티로신(azatyrosine), 베카틴(baccatin) III 유도체, 발라놀(balanol), 바티마스타트(batimastat), BCR/ABL 길항제, 벤조콜린(benzochlorins), 벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine), 베타 락탐 유도체, 베타-알레틴(beta-alethine), 베타클라마이신(betaclamycin B), 베튤린산(betulinic acid), bFGF 억제제, 비칼루타미드, 비스안트렌(bisantrene), 비스아지리디닐스퍼민(bisaziridinylspermine), 비스나피드(bisnafide), 비스트라틴(bistratene A), 바이젤레신(bizelesin), 브레피에이트(brefiate), 브로피리민(bropirimine), 부도티탄(budotitane), 부티오닌 설폭시이민(buthionine sulfoximine), 칼시포트리올(calcipotriol), 칼포스틴 C5 캄포테신 유도체(calphostin C5 camptothecin derivatives), 카나리폭스(canarypox IL-2), 카페시타빈(capecitabine), 카르복스아미드-아미노-트리아졸(carboxamide-amino-triazole), 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), CaRest M3, CARN 700, 연골 유래 억제제, 카르젤레신(carzelesin), 카세인 키나제억제제(ICOS), 카스타노스퍼민(castanospermine), 세크로핀(cecropin B), 세트로렐릭스 (cetrorelix), 클로로퀴녹살린 설폰아미드(chloroquinoxaline sulfonamide), 시카프로스트(cicaprost), cis-포르피린(porphyrin), 클라드리빈(cladribine), 클로미펜 유사체(clomifene analogues), 클로트리마졸(clotrimazole), 콜리스마이신(collismycin) A, 콜리스마이신(collismycin) B, 콤브레타스틴(combretastatin) A4, 콤브레타스틴 유사체(combretastatin analogue), 코나게닌(conagenin), 크램베시딘(crambescidin 816), 크리스나톨(crisnatol), 크립토피신(cryptophycin) 8, 크립토피신(cryptophycin) A 유도체, 쿠라신(curacin) A, 시클로펜탄트라퀸논(cyclopentanthraquinones), 시클로플라탐(cycloplatam), 시페마이신(cypemycin), 시타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate), 세포용해 인자(cytolytic factor), 시트스타틴(cytostatin), 다클릭시맙(dacliximab), 데시타빈(decitabine), 디히드로디뎀닌 B(dehydrodidemnin B), 데슬로레린(deslorelin), 덱사메타손(dexamethasone), 덱시포스파미드(dexifosfamide), 데크라족산(dexrazoxane), 덱스베라파밀(dexverapamil), 디아지퀴온(diaziquone), 디뎀닌 B(didemnin B), 디독스(didox), 디에틸노르스퍼민(diethylnorspermine), 디히드로-5-아자시티딘(dihydro-5-azacytidine), 디히드로탁솔(dihydrotaxol), 디옥사마이신(dioxamycin), 디페닐 스피로무스틴(diphenyl spiromustine), 도세탁셀, 도코사놀(docosanol), 돌라세트론(dolasetron), 독시플루리딘(doxifluridine), 드록시펜(droloxifene), 드로나비놀(dronabinol), 듀오카마이신 SA(duocarmycin SA), 엡셀렌(ebselen), 에코무스틴(ecomustine), 에델포신(edelfosine), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에플로미틴(eflomithine), 엘레민(elemene), 에미테퍼(emitefur), 에피루비신, 에피리스테라이드(epristeride), 에스트라무스틴 유사체, 에스트로겐 제제, 에스트로겐 길항제, 에타니다졸(etanidazole), 인산에토포시드, 엑세메스탄(exemestane), 파드로졸(fadrozole), 파자라빈(fazarabine), 펜레티나이드(fenretinide), 필그라스팀(filgrastim), 피나스테리드(finasteride), 플라보피리돌(flavopiridol), 플레젤라스틴(flezelastine), 플루아스테론(fluasterone), 플루다라빈(fludarabine), 염산플루오로다우노루니신(fluorodaunorunicin hydrochloride), 포르페니멕스(forfenimex), 프로메스탄(formestane), 포스트리에신(fostriecin), 포테무스틴(fotemustine), 가도리늄 텍사피린(gadolinium texaphyrin), 갈륨 니트레이트(gallium nitrate), 갈로시타빈(galocitabine), 가니렐릭스(ganirelix), 겔라티나제 억제제, 겜시타빈(gemcitabine), 글루타티온 억제제, 헵설팜(hepsulfam), 헤레굴린(heregulin), 헥사메틸렌 비스아세트아미드(hexamethylene bisacetamide), 하이퍼리신(hypericin), 이반드론산(ibandronic acid), 이다루비신(idarubicin), 이독시펜(idoxifene), 이드라만톤(idramantone), 일모포신(ilmofosine), 일로마스태이트(ilomastat), 이미다조아크리돈(imidazoacridones), 이미퀴모드(imiquimod), 이뮤노스티뮬런트 펩티드(immunostimulant peptides), 인슐린-유사 성장인자-1 수용체 억제제, 인터페론 제제, 인터페론, 인터류킨, 이오벤구안, 아이오도 독소루비신, 이포메아놀(ipomeanol), 이로플락트(iroplact), 이어소글라딘(irsogladine), 이소벤가졸(isobengazole), 이소호모할리콘드린 B(isohomohalicondrin B), 이타세트론(itasetron), 자스플라키놀리드(jasplakinolide), 카할라이드 F(kahalalide F), 트리아세트산라멜라린-N(lamellarin-N triacetate), 란레오타이드(lanreotide), 레이나마이신(leinamycin), 레노그라스팀(lenograstim), 황산렌티난(lentinan sulfate), 렙톨스타틴(leptolstatin), 레트로졸(letrozole), 백혈병 억제 인자, 백혈병 알파 인터페론, 루프롤리드+에스트로겐+프로게스테론, 루프로레린(leuprorelin), 레바미솔, 리아로졸(liarozole), 선형 폴리아민 유사체(linear polyamine analogue), 친지질성 디사카라이드 펩티드(lipophilic disaccharide peptide), 친지질성 백금 화합물, 리속클린아미드 7(lissoclinamide 7), 로바플라틴(lobaplatin), 롬브리신(lombricine), 로메트렉솔(lometrexol), 로니다민(lonidamine), 로속산트론(losoxantrone); HMG-CoA 리덕타제 억제제(예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 로바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 스타틴, 심바스타틴 및 아토르바스타틴); 록소리빈(loxoribine), 루토테칸(lurtotecan), 루테튬 텍사피린(lutetium texaphyrin), 리소필린(lysofylline), 용균 펩티드(lytic peptides), 메이탄신(maitansine), 마노스타틴 A(mannostatin A), 마리마스타트(marimastat), 마소프로콜(masoprocol), 마스핀(maspin), 마트릴리신(matrilysin) 억제제, 기질 금속단백분해효소 억제제, 메노가릴(menogaril), 메르바론(merbarone), 메테렐린(meterelin), 메티오나제(methioninase), 메토클로프라미드(metoclopramide), MIF 억제제, 미페프리스톤(mifepristone), 밀테포신(miltefosine), 미리모스팀(mirimostim), 부정합 이중 가닥 RNA, 미토구아존(mitoguazone), 미토락톨(mitolactol), 미토마이신 유사체, 미토나피드(mitonafide), 미토톡신 피브로블라스트 성장인자-사포린, 미톡산트론(mitoxantrone), 모파로텐(mofarotene), 몰그라모스팀(molgramostim), 모노클로날 항체, 인간 만성 고나도트로핀, 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포벽 sk, 모피다몰(mopidamol), 다중 약물 내성 유전자 억제제, 다중 종양 서프레서 1-기재 요법, 머스타드 항암제, 미카퍼록시드 B(mycaperoxide B), 미코박테리아 세포벽 추출물, 미리아포론(myriaporone), N-아세틸디날린, N-치환 벤즈아미드, 나파렐린(nafarelin), 나그레스팁(nagrestip), 날록손 + 펜타조신, 나파빈(napavin), 나프테르핀(naphterpin), 나르토그라스팀(nartograstim), 네다플라틴(nedaplatin), 네모루비신(nemorubicin), 네리드론산(neridronic acid), 중성 엔도펩티드(neutral endopeptidase), 니루타미드, 니사마이신(nisamycin), 산화질산 조절제, 니트록시드 항산화제(nitroxide antioxidant), 니트룰린(nitrullyn), O6-벤질구아닌, 옥트레오티드(octreotide), 오키세논(okicenone), (올리고뉴클레오티드), 오나프리스톤(onapristone), 온단세트론(ondansetron), (ondansetron), 오라신(oracin), 경구 사이토카인 유도제(oral cytokine inducer), 올마플라틴(ormaplatin), 오사테론(osaterone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 옥사우노마이신(oxaunomycin), 파클리탁셀, 파클리탁셀 유사체, 파클리탁셀 유도체, 팔라우아민(palauamine), 팔미토일리족신(palmitoylrhizoxin), 파미드론산(pamidronic acid), 파낙시트리올(panaxytriol), 파노미펜(panomifene), 파라벡틴(parabactin), 파젤립틴(pazelliptine), 페가스파르가제(pegaspargase), 펠데신(peldesine), 펜도산 폴리설페이트 나트륨(pentosan polysulfate sodium), 펜토스타틴(pentostatin), 펜트로졸(pentrozole), 퍼플루브론(perflubron), 퍼포스파미드(perfosfamide), 페릴릴 알콜(perillyl alcohol), 페나진마이신(phenazinomycin), 페닐아세테이트(phenylacetate), 인산염 억제제, 피키바닐(picibanil), 염산필로카르핀(pilocarpine hydrochloride), 피라루비신(pirarubicin), 피리트렉심(piritrexim), 플라세틴 A(placetin A), 플라세틴 B(placetin B), 플라스미노겐 활성자 억제제, 백금 착체, 백금 화합물, 백금- 트리아민 착체, 포르피머 나트륨, 포르피로마이신(porfiromycin), 프레드니손, 프로필 비스-아크리돈(propyl bis-acridone), 프로스태글란딘(prostaglandin) 32, 프로테아솜 억제제, 단백질 A-기재 면역조절제, 단백질 키나제 C 억제제, 단백질 키나제 C 억제제, 마이크로알갈(microalgal), 단백질 티로신 포스페타제 억제제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제, 푸르푸린(purpurins), 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine), 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트, raf 길항제, 랄티트렉스드(raltitrexed), 라모세트론(ramosetron), ras 파네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, ras 억제제, ras-GAP 억제제, 디메틸화 레텔립틴(retelliptine demethylated), 레늄 Re 186 데티드로네이트(rhenium Re 186 etidronate), 리족신(rhizoxin), 리보자임(ribozymes), RII 레틴아미드(retinamide), 로글레티미드(rogletimide), 로히튜카인(rohitukine), 로뮤르타이드(romurtide), 로키니멕스(roquinimex), 루비기논 B1(rubiginone Bl), 루복실(ruboxyl), 사핀골(safingol), 사인토핀(saintopin), SarCNU, 사르코피톨 A(sarcophytol A), 사르그라포스팀(sargramostim), Sdi 1 모방체, 세무스틴(semustine), 세네센스 유도 억제제 1(senescence derived inhibitor 1), 센스 올리고뉴클레오티드, 신호 전달 억제제, 신호 전달 조절제, 단쇄 항원 결합 상대단백질, 시조피란(sizofiran), 소부족산(sobuzoxane), 나트륨 보로캅테이트(sodium borocaptate), 나트륨 페닐아세테이트(sodium phenylacetate), 솔베롤(solverol), 소마토메딘(somatomedin) 결합 상대 단백질), 소네르민(sonermin), 스파포스산(sparfosic acid), 스피카마이신 D(spicamycin D), 스피로무스틴(spiromustine),스플레노펜틴(splenopentin), 스폰지스틴 1(spongistatin 1), 스쿠알라민(squalamine), 줄기 세포 억제제, 줄기 세포 분할 억제제, 스티피아미드(stipiamide), 스트로멜리신(stromelysin) 억제제, 설피노신(sulfinosine), 초활성 바소활성 장관내 펩티드 길항제, 수라디스타(suradista), 수라민(suramin), 스웨인소닌(swainsonine), 합성 글리코스아미노글리칸, 탈리무스틴(tallimustine), 타목시펜 메트아이오드(tamoxifen methiodide), 타우로무스틴(tauromustine), 탁솔(taxol), 타자로틴(tazarotene), 테코갈란 나트륨(tecogalan sodium), 테가퍼(tegafur), 텔루라피리륨(tellurapyrylium), 텔로머라제(telomerase) 억제제, 테모포르핀(temoporfin), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 테트라클로로데카옥시드(tetrachlorodecaoxide), 테트라조민(tetrazomine), 탈리블라스틴(thaliblastine), 탈리도미드(thalidomide), 티오코랄린(thiocoraline), 티오구아닌(thioguanine), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 트롬보포이에틴 모방체(thrombopoietin mimetic), 티말파신(thymalfasin), 티모포이에틴(thymopoietin) 수용체 제제, 티모트리난(thymotrinan), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 틴 에틸 에티오푸르푸린(tin ethyl etiopurpurin), 티라파자민(tirapazamine), 이염화티타노세인(titanocene bichloride), 톱센틴(topsentin), 토레미펜(toremifene), 전능성 줄기 세포 인자, 번역 억제제, 트레티노인(tretinoin), 트리아세틸유리딘(triacetyluridine), 트리시리빈(triciribine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트립토렐린(triptorelin), 트로피세트론(tropisetron), 트로스테로이드(turosteride), 티로신 키나제 억제제, 티로포스틴(tyrphostins), UBC 억제제, 유베니멕스(ubenimex), 요생식동-유래 성장억제 인자(urogenital sinus-derived growth inhibitor factor), 우로키나제 수용체 길항제, 베프리오타이드(vapreotide), 베리올린 B(variolin B), 벡터 시스템, 적혈구(erythrocyte)유전자 치료 요법, 벨라레솔(velaresol), 베라르닌(verarnine), 베르딘(verdins), 베르테포르핀(verteporfin), 비노렐빈(vinorelbine), 빈칼틴(vinxaltine), 비탁신(VITAXIN)
Figure 112009021231361-pct00015
보로졸, 자노테론(zanoterone), 제니플라틴(zeniplatin), 질라스코르브(zilascorb), 및 지노스타틴 스티말라머(zinostatin stimalamer)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 부가적 항암 약물은 5-플루오로우라실 및 류코보린이다. 이 두 제제는 탈리도미드 및 토포이소머라제 억제제를 이용하는 방법에 사용될 때 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항암제는 화학요법제가 아니다.
더욱 특별한 실시양태에서, 본 발명은 또한 상기 개시된 바와 같이, 유방암, 난소암, 흑색종, 전립선암, 결장암 및 폐암의 치료를 위해, 하나 이상의 치료제, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 항암제, 예컨대 표 1에 개시된 것들을 투여하는 것과 조합하여 항-CD19 mAb를 투여하는 것을 포함한다. 조합 요법으로 사용될 때, 표 2에 열거된 투약량 및/또는 투여 빈도는 감소될 수 있다.
[표 2]
항암제
치료제 용량/투여/제형
염산 독소루비신(아드리아마이신 RDF
Figure 112009021231361-pct00016
및 아드리아마이신 PFS
Figure 112009021231361-pct00017
)		 정맥내 제1일에 60-75 ㎎/㎡ 21일 간격
염산 에피루비신
(엘렌스(Ellence)™)		 정맥내 매 사이클의 제1일에 100-120 ㎎/㎡ 또는 사이클의 1-8일 동안 동량으로 분할하여 투입함 3-4주 사이클
플루오로우사실 정맥내 공급 방법:
(250 및 500 ㎎ 플루오로우라실을 각각 함유하는) 5 ㎖ 및 10 ㎖ 바이알
독세탁셀
(탁소테레
Figure 112009021231361-pct00018
)		 정맥내 1시간에 걸쳐 60-100 ㎎/㎡ 매3주에 1회
파클리탁셀
(탁솔
Figure 112009021231361-pct00019
)		 정맥내 3시간에 걸쳐 175 ㎎/㎡ 매3주 4코스
독소루비신-함유 조합 화학요법에 연속 투여됨)
시트르산타목시펜(놀바덱스
Figure 112009021231361-pct00020
)		 경구(정제) 20 ㎎을 초과하는 투여량
은 분할된 용량으로 투입해야 함(아침 및 저녁)
 매일
주사용 류코보린 칼슘 정맥내주사 또는 근육내 주사 공급 방법:
350 ㎎ 바이알		 투여량은 텍스트. PDR 3610으로부터 명확하지 않다.
아세트산루프로라이드(루프론
Figure 112009021231361-pct00021
)		 단일 피하 주사 1 ㎎(0.2 ㎖ 또는 20 유닛 마크)
 일일 1회
플루타미드(율렉신
Figure 112009021231361-pct00022
)
 경구(캡슐) 50 ㎎(125 ㎎ 플루타미드를 각각 함유하는 캡슐) 8시간 간격으로 일일 3번(일일 총 용량 750 ㎎)
닐루타미드(닐란드론
Figure 112009021231361-pct00023
)		 경구(정제) 300 ㎎ 또는 150 ㎎(50 또는 150 ㎎ 닐루타미드를 각각 함유하는 정제) 30일간은 일일 1회 300 ㎎, 이어서 일일 1회 150 ㎎
비칼루타미드(카소덱스
Figure 112009021231361-pct00024
)		 경구(정제) 50 ㎎(50 ㎎ 비칼루타미드를 함유하는 정제) 일일 1회
프로게스테론 주사 참깨 오일 내의 USP 50 ㎎/㎖
케토코나졸(니조랄
Figure 112009021231361-pct00025
)		 크림 증상에 따라 일일 1회 또는 2회 2% 크림 도포
프레드니손 경구(정제) 치료 특정 질환 실체에 따라 최초 투약량은 일일 5 ㎎ 내지 60 ㎎으로 다양할 수 있음.
에스트라무스틴 인산염 나트륨(엠사이트
Figure 112009021231361-pct00026
)		 경구(캡슐) 14 ㎎/㎏ 체중(즉, 10 ㎏ 또는 22 lb 체중 당, 하나의 140 ㎎캡슐) 일일 3 또는 4회 분할 용량
에토포시드 또는 VP-16 정맥내 20 ㎎/ ㎖ 용액의 5 ㎖(100 ㎎)
다카르바진(DTIC-Dome
Figure 112009021231361-pct00027
)		 정맥내 2-4.5 ㎎/㎏ 10일간 일일 1회.
4주 간격으로 반복될 수 있음.
카르무스틴 이식을 갖는 폴리페프로산 20(BCNU)(니트로소우레아)(글리아델
Figure 112009021231361-pct00028
)		 절제 공동 내에
배치된 웨이퍼		 절제 공동의 크기 및 모양이 허용할 경우, 7.7 ㎎의 카르무스틴을 각각 함유하는, 총 61.6 ㎎인, 8개 웨이퍼
시스플라틴 주사 [PDR 861에서 n/a]
공급 방법: 50 ㎖ 및 100 ㎖ 다중 용량 바이알의 1 ㎎/ ㎖의 용액
미토마이신 주사 (5 ㎎ 및 20 ㎎ 미토마이신을 함유하는) 5 ㎎ 및 20 ㎎ 바이알로 공급됨
젬시타빈 HCl
(젬자르
Figure 112009021231361-pct00029
)		 정맥내 NSCLC-2 스케줄이 조사되었고, 최적 일정은 결정되지 않았을 경우, 4주 스케줄-30분에 걸쳐 1000 ㎎/㎡ 정맥내 투여 3주 일정-젬자르는 30분에 걸쳐 1250 ㎎/㎡ 정맥내 투여됨. 4주 일정
각 28일 사이클의 제1, 8 및 15일.
젬자르의 주입 후 제1일에 100 ㎎/㎡ 정맥내 시스플라틴.
3주 일정
각 21일 사이클의 제1 및 8일.
제1일에 젬자르의 투여 후 100 ㎎/㎡ 투약량의 시스플라틴을 정맥내 투여.
카르보플라틴
(파라플라틴
Figure 112009021231361-pct00030
)		 정맥내 단일 제제 요법:
제1일 정맥내 360 ㎎/㎡(15분 이상 지속하는 주입)
다른 투여량 계산:
시클로포스파미드와의 조합 요법, 용량 조정 권장, 제형 투약 등		 매4주
이포사미드
(이펙스
Figure 112009021231361-pct00031
)		 정맥내 일일 1.2 g/㎡ 연속 5일
매3주 또는 혈액 독성으로부터 회복 후 반복함
염산 포토테칸
(하이캄틴
Figure 112009021231361-pct00032
)		 정맥내 1.5 ㎎/㎡ 매일 30분에 걸쳐 정맥내 주입 21일 코스의 1일째에 시작하여 연속 5일
비스포스포네이트
파미드로네이트
알렌드로네이트
리세드로네이트		 정맥내 또는 경구
6-7 oz 물을 취함		 암 환자의 고칼슘혈증 수정을 위해 60 ㎎ 또는 90 ㎎ 단일 주입.
골 재흡수의 예방 또는 조절을 위해 2년간 5 ㎎/d 일일, 및 이어서 9개월간 10 ㎎/d 일일.
골 재흡수의 예방 또는 5.0 ㎎.
로바스타틴(메바코르™) 경구 단일 또는 2회 분할 용량으로 10-80 mg/일
본 발명은 또한 x-선, 감마선 및 기타 방사선원의 사용을 포함한 방사선 요법과 조합하여 항-CD19 mAb를 투여하여, 암 세포를 파괴하는 것을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 방사선 처리는 외부 빔 방사선 또는 원격요법으로서 투여되는데, 여기서 방사선은 원격 공급원으로부터 지정된다. 다른 실시양태에서, 방사선 처리는 내부 요법 또는 근접요법으로 투여되는데, 여기서 방사능 공급원은 암 세포 또는 종양체에 근접하는 신체 내부에 배치된다.
암 치료법 및 그 용량, 투여 경로 및 권장 용도가 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Physician's Desk Reference (56th ed., 2002)]와 같은 문헌에 기재되었다.
5.20. 약학적 조성물
본 발명은 또한 CD19 항원에 결합하고 인간 ADCC를 매개할 수 있는 치료 항체를 이용하여, 인간 대상의 B 세포 질환 및 장애의 치료를 위한 면역요법 조성물 및 방법, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 B 세포 악성 종양의 치료를 위한 면역요법 조성물 및 방법, 인간 이식 수령자에 있어 GVHD, 이식편 거부반응 및 이식후 림프구 증식 장애의 치료 및 예방을 위한 면역요법 조성물 및 방법, 및 인간 대상에 있어 자가면역 질환 및 장애의 치료를 위한 면역요법 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입의 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 ADCC를 매개할 수 있는, IgG2 또는 IgG4 인간 이소타입의 인간 또는 인간화 항-CD19 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 당업계에 공지된 수단에 의해 생산될 수 있는 단클론 인간, 인간화, 또는 키메라화 항-CD19 항체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
급성 림프구모구성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종, 여포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 전구-림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 통상적 급성 림프구성 백혈병 및 일부 결손-급성 림프구모구성 백혈병을 포함하나 이에 국한되지 않는, B 세포 및 그것의 전구체로부터 유래되는 B 세포 악성 종양으로 진단되는 인간 대상을 치료하기 위한 치료 제형물 및 처방이 기재되어 있다.
다른 특별한 실시양태에서, 항-CD19 항체는 ADCC, 보체-의존성 세포성 세포독성 또는 아포프토시스를 매개할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 B 세포 지정 면역요법 외의 B 세포의 보다 넓은 개체군을 표적화하는 이점을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD19 항체는 표적 골수 세포, 순환 B 세포, 및 성숙 항체-분비 B 세포를 표적화하는 데 효과적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 순환 B 세포 및 순환 면역글로불린의 감소 또는 고갈에 유효할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 덜 표적화된 치료제 및 처방보다 더 적고/적거나 더 덜한 심한 합병증과 관련된, GVHD, 이식편 거부반응 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 방법 및 조성물의 부재 하에 가능할, 보다 적은 용량의 전형적 치료제와 함께 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 방사선 요법, 고용량 화학요법, 또는 비장절제술과 같은 요법의 보다 심한 형태의 필요성을 없앤다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체 및 조성물은 GVHD 및 이식편 거부반응의 치료 또는 예방을 위해, 이식 전 또는 후에 이식 수령자 환자에게, 단독으로 또는 다른 치료제 또는 처방과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CD19 항체 및 조성물은 동종 이식편의 이식 전 또는 후에 이식 수령자로부터의 동종항체를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 항-CD19 항체 및 조성물은 또한 체외, 이식 전, 또는 도너 내, 또는 GVHD 및 이식편 거부반응에 대한 예방으로서 항체-생산 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
5.21. 약학적 제형물, 투여 및 투약량
본 발명의 약학적 제형물은 활성 성분으로서, 인간, 인간화, 또는 키메라 항-CD19 항체를 함유한다. 이 제형물은 인간 환자에 투여하기 적합한 중량이나 부피 단위에서 요망하는 반응을 유도하기 위해 유효한 양으로 네이키드 항체, 면역접합체, 또는 융합 단백질을 함유하고, 바람직하게 무균이다. 반응은 예를 들어, 순환 B 세포 고갈, 조직 B 세포 고갈, B 세포 악성 종양의 퇴행, 또는 병적 증상의 감소와 같은, 항-CD19 항체 조성물의 생리학적 효과를 결정함으로써 측정될 수 있다. 다른 검정법이 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 반응의 수준을 측정하는 데 이용될 수 있다.
5.21.1. 약학적 제형물
항-CD19 항체 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체로 제형될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한"은 활성 성분의 생리학적 활성의 효능을 간섭하지 않는 하나 이상의 비-독성 물질을 의미한다. 그러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 친화도 담체 및 임의의 다른 치료제를 또한 함유할 수 있다. 이들 약학적으로 허용가능한 제제는 통상적으로 인간에게 투여하는 데 적합한 친화도 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 또한 함유할 수 있다. 의약품으로 사용되는 경우에, 이들 염은 약학적으로 허용되어야 하나, 약학적으로 허용되지 않는 염이 그들의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는데 편의적으로 이용될 수 있고, 본 발명의 범위에서 배제되지 않는다. 그러한 약리학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 염에는 하기 산으로부터 제조된 염들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다: 염화수소산, 염화브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 붕산, 포름산, 말론산 및 숙신산. 또한, 약학적으로 허용가능한 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다. "담체"는 적용을 용이하게 하기 위하여 활성 성분이 결합되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미한다. 이 약학적 조성물의 성분은 또한 원하는 약학적 효능을 현저하게 손상시키는 상호작용이 존재하지 않도록 하는 방식으로, 본 발명의 항체와, 또한 상호간에 혼합될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 항-CD19 항체 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체 또는 면역접합체를 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써, 동결건조된 제형물 또는 수용액의 형태로, 저장용으로 제조될 수 있다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 제16판, Osol, A. Ed. (1999)]). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투약량 및 농도에서 수령자에게 비독성이고, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(대략 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 짝이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 트윈(TWEEN), 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
항-CD19 항체 조성물은 또한 염화벤잘코늄; 클로로부탄올; 파라벤; 및 티메로살과 같은 적합한 보존제를 임의적으로 함유할 수 있다.
항-CD19 항체 조성물은 편리하게 단위 투약 형태(unit dosage form)로 제공될 수 있고, 약학 분야에 공지되어 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 모든 방법은 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 활성제를 접촉시키는 단계를 수반한다. 일반적으로 항-CD19 항체 조성물은 활성 화합물을 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 접촉시키고, 필요한 경우에, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 항-CD19 항체의 무균 수성 또는 비-수성 제제를 편의적으로 함유하는데, 이는 바람직하게 수령자의 혈액과 등장성이다. 이 제제는 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용한 공지된 방법에 따라 제형될 수 있다. 무균 주사가능 제제는 또한 비-독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매에 녹인 무균 주사가능 용액이나 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄 디올 중의 용액일 수도 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클과 용매 중에는, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균의 고정 오일이 용매 또는 현탁 매체로서 통상적으로 사용된다. 그러한 목적으로 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 비롯한 임의의 순한 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 투여에 적합한 담체 제형물은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다양한 경로의 투여에 적합한 담체 제형물은 리툭산™에서 기재된 것과 동일하거나 유사할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Physicians' Desk Reference (Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ, 2005), pp. 958-960 and 1354-1357](이는 본원에 전체적으로 참조 인용됨)를 참조한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 항체 조성물은 염화나트륨, 시트르산나트륨 이수화물, 폴리소르베이트 80과 함께 정맥내 투여용으로 제조되는데, 여기서 조성물의 pH는 대략 6.5로 조정된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 정맥내 주사는 항체가 순환계를 통하여 급속하게 분산되기 때문에 유용한 투여 방식이다. 그러나, 정맥내 투여는 맥관구조(vasculature)와 내피하 기질(subendothelial matrix)의 내피 세포를 포함하는 혈관 장벽에 의해 제한된다. 또한, 이러한 혈관 장벽은 고형 종양에 의한 치료 항체의 흡수에도 더욱 중요한 문제점이다. 림프종은 상대적으로 높은 혈류 속도를 보유하기 때문에, 효과적인 항체 전달에 기여한다. 림프내 투여 경로, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사, 또는 림프관의 도관삽입(catheterization) 역시 B 세포 림프종을 치료하는 데 유용한 수단을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체 조성물 및 방법은 피하에 자가-투여된다. 그러한 실시양태에서, 조성물은 약 50 ㎎/㎖로, 동결건조된 약물로서 제형되거나, 또는 액체 완충제(예를 들어, PBS 및/또는 시트르산염)에 담겨 제형된다.
본원에서의 제형물은 또한 치료되는 특정 증상에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 적절하게 그러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 그러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 이들 제형물은 전형적으로 무균이다. 이는 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성(sustained-release) 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예에는 항-CD19 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스가 포함되는데, 상기 매트릭스는 형상화 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체(예를 들어, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산 글리콜산 공중합체 및 아세트산레우프롤리드로 구성된 주사가능 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트와 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 초과 동안 분자의 방출이 가능하나, 특정 하이드로겔은 더욱 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랜 기간 동안 체내에 머무르면, 이들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있고, 이에 생물학적 활성의 상실 및 면역원성에서 가능한 변화가 초래된다. 관련된 기전에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 관찰되면, 안정화는 설피드릴 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 이용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 ADCC 또는 CDC에 영향을 주지 않는다.
본원에 개시된 항-CD19 항체 조성물은 면역리포좀으로서 제형될 수도 있다. "리포좀"은 약물(예컨대, 본원에 기재된 항-CD19 항체)의 인간으로의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성되는 소형 소포(nesicle)이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 정렬과 유사한 이중층 형태로 정렬된다. 본 발명의 항체를 포함하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; 문헌 [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 방법으로 제조된다. 증진된 순환 시간(circulation time)을 갖는 리포좀은 미국 특허 제5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 세공 크기의 필터를 통해서 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체는 디설피드 교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에서 기재된 바와 같이, 리포좀에 접합될 수 있다. 치료제는 또한 리포좀 내에 내포될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19): 1484 (1989)]를 참조한다.
약학적 제형물의 일부에는 하기의 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다:
(a) 100 ㎎(10 ㎖) 또는 500 ㎎(50 ㎖) 1회용 바이알에 담겨 10 ㎎/㎖의 농도로 공급되는, 항-CD19 항체의 정맥내(i.v.) 투여용 무균성 보존제-무함유 액체 농축물. 상기 산물은 염화나트륨, 시트르산나트륨 이수화물, 폴리소르베이트 및 주사용 무균수를 이용하여 i.v. 투여용으로 제형될 수 있다. 예를 들어, 상기 산물은 9.0 ㎎/㎖ 염화나트륨, 7.35 ㎎/㎖ 시트르산나트륨 이수화물, 0.7 ㎎/㎖ 폴리소르베이트 80 및 주사용 무균수에서 제조될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다.
(b) 1회용 바이알 내의 피하(s.c.) 주사용 무균의 동결건조된 분말. 상기 산물은 수크로스, L-히스티딘 염산모노하이드레이트, L-히스티딘 및 폴리소르베이트 20으로 제형될 수 있다. 예를 들어, 각 1회용 바이알은 150 ㎎ 항-CD19 항체, 123.2 ㎎ 수크로스, 6.8 ㎎ L-히스티딘 염산모노하이드레이트, 4.3 ㎎ L-히스티딘, 3 ㎎ 폴리소르베이트 20을 함유할 수 있다. 1.3 ㎖의 주사용 무균수로 1회용 바이알의 재구성(reconstitution)은 대략 1.5 ㎖ 용액을 생성하고 1.25 ㎖ 당 125 ㎎(100 ㎎/㎖)의 항체를 전달하였다.
(c) 정맥내(i.v.) 투여를 위한 무균의 보존제-무함유 동결건조된 분말. 상기 산물은 α-트레할로스 이수화물, L-히스티딘 HCl, 히스티딘, 및 폴리소르베이트 20, USP로 제형될 수 있다. 예를 들어, 각 바이알은 440 ㎎ 항-CD19 항체, 400 ㎎ α,α-트레할로스 이수화물, 9.9 ㎎ L-히스티딘 HCl, 6.4 ㎎ L-히스티딘, 1.8 ㎎ 폴리소르베이트 20, USP를 함유할 수 있다. 보존제로서 1.1% 벤질 알코올(benzyl alcohol)을 함유하는 20 ㎖의 정균처리한 주사용수(BWFI), USP로 재구성은 대략 6의 pH에서 21 ㎎/㎖ 항체를 함유하는 복수-분량 용액을 생성한다.
(d) 항-CD19 항체가 수크로스, 폴리소르베이트, 일염기성 인산나트륨 일수화물, 이염기성 인산나트륨 이수화물로 제형되는, 정맥내 주입용 무균의 동결건조된 분말. 예를 들어, 각 1회용 바이알은 100 ㎎ 항체, 500 ㎎ 수크로스, 0.5 ㎎ 폴리소르베이트 80, 2.2 ㎎ 일염기성 인산나트륨 일수화물, 및 6.1 ㎎ 이염기성 인산나트륨 이수화물을 함유할 수 있다. 보존제는 존재하지 않는다. 10 ㎖의 주사용 무균수, USP로 재구성이후, 결과의 pH는 대략 7.2이다.
(e) 1회용, 1 ㎖ 미리-충전된 주사기로 공급되는 피하 주사용 무균의 보존제-없는 용액. 상기 산물은 염화나트륨, 일염기성 인산나트륨 일수화물, 이염기성 인산나트륨 이수화물, 시트르산나트륨, 시트르산 일수화물, 만니톨, 폴리소르베이트 80, 주사용수, USP로 제형될 수 있다. pH를 대략 5.2로 조정하기 위하여 수산화나트륨이 추가될 수도 있다. 예를 들어, 각 주사기는 0.8 ㎖(40 ㎎)의 약물 제품을 전달하도록 제조될 수 있다. 각 0.8 ㎖는 40 ㎎ 항-CD19 항체, 4.93 ㎎ 염화나트륨, 0.69 ㎎ 일염기성 인산나트륨 일수화물, 1.22 ㎎ 이염기성 인산나트륨 이수화물, 0.24 ㎎ 시트르산나트륨, 1.04 시트르산 일수화물, 9.6 ㎎ 만니톨, 0.8 ㎎ 폴리소르베이트 80 및 주사용수, 및 USP를 함유한다.
(f) 무균 주사용수(SWFI), USP로 재구성되고 피하(s.c.) 주사로 투여되는, 1회용 바이알에 함유된 무균의 보존제-없는 동결건조된 분말. 상기 산물은 수크로스, 히스티딘 염산모노하이드레이트, L-히스티딘, 폴리소르베이트로 제형될 수 있다. 예를 들어, 75 ㎎ 바이알은 129.6 ㎎ 또는 112.5 ㎎의 항-CD19 항체, 93.1 ㎎ 수크로스, 1.8 ㎎ L-히스티딘 염산모노하이드레이트, 1.2 ㎎ L-히스티딘, 0.3 ㎎ 폴리소르베이트 20를 함유할 수 있고, 0.9 ㎖ SWFI, USP로 재구성이후 0.6 ㎖에서 75 ㎎의 항체를 전달하도록 설계된다. 150 ㎎ 바이알은 202.5 ㎎ 또는 175 ㎎ 항-CD19 항체, 145.5 ㎎ 수크로스, 2.8 ㎎ L-히스티딘 염산모노하이드레이트, 1.8 ㎎ L-히스티딘, 0.5 ㎎ 폴리소르베이트 20을 함유할 수 있고, 1.4 ㎖ SWFI, USP로 재구성이후 1.2 ㎖에서 150 ㎎의 항체를 전달하도록 설계된다.
(g) 무균 주사용수로 재구성을 위한 무균의 동결건조된 산물. 상기 산물은 만니톨, 히스티딘, 글리신을 이용하여 근육내(IM) 주사를 위한 1회용 바이알로서 제형될 수 있다. 예를 들어, 각 1회용 바이알은 100 ㎎ 항체, 67.5 ㎎ 만니톨, 8.7 ㎎ 히스티딘, 0.3 ㎎ 글리신을 함유할 수 있고, 1.0 ㎖ 무균 주사용수로 재구성되는 경우에 1.0 ㎖에서 100 ㎎ 항체를 전달하도록 설계된다. 또 다른 예로서, 각 1회용 바이알은 50 ㎎ 항체, 40.5 ㎎ 만니톨, 5.2 ㎎ 히스티딘 및 0.2 ㎎ 글리신을 함유할 수 있고, 0.6 ㎖ 무균 주사용수로 재구성되는 경우에 50 ㎎ 항체를 전달하도록 설계된다.
(h) 100 ㎎/㎖의 농도로 공급되는, 근육내(IM) 주사를 위한 무균의 보존제-없는 용액. 상기 산물은 히스티딘, 글리신 및 무균 주사용수로 1회용 바이알로 제형될 수 있다. 예를 들어, 각 1회용 바이알은 1 ㎖에서 100 ㎎ 항체를 전달하도록 설계된 1.2 ㎖ 부피에서 100 ㎎ 항체, 4.7 ㎎ 히스티딘 및 0.1 ㎎ 글리신으로 제형될 수 있다. 또 다른 예로서, 각 1회용 바이알은 0.5 ㎖에서 50 ㎎ 항체를 전달하도록 설계된 0.7 ㎖ 또는 0.5 ㎖ 부피에서 50 ㎎ 항체, 2.7 ㎎ 히스티딘 및 0.08 ㎎ 글리신으로 제형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 40℃에서 안정하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 실온에서 안정하다.
5.21.2. 항체 반감기
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체의 반감기는 적어도 4 내지 7일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체의 평균 반감기는 적어도 약 2 내지 5일, 3 내지 6일, 4 내지 7일, 5 내지 8일, 6 내지 9일, 7 내지 10일, 8 내지 11일, 8 내지 12, 9 내지 13일, 10 내지 14일, 11 내지 15일, 12 내지 16일, 13 내지 17일, 14 내지 18일, 15 내지 19일, 또는 16 내지 20일이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체의 평균 반감기는 적어도 약 17 내지 21일, 18 내지 22일, 19 내지 23일, 20 내지 24일, 21 내지 25일, 22 내지 26일, 23 내지 27일, 24 내지 28일, 25 내지 29일, 또는 26 내지 30일이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체의 반감기는 약 50일 이하일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체의 조성물 및 방법의 반감기는 당업계에 공지된 방법으로 연장될 수 있다. 그러한 연장은 본 발명의 항체 조성물의 투여량 및/또는 투약 빈도를 감소시킬 수 있다. 개선된 생체내 반감기를 갖는 항체 및 이들을 제조하는 방법은 미국 특허 제6,277,375호; 및 국제 공보 제WO 98/23289호 및 제WO 97/3461호에 기재되어 있다.
생체내 항-CD19 항체의 혈청 순환 역시, 항체의 N- 또는 C-말단에 PEG의 부위-특이적 접합을 통하여, 또는 리실 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통하여, 다중기능성 링커와 함께 또는 그러한 링커 없이, 중합체 분자, 예를 들어 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 항체에 부착함으로써 연장될 수 있다. 생물학적 활성의 최소 상실을 초래하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용된다. 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 담보하기 위하여 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분석법으로 밀접하게 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 당업자에게 공지되어 있는 기술, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정법을 이용하여 결합 활성 및 생체내 효능을 시험될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법의 항체는 이러한 항체가 생체내 더욱 안정하도록, 또는 생체내 더욱 긴 반감기를 갖도록 하기 위하여 알부민에 접합될 수 있다. 이들 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 국제 공보 제WO 93/15199호, 제WO 93/15200호 및 제WO 01/77137호; 및 유럽 특허 제EP 413, 622호(이들은 본원에 참조 인용됨)를 참조한다.
5.21.3. 투여 및 용량
인간 환자에 대한 본 발명의 조성물의 투여는 정맥내, 피내, 경피, 피하, 근육내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통하여), 볼(예를 들어, 설하), 국소(즉, 기도 표면을 비롯한 피부 및 점막 표면 모두), 경막내, 관절내, 흉막내, 뇌내, 동맥내, 복막내, 경구, 림프내, 비내, 직장이나 질내 투여; 국소 카테터를 통한 관류; 또는 직접적인 병소내 주입을 비롯한 임의의 경로로 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 정의된 기간(예를 들어, 0.5 내지 2시간) 동안 제공된 정맥내 푸시(push) 또는 정맥내 주입으로 투여된다. 본 발명의 조성물은 연동 수단에 의해 또는 저장소(depot)의 형태로 전달될 수 있지만, 임의의 특정 예에서 가장 적합한 경로는 당업계에 공지된 바와 같이, 대상의 종, 연령, 성별, 전반적인 상태; 치료되는 질환의 특성과 중도 및/또는 투여되는 특정 조성물의 특성(즉, 투약량, 제형)과 같은 인자에 좌우된다. 특별한 실시양태에서, 투여 경로는 일정한 기간 동안 주 1회 또는 2회, 볼루스(bolus) 또는 연속 주입이다. 다른 특정 실시양태에서, 투여 경로는 임의적으로 주 1회 또는 2회, 피하 주사이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 외래환자에 기초하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 항체를 함유하는 조성물의 용량은 ㎎/환자 체중 ㎏의 단위로 측정된다. 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체를 함유하는 조성물의 용량은 ㎎/환자 제지방 체중(즉, 지방 함량을 제외한 체중) kg의 단위로 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체를 함유하는 조성물의 용량은 ㎎/환자 체표면적 ㎡의 단위로 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체를 함유하는 조성물의 용량은 환자에 투여되는 1회 분량당 ㎎의 단위로 측정된다. 용량의 임의의 측정이 본 발명의 조성물 및 방법과 관련하여 이용될 수 있고, 용량 단위는 당업계의 표준적인 수단에 의해 전환될 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 용량은 대상의 연령, 성별, 종류, 상태(즉, B 세포 악성 종양의 단계), 원하는 세포 고갈 수준, 치료 질환 및/또는 이용되는 특정 항체 또는 항원-결합 단편을 비롯한 다수의 인자에 기초하여 선택될 수 있고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 유효량은 시험관내 검사 시스템 또는 동물 모델(예를 들어, 목화 쥐(cotton rat) 또는 원숭이) 검사 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 항체의 효과를 평가하기 위한 모델과 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Wooldridge et al., Blood, 89(8): 2994-2998 (1997)](전체적으로 본원에 참조 인용됨)). 특정 실시양태에서, 특정 B 세포 악성 종양의 경우에, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께, 항체 요법을 위한 당분의 표준적인 치료 처방을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 투약 처방의 예에는 매일, 주3회(간헐적), 매주 또는 매 14일 마다 투약이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 투약 처방에는 매월 투약, 또는 매6 내지 8주 투약이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
당업자는 투약량이 일반적으로 유지 처방(maintenance regime)과 비교하여 초기 치료에 대해 더 크고/크거나 투약 빈도도 더 큼을 인식할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항-CD19 항체는 B 세포에 결합하고, 이에 따라 (본원에 기재된 바와 같은) B 세포의 더욱 효율적인(즉, 더욱 낮은 용량에서) 고갈을 초래할 수 있다. 더욱 높은 결합은 환자의 B 세포의 표면 상에서 인간 CD19의 밀도가 높은 경우에 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체(임의적으로 약학적 조성물의 일부로서 약학적으로 허용가능한 담체 내)의 투약량은 적어도 약 0.0005, 0.001, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.375, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 37.5, 또는 50 ㎎/㎡, 및/또는 약 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37.5, 20, 15, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.375, 0.1, 0.075 또는 0.01 ㎎/㎡ 미만이다. 특정 실시양태에서, 투약량은 약 0.0005 내지 약 200 ㎎/㎡, 약 0.001 내지 약 150 ㎎/㎡, 약 0.075 내지 약 125 ㎎/㎡, 약 0.375 내지 약 100 ㎎/㎡, 약 2.5 내지 약 75 ㎎/㎡, 약 10 내지 약 75 ㎎/㎡, 및 약 20 내지 약 50 ㎎/㎡이다. 관련 실시양태에서, 이용되는 항-CD19 항체의 투약량은 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5 ㎎/환자 체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 이용되는 네이키드 항-CD19 항체의 투약량은 적어도 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 ㎎/환자 체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 이용되는 항-CD19 항체의 투약량은 적어도 약 1 내지 20, 3 내지 15, 또는 5 내지 10 ㎎/환자 체중 kg이다. 바람직한 실시양태에서, 이용되는 항-CD19 항체의 용량은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 ㎎/환자 체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 항체(임의적으로 약학적 조성물의 일부로서 약학적으로 허용가능한 담체 내에)의 단일 투약 단위(single dosage unit)는 적어도 약 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248 또는 250 ㎍/㎡일 수 있다. 다른 실시양태에서, 용량은 단일 투약 단위당 1 g 이하이다.
상기 모든 용량은 예시적이고, 본 발명의 조성물 및 방법과 관련하여 이용될 수 있지만, 항-CD19 항체가 독소 또는 방사선요법제와 병용되는 경우에는 상기 기재된 용량보다 낮은 용량이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자가 낮은 CD19 밀도 수준을 나타내는 경우에, 상기 기재된 용량보다 낮은 용량이 바람직할 수 있다.
키메라 항-CD19 항체가 사용되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 이러한 키메라 항체의 용량 또는 양은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 ㎎/환자 체중 ㎏보다 크다. 키메라 항-CD19 항체가 사용되는 본 발명의 다른 실시양태에서, 이러한 키메라 항체의 용량 또는 양은 약 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1 ㎎/환자 체중 ㎏ 미만이다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 및/또는 조성물은 약 375 ㎎/㎡보다 적은 용량; 약 37.5 ㎎/㎡보다 적은 용량; 약 0.375 ㎎/㎡보다 적은 용량; 및/또는 약 0.075 ㎎/㎡ 내지 약 125 ㎎/㎡ 사이의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 투약 처방은 반복된 간격으로 투여되는 적은 용량을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 대략 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 또는 200일의 간격으로, 약 375 ㎎/㎡보다 적은 용량으로 투여될 수 있다.
상기 명시된 투약량은 적어도 약 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 또는 180일 또는 그 이상의 기간 동안 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 인간에서 B 세포 고갈을 초래할 수 있다. 특정 실시양태에서, 예비-B 세포(표면 면역글로불린을 발현하지 않음)가 고갈된다. 특정 실시양태에서, 성숙 B 세포(표면 면역글로불린을 발현함)가 고갈된다. 다른 실시양태에서, 모든 비-악성 유형의 B 세포가 고갈을 나타낼 수 있다. 임의의 이들 유형의 B 세포는 B 세포 고갈을 측정하는 데 이용될 수 있다. B 세포 고갈은 혈액 혈청과 같은 체액 내에서, 또는 골수와 같은 조직 내에서 측정될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, B 세포는 본 발명의 조성물 및 방법의 이용 전에 치료 환자 내 B 세포 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 고갈된다. 본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, B 세포는 인간에 대한 전형적인 표준 B 세포 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 고갈된다. 관련 실시양태에서, 인간에 대한 전형적인 표준 B 세포 수준은 연령, 성별, 체중 및 기타 인자와 관련하여, 치료되는 환자에 필적하는 환자를 이용하여 결정된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 약 125 ㎎/㎡ 이하의 투약량은 적어도 약 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 200일의 기간 동안 B 세포 고갈을 초래한다. 다른 전형적인 실시양태에서, 약 37.5 ㎎/㎡ 이하의 투약량이 적어도 약 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 200일의 기간 동안 B 세포를 고갈시킨다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.375 ㎎/㎡ 이하의 투약량이 적어도 약 7, 14, 21, 30, 45 또는 60일의 기간 동안 B 세포의 고갈을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.075 ㎎/㎡ 이하의 투약량이 적어도 약 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 200일의 기간 동안 B 세포의 고갈을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.01 ㎎/㎡, 0.005 ㎎/㎡ 또는 심지어, 0.001 ㎎/㎡ 이하의 용량이 적어도 약 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 200일의 기간 동안 B 세포의 고갈을 초래한다. 이들 실시양태에 따라, 용량은 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있기는 하나, 임의적으로 피하 경로로 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B 세포 고갈 및/또는 B 세포 질환의 치료가 통상적으로 이용되는 방법에서 사용되는 양보다 적은 양의 항체 또는 항체 단편으로 달성될 수 있다는 발견을 제공한다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 CD19에 특이적으로 결합하는 유효량의 항체를 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, B 세포를 고갈시키고/시키거나 B 세포 질환을 치료하는 방법을 제시하는데, 여기서 약 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37.5, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.375, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.001 또는 0.0005 ㎎/㎡ 이하의 투약량이 적어도 약 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 또는 200일 또는 그 이상의 기간 동안 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 B 세포(순환 및/또는 조직 B 세포) 고갈을 초래한다. 대표적인 실시양태에서, 약 125 ㎎/㎡ 또는 75 ㎎/㎡ 이하의 투약량은 적어도 약 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120, 150 또는 180일의 기간 동안, 적어도 약 50%, 75%, 85% 또는 90%의 B 세포 고갈을 초래한다. 다른 실시양태에서, 약 50, 37.5 또는 10 ㎎/㎡의 투약량은 적어도 약 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120 또는 180일의 기간 동안 적어도 약 50%, 75%, 85% 또는 90%의 B 세포 고갈을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.375 또는 0.1 ㎎/㎡의 투약량은 적어도 약 7, 14, 21, 30, 60, 75 또는 90일의 기간 동안 적어도 50%, 75%, 85% 또는 90%의 B 세포 고갈을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 약 0.075, 0.01, 0.001, 또는 0.0005 ㎎/㎡의 투약량은 적어도 약 7, 14, 21, 30 또는 60일의 기간 동안 적어도 약 50%, 75%, 85% 또는 90%의 B 세포 고갈을 초래한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 용량은 혈액 또는 조직, 예를 들어 이에 국한되는 것은 아니나 골수 내에서 일정한 양을 유지하기 위하여 증가되거나 감소될 수 있다. 관련 실시양태에서, 용량은 본 발명의 조성물 및 방법의 항체의 원하는 수준을 유지하기 위하여 약 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 95% 증가되거나 감소된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 환자의 면역원성 반응에 기초하여, 투약량이 조정될 수 있고/있거나 주입 속도가 감소될 수 있다.
본 발명의 방법의 한 측면에 따라, 적하량(loading dose)의, 본 발명의 항-CD19 항체 및/또는 조성물이 먼저 투여된 후, 치료되는 B 세포 악성 종양이 진행될 때까지 유지량(maintenance dose)으로, 또는 규정된 치료 과정(예를 들어, 캄파쓰™, 마이로타그(MYLOTARG)™ 또는 리툭산™, 이들 중에서 후자는 추가적인 데이터가 산출됨에 따라 증가한 규정된 용량으로 환자가 치료될 수 있도록 함)으로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 측면에 따라, 환자는 본 발명의 조성물 및 방법의 면역 반응을 검출하거나, 면역 반응을 최소화하거나, 또는 부작용을 최소화하기 위하여 본 발명의 조성물 및 방법으로 사전 치료될 수 있다.
5.21.4. 독성 시험
본 발명의 조성물 및/또는 치료 처방의 내성(tolerance), 독성 및/또는 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준적인 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(개체군의 50%에서 치사량), ED50(개체군의 50%에서 치료 효과량), IC50(50% 억제를 달성하기 위한 유효량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 용량은 순환 B 세포 또는 순환 면역글로불린, 또는 둘 모두의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 고갈을 달성하는 데 유효한 용량이다. 독성 효과와 치료 효과 사이에 용량 비율(dose ratio)은 치료 지수(therapeutic index)인데, 이는 LD50/ED50 비율로서 표시될 수 있다. 더욱 높은 치료 지수를 나타내는 치료제가 바람직할 수 있다. 독성 부작용을 나타내는 치료제가 사용될 수 있기는 하나, CD19 음성 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 따라서 부작용을 감소시키기 위하여, 이들 제제를 CD19-발현 세포로 표적시키는 전달 시스템을 설계하기 위해 주의해야 한다.
세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 이용되는 조성물 및/또는 치료 처방의 용량 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 이들 제제의 용량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 존재할 수 있다. 용량은 이용된 투약 형태 및 투여 경로에 따라, 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 요법에서, 치료적 유효량은 적절한 동물 모델에 의해 평가될 수 있다. 동물 모델의 종류에 따라, 용량은 예를 들어, 문헌 [Freireich et al., Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, monkey, dog, and human, Cancer chemotherapy Reports, NCI 1966 40:219-244]에 제시된 바와 같이, 당업계에 확립된 공식에 따른 일정한 비율로 인간에 맞게 결정될 수 있다. 세포 배양 검정법으로부터 수득된 데이터는 잠재적 독성을 예측하는 데 유용할 수 있다. 동물 연구는 세포 배양에서 측정되는 바와 같이, IC50(즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 검사 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 특정 용량을 공식화하는 데 이용될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 효과적인 영향을 더욱 정확하게 결정하는 데 이용될 수 있다. 혈장 약물 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA, 또는 세포 기초 검정법으로 측정될 수 있다.
5.22. 환자 진단, 단계 결정 및 치료 처방 종양학
본 발명의 특정 측면에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용되는 치료 처방과 용량은 치료되는 B 세포 질환 또는 장애의 단계를 비롯한 다수의 인자에 기초하여 선택된다. 환자 또는 환자 개체군에서 B 세포 질환 또는 장애의 특정 단계에 적절한 치료 처방이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상이한 단계의 B 세포 질환 또는 장애를 앓는 환자를 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 유효량을 결정하기 위하여, 당업계의 표준적인 프로토콜을 이용하여 용량 반응 곡선을 산출할 수 있다. 일반적으로 진행된 단계의 B 세포 질환 또는 장애를 앓는 환자는 초기 단계 B 세포 질환 또는 장애를 앓는 환자에 비하여, 더욱 오랜 기간 동안 투여될 수 있는 더욱 높은 용량 및/또는 더욱 빈번한 용량을 필요로 할 것이다.
본 발명의 항-CD19 항체 조성물 및 방법은 B 세포 악성 종양을 비롯한 B 세포 질환을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 용어 "B 세포 악성 종양(malignancy)"은 B 세포 계열의 세포로부터 유래된 임의의 악성 종양을 포함한다. 전형적인 B 세포 악성 종양에는 하위 등급/여포성 NHL, 소형 림프구성(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 미만성(diffuse) NHL, 상위 등급 면역아구성 NHL, 상위 등급 림프성 NHL, 상위 등급 소형 비-분할 세포 NHL, 맨틀 세포 림프종, 치료하기 어려운 질환(bulky disease) NHL를 비롯한 B 세포 아형 비-호지킨 림프종(NHL); 버킷 림프종; 다발성 골수종; 예비-B 급성 림프아구성 백혈병 및 초기 B 세포 전구체로부터 유래되는 다른 악성 종양; 통상적 급성 림프구성 백혈병(ALL); 면역글로불린-돌연변이화된 CLL 및 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 비롯한 만성 림프구성 백혈병(CLL); 모발상 세포 백혈병; 무-급성 림프아구성 백혈병; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 종자 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL, 3형 DLBCL을 비롯한 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL); 전림프구성 백혈병; 경쇄 질환; 형질구종; 골경화성 골수종; 형질 세포 백혈병; 미확정 단클론 감마병증(MGUS); 아급성 다발성 골수종(SMM); 무통성 다발성 골수종(IMM); 표준형과 결절성 림프구 우세형을 비롯한 호지킨 림프종; 림프형질세포 림프종(LPL); 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종을 비롯한 변연부 림프종이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 한 실시양태에서, 본 발명은 여포성 림프종; 맨틀 세포 림프종; 버킷 림프종; 다발성 골수종; 종자 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL, 3형 DLBCL을 비롯한 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL); 표준형과 결절성 림프구 우세형을 비롯한 호지킨 림프종; 림프형질세포 림프종(LPL); 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종을 비롯한 변연부 림프종; 면역글로불린-돌연변이화된 CLL과 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 비롯한 만성 림프구성 백혈병(CLL)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 성숙 B 세포 악성 종양(즉, 세포 표면 상에서 Ig를 발현함)을 치료하는 데 이용될 수 있다.
또한, CD19는 예를 들어, CD20과 달리 B 세포 발달 시에 초기에 발현되기 때문에, 예를 들어 골수 내에서 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양(즉, 세포 표면 상에 Ig를 발현하지 않음)을 치료하는 데 특히 적합하다. 예시적인 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양에는 급성 림프성 백혈병이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 특별한 실시양태에서, 본 발명은 림프절외 종양을 치료하는 데 이용될 수 있다.
5.22.1. B 세포 악성 종양의 진단과 단계 결정
암, 예를 들어 종양을 형성할 수 있는 B 세포 질환 또는 장애(예를 들어, 비-호지킨 림프종, 미만성 대형 B 세포 림프종, 여포성 림프종 및 버킷 림프종)의 진행은 전형적으로 암이 신체를 통하여 확산되는 정도에 의해 특징화되고, 종종 결과를 전조하는 하기 4 단계로 구분된다. 단계 I: 암이 특정 조직에 국한되고 림프절로 확산되지 않는다. 단계 II: 암이 주변 림프절로 확산된다(즉, 전이). 단계 III: 암이 기원 조직으로부터 멀리 떨어진 신체 부위에서 림프절 내에서 관찰되고 하나가 아닌 대량의 또는 복수의 종양을 포함할 수 있다. 단계 IV: 암이 신체의 원위 부위까지 확산된다. 암의 단계는 임상적 관찰 및 당업자에게 공지되어 있는 검사 방법으로 결정될 수 있다. 상기 기재된 암의 단계는 전형적으로 종양 형성에 의해 특징화되는 암의 임상적 진단과 관련하여 이용되고, B 세포 질환 및 장애를 치료하기 위하여 본 발명의 조성물 및 방법과 관련하여 이용될 수 있다. 전형적으로 초기 단계 질환은 상기 질환이 환자의 신체 일부에 국한되고 전이되지 않았음을 의미한다.
다발성 골수종이 포함되나, 이에 국한되지 않는 비-종양 형성 B 세포 질환 및 장애와 관련하여, 질환의 단계를 결정하는 기준이 상이하다. 듀리-샐먼(Durie-Salmon) 단계 결정 시스템이 광범위하게 이용된다. 이러한 단계 결정 시스템에서, 질환의 임상적 단계(단계 I, II 또는 III)는 M 단백질의 수준, 용해성 골 병변의 총수, 헤모글로빈 수치, 혈청 칼슘 수준을 비롯한 여러 척도에 기초한다. 단계는 신장 기능(A 또는 B로 분류됨)에 따라 더욱 세분된다. 듀리-샐먼 단계 결정 시스템에 따라, 단계 I(적은 세포량)은 아래와 같이 특징화된다: 헤모글로빈 수치 >10 g/㎗; 혈청 칼슘 수치 정상 또는 ≤ 12 ㎎/㎗; 골 x-선, 정상 골 구조(등급 0) 또는 고립성 골 형질구종 단독; 낮은 M-성분 생산율: IgG 수치 <5 g/㎗, IgA 수치 <3 g/d, 벤스 존스 단백질(Bence Jones protein) <4 g/24 h. 단계 I 환자는 전형적으로 관련된 기관이나 조직 손상 또는 증상이 나타나지 않는다. 단계 II(중간 세포량)는 단계 I과 단계 III 모두에 합치되지 않는 것에 의해 특징화된다. 단계 III(많은 세포량)은 하기 수치들 중 하나 이상에 의해 특징화된다: 헤모글로빈 수치 <8.5 g/㎗; 혈청 칼슘 수치 >12 ㎎/㎗; 진행된 용해성 골 병변(등급 3); 높은 M-성분 생산율: IgG 수치 >7 g/㎗, IgA 수치 >5 g/㎗, 벤스 존스 단백질 >12 g/24 h 하위부류(A 또는 B)(여기서, A는 상대적으로 정상인 신장 기능(혈청 크레아티닌 수치 <2.0 ㎎/㎗)이고, B는 이상 신장 기능(혈청 크레아티닌 수치 ≥ 2.0 ㎎/㎗)임).
골수종에 대한 또 다른 단계 결정 시스템은 골수종에 대한 국제 단계 결정 시스템(International Staging System)(ISS)이다. 이 시스템은 단계 결정 그룹을 더욱 효율적으로 구별할 수 있고, 베타2-마이크로글로불린(β2-M)과 알부민의 용이하게 측정되는 혈청 수준에 기초한다. 골수종에 대한 ISS에 따라, 단계 I은 β2-M <3.5와 알부민 ≥ 3.5에 의해 특징화되며, 단계 II는 β2-M <3.5와 알부민 <3.5 또는 β2-M 3.5 내지 5.5에 의해 특징화되고, 단계 III은 β2-M >5.5에 의해 특징화된다(다발성 골수종 연구 재단(미국 코넥티컷주 뉴캐넌 소재)).
환자에 있어서의 B 세포 악성 종양의 단계는 임상적 결정이다. 상기 지시된 바와 같이, 고형 종양(solid tumor)과 관련하여, 종양의 폭, 위치, 총수는 단계의 임상적 결정에서 일차적인 인자이다. 비-종양 형성 B 세포 악성 종양을 앓는 환자에서 단계의 결정은 상기 기재된 바와 같은 혈청 수준 측정을 필요로 하여, 더욱 복잡할 수 있다.
B 세포 질환 및 장애의 단계에 관한 설명은 비제한적이다. B 세포 질환 및 장애의 진단에서 당업계에 공지된 다른 특징은 B 세포 질환 또는 장애의 단계를 결정하기 위한, 환자에 대한 기준으로서 이용될 수 있다.
5.22.2. B 세포 악성 종양을 진단하기 위한 임상적 기준
상이한 B 세포 악성 종양에 대한 진단 기준은 당업계에 공지되어 있다. 역사적으로 진단은 전형적으로 현미경적 외관 및 면역표현형의 조합에 기초한다. 더욱 최근에, B 세포 악성 종양의 분자 정의를 개발하기 위하여 유전자-발현 프로파일링과 같은 분자 기술이 적용되고 있다(예를 들어, 문헌 [Shaffer et al., Nature 2:920-932(2002)] 참조). 특정 B 세포 악성 종양의 임상적 진단을 위한 예시적 방법이 이하에 제공된다. 다른 적합한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
5.22.2.1. 여포성 NHL
일반적으로 대부분의 NHL(맨틀 세포 림프종 제외)은 체세포성 극돌연변이(SHM)의 결과인 것으로 보이는 고도로 돌연변이화된 면역글로불린 유전자를 보유한다. NHL에서 가장 일반적인 유전자 이상은 BCL6 유전자의 전좌(translocation) 및 돌연변이다.
여포성 NHL는 종종 여포성 성장 패턴을 갖는 무통성 B 세포 림프종이다. 이는 미국과 서유럽에서 두 번째로 많이 발병하는 림프종이다. 상기 질환이 나타나는 평균 연령은 60세이고, 여성에서 약간 우세하다. 무통성 림프절병증이 가장 일반적인 증상이다. 검사에서, 골수 및 간혹, 말초혈의 침습이 종종 관찰된다. 여포성 NHL은 여포성 소형 절단된 세포에서부터 대형 세포 우세로 연속체(continuum)를 형성하는 등급을 갖는, 여포 내에서 대형 세포의 비율에 기초하여 세포학적 등급(cytologic grade)으로 세분된다(예를 들어, 문헌 [S. Freedman, et al., Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [T. Lister et al., Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N. Y. (2000)] 참조).
대부분의 여포성 NHL은 BCL2의 발현을 유도하는, 염색체 14와 18 사이의 전좌에 의해 특징화된다. 여포성 NHL은 또한, SHM과 진행성 SHM 및 종자 중심(GC) B 세포와 유사한 유전자 발현 프로파일에 의해 특징화되는데(예를 들어, 문헌 [Shaffer et al., Nature 2:920-932 (2002)] 참조), 상기 세포는 이러한 악성에 대한 추정 기원 세포이다. 중쇄- 및 경쇄 재정렬(rearrangement)이 전형적이다. 이러한 질환의 종양 세포는 단클론 표면 면역글로불린을 발현하는데, 특히, IgM을 가장 많이 발현한다. 거의 모든 여포성 NHL 종양 세포는 항원 CD19, CD20, CD79a, CD21, CD35 및 CD10은 발현하나, CD5 및 CD43은 발현하지 않는다. 소형 절단된 세포로 섬유주주위 침윤이 골수 내에서 관찰된다(문헌 [S. Freedman et al., Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [T. Lister et al., Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)]).
여포성 NHL의 진단은 일반적으로 조직 구조와 세포학적 특징을 평가하기 위하여 절개된 결절의 생검에 의존한다. 미세-바늘 흡인(fine-needle aspiration)은 통상 적합하지 않은데, 그 이유는 이러한 절차가 평가될 수 있는 조직을 제공할 가능성이 낮고 추가 검사를 위한 충분한 조직을 제공하지 못하기 때문이다. 좌우 양측 골수 생검 역시 지적되는데, 그 이유는 관여가 부조화일 수 있기 때문이다. 다른 진단 절차에는 흉부 x-선, 흉부, 복부, 목과 골반 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 전체 혈구수 계수 및 화학 프로파일이 포함된다. 여포성 NHL과 다른 성숙 B 세포 림프종을 구별하는데 유세포분석법 및 면역조직화학이 이용될 수 있다(문헌 [S. Freedman et al., Follicular Lymphoma, pp. 367-388, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [T. Lister et al., Follicular Lymphoma, pp. 309-324, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)]).
5.22.2.2. 맨틀 세포 림프종
맨틀 세포 림프종은 이차성 여포의 맨틀 영역에 국한되고, 결절성 및/또는 미만성 성장 패턴에 의해 특징화된다. 맨틀 세포 림프종 환자는 60-65세의 평균 연령을 보유하는데, 상기 질환은 남성에서 우세하다. 진단 목적으로 통상적인 증상 특징은 전신성 림프절병증(generalized lymphadenopathy)이다. 부가적으로 비장이 종종 확장된다. 이러한 B 세포 림프종은 사이클린 D1의 과다발현을 유발하는, IgH 좌위와 사이클린 D1 유전자 사이에 t(11;14)에 관련된다. 사례 중 50% 이상은 부가적인 염색체 이상을 나타낸다. 맨틀-세포 림프종은 전형적으로 SHM에 의해 특징화되지 않는다(문헌 [W. Hiddemann et al., Mantle cell Lymphoma, pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [D. Weisenburger et al., Mantel Cell Lymphoma, pp. 28-41, In Malignant Lymphoma, B. Hancock et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)] 참조).
맨틀 세포 림프종 세포의 면역조직화학의 면역표현형 검사(유세포분석 또는 동결 표본(frozen section))는 이들이 거의 항상 단클론이고, 표면 IgM을 보유한다는 것을 입증한다. 맨틀 세포 림프종 세포는 또한 표면 IgD를 보유하는 것으로 관찰되었다. 이들 세포는 항원 CD19, CD20, CD22 및 CD24는 발현하나 CD23은 발현하지 않는다. 이들은 또한 표면 항원 CD5를 발현하나, CD10을 발현하지 않고, 이들을 거의 항상 CD5 음성인 진성 여포 중심-세포 림프종을 구별한다. 빈번하게, 골수 침윤 및 간과 위장관의 종양을 비롯하여 림프절외 침습(extranodal involvement)이 관찰된다. 경미한 빈혈과 백혈병 표현은 맨틀 세포 림프종에서 드물지 않게 나타난다(문헌 [A. LaI et al., Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pp. 181-220, In W. Finn et al., eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)]; 문헌 [W. Hiddemann et al., Mantel Cell Lymphoma, pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
맨틀 세포 림프종의 진단은 말초혈의 검사 및 골수와 림프절 생검을 수반한다. 또한, 세포유전학 연구 및 면역표현형 검사가 상이한 진단에 사용된다(문헌 [W. Hiddemann, et al., Mantel Cell Lymphoma pp. 461-476, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [D. Weisenburger, et al., Mantel Cell Lymphoma, pp. 28-41, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)]).
5.22.2.3. 버킷 림프종
버킷 림프종은 어린이와 청년에서 전형적으로 관찰되는 침습성 B 세포 림프종이고, 일반적으로 하악 및/또는 복부의 치료하기 어려운 질환과 관련된다. 환자의 대략 20%가 골수 침습을 나타내기 때문이다. 버킷 림프종의 풍토형은 악성 세포의 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 감염을 수반하고; 산발형은 EBV 감염과 무관하다. c-myc 유전자의 탈조절(deregulation)을 유발하는, c-myc의 면역글로불린 좌위로의 전좌는 상기 질환의 특징이다(t(8;14)(q24;q32)). 흥미롭게도, cmyc 서열의 결실은 상기 질환의 산발형에 관여하는 반면, 풍토형은 일반적으로 점 돌연변이 또는 삽입을 수반하는 것으로 보인다(문헌 [V. Pappa, et al., Molecular Biology, pp. 133-157, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)]). 버킷 림프종은 또한 SHM에 의해 특징화되고, 이들 악성 세포는 GC B 세포와 유사한 유전자 발현 프로파일을 보유하는데, 이는 이러한 악성이 GC B 세포로부터 유래된다는 것을 제시한다.
버킷 림프종의 면역표현형은 이러한 질환의 세포가 CD19, CD20, CD22 및 CD79a를 발현하나, CD5, CD23, 사이클린 D 또는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 발현하지 않는다는 것을 입증한다. 빈번하게, 이들 세포는 CD10 및 BCL6에 대하여 양성이고, BCL2에 대하여 통상적으로 음성이다(문헌 [I. Magrath, et al., Burkeitt's Lymphoma, pp. 477-501, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
고급 B 세포 버킷-유사 림프종은 버킷 림프종과 대형 B 세포 림프종 사이의 경계선에 위치하는 림프종이다. 이러한 림프종의 세포는 CD19, CD20 및 CD22를 발현하나, 진성 버킷 림프종에서 거의 항상 존재하는 CD10의 발현이 빈번하게 부재한다. 이들 특징으로 인하여, 일부 연구자들은 상기 림프종이 미만성 대형 B 세포 림프종으로서 분류되어야 한다고 믿고 있다(문헌 [K. Maclennan, Diffuse Aggressive B Cell Lymphoma, pp. 49-54, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)] 참조).
버킷 림프종의 진단은 일반적으로 상기 림프종과 관련된 전좌의 검출에 의존하고; 따라서, 전형적인 세포유전학 분석이 일반적으로 수행된다. 이러한 질환과 관련된 전좌 및 다른 유전자 변형에서 Ig-myc 접합(junction)을 검출하기 위하여 장거리 중합효소 연쇄 반응 기법 및 형광 인시츄 혼성화(FISH)가 사용되고 있다(문헌 [R. Siebert, et al., Blood 91:984-990 (1998)]; 문헌 [T. Denyssevych, et al., Leukemia, 16:276-283 (2002)] 참조).
5.22.2.4. 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL)
DLBCL은 가장 통상적인 비-호지킨 림프종이고, 소형 B 세포 림프종, 여포성 림프종 또는 변연부 림프종으로부터 발생할 수 있다. 전형적으로 환자는 림프절병증을 나타내나; 높은 비율의 환자가 림프절외 부위 역시 나타내고 위장 침습(gastrointestinal involvement)이 가장 일반적이다. 골수 침습은 약 15%의 환자에서 관찰된다(문헌 [Armitage, et al., Diffuse Large B cell lymphoma, pp. 427-453, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]). 임상적, 생물학적 및 형태학적 특징에 있어 이질성(heterogeneity)은 이와 같은 림프종 군을 하위분류하는 것을 어렵게 만든다. 그러나, 종자 중심 B 세포(GC-DLBCL)의 특징적인 유전자를 발현하는 부분집합과 말초혈 B 세포에서 유전자를 과다발현하는 부분집합으로 2가지 상이한 부분집합이 확인되었다. 생존율은 활성화된 B 세포 유형(ABC)-DLBCL 환자보다 GC-DLBCL 환자에서 현저하게 높다(문헌 [W. Chan, Archives of Pathology and Laboratory Medicine 128(12): 1379-1384 (2004)] 참조).
DLBCL은 세포 표면 항원 CD19, CD20, CD22 및 CD79a를 발현한다. CD10은 대다수의 사례에서 발현되고, CD5 발현은 사례의 약 10%에서 관찰된다(문헌 [K. Maclennan, Diffuse Aggressive B Cell Lymphoma, pp. 49-54, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)] 참조). DLBCL은 종종, BCL6의 이상 및/또는 BCL2의 IgH 좌위로의 전좌에 의해 특징화된다. GC B 세포 유사(GC) DLBCL은 고도로 돌연변이화된 면역글로불린 유전자를 보유하는 SHM 및 GC B 세포-유사 유전자 발현 프로파일을 보유하는 악성 클론에서 진행성 SHM에 의해 특징화된다. 대부분의 GC DLBCL은 면역글로불린 클래스 전환(class switching)을 겪는다. ABC-DLBCL은 BCL2, 인터페론 조절 인자 4, CD44, FLIP 및 사이클린 D를 비롯한 NF-κB 표적 유전자의 높은 수준 발현에 의해 특징화된다. SHM은 나타나지만 진행성 SHM은 나타나지 않고, ABC-DLBCL은 GC B 세포 유전자 발현 프로파일을 보유하지 않는다. 거의 모든 ABC-DLBCL은 IgM을 높은 수준으로 발현한다.
5.22.2.5. 림프절외 변연부 림프종
림프절외 변연부 림프종은 조직화된 림프 조직이 정상적으로 부재하는 기관(예를 들어, 위, 타액선, 폐 및 갑상선)에서 발생하는 림프절외 림프종이다. 이는 주로, 60세 초과의 평균 연령을 갖는 노인에게 영향을 주는 질환이다. 종종, 만성 염증 또는 자가면역 과정이 이러한 림프종의 발생을 선행한다. 변연부 림프종의 가장 일반적인 형태인 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염과 관련된다. 여러 연구에서, 항생제 처방 이후 H. 파일로리 감염의 박멸로 증상의 소멸이 입증되었다. 위 MALT 림프종에서 나타나는 증상에는 불특정의 소화불량, 상복부 통증(epigastric pain), 메스꺼움, 위장 출혈, 빈혈 등이 포함된다. 전신성 증상은 드물게 나타나고, 유산 탈수소효소의 상승된 수준 역시 그러하다(문헌 [J. Yahalom, et al., Extranodal Peripheral Zone B Cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [J. Radford, Other Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphomas, pp. 325-330, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)] 참조). 전신 B 증상에는 감염의 징후 없이 2주 초과 동안 38℃ 초과의 열병, 도한(night sweat), 극도의 피로감, 또는 이전 6개월 동안 10% 이상의 의도하지 않은 체중 감소)이 포함된다.
MALT 림프종의 면역표현형은 CD19, CD20, CD79a, CD21 및 CD35의 발현 및 CD5, CD23 및 CD10의 발현 부재에 의해 특징화된다. 대략 절반 정도의 MALT 림프종이 CD43을 발현한다. 상기 질환의 종양 세포 내에서 전형적으로 발현되는 면역글로불린은 IgM이고, IgD는 발현되지 않는다. 이들 특징은 상기 림프종을 다른 소형 B 세포 림프종, 예를 들어 맨틀 세포 림프종, 림프구성 림프종, 여포성 림프종으로부터 구별하는데 매우 중요하다. 삼염색체증(trisomy) 3이 MALT 림프종 사례의 60%에서 보고되었다. 위 및 폐 MALT 림프종의 25-40%에서, t(11; 18)이 관찰된다. 이러한 전좌는 다른 MALT 림프종에서는 훨씬 낮은 빈도로 관찰된다. t(11; 18)는 BCL10의 핵 발현과 관련된다(문헌 [J. Yahalom, et al., Extranodal Peripheral Zone B Cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조). 변연부 림프종은 일반적으로 SHM 및 진행성 SHM에 의해 특징화된다.
진단 절차는 세포 표면 마커의 동일성을 결정하기 위한 면역표현형 검사 또는 유세포분석을 포함한다. 또한, t(11;18)의 존재를 결정하기 위한 분자 유전학적 분석이 수행되어야 하는데, 그 이유는 그것의 존재가 상기 질병이 항생제에 반응하지 않는다는 지표이기 때문이다. H. 파일로리의 존재를 결정하기 위하여 조직학이 이용될 수 있다. 부가적인 검사에는 전체 혈구수 계산; 유산 탈수소효소에 대한 검사를 비롯한 기초적인 생화학 검사; 복부, 흉부, 골반, 골수 생검의 CT 스캔 등이 포함된다(문헌 [J. Yahalom, et al., Extranodal Peripheral Zone B Cell Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, pp. 345-360, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.6. 결절성 변연부 B 세포 림프종
결절성 변연부 B 세포 림프종은 상대적으로 새로 분류된 림프종이기 때문에, 공개된 정보가 거의 없다. 이는 림프절외 및 비장 변연부 림프종 및 유전적 특징과 형태학적 특징을 공유하나, 비장 또는 림프절외에 국한되지 않는 원발성 결절성 B 세포 림프종이다. C형 간염 바이러스가 이러한 림프종과 관련되는 것을 보고되었고, 쇼그렌 증후군도 역시 그러하였다. 문헌 [F. Berger, et al., Nodal Peripheral Zone B Cell Lymphoma, pp. 361-365, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
결절성 변연부 림프종은 이질성 세포 구조(cytology) 및 조직 형태를 보유한다. 대형 세포의 상대적으로 높은 비율로 인하여, 상기 림프종은 다른 변연부 림프종(비장과 림프절외)과 달리, 진성 하위 등급 B 세포 림프종으로 분류될 수 없다. 결절성 변연부 림프종의 유전적 표현형과 면역학적 표현형에는 CD19, CD20, BCL2, sIgM, 세포질 IgG(cIg)의 발현이 포함된다. 이들 세포는 CD5, CD10, CD23, CD43 또는 사이클린 D1을 발현하지 않는다. MALT 림프종의 전좌 특징, t(11;18)은 결절성 변연부 림프종에서 관찰되지 않는다. 이들 특징은 다른 소형 B 세포 림프종으로부터 상기 림프종의 감별 진단(differential diagnosis)에 도움을 준다. (문헌 [F. Berger, et al., Nodal Peripheral Zone B Cell Lymphoma, pp. 361-365, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.7. 비장 변연부 림프종
비장 변연부 림프종은 현저한 비장비대 및 말초혈과 골수의 침윤의 특징적인 임상적 증상을 갖는 무통성 미세-결절성 B 세포 림프종이다. 또한, 상대적으로 높은 수준의 간 침습이 보고되었다. 이러한 림프종에 대한 C형 간염 바이러스에 대한 역할이 가정되었다. 비장 변연부 림프종의 면역표현형은 전형적으로 CD19+, CD20+, IgD+, BCL2 + , p27+, CD3-, CD5-,CD10-, CD23-, CD38-, CD43-, BCL-6 - , 및 사이클린 D1-이다. 유전적 특징은 7q 결실, p53 변형 및 SHM이다. (문헌 [M. Piris, et al., Splenic Marginal Zone Lymphoma, pp. 275-282, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
진단은 일반적으로 세포 표면 마커의 동일성을 결정하는 면역표현형 검사에 의존한다. 세포 표면 마커에 대한 데이터와 함께, 유전적 분석과 생화학적 분석은 이러한 림프종을 다른 소형 B 세포 림프종으로부터 구별하는 데 도움이 된다. (문헌 [M. Piris, et al., Splenic Marginal Zone Lymphoma, pp. 275-282, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.8. 급성(B 세포) 림프구성 백혈병(ALL)
ALL은 주로 1-5세 사이의 어린이에서 가장 높은 비율로 발병하는 골수-기재 신생물이다. 나타나는 가장 일반적인 증상은 피로, 혼수, 열병, 뼈 및 관절 통증이 포함된다. 피로 및 혼수는 빈혈 증상의 정도와 상관된다. 상승된 백혈구 세포 수가 통상적으로 나타난다. 흉부 방사선사진은 종종 골격 병변을 보여준다. 골수외 확산이 일반적이고, 중추신경계, 고환, 림프절, 간, 비장 및 신장에 침습한다. 새로 진단된 사례의 약 5 내지 10%에서만 전종격동 종양이 관찰된다. (문헌 [J. Whitlock, et al., Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)] 참조).
ALL의 면역표현형은 CD10+, CD19+, CD20+, CD22 및 CD24+이다. 예비-B 세포 ALL 세포는 세포질 면역글로불린을 발현하나, 표면 면역글로불린을 발현하지 않는 반면, 성숙 B 세포 ALL(이는 ALL 사례의 1-2%에 불과함)은 표면 면역글로불린의 발현에 의해 B 세포 계열의 다른 백혈병과 구별된다. ALL의 세포유전학적 특징에는 t(8;14), t(2;8) 및 t(8;22)이 포함된다. 세포유전학적 수준에서 드물게 검출되긴 하나, t(12;21)는 유년기 ALL(약 25%의 사례에서 관찰됨)과 관련하여 가장 통상적인 세포유전학적 이상일 수 있다(문헌 [M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Acute Leukemia, pp. 2209-2240, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)]; 문헌 [J Whitlock, et al., Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)] 참조).
급성 백혈병의 정확한 진단은 통상적으로 골 흡인물(bone aspirate) 및 생검에 의존한다. 흡인물 도말표본(aspirate smear)이 형태학적, 면역학적, 세포학적 평가에 사용된다. 골수 내에서 림프아구의 존재는 ALL의 특징이다. 골수 내에서 5% 초과의 백혈병성 림프아구성 세포의 존재는 ALL 진단을 확증하나, 대부분의 경우에, 결정적인 진단을 위하여 25% 초과이어야 한다. 중추신경계 침습을 진단하기 위하여 요추 천자(lumbar puncture)가 사용된다. 혈청 요산 수준과 혈청 락테이트 탈수소효소 수준이 ALL에서 상승하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [M. Kinney, et al., Classification and Differentiation of the Acute Leukemia, pp. 2209-2240, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)]; 문헌 [J. Whitlock, et al., Acute Lymphocytic Leukemia, pp. 2241-2271]; 문헌 [In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee, et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (1999)] 참조).
5.22.2.9. 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소형 B 세포 림프구성 림프종(SLL)
CLL/SLL은 백혈병의 가장 통상적인 유형이다. 상기 질환이 말초혈과 골수에 침습하면, 이는 CLL로 불린다. 그러나, 림프절 및 다른 조직이 CLL에서의 그것과 면역학적으로 형태학적으로 동일한 세포에 의해 침윤되지만 상기 질환의 백혈병 특징이 부재하는 경우에는 SLL로 불린다. 이러한 질환은 주로, 노인에게 영향을 주고, 여성보다 남성에서 더욱 높은 빈도로 발병한다. 무통성 림프절병증이 가장 일반적으로 관찰된다. 저감마글로불린혈증은 면역글로불린의 임의의 특정 하위부류가 아닌 전체 면역글로불린의 감소된 수준을 나타내는 대부분의 CLL/SLL 사례에서 공통적이다. 무증상 환자는 빈번하게, 정기적인 혈구수 계산 동안 진단된다(5000×109/L 초과의 림프구 수). CLL/SLL 사례의 20% 정도가 B 증상을 보고한다. 부가적인 진단 특징은 미성숙 림프구에 의한 30% 초과의 골수 침윤이다. 림프절 생검은 일반적으로 잘 분화된 림프구에 의한 침습된 결절의 침윤을 보여준다. 자가면역 용혈성 빈혈과 면역 혈소판감소증을 비롯하여 자가면역 폐렴이 종종, CLL/SLL과 관련된다. (문헌 [J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [K. Maclennan, Diffuse Indolent B Cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N. Y. (2000)]; 및 문헌 [Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)] 참조).
많은 하위 등급 B 세포 악성 종양과 대조적으로 CLL/SLL에서는 작위적 상호 전좌가 거의 발견되지 않는다. 그러나, 13ql4, 11q22-23, 및 17ql3에서 결실을 비롯한 다른 세포유전학적 이상이 보고되었는데, 후자 2개는 p53 좌위에 영향을 준다. 사례의 대략 20%가 삼염색체증 12를 나타낸다. 상승된 수준의 β2-마이크로글로불린, 더욱 높은 수준의 CD38 발현 및 종양 괴사 인자-알파의 생산 모두 CLL/SLL의 특징이다. CLL/SLL의 면역표현형은 매우 특징적인데, 표면 면역글로불린, 통상적으로 IgM, 또는 IgM과 IgG의 약한 발현 및 세포 항원 CD19, CD22 및 CD20과 통상적으로 CD5 및 CD23의 발현을 포함한다. (문헌 [J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 및 문헌 [K. Maclennan, Diffuse Indolent B Cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N. Y. (2000)]).
5.22.2.10. B 세포 전림프구성 백혈병(PLL)
한때 CLL의 변종으로 간주되었던 PLL은 현재, 별개의 질환으로 이해되고 있다. PLL은 일반적으로 노인 남성의 질환이고 매우 높은 백혈구 세포 수(200×109/L 초과) 및 비장비대에 의해 특징화된다. 부가적인 증상에는 빈혈 및 혈소판감소증이 포함된다. PLL에서 전림프구는 혈액과 골수 내에서 세포의 55% 초과를 차지한다. CLL과 대조적으로 PLL에서는 자가면역 현상이 드물게 관찰된다. 문헌 [J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA(2004)] 참조).
PLL의 면역표현형은 CD19, CD21, CD22, CD24 및 FMC7의 발현에 의해 특징화된다. PLL 세포는 CD23을 발현하지 않고, 대부분의 경우에 CD5를 발현하지 않는다. PLL 세포는 복잡한 염색체 이상을 나타내는데, 13q14 및 11q23이 가장 빈번하다. PLL 세포에서 p53 돌연변이의 패턴은 CLL에서 관찰되는 것과 상이하다. 감별 진단은 일반적으로 전체 혈구수 계산, 조직학적 분석, 면역학적 분석, 유전적 분석에 의존한다. 문헌 [J. Gribben, et al., Small B Cell Lymphocytic Lymphoma/Chronic Lymphocytic Leukemia and Prolymphocytic Leukemia, pp. 243-261, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.11. 모발상 세포 백혈병(HCL)
HCL은 주로 여성보다는 남성에서 중년의 개체군에 영향을 주는 드물게 발병하는 무통성 만성 백혈병이다. 전형적인 증상에는 심한 비장비대 및 범혈구감소증(pancytopenia)이다. 말초혈과 골수는 전형적인 "모발상 세포"를 보유하는데, 이들은 세포질 돌출(cytoplasmic projection)을 보이는 B 림프구이다. HCL 환자의 90% 초과가 골수 침윤을 가진다. 문헌 [Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)]; 문헌 [J. Johnston, Hairy Cell Leukemia, pp. 2428-2446, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)] 참조).
세포유전학 분석에서, 클론 이상이 사례의 19%에서 존재하고, 염색체 5, 7 및 14의 수치적 이상과 구조적 이상에 관련되는 것으로 밝혀졌다. TNF-α의 혈청 수준은 모발상 세포 백혈병에서 상승하고, 종양 부하량(tumor burden)과 상관한다.
모발상 세포 백혈병 세포는 표면 면역글로불린(IgG 및 IgM)을 발현하고 CD11c, CD19, CD20 및 CD22와 전형적으로는 CD25를 발현한다. 또한, FMC7, HC-2 및 CD103이 발현된다. HCL 세포는 CD5 또는 CD10을 발현하지 않는다. 진단은 일반적으로 골수 흡인물의 이용, 세포유전학, 혈액 스미어, 면역표현형 검사를 수반한다. 문헌 [Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)]; 문헌 [J. Johnston, Hairy Cell Leukemia, pp. 2428-2446, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)] 참조).
5.22.2.12. 전구체 B 세포 림프성 림프종/예비-B 세포 급성 림프성 백혈병/림프성 림프종
전구체 B 세포 림프성 림프종/예비-B 세포 급성 림프성 백혈병/림프성 림프종은 전구체 T 또는 B 세포의 질환이다. 이 T 및 B 세포 림프성 림프종은 형태학적으로 동일하나, 골수 침윤 또는 골수 침습의 정도에 기초하여 임상적 구별이 이루어질 수 있다. 림프성 림프종의 85 내지 90%은 T-세포에서 유래되고, 나머지는 B 세포에서 유래된다. 림프성 림프종은 평균 20세에 발병하고, 남성에서 우세하다. 말초 림프절 침습은 특히, 경부, 쇄골상 및 겨드랑이 부위에서 일반적으로 나타나는 증상이다. 이러한 질환은 빈번하게 골수 침습이 나타난다. 중추신경계에는 발생이 덜하나, 재발의 사례에서 종종 나타난다. 다른 침습 부위에는 간, 비장, 골, 피부, 인두 및 고환이 포함될 수 있다. 문헌 [J. Sweetenham, et al., Precursor B- and T-Cell Lymphoblastic Lymphoma, pp. 503-513, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
전구체 B 세포 림프성 림프종은 CD99, CD34, 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 같은 미성숙 마커 B 세포 마커를 발현한다. 이들 세포는 또한 CD79a, CD19 및 CD22와 간혹, CD20을 발현하고, CD45 및 표면 면역글로불린의 발현이 전형적으로 부재한다. 11q23에서 전좌 및 t(9;22)(q34;q11.2) 및 t(12;21)(p13;q22)은 불량한 예후에 관련되었다. 양호한 예후는 특히, 삼염색체증 4, 10 및 17, 및 t(12;21)(p13;q22)와 관련된 다배수성 핵형에 관련된다(문헌 [J. Sweetenham, et al., Precursor B- and T-Cell Lymphoblastic Lymphoma, pp. 503-513, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
진단 검사는 림프절 생검, 혈액 검사, x-선, CT 스캔 및 뇌척수액(cerebralspinal fluid)에서 악성 세포를 시험하기 위한 요추 천자(lumbar puncture)를 포함한다.
5.22.2.13. 원발성 종격동 대형 B 세포 림프종
원발성 종격동 대형 B 세포 림프종은 젊은 여성에서 주로 발생하고 흉선에서 기원하는 국소 침입성 전종격동 종양에 의해 특징화되는 미만성 대형 B 세포 림프종이다. 말초 결절로의 원위 확산 및 골수 침습은 비통상적이다. 전신성 증상이 통상적이다. 상기 질환이 결절성 대형 세포 림프종과 유사하긴 하나, 이는 구분된 유전학적, 면역학적 및 형태학적 특성을 가진다.
원발성 종격동 대형 B 세포 림프종의 종양 세포의 면역표현형은 종종, 면역 면역글로불린 음성이지만 CD19, CD20, CD22 및 CD79a와 같은 B 세포 관련된 항원을 발현한다. CD10 및 BCL6도 역시 통상적으로 발현된다. 형질 세포 관련된 마커 CD15, CD30, 상피세포 막 항원(EMA)의 발현은 드물다. BCL6 및 c-myc 유전자 정렬도 역시 비통상적이다. 클론 면역글로불린 재정렬, 면역글로불린 가변 영역 및 BCL6 초돌연변이와 함께 유전자 초돌연변이의 존재는 상기 림프종이 성숙 종자 중심 또는 포스트-종자 중심 B 세포로부터 유래된다는 것을 제시한다. 이러한 질환의 종양과 연관하는 것으로 생각되는 염색체 전좌는 다른 형태의 미만성 대형 세포 림프종에서 관찰되는 것들과 유사하다. 문헌 [P. Zinzani, et al., Primary Mediastinal Large B Cell Lymphoma, pp. 455-460, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
원발성 종격동 대형 B 세포 림프종에 대한 진단적 평가는 일반적으로 전체 신체 검사, 전체 혈액학적 분석 및 생화학적 분석, 전신성 컴퓨터 단층촬영 및 골수 생검을 포함한다. 갈륨-67 스캐닝 검사가 단계 결정, 치료에 대한 반응, 및 재발의 평가에 유용하다. 문헌 [P. Zinzani et al., Primary Mediastinal Large B Cell Lymphoma, pp. 455-460, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.14. 림프형질세포 림프종(LPL)/림프형질세포 면역종/발덴스트롬 마크로글로불린혈증
LPL/림프형질세포 면역종/발덴스트롬 마크로글로불린혈증은 일반적으로 무통성이며, 종종, 골수, 림프절 및 비장을 침습하는 결절성 림프종이다. 이는 일반적으로 노인성 질환이고 남성에서 약간 우세한다. 대부분의 환자는 혈청의 과점도를 유발하는 단클론 IgM 파라단백질(>3 g/㎗)을 그들의 혈청 내에 보유한다. 종양 세포는 형질세포 형태를 보유한다. LPL의 부분집합은 염색체 9와 14 사이에 재발성 전좌에 의해 특징화되는데, 이는 PAX5 및 면역글로불린 중쇄 좌위에 영향을 준다. LPL은 SHM 및 진행성 SHM에 의해 특징화되고, 포스트-GC B 세포로부터 유래되는 것으로 생각된다(문헌 [A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [K. Maclennan, Diffuse Indolent B Cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N. Y. (2000)]; 문헌 [A. LaI, et al., Role of Fine Needle Aspiration in Lymphoma, pp. 181-220, In W. Finn, et al., eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)] 참조).
이러한 질환의 면역표현형은 B 세포 관련된 항원 CD19, CD20, CD22 및 CD79a의 발현, 및 CD5, CD10 및 CD23의 발현의 결여를 나타낸다. 강한 표면 면역글로불린과 CD20의 존재, CD5 및 CD23의 발현의 결여, 세포질 면역글로불린의 부재는 상기 질환을 만성 림프구성 백혈병과 구별하는 데 도움을 주는 특징이다. 또한, t(9;14)(p13;q32)도 상기 질환의 특징이다. (문헌 [A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)]; 문헌 [K. Maclennan, Diffuse Indolent B Cell Neoplasms, pp. 43-47, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N. Y. (2000)]; 문헌 [R. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, pp. 809-824, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
진단 검사는 전형적으로 전체 혈구수 계산, 신장과 간 기능 검사, CT 스캔, 골수의 생검과 흡인 및 파라단백질과 혈청 점도를 정량하고 특징화하기 위한 단백질 전기영동을 포함한다. β2-마이크로글로불린의 측정은 예후 검사로서 이용된다. (문헌 [A. Rohatiner, et al., Lymphoplasmacytic Lymphoma and Waldstrom's Macroglobulinemia, pp. 263-273, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2004)] 참조).
5.22.2.15. 무(null)-급성 림프아구성 백혈병
무-급성 림프아구성 백혈병은 B- 또는 T-세포 특징이 부재하는 ALL의 부분집합이다. 백혈병성 아세포의 표현형 분석은 전형적 무-ALL 패턴, 즉 CD10(통상적인 ALL 항원)-음성, 강한 HLA-DR-양성, CD19(B4)-양성을 보인다(문헌 [Katz et al. (1988) Blood 71(5):1438-47] 참조).
5.22.2.16. 호지킨 림프종
호지킨 림프종은 통상 청년의 림프절 내에서 발생한다. 이는 표준적인 아형 및 덜 일반적인 결절성 림프구성 우성 아형으로 구분될 수 있다. 표준형은 SHM을 나타내지만 진행성 SHM을 나타내지 않고, GC B 세포 유전자 발현 프로파일을 보유하지 않는다. 대조적으로 결절성 림프구 우세형은 SHM과 진행성 SHM, 및 GC B 세포 유전자 발현 프로파일에 의해 특징화된다. 이 2가지 유형이 임상적으로 또한 생물학적으로 상이하긴 하나, 이들은 양성 염증 세포의 배경 내에서 신생물 세포의 결여와 같은 일정한 특징을 공유한다. 문헌 [B. Schnitzer et al., Hodgkin Lymphoma, pp. 259-290, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)] 참조).
증상에서 가장 통상적인 특징은 통상은 목, 또한 경우에 따라 서혜(inguinal) 부위에서의 림프절의 무통증 확장이다. 결절의 왁싱(waxing)과 종말(waning) 역시 상기 질환의 특징이다. B 증상은 환자의 약 1/3에서 관찰된다. 독립된 림프절외 침습은 드물고, 파종(dissemination)이 발생한 사례에서, 림프절외 침습은 전체 기간의 약 10 내지 20%에서 관찰된다. 문헌 [P. Johnson et al., Hodgkin's Disease: Clinical Features, pp. 181-204, In Malignant Lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)] 참조).
리드-스턴버그(Reed-Sternberg)(RS) 세포는 호지킨 림프종의 악성 세포이다. RS 세포 및 이들의 변이체는 CD15, CD25, CD30 및 트랜스페린 수용체를 발현한다. 또한, 이들 세포는 다클론 세포질 면역글로불린을 발현한다. 대부분의 호지킨 림프종 사례에서, RS 세포는 CD45를 발현하지 않는데, 이는 상기 질환을 비-호지킨 림프종으로부터 구별하는 데 도움을 주는 특징이다. 엡스타인-바르(Epstein Barr) 바이러스는 호지킨 림프종 사례의 약 절반에서 리드-스턴버그 세포 내에 존재하는 것으로 입증되긴 했지만 그것의 역할은 확실치 않다.
진단은 가장 빈번하게는, 림프절 생검에 의해 행해진다. 부가적인 진단 검사에는 전혈 측정(종종, 혈액학적 검사는 정상이고; 1.0×109/L 미만의 백혈구 세포 수가 사례의 약 20%에서 관찰된다), 적혈구 침강 속도(종종, 상기 질환의 진행된 단계에서 상승한다); 전해질, 요소, 크레아티닌, 요산염(urate)을 비롯한 생화학적 검사(고칼슘혈증이 드물긴 하나, 발병하는 경우에, 과도한 골 침습에 관련된다), 간 혈액 검사, 락테이트 탈수소효소(종종, 상승된 수준이 진행된 질병과 연관한다), 알부민, 베타2-마이크로글로불린(β2-M)이 포함된다. 흉부, 복부, 골반의 림파니지오그램 및 흉부 x-선 및 CT 스캔은 이상 림프절 및 림프절외 침습의 정도를 확인하는데 중요하다. 골수 생검은 전형적으로 선택적인 것으로 간주되는데, 그 이유는 골수 침습이 드물고, 이런 생검의 결과가 임상적 관리 또는 예후에 영향을 주지 않는 것으로 생각되기 때문이다. 비절제(splenectomy)는 현재, 통상적으로 수행되지 않는데, 그 이유는 이런 절차가 관리에 거의 영향을 주지 않고, CT 또는 MRI 영상이 비장 상태에 대한 정보를 제공하기 때문이다. 현저하게 상승된 수준의 p55, TNF, sICAM-1은 상기 질환의 단계, 증상의 존재 및 완전 반응 속도에 상관된다. (문헌 [P. Johnson, et al., Hodgkin's Disease: Clinical Features, pp. 181-204, In Malignant lymphoma, B. Hancock, et al., eds., Oxford University Press, New York, N.Y. (2000)]; 문헌 [Clinical Oncology, A. Neal, et al., Neal, Hoskin and Oxford University Press, co-publ., New York, NY (2003)]; 문헌 [R. Stein, Hodgkin's Disease, pp. 2538-2571, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)] 참조).
5.22.2.17. 다발성 골수종
다발성 골수종은 형질 세포의 악성 종양이다. 신생물 세포는 골수 내에 국한되고, 골용해성 골 병변(osteolytic bone lesion)이 그것의 특징이다. 면역글로불린 좌위와 다양한 다른 유전자, 예를 들어 사이클린 D1, 사이클린 D3, c-MAF, MMSET (다발성 골수종 SET-도메인 단백질) 또는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 사이의 상호 염색체 전좌(reciprocal chromosomal translocation)는 일차적 발암 현상인 것으로 생각된다. 다발성 골수종은 SHM에 의해 특징화되고, 추정 기원 세포는 포스트-GC B 세포이다. 다발성 골수종은 전형적으로 재발성 감염, 피로, 통증, 신장 문제와 같은 증상으로 먼저 확인되고, 임상적 검사로 확증된다. (문헌 [Cancer: Principles and Practice of Oncology. 6th edition. DeVita, V.T., Hellman, S. and Rosenberg, S. A. editors. 2001 Lippincort Williams and Wilkins Philadelphia, PA 19106 pp. 2465-2499] 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 치료 후보가 되는 환자는 CBC에서 보고된 세포 유형이 당업계에 공지된 그들의 정상적인 범위 내에 있는 지를 결정하는 전체 혈구수 계산(CBC), 다양한 혈액 성분, 예를 들면, 알부민, 혈액 요소 질소(BUN), 칼슘, 크레아티닌, 락테이트 탈수소효소(LDH)의 수준이 표준 수치로부터 벗어나는 지를 결정하는 혈액 화학 프로파일을 비롯하여, 다발성 골수종의 진단 또는 의심을 확증하기 위한 혈액 및/또는 소변에 대한 진단 검사를 추가로 받을 수 있다. 베타2-마이크로글로불린(β2-M)의 혈청 수준을 또한 검사하여, 골수종 세포에 대한 성장 인자, IL-6에 대한 마커를 대위할 수 있다. 소변 내에서 단백질의 수준을 측정하기 위하여 검뇨(urinalysis)가 사용될 수 있다. 혈액 내에서(혈청 단백질 전기영동, 또는 SPEP), 또는 소변 내에서(소변 전기영동, 또는 UEP), M 단백질을 비롯한 다양한 단백질의 수준을 측정하기 위하여 전기영동이 이용될 수 있다. 존재하는 이상 항체 단백질에 관한 더욱 구체적인 정보를 제공하기 위하여 면역고정 전기영동(IFE) 또는 면역전기영동이라고 하는 검사가 추가로 수행될 수도 있다. 다양한 단백질, 특히, M 단백질의 변화와 비율을 평가하여 골수종 질환의 진행 및 치료 처방에 대한 반응을 추적할 수 있다. 다발성 골수종은 골수종 종양 세포에 의해 분비되는 M 단백질의 급격한 증가에 의해 특징화된다.
다발성 골수종의 진단 또는 의심을 확인하기 위하여 골에 대한 진단 검사가 또한 수행될 수 있는데, 여기에는 골 구조에서 변화를 평가하고 골 내에서 종양의 수와 크기를 결정할 수 있는 X-선 및 골(골격) 조사, 자기공명 영상(MRI), 및 컴퓨터 단층촬영(CT)으로도 알려진 전산화 축성 단층촬영(CAT)을 비롯한 다른 영상 검사가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 골수 내에서 형질 세포의 총수에서 증가를 검출하기 위하여 골수 흡인 또는 골수 생검이 이용될 수 있다. 흡인은 액상 골수의 샘플을 요하고, 생검은 고형 골 조직의 샘플을 요한다. 양쪽 검사에서, 샘플은 골반(관골(hip bone))으로부터 채취될 수 있다. 골수의 흡인을 위하여 복장뼈도 역시 이용될 수 있다.
다발성 골수종 환자는 전형적으로 효과적인 치료 처방을 규정하는 데 도움이 되는 하기 3가지 군으로 분류된다. 미확정 단클론 감마병증(MGUS)은 전형적으로 3 g/㎗ 미만의 혈청 M 단백질 수준, 10% 미만의 골수 클론 형질 세포, 다른 B 세포 질환의 증거가 없다는 점, 관련된 기관 또는 조직 손상, 예를 들어 고칼슘혈증(증가된 혈청 칼슘 수준), 및 증가된 혈청 크레아티닌으로 확인되는 손상된 신장, 빈혈, 또는 골 병변이 없다는 점에 의해 특징화된다. 무증상 골수종은 전형적으로 단계 I이고, 아급성 다발성 골수종(SMM)과 무통성 다발성 골수종(IMM)을 포함한다. SMM은 3 g/㎗ 이상의 혈청 M 단백질에 의해 특징화되고, IMM은 골수 세포의 10% 이상의 골수 클론 형질 세포에 의해 특징화된다. 증상성 골수종은 혈청 및/또는 소변 내에 M 단백질에 의해 특징화되고, 골수 클론 형질 세포 또는 형질구종의 존재에 의해 특징화되는 단계 II 다발성 골수종 및 관련된 기관 또는 조직 손상에 의해 특징화되는 단계 III 다발성 골수종을 포함한다.
골경화성 골수종은 드물게 발생하는 POEMS 증후군(다발신경병증(polyneuropathy) 및 장기비대(organomegaly), 내분비병증(endocrinopathy), 단클론 감마병증, 피부 병소)의 한 구성요소이다. 피크 발생율(Peak incidence)은 40 내지 50세 연령에서 나타난다. 전신성 특징에는 골격 병변, 골수-형질(marrow-plasma) 세포 < 5%, 정상 CBC, 증가된 혈소판 및 장기비대가 포함된다. CSF는 높은 단백질 함량을 보유하고, 세포가 존재하지 않는다. M-단백질 수준이 낮다(<3 g/㎗, 평균 = 1.1 g/㎗); 중쇄 분류 - 통상 α 또는 γ; 경쇄 분류 - 통상 λ; 희박한 요소 단클론과 간혹, 한냉글로불린혈증(cryoglobulinemia). 신경병증(neuropathy)이 원위 및 근위가 모두 약화된 환자의 50%에서 발생하고, 감각 상실(sensory loss)은 소형 섬유(small fiber)에서보다 크고; 탈수초화(demyelination)와 긴 원위 잠복(long distal latency)가 있다.
아급성 다발성 골수종 환자는 일반적으로 수개월/수년 동안 안정적인 질환; 빈혈, 골 병변, 신장 부전 또는 고칼슘혈증이 없고; 골수 및 단클론 혈청 단백질 내에서 >10% 형질 세포를 가진다. 아급성 다발성 골수종에 대한 기준은 다발성 골수종의 진단에 필적하나; 진행 과정의 증거가 없다. 이들은 진행이 느린 사례이고, 종양 세포량이 진단 시에 적고, S 기에서 골수 형질 세포의 비율이 낮다(<0.5%). 특징적인 임상적 증상에는 하기가 포함된다: 혈청 M 단백질 수준 >3 g/㎗ 및/또는 골수 형질 세포 ≥10%; 빈혈, 신부전, 고칼슘혈증, 및 용해성 골 병변의 부재.
무통성(또는 무증상) 다발성 골수종은 증상의 부재에서, 통상적으로 스크리닝 실험실 연구이후 우연히 진단되는 다발성 골수종이다. 무통성 다발성 골수종은 아급성 골수종과 유사하나, 극소수의 골 병변과 경미한 빈혈을 나타낸다. 무통성 다발성 골수종의 대부분의 사례는 3년 이내에 명백한 다발성 골수종으로 발달한다. 진단 기준은 하기 사실을 제외하고 다발성 골수종에서와 동일하다: 골 병변 없음 또는 무증상 용해 병변(X-선 검사); M 성분 수준: IgG의 경우에는 <3 g/㎗, IgA 소변 경쇄 < 4 g/24h의 경우에는 2 g/㎗; 헤모글로빈 >10 g/㎗, 혈청 칼슘 정상, 혈청 크레아티닌 <2 ㎎/㎗, 및 감염 없음.
5.22.2.18. 단발성 형질세포종
단발성 형질세포종(solitary plasmacytoma)은 양성 단클론 감마병증에서부터 단발성 형질세포종 내지 다발성 골수종까지 광범위한 형질 세포 신생물 중의 하나이다. 전체 단발성 형질세포종 중에서 대략 70%가 궁극적으로 다발성 골수종을 유발한다. 이들 질환은 특징적인 파라단백질을 생산하는 B 세포의 증식에 의해 특징화된다. 단발성 형질세포종은 단발성 부위, 일반적으로 단일 골 또는 골수외(extramedullary) 조직 부위 내에서 클론 형질 세포의 증식을 초래한다. 단발성 형질세포종의 진단 기준에는 조직학적으로 확증된 단일 병변, 정상적인 골 생검, 음성 골격 검사결과, 빈혈 없음, 정상적인 칼슘과 신장 기능 등이 포함된다. 대부분의 사례는 최소로 상승된 혈청 M-단백질(파라단백질)을 나타낸다. 진단 시에 평균 연령은 다발성 골수종의 평균 연령보다 대략 5 내지 10세 낮은 50 내지 55세이다. (문헌 [C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pp. 113-144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004), S. Chaganti, et al., Cytogenetics of Lymphoma, pp. 809-824, In Non-Hodgkin's Lymphomas, P. Mauch, et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, (2004)] 참조).
형질세포종의 면역표현형 특징 및 유전적 특징은 다발성 골수종과 유사한 것으로 보인다.
5.22.2.19. 경쇄 질환/경쇄 침착 질환(LCDD)
LCDD는 조직 내에 침착되는 면역글로불린 경쇄(통상 카파 경쇄)의 과다-발현에 의해 유발되는 형질 세포 질환(dyscrasias)이다. 환자는, 통상적으로 기관 기능부전, 약화, 피로 및 체중 감소를 나타낸다. LCDD의 사례의 대략 80%에서, 단클론 면역글로불린이 검출된다. 면역 형광 기술을 이용한 단클론 카파 경쇄의 검출은 과도한 배경 염색(background staining)을 제공하는 경쇄의 성향으로 인하여 제한되고, 이에 따라 초미세구조 면역황금 표지가 필요할 수 있다. (문헌 [C. Wilson, The Plasma Cell Dyerasias, pp. 113-144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (2004)] 참조).
5.22.2.20. 형질 세포 백혈병(PCL)
PCL, 형질 세포 백혈병은 드물게 발생하는 다발성 골수종의 침습성 변이체이다. 형질 세포 백혈병에 대한 기준은 2×109/L 초과의 말초혈 형질 세포 절대치 또는 백혈구 세포의 20% 초과의 형질 세포이다. 유세포분석법에 의한 세포질 경쇄 제한으로 CD138+ 개체군의 존재의 결정은 PCL을 형질세포 특성을 갖는 림프 신생물과 구별할 것이다. PCL 세포는 또한 표면 경쇄와 CD19 발현의 결여 및 CD45의 발현 없음이나 약한 발현에 의해 특징화된다. PCL의 사례의 약 50%가 CD20을 발현하고 약 50%는 CD56의 발현이 부재한다. PCL 환자에서 관찰되는 유전적 이상은 다발성 골수종 환자에서 관찰되는 것들과 동일하긴 하나, PCL에서 이들의 빈도가 더욱 높다(문헌 [C. Wilson, The Plasma Cell Dycrasias, pp. 113-144, In W. Finn and L. Peterson, eds., Hematopathology in Oncology, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA, (2004)] 참조).
형질 세포 백혈병은 2가지 형태를 가진다: 최초 진단이 골수종의 백혈병성 기에 기초하면 일차성 형태이고, 그렇지 않으면 이차성 형태이다. 일차성 형질 세포 백혈병은 어린 연령, 간비종대, 림프절병증, 및 극소수의 용해성 골 병변에 관련되지만, 이차성 형태보다 예후가 불량하다. 형질세포 백혈병 환자의 말초혈은 2000/㎖ 또는 그 이상의 절대치로, 20% 초과의 형질 세포를 보유한다.
5.22.2.21. 미결정 유의성 단클론 감마병증(MGUS)
MGUS는 전기영동에서 균일한 면역글로불린 또는 양성 M-성분의 존재에 의해 특징화되는 상대적으로 통상적인 질환이다. 이러한 질환의 발생은 연령에 따라 증가하는 것으로 보인다. M-성분을 보유하는 대부분의 개체는 악성 형질 세포 질환, 예를 들어 다발성 골수종이 발병하지 않는다. 그러나, 이러한 질환을 앓는 일부 개체는 관련된 악성 질환을 나타낸다. 증상성인 경우에, 환자는 확장된 간 또는 비장 및 흉막신경병증(pleuroneuropathy)을 가질 수 있다. (문헌 [J. Foerster, Plasma Cell Dycrasias: General Considerations, pp. 2612-2630, In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)] 참조).
MGUS는 말초혈 내에서 순환하는 증가된 수의 단클론 형질 세포의 존재에 이해 다발성 골수종으로부터 차별화될 수 있다. M-성분의 혈청학적 특징은 다른 형질 세포 질환에서와 동일하나, M-성분의 전체 농도가 일반적으로 30 g/L 미만이다. 파라단백질은 일반적으로 IgG이나; IgG, IgA, IgM을 비롯한 복수의 파라단백질이 존재할 수도 있다. 개별 면역글로불린 분류 각각의 상대적인 양은 정상 혈청 내에서 관찰되는 양에 전형적으로 비례한다. 단백혈증(proteinemia) 또는 단백뇨증(proteinuria)은 드물다. 혈액과 소변 내에서 M-단백질 수준의 일련의 측정 및 임상적 특징과 실험적 특징의 지속된 모니터링(단백질 전기영동 포함)이 MGUS를 초기 단계 형질 세포 질환과 구별하는 가장 신뢰가능한 방법이다(문헌 [In Wintrobe's Clinical Hematology, Tenth Edition, G. Lee et al., eds. Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1999)]).
5.22.2.22. 성숙 B 세포 악성 종양
다른 한 실시양태에서, 본 발명은 여포성 림프종; 맨틀 세포 림프종; 버킷 림프종; 다발성 골수종; 종자 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL 및 3형 DLBCL을 비롯한 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL); 표준형 및 결절성 림프구 우세형을 비롯한 호지킨 림프종; 림프형질세포 림프종(LPL); 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종을 비롯한 변연부 림프종; 및 면역글로불린-돌연변이화된 CLL과 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 비롯한 만성 림프구성 백혈병(CLL)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 성숙 B 세포 악성 종양을 치료하기 위해 수행될 수 있다.
5.22.2.23. 예비-B 세포 악성 종양
또한, CD19는 예를 들어, CD20과 달리 B 세포 발달 시에 초기에 발현되기 때문에, 예를 들어 골수 내에서 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양을 치료하는데 특히 적합하다. 대표적인 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양에는 맨틀 세포 림프종, 예비-B 세포 급성 림프성 백혈병, 전구체 B 세포 림프성 림프종 및 CD19 발현에 의해 특징화되는 다른 악성 종양이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
5.23. 환자 진단 및 치료 처방: 이식
본 발명의 특정 측면에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용되는 치료 처방 및 용량은 예를 들어, 체액성 거부반응, 또는 그러한 거부반응이 발병하고 있는 임상적 증상의 위험에 처한 것으로 판단토록 하는 임상적 표시를 포함한 다수의 인자들에 기초하여 선택된다. 용어 "체액성" 및 "항체-매개"는 본원에서 혼용된다.
환자가 체액성 거부반응을 발병하게 될 위험을 판단을 위한 기준이 당업계의 지식 및 기술에 따라 확립되어 있다. 한 실시양태에서, 양성 보체 의존성 세포독성 또는 항글로불린 증진된 보체 의존성 세포독성 교차는, 환자가 체액성 거부반응에 대한 큰 위험에 처해 있음을 가리킨다. 한 실시양태에서, 양성 교차 또는 기존 양성 보체 의존성 세포독성 또는 항-글로불린 증진된 보체 의존성 세포독성 교차는, 환자가 체액성 거부 반응에 대한 중간 위험에 처해 있음을 가리킨다. 한 실시양태에서, 음성 교차는, 환자가 체액성 거부반응에 대한 낮은 위험에 처해 있음을 가리킨다.
또 다른 실시양태에서, 이식편 거부반응에 대한 예방이 필요한 이식 수령자는 이식 전에 검출가능 순환 항-HLA 동종항체를 갖는 환자 또는 환자 개체군으로 확인될 수 있다. 또 다른 예에서, 환자 또는 환자 개체군은 이식 전에 패널 반응성 항체를 가지는 것을 확인된다. 이식후 이식 수령자 내 검출가능 순환 항-HLA 동종항체의 존재는 또한 본 발명에 따라 체액성 거부반응을 치료할 필요가 있는 환자 또는 환자 개체군을 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 체액성 거부반응을 치료할 필요가 있는 환자 또는 환자 개체군은 또한 이식 수령자가 체액성 거부반응을 발병할 위험에 처해 있거나, 이미 체액성 거부반응을 발병하였음을 가리키는 기타 임상적 기준에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 체액성 거부반응을 치료할 필요가 있는 이식 수령자는, 체액성 거부반응의 초기 단계, 예컨대 순환 항-도너 동종항체에 의해 특징화되는 잠재 체액성 반응 상태에 있는 환자 또는 개체군으로 확인될 수 있다. 체액성 거부반응의 초기 단계는 또한 순환 항-도너 동종항체 및 C4d 침착에 의해 특징화되는 침묵 반응, 또는 순환 항-도너 동종항체, C4d 침착 및 조직 병리에 의해 특징화되는 준임상적 거부반응일 수 있다. 후기 단계에서, 수령자는 당업계의 지식 및 기술에 따라 특징화되는, 예를 들어 순환 항-도너 동종항체, C4d 침착, 조직 병리 및 이식편 기능부전에 의해 특징화되는 체액성 거부반응의 임상적 표시가 제기된 환자 또는 환자 개체군으로 확인될 수 있다.
본 발명은 GVHD, 거부반응 에피소드, 또는 이식후 림프증식성 장애의 발병율, 중도 또는 기간을 감소시키기에 유효한 조성물, 치료적 제형물, 방법 및 처방을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 고형 조직 또는 기관 이식편의 허혈성 재관류 손상에 대한 숙주 반응을 경감시키는 데 효과적이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식 수령자에 있어 이식편 생존을 연장시키는 데 효과적이다.
본 발명은 수령자에게 자가성, 동종성 또는 이종성인 이식편들을 포함한다. 본 발명에 의해 포함되는 이식편의 유형에는 골수 이식편, 말초 줄기 세포 이식편, 피부 이식편, 동맥 및 정맥 이식편, 췌도 세포 이식편, 및 신장, 간, 췌장, 흉선 및 심장의 이식을 포함하나 이에 국한되지 않는 조직 및 기관 이식편이 포함된다. 용어 "이식편" 및 "이식"은 본원에 혼용된다. 한 실시양태에서, 자가성 이식편은 골수 이식편, 동맥 이식편, 정맥 이식편 또는 피부 이식편이다. 한 실시양태에서, 동종이식편은 골수 이식편, 각막 이식편, 신장 이식, 췌도 세포 이식, 또는 신장 및 췌장의 조합 이식이다. 한 실시양태에서, 이식편은 이종이식편인데, 여기서 가능한 동물 도너에는 돼지가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 인공 관절, 스텐트 또는 페이스메이커 장치를 포함하나 이에 국한되지 않는 비생물학적 이식편 또는 임플란트에 대한 유해한 면역 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항-CD19 항체, 조성물 및 방법을 사용하여, 이식 또는 특별한 유형의 이식 조직에 대한 필요성을 처음에 발생시키는 특별한 증상과 무관하게, GVHD, 체액성 거부반응, 또는 이식후 림프증식성 장애를 치료 또는 예방할 수 있다.
류마티스성 관절염, SLE, ITP, 천포창-관련 장애, 당뇨병 및 경피증을 포함하나 이에 국한되지 않는 자가면역 질환 또는 장애가 진단된 인간 대상을 치료하기 위한 본 발명의 치료 제형물 및 처방이 기재되어 있다.
적절한 치료 처방은 특별한 환자 또는 환자 개체군에 대해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 치료 처방은 이식전 컨디셔닝 처방, 이식후 유지 처방, 또는 급성 또는 만성 거부반응에 대한 이식후 치료 처방이다. 특정 실시양태에서, 특별한 처방은 체액성 반응을 발생시킬 수 있는 위험이 낮은 것으로 판단되는 환자에 대한 처방에 비해, 체액성 반응을 일으킬 수 있는 위험이 높거나 중간 정도인 것으로 판단되는 환자에 대해 다양하다.
특정 실시양태에서, 특별한 처방은 체액성 거부반응의 단계에 따라 다양하고, 거부반응의 후반 단계에 있는 환자에 대해서는 더욱 공격적인 요법이 지시된다. 체액성 거부반응의 단계는 당업계의 지식 및 기술에 따라 분류될 수 있다. 예를 들어, 체액성 거부반응의 단계는 하기 기준에 따라 단계 I 내지 IV 중 하나로 분류될 수 있다: 단계 I 순환 항-도너 동종항체, 특히 항-HLA 항체에 의해 특징화되는 잠복 반응; 단계 II 순환 항-도너 동종항체에 의해 특징화되는 침묵 반응, 특히 면역학적 변화 또는 이식편 기능부전이 없는 항-HLA 항체 및 C4d 침착; 단계 III 순환 항-도너 동종항체, 특히 항-HLA 항체, C4d 침착, 및 조직 병리에 의해 특징화되나 이식편 기능부전이 없는 준임상적 거부반응; 및 단계 IV 순환 항-도너 동종항체, 특히 항-HLA 항체, C4d 침착, 조직 병리 및 이식편 기능부전에 의해 특징화되는 체액성 거부반응.
특별한 처방, 예를 들어 GVHD, 체액성 거부반응, 또는 이식후 림프증식성 장애의 예방 및 치료를 위한 이식전 컨디셔닝 처방 및 이식후 처방에 사용하기 위한 본 발명의 조성물의 유효량을 결정하기 위해, 당업계의 표준 프로토콜을 이용하여 용량 반응 곡선을 생성시킬 수 있다. 일반적으로 체액성 거부반응을 일으킬 위험이 높은 환자 및 거부반응의 하나 이상의 임상적 지표를 이미 나타내는 환자는 활성 거부반응의 어떠한 표시도 나타내지 않거나 위험이 크지 않은 환자에 비해, 보다 높은 용량 및/또는 장시간에 걸쳐 투여될 수 있는 보다 빈번한 용량을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 항-CD19 항체, 조성물 및 방법은 GVHD, 체액성 거부반응, 또는 이식후 림프증식성 장애를 치료 또는 예방하기 위해, 단독으로 또는 다른 치료제 또는 치료 처방과 조합하여 수행될 수 있다. GVHD, 체액성 거부반응, 또는 이식후 림프증식성 장애의 치료 또는 예방을 위한 다른 치료 처방은 예를 들어, 항-림프구 요법, 스테로이드 요법, 항체 고갈 요법, 면역억제 요법 및 혈장사혈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
항-림프구 요법은 타이모글로불린으로도 칭해지는 항-흉선세포 글로불린을 이식 수령자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 항-림프구 요법은 또한 T 세포 표면 항원에 대해 지정된 하나 이상의 단클론 항체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 항체의 예에는 비제한적으로 OKT3™(뮤로모납-CD3), 캄파쓰™-1H(알렘투주맙), 캄파쓰™ -IG, 캄파쓰™-1M, 시물렉트™(바실릭시맙) 및 제나팍스™(다클리주맙)이 포함된다. 한 특정 실시양태에서, 항-림프구 요법은 리툭산™(리툭시맙)을 비제한적으로 포함하는 B 세포에 대해 지정된 하나 이상의 부가적 항체를 포함한다.
스테로이드 요법은 코르티졸, 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 덱사메타존 및 인도메타신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 스테로이드를 이식 수령자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 스테로이드 중 하나 이상은 코르티졸, 프레드니손 및 메틸프레드니솔론을 포함하나 이에 국한되지 않는 코르티코스테로이드일 수 있다.
항체 고갈 요법은 예를 들어 정맥내 면역글로불린을 이식 수령자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 항체 고갈 요법은 또한 이식 전에 체외 이식편에 적용된 면역흡착 요법을 포함할 수 있다. 면역흡착은 T 세포 또는 B 세포 표면 마커에 대해 지정된 항체, 예컨대 항-CD3 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 및 항-CD19 항체를 이용하는 임의의 적합한 기법, 예를 들어 단백질 A 친화도 또는 항체 기재 친화도 기법을 이용하여 달성될 수 있다.
면역억제 요법은 하나 이상의 면역억제제, 예컨대 사이토카인 전사의 억제제(예를 들어, 시클로스포린 A, 타크롤리무스), 뉴클레오티드 합성의 억제제(예를 들어, 아자티오퓨린, 마이코페놀레이트 모페틸), 성장 인자 신호 유도의 억제제(예를 들어, 시롤리무스, 라파마이신), 및 T 세포 인터류킨 2 수용체의 억제제(예를 들어, 다클리주맙, 바실릭시맙)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 한 특별한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법과 조합하여 사용되는 면역억제제에는 아드리아마이신, 아자티오퓨린, 부술판, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A("CyA"), 사이톡신, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸(모페틸(MOFETIL)), 비스테로이드계 항염증제(NSAID), 라파마이신 및 타크롤리무스(FK506)가 포함된다. 면역억제제는 또한 보체의 억제제, 예를 들어 가용성 보체 수용체-1, 항-C5 항체, 또는 C1의 소분자 억제제, 예를 들어 문헌 [Buerke et al. (J. Immunol., 167:5375-80(2001))]에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 타크롤리무스 및 마이코페놀레이트 모페틸 요법, 면역흡착, 정맥내 면역글로불린 요법 및 혈장사혈을 포함하나 이에 국한되지 않는 체액성 거부반응을 억제하기 위한 하나 이상의 치료 처방과 조합하여 사용된다.
5.23.1. 진단 및 임상적 기준
본 발명은 인간 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방을 위한, 항체, 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 이식에 대한 필요성을 발생시킨 특별한 증상과 무관하게 사용될 수 있다. 유사하게 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 및 예방을 위한 본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 이식하도록 의도되거나 이식된 조직의 특별한 유형에 의해 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 이식 수령자가 체액성 거부반응의 발생에 대하여 증진된 위험에 처한 환자 또는 환자 개체군으로 확인된 인간 이식 수령자의 체액성 거부반응의 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 그러한 환자는 또한 "감작된(sensitized)"것으로서도 칭해질 수 있다. 감작된 환자의 확인을 위한 기준은 숙련가에게 알려진 것이다. 그러한 기준은 예를 들어, HLA 항원에 대한 순환 항체, 예를 들어 항-HLA 동종항체의 검출 가능한 수준을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 그러한 기준은 전에 이식을 경험했거나, 임신 또는 다회 수혈을 경험한 환자도 또한 포함할 수 있다. 체액성 거부반응에 대한 증진된 위험에 처한 환자에는 또한 불완전한 도너-수령자 HLA 정합(HLA matching)을 갖는 환자들, 및 ABO 혈액형 부적합인 이식을 한 환자들이 포함된다. 감작된 개체는 이식전 예비처리 또는 컨디셔닝에 대한 후보이다. 감작된 개체는 또한 체액성 거부 반응의 예방를 위한 이식후 지속 처방에 대한 후보이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체, 조성물 및 방법은 급성 또는 만성 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 치료 처방과 조합되어 사용된다. 특별한 실시양태에서, 거부반응은 단계 I, 단계 II, 단계 III, 또는 단계 IV 체액성 거부반응에 의해 특징화된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체, 조성물 및 방법은 초기 단계 체액성 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 특별한 실시양태에서, 초기 단계 체액성 거부반응은 단계 I, II, 또는 III 거부반응이다. 초기 단계 체액성 거부반응의 임상적 증상은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정되고, 예를 들어 순환 도너-특이적 항-HLA 항체의 환자에서의 발생, 항체 활성의 보체 마커의 존재, 예컨대 이식편 생검의 C4d 및 C3d 침착, 및 이식편 생검의 항-HLA 항체의 존재를 포함할 수 있다. 초기 단계 체액성 거부반응의 기타 증상은 숙련가에게 알려진 것이며 예를 들어, 항내피 항체, 특히 안티비멘틴 항체의 발생, 및 비통상의 MHC 부류 I-관련 사슬 A(MICA) 동종항체의 발생을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 부분적으로 이식편 기능부전에 의해 특징화되는 체액성 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 특별한 실시양태에서, 체액성 거부반응에 대한 처리가 필요시 되는 환자 또는 환자 개체군은 이식편 기능부전에 대하여 당업계에 공지된 기준에 따라 확인된다. 이식편의 특별한 유형에 대한 이러한 기준의 예는 하기의 단락에서 제공된다. 다른 실시양태에서, 체액성 거부반응에 대한 처리가 필요시 되는 환자 또는 환자 개체군은 특정한 조직 이식편의 유형에 대한 기타 기준, 예컨대 조직학적 기준에 따라 확인된다. 이러한 기준의 예도 또한 하기의 단락에서 제공된다.
5.23.2. 골수 이식
본 발명의 조성물 및 방법은 골수 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프증식성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식전 컨디셔닝 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식 전에 골수 이식편으로부터 B 세포를 고갈시키기 위해 사용된다. 이식편은 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 제대혈 줄기 세포, 말초혈 줄기 세포, 또는 골수액으로부터 유래될 수 있다. 말초혈 줄기 세포는 적합한 컨디셔닝 처방 후에 도너 혈액으로부터 수거될 수 있다. 적합한 처방은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 도너 혈액을 수거하기 전에 도너에게 하기 것들 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함할 수 있다: 뉴포젠(NEUPOGEN), 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, 저용량 화학요법 처방, 및 케모카인 요법. 이식편은 이식 수령자에 대해 동종성 또는 자가성일 수 있다. 이식편은 또한 이종이식편일 수 있다.
조성물 및 방법은 골수 이식에 대한 조혈 증상이 있는 다수 부문에 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 자가성 골수 이식편은 급성 림프구모구성 백혈병 ("ALL") 또는 비호지킨 림프종을 포함하나 이에 국한되지 않는 B 세포 백혈병 또는 림프종에 대해 지시되고, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식편을 오염시키는 잔류 악성 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 자가성 골수 이식은 바이러스 감염, 예를 들어 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 또는 거대세포 바이러스(CMV)와 관련된 바이러스 감염을 소거할 수 없는 환자에 대해 지시되고, 본 발명의 조성물 및 방법은 바이러스가 체류할 수 있는 B 세포의 이식편을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이식편은 동종성 이식편이고, 본 발명의 조성물 및 방법은 GVHD에 대한 예방으로서 이식편으로부터의 도너 B 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 증상은 B 세포 관련 자가면역 상태이며, 본 발명의 조성물 및 방법은 화학요법 또는 방사선요법 컨디셔닝 처방에 대한 필요없이 환자로부터 해로운 B 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화학요법 또는 방사선요법 처방과 조합하여 투여되며, 그 처방은 본 발명의 조성물의 부재시 투여되는 용량보다 저 용량의 하나 이상의 화학요법제, 또는 저 용량의 방사선을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 화학요법 또는 방사선요법에 후속하여 자가 조직 골수 이식편을 수령하며, 여기서 그 이식편은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 이식 전에 해로운 B 세포를 고갈시킨다.
골수 이식이 필요하거나 골수 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 확인된다. 골수 이식을 위한 후보일 수 있는 환자의 예로는 암 또는 자가면역 질환 또는 장애의 처리를 위한 화학요법 또는 방사선요법을 수행한 환자, 및 세포의 면역 시스템 내에 잔류하는 바이러스 감염을 소거할 수 없는 환자를 포함한다.
5.23.3. 간 이식
본 발명의 조성물 및 방법은 간 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 특별한 실시양태에서, 거부반응은 급성 또는 만성 거부반응이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 간 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 예방에 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식전 컨디셔닝 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 이식 수령자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 이식 전에, 체외 이식편과 접촉된다.
간 이식은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정되는 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 간은 HLA-정합 동종성 이식편이다. 또 다른 실시양태에서, 간은 돼지 도너 유래의 이종 이식편이다. 한 실시양태에서, 간은 환자의 혈액을 여과하기 위해 체외에서, 예를 들어 체외막 관류로 사용된다. 체외막 관류는 환자가 신체의 바깥쪽에 유지된 간에 외과수술로 연결된 간 투석의 한 형태이다. 이 절차는 때때로 "인공 간"으로 칭해진다. 이 실시양태에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법은 환자의 혈액을 오염시킬 수 있는 간 항원에 대한 항체의 발생을 방지하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 치료 및 예방을 위한 개선된 치료 처방을 포함한다. 한 특별한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 개선된 치료 처방을 포함하며, 여기서 개선은 전형적인 면역억제제와 관련된 합병증의 발생율 및/또는 중도의 감소에 있다. 한 실시양태에서, 신독성, 간독성, 및 다모증의 발생율 및/또는 중도는 시클로스포린 A 또는 기타 칼시뉴에린(calcinuerin) 억제제에 의존하는 전형적인 처방에 비해 감소된다. 한 실시양태에서, 비만, 골이영양증, 진성 당뇨병 및 세균 및 바이러스 감염에 대한 감수성에 대한 발생율 및/또는 중도는 코르티코스테로이드에 의존하는 전형적인 처방에 비해 감소된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 항-림프구 항체 요법의 부재시 사용되는 용량보다 낮은 용량의 하나 이상의 전형적인 면역억제제를 조합하여 사용된다. 저용량은 하나 이상의 전형적인 면역억제제와 관련된 하나 이상의 합병증의 감소된 발생율 및/또는 중도를 초래할 수 있다.
간 이식이 필요하거나 또는 간 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 확인된다. 간 이식을 위한 후보일 있는 환자는 하기의 상태, 질환, 또는 장애 중 하나 이상을 가지는 사람을 포함한다: 급성 간 부전, 아밀로이드증, 빌리루빈 배설 장애, 담도 폐쇄증(biliary atresia), 버드-키아리(Budd-Chiari) 증후군, 만성 활동 자가면역성 간염(chronic active autoimmune hepatitis), (B형 간염 및 C형 간염을 포함하는 바이러스 간염, 알코올성 경화, 또는 원발성 담즙성 경화와 관련된) 경화증, 담관염, 선천성 인자 VIII 또는 IX 장애, 구리 대사 장애, 낭성 섬유증, 글리코겐 합성(glycogenesis), 고콜레스테롤혈증, 지방 대사 장애(lipidoses), 점액다당류증, 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 포르피린 대사 장애, 퓨린 및 피리미딘 대사 장애, 및 특히 간 및 간내 담관(intrahepatic bile ducts), 담 시스템(biliary system), 담로(biliary passages), 또는 소화계의 원발성 양성 및 악성 신생물.
간 이식이 필요하거나 간 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군의 확인을 위한 임상적 기준은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정될 수 있다. 그러한 기준은, 예를 들어 하기 증상들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 피로, 체중 감소, 상부 복통(upper abdominal pain), 청결(purities), 황달, 간 비대, 변색된 소변(discolored urine), 상승된 알칼리성 포스파타제, 및 감마 글루타밀펩티다제 활성, 상승된 빌리루빈 수준, 감소된 혈청 알부민, 상승된 간-특이적 효소, 낮은 담즙 생산, 증진된 혈중 요소 질소, 증진된 크레아티닌 및/또는 항-호중구 세포질 항체(ANCA) 역가의 존재, 재발성 정맥류 출혈, 난치성 복수, 자발적 세균성 복막염, 고질성 뇌질환(refractory encephalopathy), 심각한 황달, 악화된 통합 기능부전(exacerbated synthetic dysfunction), 갑작스러운 생리힉적 열화(sudden physiologic deterioration) 및 전격성 간염(fulminant hepatic failure).
5.23.4. 콩팥(신장) 이식
본 발명의 조성물 및 방법은 신장 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "신장 이식"은 콩팥의 이식 및 콩팥과 췌장의 조합 이식을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 거부반응은 급성 거부반응 또는 만성 거부반응에 의해 특징화된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식전 컨디셔닝 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 단일 용량의 본 발명의 하나 이상의 조성물은 환자 또는 환자 개체군의 패널(panel) 반응성 항체의 감소 및 B 세포의 고갈을 위해 효과적이다. 또 다른 실시양태에서, 다중 용량의 본 발명의 하나 이상의 조성물은 환자 또는 환자 개체군의 패널 반응성 항체의 감소 및 B 세포의 고갈에 효과적이다. 한 실시양태에서, 단일 용량의 본 발명의 하나 이상의 조성물은 하나 이상의 면역억제제와 조합하여 투여되며 환자 또는 환자 개체군의 패널 반응성 항체의 감소 및 B 세포의 고갈에 효과적이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 이식편을 수령한 환자의 GVHD 및 이식편 거부반응의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 한 실시양태에서, 환자는 임상적 거부반응의 신호를 아직 나타내지 않는다. 관련 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식 수령자의 이식편 거부반응의 예방을 위한 지속적인 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 준임상적 체액성 거부반응의 처리를 위한 것이다. 관련 실시양태에서, 준임상적 체액성 거부반응에 대한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 이식편으로부터의 생검에서 Cd4 침착의 검출에 의하여 또는 순환 항-HLA 항체의 검출에 의해 지시된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식 수령자의 급성 또는 만성 거부반응 에피소드의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 급성 또는 만성 거부반응 에피소드에 대한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 거부 반응의 임상적 지표 중 하나 이상의 검출에 의해 확인된다. 특정 실시양태에서, 거부 반응의 임상적 지표 중 하나 이상은 이식후 1 내지 6주에 검출된다. 한 실시양태에서, 거부 반응의 임상적 지표 중 하나 이상은 이식후 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 60 개월에 검출된다. 한 실시양태에서, 급성 거부반응은 생검으로 확인된 급성 체액성 거부반응이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 하나 이상은 급성 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함한다. 한 특별한 실시양태에서, 치료 처방은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 혈장반출법(plasmapheresis), 타크롤리무스/마이코페놀레이트, 정맥내 면역글로불린, 단백질 A와의 면역흡착, 및 항-CD20 항체. 한 실시양태에서, 환자는 거부반응의 발생 전에 면역억제성 프로토콜에 적용되었다. 한 특별한 실시양태에서, 면역억제성 프로토콜은 시클로스포린, 아자티오프린, 및 스테로이드 요법 중 하나 이상을 포함한다.
급성 체액성 거부반응의 임상적 지표는 당업계에 공지되었으며, 예를 들어 신장 기능의 돌연적인 심각한 악화, 핍뇨의 발생, 및 절충 신장 관류를 포함한다. 부가적 지표는, 예를 들어 생검상의 관주의 모세혈관(peritubular capillaries) 내의 염증성 세포 및 순환 도너-특이적 동종항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 신장 동종이식편의 체액성 거부반응에 대한 하기 진단 기준들 중 하나 이상을 가진다: (1) 급성 조직 손상의 형태학상의 증거; (2) 동맥 섬유 소성 괴사에서 C4d 침착 또는 면역글로불린과 같은 항체 작용 및 보체의 증거; 및 (3) 도너 HLA 항원 또는 도너 내피 항원에 대한 검출가능 순환 항체. 한 실시양태에서, 환자는 상기 진단 기준 중 3개 모두 가진다.
한 실시양태에서, 환자는 급성 체액성 거부반응의 전술한 진단 기준 중 하나 이상을 가지며 본 발명의 조성물은 급성 체액성 거부반응을 치료하기 위해 하기 면역억제제들 중 하나 이상과 조합하여 사용된다: 정맥내 면역글로불린, 항-흉선세포 글로불린, 항-CD20 항체, 마이코페놀레이트 모페틸, 또는 타크롤리무스. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 면역억제제 및 환자로부터 동종항체의 제거를 위한 절차, 예컨대 혈장반출법 또는 면역흡착과 조합하여 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 만성 신장 동종이식편 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 예를 들어, 항-CD154(CD40L), 타크롤리무스, 시롤리무스, 및 미조리빈을 포함하는 하나 이상의 면역억제제와 조합하여 사용된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 항-CD19 항체는 타크롤리무스 및 마이코페놀레이트와 조합하여 사용된다.
콩팥의 만성 거부반응에 대한 임상적 지표는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 내막 단핵 세포 (만성 동종이식편 맥관병)를 갖는 동맥 내막 섬유증, 사구체 기저 막의 중복 (만성 동종이식편 사구체병증), 관주 기저 막의 적층, 관주 모세혈관의 C4d, 및 검출가능 순환 도너 HLA-반응성 항체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식편 병변이 발생하기 전에 만성 거부반응을 치료하기 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 하나 이상의 이식 사구체병증의 임상적 지표를 가지는 것으로서 확인된다. 관련 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 특정 실시양태에서, 치료 처방은 신장 기능을 안정화하고 이식편 거부반응을 억제하는 데 효과적이다. 한 특별한 실시양태에서, 하나 이상의 치료제는 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제 및/또는 수용체 길항제, 정맥내 면역글로불린, 항-흉선세포 글로불린, 항-CD20 항체, 마이코페놀레이트 모페틸, 또는 타크롤리무스를 포함한다. 항-CD19 항체는 기타 치료제 또는 기타 치료제 없이 마이코페놀레이트 모페틸 및 타크롤리무스와 조합하여 사용될 수 있다. 혈장반출법은 또한 치료 처방의 일부로서 사용될 수 있다.
신장 이식이 필요하거나 신장 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 확인된다. 신장 이식을 위한 후보일 수 있는 환자의 예로는 유전분증(amyloidosis), 당뇨병(I형 또는 II형), 사구체 질환(예를 들어, 사구체 신염), 통풍, 용혈성 요독 증후군, HIV, 유전성 신장 질환(예를 들어, 다낭성 신장 질환, 선천성 폐색성 요로병증, 시스틴증, 또는 말린 자두 증후군), 기타 콩팥 질환(예를 들어, 후천성 폐색성 신장병증, 급성 세뇨관 괴사, 급성 간질성 신염), 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루프스, 또는 겸상적혈구성 빈혈(sickle cell anemia)로 진단된 환자를 포함한다. 신장 이식을 위한 기타 후보는 인슐린 결핍, 고혈압, 심각한 손상 또는 화상, 대수술, 심장 질환 또는 심장 마비, 간 질환 또는 간 부전, 혈관(vascular) 질환(예를 들어, 진행성 전신성 피부경화증(progressive systemic sclerosis), 신동맥 혈전증, 경피증), 방광요관 역류(vesicoureteral reflux), 및 특정 암(예를 들어, 우발성 암종, 림프종, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 윌름스(Wilms) 종양)을 갖는 환자를 포함한다. 신장 이식을 위한 기타 후보자는 예를 들어, 헤로인 사용자, 콩팥 또는 췌장 이식 전에 거부반응을 나타낸 사람, 및 항생제, 시클로스포린, 또는 화학요법을 포함하는 치료 처방을 수행하고 있는 사람을 포함한다.
콩팥 이식이 필요하거나 콩팥 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군의 확인을 위한 임상적 기준은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정될 수 있다. 그러한 기준은, 예를 들어 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 요로 문제, 출혈, 쉽게 입는 타박상(easy bruising), 피로, 정신 착란(confusion), 구역질 및 구토, 식욕 상실, 창백한 피부(빈혈 원인), 근육, 관절, 측부 및 흉부의 통증, 골 통증 또는 골절, 및 가려움(itching).
5.23.5. 심장 이식
본 발명의 조성물 및 방법은 심장 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 특별한 실시양태에서, 거부반응은 급성 또는 만성 거부반응이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식전 컨디셔닝 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심장 이식 수령자의 급성 체액성 거부반응의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 특별한 실시양태에서, 치료 처방은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 혈장반출법, 정맥내 면역글로불린, 및 항-CD20 항체 요법. 급성 체액성 거부반응에 대한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 하나 이상의 급성 체액성 거부반응의 임상적 증상의 검출에 의해 확인된다. 급성 체액성 거부반응의 임상적 지표의 예로는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 쇼크, 저혈압, 감소된 심박출량, 및 모세혈관 쇄기압 또는 폐동맥 압의 상승으로 정의된 혈역학 기능부전. 한 특별한 실시양태에서, 급성 체액성 거부반응은 이식후 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 60 개월 내에 진단된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심장 이식 수령자의 거부반응의 예방을 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 거부반응에 대한 예방이 필요한 이식 수령자는 하기 위험 인자들 중 하나 이상을 갖는 환자 또는 환자 개체군으로써 확인된다: 여성, 거대세포 바이러스 혈청반응 양성, 패널 반응성 항체에 대한 상승된 반응, 양성 이식전 및/또는 이식후 교차, 및 면역억제제를 이용한 예비감작(presensitization).
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심장 이식 수령자의 이식편 열화를 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 이식편 열화에 대한 치료 또는 예방이 필요한 이식 수령자는 하기의 체액성 거부반응의 임상적 징후들 중 하나 이상을 갖는 환자 또는 환자 개체군으로 확인된다: 면역글로불린의 침착, 모세혈관 내 C1q, C3, 및/또는 C4d, 모세혈관 내 CD68-포지티브 세포의 증거, 및 생검시 염증성 세포에 의한 이식편의 침윤의 증거. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 심장 이식 수령자의 이식편 열화를 치료하기 위한 하기의 면역억제제들 중 하나 이상과 조합하여 사용된다: 정맥내 면역글로불린, 항-흉선세포 글로불린, 항-CD20 항체, 마이코페놀레이트 모페틸, 또는 타크롤리무스. 또 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체 조성물은 하나 이상의 면역억제제 및 환자로부터 동종항체를 제거하기 위한 절차, 예컨대 혈장반출법 또는 면역흡착과 조합하여 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 만성 심장 거부반응, 예를 들어 만성 동종이식편 맥관병, 또한 이식 관상 동맥 질환으로도 칭해지는 질환의 처리를 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 위험에 처한 환자 또는 환자 개체군의 이식 관상 동맥 질환의 예방을 위한 치료 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다. 이식 관상 동맥 질환 발생 위험에 처한 환자 또는 환자 개체군을 확인하기 위한 기준은 당업계에 공지되었으며, 예를 들어 불량하게 접합된 이식편을 갖는 환자, 순환 항-HLA 항체를 발생하는 환자, 및 심장 이식 직후의 체액성 거부반응의 임상적 증상들 중 하나 이상을 발생시키는 환자를 포함할 수 있다.
심장 이식이 필요하거나 심장 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 확인된다. 심장 이식을 위한 후보일 수 있는 환자의 예로는 하기 질환 및 장애가 있는 것으로 진단된 환자일 수 있다: 관상 동맥 질환, 심근병증(심장의 비염증성 질환), 울혈성 심부전을 갖는 심장 판막 질환, 기타 요법에 반응하지 않는 생명을 위협하는 이상 심장 리듬, 특발성 심근병증, 허혈성 심근병증, 확장성 심근병증, 허혈성 심근병증, 및 통상의 요법이 존재하지 않거나 또는 통상의 요법이 실패한 선천성 심장 질환.
심장 이식이 필요하거나 심장 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군의 확인을 위한 임상적 기준은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정될 수 있다. 그러한 기준은 예를 들어, 하기 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 25% 미만의 박출 계수, 통상의 요법에 반응하지 않는 난치성 협심증 또는 악성 심장 부정맥, 및 2 우드(Wood) 단위 미만의 폐혈관 저항. 또한, 심장 이식이 필요한 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 일련의 시험을 수행하여 확인될 수 있다. 이러한 시험에는 예를 들어, 휴식(resting) 및 스트레스 초음파심장동태도(echocardiogram), EKG, 혈액내 크리아티닌의 검정법, 관상동맥 조영술, 및 우심 및 좌심 카테터삽입술을 포함하는 심폐 평가가 포함된다.
5.23.6. 폐 이식
본 발명의 조성물 및 방법은 폐 이식 수령자의 GVHD, 체액성 거부반응, 및 이식후 림프 증식성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 특별한 실시양태에서, 거부반응은 급성 또는 만성 거부반응에 의해 특징화된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이식전 컨디셔닝 처방을 포함하거나 그러한 처방과 조합되어 사용된다.
폐 이식이 필요하거나 폐 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군은 당업계의 지식 및 기술에 따라 확인된다. 폐 이식을 위한 후보일 수 있는 환자의 예로는 하기 질환 또는 상태중의 하나를 갖는 환자를 포함한다: 기관지 확장증, 만성 폐색성 폐 질환, 낭성 섬유증, 아이젠멘거(Eisenmenger) 증후군 또는 아이젠멘거 증후군을 갖는 선천성 심장 질환, 폐기종, 폐의 호산구성 육아종, 또는 조직구 증식증 X, 흡입/화상 외상, 림프관평활근증(LAM), 원발성 폐동맥 고혈압, 폐 섬유증(폐의 반흔), 또는 유육종증.
폐 이식이 필요하거나 폐 이식으로부터 이익을 얻기 쉬운 환자 또는 환자 개체군의 확인을 위한 임상적 기준은 당업계의 지식 및 기술에 따라 결정될 수 있다. 그러한 기준은 예를 들어, 하기 중의 하나 이상을 포함한다: 하기 지표들 중의 하나 이상에 의해 특징화되는 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 및 알파 1-항트립신 결핍 폐기종: 예측된 25% 미만의 포스트 기관지 확장제 FEVI, 휴면 저산소증, 즉 55-60 mmHg 미만의 PaO2, 과탄산증. 이차 폐 고혈압, FEVI의 빠른 속도의 감퇴, 또는 생명을 위협하는 악화(exacerbations); 하기 지표들 중 하나 이상에 의해 특징화되는 낭성 섬유증: 예측된 30% 미만의 포스트 기관지 확장제 FEVI, 휴면 저산소증, 과탄산증, 또는 악화 증진하는 빈도 및 중증도; 하기 지표들 중 하나 이상에 의해 특징화되는 특발성 폐 섬유증: 예측된 60 내지 65% 미만의 폐활량(vital capacity)(VC) 및 TLC, 및 휴면 저산소증; 의약 요법을 하는 동안 임상적, 방사선, 또는 생리학적 진행에 의해 특징화되는 이차 폐 고혈압; 하기 지표들 중 하나 이상에 의해 특징화되는 원발성 폐동맥 고혈압: NYHA 기능성 부류 III 또는 IV, 10 mm Hg 초과의 평균 우심방 압, 50 mm Hg 초과의 평균 폐 동맥 압, 2.5 L/min/m2 미만의 심장 지수, 및 장기간 프로스타사이클린 주입 요법의 실패.
5.23.7. 이식후 림프 증식성 장애
성공적인 이식에 필요한 면역억제는 B 세포 기원의 이식후 림프 증식성 장애를 일으킬 수 있다. 일반적으로 이식후 림프 증식성 장애는 엡스타인-바르 바이러스 감염된 세포와 관련된다. 이식후 림프 증식성 장애(PTLD)는 양성 자기 제한 단핵구증-유사 증후군 내지 공격적인 비호지킨 림프종의 중증도 범위 내일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 모든 이식으로부터 야기하는 PTLD의 치료에 사용될 수 있다. 이식은 고형 장기 이식, 예를 들어 심장 이식, 간 이식, 콩팥 이식, 또는 조합된 콩팥-췌장 이식일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 기타 면역억제성 요법의 일시적 정지 또는 감소를 포함하는 치료 처방의 일부로서 PTLD를 치료하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 항-CD19 항체 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 치료 처방의 일부로서 투여된다: 고용량 정맥내 감마 글로불린, 사이토카인, 항-바이러스제, 및 항-CD20 단클론 항체. 치료 처방은 면역억제 요법의 일시적 정지 또는 감소를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 정맥내 감마 글로불린은 1 내지 5일 동안, 바람직하게는 3일 동안 0.4 g/kg의 일일 용량으로 투여되며 사이토카인은 적어도 7일 동안 투여되는 인터페론 알파이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 사이토카인이 처방에 사용된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 항-바이러스제가 처방에 사용된다. 항-바이러스제는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 항-바이러스제로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-바이러스제는 아시클로버(aciclovir) 또는 간시클로버(ganciclovir)이다. 항-바이러스제는 적어도 1주 또는 2주 동안 투여될 수 있다. 항-바이러스제는 또한 보다 긴 기간, 예를 들어 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 또는 5개월 동안 투여될 수 있다.
5.24. 환자 진단 및 치료 처방: 자가면역 질환
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 치료 처방 및 용량은 치료되는 자가면역 질환 또는 장애를 비롯한 다수의 인자에 기초하여 선택된다. 환자 또는 환자 개체군에서 자가면역 질환 또는 장애의 특정 단계에 적합한 치료 처방은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상이한 단계의 자가면역 질환 또는 장애를 앓는 환자를 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 유효량을 결정하기 위하여, 당업계의 표준적인 프로토콜을 이용하여 용량 반응 곡선을 산출할 수 있다. 일반적으로, 자가면역 질환 또는 장애의 활성이 더 큰 환자는 자가면역 질환 또는 장애의 활성이 덜한 환자에 비하여, 더욱 오랜 기간 동안 투여될 수 있는 더욱 높은 용량 및/또는 더욱 빈번한 투약 빈도를 필요로 할 것이다.
본원에 기재된 항-CD19 항체, 조성물 및 방법의 항-CD19 항체는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 수행될 수 있다. 용어 "자가면역 질환 또는 장애"는 대상의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 면역 반응에 의해 유발되는 세포, 조직 및/또는 기관 손상에 의해 특징화되는 대상 내의 상태를 가리킨다.
용어 "염증성 질환"은 만성 염증을 포함하나 이에 국한되지 않는 염증에 의해 특징화되는 대상의 상태를 가리키기 위해 용어 "염증성 장애"와 혼용된다. 자가면역 장애는 염증과 관련되거나 관련되지 않을 수 있다. 또한, 염증은 자가면역 장애에 의해 유발되거나 유발되지 않을 수 있다. 따라서, 특정 장애는 자가면역 및 염증성 장애 모두에 의해 특징화될 수 있다. 예시적 자가면역 질환 또는 장애에는, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 아드레날린선의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루 피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역 기능부전 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증, 척-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한랭응집소 질환, 크론병, 원판상 홍반성 루푸스, 원발성 혼성 한성글로불린증, 당뇨병, 호산구성 근막염, 섬유근통-섬유근염, 신장염, 그레이브병, 귈레인-바레병, 하시모토 갑상선염, 헤노흐-쇤라인 자반증, 특발성 폐 섬유화증/특발성 자가면역 혈소판감소 자반증(ITP), IgA 신경병증, 연소성 관절염, 편평태선, 홍반 루푸스, 메니에르병, 혼성 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역-매개 당뇨병, 중증 근무력증, 천포창-관련 장애(예를 들어, 심상성 천포창), 악성 빈혈, 결절성 다발성동맥염, 다발성 연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 감마글로불린증, 원발성 담즙성 경화, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼렌 증후군, 스티프-만 증후군, 전신성 홍반 루푸스(SLE), 스위트 증후군, 스틸병, 홍반 루프스, 타카야스 동맥염, 측두동맥염/거대세포성 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관변증, 예컨대 포진상 피부염 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 염증성 장애의 예에는 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 알레르기성 장애, 패혈증 쇼크, 폐섬유증, 미분화형 척추관절증, 미분화형 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 이식편대 숙주질환, 두드러기, 보그트-코야나기-하레다(Vogt-Koyanagi-Hareda) 증후군, 및 만성 바이러스 또는 세균 감염에서 비롯되는 만성 염증이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
항-CD19 면역요법은 자가면역 질환 또는 장애의 치료를 위한 단일 치료제로서 항-CD19 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 면역요법은 시험관내 자극 B 세포 증식을 억제할 수 있는 항-CD19 항체를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 면역요법은 Fc 변이 항-CD19 항체를 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 Fc 변이체는 비교 비변이 분자에 비해 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 변경된 결합 친화도를 가진다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 면역요법은 Fc 변이 항-CD19 항체를 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 Fc 변이체는 비교 비변이 분자에 비해 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 증진된 결합 친화도를 가진다.
항-CD19 면역요법은 또한 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위한 단일 치료제로서 항-CD19 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 면역요법은 제1 항원 및 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD19 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 제1 항원은 인간 CD19이고, 상기 제2 항원은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIV로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 감마 수용체이다. 다른 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 면역요법은 인간 CD19 및 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD19 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
CD19는 미성숙 B 세포 상에 발현되며, 이에 따라 항-CD19 mAb는 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포를, 예를 들어 골수에서 고갈시키는 데 특히 적합할 수 있다.
5.24.1. 자가면역 질환 또는 장애의 진단
자가면역 질환 또는 장애의 진단은, 자가면역 질환 또는 장애의 각 유형이 환자 간에 상이하게 나타난다는 점에서 복잡하다. 이러한 증상의 이종성은, 전형적으로 임상적 진단에 도달하기 위해 다중 인자가 사용된다는 것을 의미한다. 일반적으로 임상의는 인자들, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 자가항체의 존재, 상승된 사이토카인 수준, 특이적 기관 기능부전, 피부 홍반, 관절 부종, 통증, 골 재형성, 및/또는 운동 손실을 일차적으로 자가면역 질환 또는 장애의 일차적 지표로서 사용한다. 특정 자가면역 질환 또는 장애, 예컨대 RA 및 SLE의 경우, 진단 표준법이 당업계에 공지되어 있다. 특정 자가면역 질환 또는 장애의 경우, 질환의 단계가 특징화되었고, 당업계에 공지되어 있다. 이 당업계에 인식된, 자가면역 질환 및 장애, 및 질환의 단계 및 당업계에 공지된 질환의 활성 척도 및 중증도를 진단하는 방법을 사용하여, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용한 자가면역 질환 또는 장애의 치료가 필요한 환자 및 환자 개체군을 확인할 수 있다.
5.24.2. 자가면역 질환 또는 장애의 진단을 위한 임상적 기준
상이한 자가면역 질환 또는 장애에 대한 진단 기준이 당업계에 공지되어 있다. 역사적으로 진단은 전형적으로 신체적 증상들의 조합에 기초한다. 더욱 최근, 분자 기법, 예컨대 유전-발현 프로파일링을 적용하여, 자가면역 질환 또는 장애의 분자적 정의를 개발하였다. 특별한 자가면역 질환 또는 장애의 예시적 임상적 진단 방법이 이하 제공된다. 다른 적합한 방법이 당업자에게 자명할 것이다.
특정 실시양태에서, 낮은 수준의 자가면역 질환 활성을 갖는 환자, 또는 자가면역 질환(단계가 인식되는 질환)의 초기 단계에 있는 환자를, 항-CD19 항체 조성물 및 방법을 사용한 치료를 위해 확인할 수 있다. 자가면역 질환의 조기 진단은 보편적 증상 및 질환 간의 증상 중첩으로 인해 어렵다. 그러한 실시양태에서, 초기 단계에서 치료하거나 낮은 수준의 자가면역 질환 활성을 갖는 환자는 자가면역 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 포함하는 증상을 가진다. 관련 실시양태에서, 초기 단계에서 치료하거나 낮은 수준의 자가면역 질환 활성을 갖는 환자는 자가면역 질환 또는 장애의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15가지 증상을 포함하는 증상을 가진다. 증상은 임의의 자가면역 질환 및 장애 또는 이들의 조합의 증상일 수 있다. 자가면역 질환 및 장애 증상의 예가 이하에 나와 있다.
5.24.3. 류마티스성 관절염
류마티스성 관절염은 주로 관절의 활액 또는 내층의 염증에 의해 주로 특징화되는 만성 질환이다. 그것은 장기 관절 손상을 초래할 수 있고, 이는 만성 통증, 기능 손실 및 장애를 야기한다. 류마티스성 관절염의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 확인하는 것이 한 공정이 된다. 류마티스성 관절염의 양 또는 음 진단을 제공하는 결정적 시험은 없다. 임상의는 병력, 신체 검사, 실험실 시험 및 x-선을 비롯한 다수의 도구에 의존한다.
신체적 증상은 환자들 간에 광범위하게 다양하고, 통상적으로는 관절 부종, 관절 압통, 관절 운동 손실, 관절 부정렬, 골 재형성, 피로, 경직(특히 아침에, 또는 장시간 앉아 있을 때의 경직), 허약함, 독감-유사 증상(저등급 고열 포함), 장기 앉아 있는 것과 관련된 통증, 질환 활성 발적, 및 이에 이어지는 경감 또는 질환 불활성의 발생, 류마티스성 결절 또는 피부 아래의 조직의 소괴(전형적으로 팔꿈치에서 발견되며, 이는 더욱 심한 질환 활성을 가리킬 수 있음), 근육 통증, 식욕 상실, 우울, 체중 감량, 빈혈증, 수족냉증 및/또는 다한증, 및 눈물 및 침의 생성을 감소시키는 눈 및 입 주변의 샘 관련증(쇼렌 증후군)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 쇼렌 증후군에 대해, 구체적으로 하기 참조문헌을 이용할 수 있다. 문헌 [Fox et al. Arthritis Rheum.(1986) 29:577-586] 및 문헌 [Vitali et al. Ann. Rheum. Dis.(2002). 61:554-558].
신체적 증상과 별도로, 임상의는 통상적으로 시험, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 전체 혈구계산, 적혈구 침강속도(ESR 또는 세드 속도), C-반응성 단백질, 류마티스성 인자, 항-DNA 항체, 항핵 항체(ANA), 항-카르디올리핀 항체, 영상화 연구, 방사선사진(X-선), 관절 또는 기관의 자기 공명 영상화(MRI), 관절 초음파, 골 스캔, 및 골 밀도측정(DEXA)을 이용한다. 이 시험은 존재할 수 있는 이상성을 체크하기 위해(즉, 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군의 확인), 또는 약물 및 체크 진행의 부작용을 모니터링하기 위해 본 발명의 조성물 및 방법과 병용될 수 있는 시험의 예이다.
류마티스성 관절염의 초기 증상은 통상적으로 손가락, 손 및 손목의 작은 관절에서 나타난다. 관절 관련증은 통상 대칭적인데, 이는 왼손의 관절이 손상될 경우, 오른손의 동일한 관절이 손상됨을 의미한다. 일반적으로 관절 골미란이 보다 큼은 질환 활성이 보다 심함을 가리킨다.
더욱 진전된 질환 활성의 증상에는 연골, 힘줄, 인대 및 뼈에 대한 손상이 포함되고, 이는 관절의 기형 및 불안정성을 유발한다. 손상은 제한된 범위의 운동을 초래할 수 있고, 이는 일일 업무(포크 잡기, 머리 빗기, 셔츠 단추 끼우기)를 더욱 어렵게 되도록 할 수 있다. 피부 궤양, 보다 큰 감염 감수성, 및 건강의 전반적 악화도 또한 더욱 진전된 질환 활성의 또 다른 지표이다.
류마티스성 관절염의 진행은 통상적으로 3 단계로 구분된다. 제1 단계는 활액 내층의 부종으로, 이는 통증, 온기, 경직, 적화 및 관절 부위의 부종을 유발한다. 두 번째 단계는 세포 성장, 또는 활액 비후화를 유발하는 판누스 또는 세포의 급속 분할 및 성장이다. 세 번째 단계에서, 염증 세포는 뼈 및 연골을 절단할 수 있는 효소를 방출하고, 이는 종종 관련 관절이 그 모양 및 배열을 손실하도록 하고, 더 큰 통증 및 이동 손실을 유발한다.
분자 기법을 또한 사용하여, 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 확인할 수 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염은 인간 백혈구 항원(HLA)-DR4 및 HLA-DRB1 유전자의 대립형질 다형과 관련된 것으로 나타났다(문헌 [Oilier and Winchester, 1999, Genes and Genetics of Autoimmunity. Basel, Switzerland]; 문헌 [Stastny, 1978, N. Engl J Med 298:869-871]; 및 문헌 [Gregersen et al., 1987, Arthritis Rheum 30:1205-1213]). 류마티스성 관절염 환자는 빈번하게 2개 질환-관련 HLA-DRB1*04 대립형질을 발현한다(문헌 [Weyand et al., 1992 Ann Intern Med 117:801-806]). 환자를 당업계 표준인 방법을 이용하여 대립형질 다형을 시험할 수 있다. MHC 유전자는 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 진단하거나 확인하기 위해 사용될 수 있는 RA에 대한 감수성에 영향을 미치는 유일한 배선-코딩된 유전자가 아니다. 성별 여성은 위험도를 명료히 증가시키고, 여성 환자는 남성 환자와는 상이한 표현형의 질환을 발병한다. 류마티스성 관절염의 임의의 분자 지표를 사용하여, 항-CD19 항체 조성물 또는 방법을 이용한 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 확인할 수 있다.
활성 척도와 관련하여 환자의 류마티스성 관절염의 활성을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 약학적 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, [American College of Rheumatologists Score(ACR score)]를 사용하여, 환자 또는 환자 개체군의 류마티스성 관절염의 활성을 결정할 수 있다. 이 방법에 따라, 환자에게 개선과 상관되는 점수가 주어진다. 예를 들어, ACR에 의해 정의되는 인자의 20% 개선을 갖는 환자에게 ACR20 점수가 주어진다.
초기에, 류마티스성 관절염의 증상을 나타내는 환자를 진통제로 치료할 수 있다. 다른 실시양태에서, 류마티스성 관절염으로 진단되거나 그 증상을 나타내는 환자를 초기에 비스테로이드계 항-염증성(NSAID) 화합물로 처리한다. 질환이 진행되고/되거나 증상의 중증도가 증가함에 따라, 류마티스성 관절염을 덱사메타손 및 프레드니손을 포함하나 이에 국한되지 않는 스테로이드의 투여에 의해 치료될 수 있다. 더욱 심한 경우, 메토트렉세이트 또는 사이톡신을 포함하나 이에 국한되지 않는 화학요법제를 투여하여, 류마티스성 관절염의 증상을 경감시킬 수 있다.
특정 경우에서, 류마티스성 관절염은 금을 투여함으로써 치료할 수 있는 반면, 다른 경우에서는 생물 제제, 예컨대 항체 또는 수용체(또는 수용체 유사체)를 투여할 수 있다. 그러한 치료 항체의 예는 리툭신 및 레미케이드이다. 류마티스성 관절염을 치료하기 위해 투여될 수 있는 가용성 수용체의 예시적 예는 엔브렐(Enbrel)이다.
류마티스성 관절염의 극히 심한 경우에, 수술이 지시될 수 있다. 외과수술 접근법에는 관절의 질환이 있는 활액 또는 내층을 제거함으로써 염증성 조직의 양을 감소시키기 위한 윤활막절제술; 조직 샘플을 취하고, 유리 연골을 제거하며, 눈물을 수복하고, 조질 표면을 평탄화하거나 질환이 있는 활액 조질을 제거하기 위한 관절경검사 수술; "골 절단"을 의미하는 골절술(이 절차는 관절 상의 중량을 재분배함으로써 안정성을 증가시키기 위해 사용됨); 관절의 외과수술 재구성 또는 재배치를 위한 관절 재배치 수술 또는 치환술; 또는 관절고정술 또는 두 뼈를 함께 융합하는 융합술이 포함될 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 진통제, NSAID, 스테로이드, 또는 상기 언급한 화학요법제 중 임의의 것과 조합하여, 또한 류마티스성 관절염의 치료를 위해 투여되는 생물 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.24.4. 전신성 홍반 루프스(SLE)
전신성 홍반 루프스(SLE)는 관절, 근육 및 신체의 다른 부분에 영향을 주는 만성(장기 지속) 류마티스성 질환이다. SLE의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은, 신체적 증상 및/또는 실험실 시험 결과를 조사함으로써 확인될 수 있다. 신체적 증상은 환자 간에 다양하다. 예를 들어, SLE에서, 환자를 SLE로 진단하기 전에 하기 11가지 증상 중 전형적으로 4가지가 존재한다: 1) 뺨 발진: 볼 위의 발진; 2) 원판상 발진: 적색 융기 패치; 3) 감광성: 피부 발진의 발생 또는 증가를 초래하는, 일광에 대한 반응; 4) 구강 궤양: 코 또는 입의 궤양, 통상 무통; 5) 관절염: 2개 이상의 말초 관절과 관련된 비미란성 관절염(관절 주위 뼈가 파괴되지 않게 되는 관절염); 6) 장막염, 흉막염 또는 심낭염: (폐 또는 심장의 내층의 염증); 7) 신장 장애: 소변 중 과다 단백질(0.5 gm/일 초과 또는 시험 스틱에서 3+) 및/또는 세포성 원주(소변, 적혈 세포 및/또는 백혈 세포 및/또는 신장 세관 세포로부터 유래된 이상 요소); 8) 신경학적 장애: 발작(경련) 및/또는 약물 부재 시의 정신이상증 또는 그러한 효과를 유발하는 것으로 알려진 대사 교란; 9) 조직학적 장애: 용혈성 빈혈 또는 백혈구감소증(백혈구 계수 4,000개 미만 세포/입방 밀리미터) 또는 림프구감소증(1,500개 미만 림프구/입방 밀리미터) 또는 혈소판감소증(100,000개 미만 혈소판/입방 밀리미터) (백혈구감소증 및 림프구감소증은 2가지 이상의 경우에 검출되어야 한다. 혈소판감소증은 그것을 유도하는 것으로 알려진 약물의 부재 하에 검출되어야 한다); 10) 항핵 항체: 그것을 유도하는 것으로 알려진 약물의 부재 하에 항핵 항체(ana)에 대한 양성 시험; 및/또는 11) 면역학적 장애: 양성 항-이중 가닥 항-DNA 시험, 양성 항-sm 시험, 양성 항인지질 항체, 예컨대 항카르디올리핀, 또는 위(false) 양성 매독 시험(vdrl).
SLE를 지시할 수 있는 다른 신체적 증상에는 빈혈증, 피로, 고열, 피부 발진, 근육통, 메스꺼움, 구토 및 설사, 선 비대, 식욕 감퇴, 한냉 감수성(레이노 현상) 및 체중 감량이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
실험실 시험을 또한 사용하여, 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 확인할 수 있다. 예를 들어, 혈액 시험을 사용하여, SLE를 갖는 모든 사람들의 혈액에서 발현되는 자가항체를 검출할 수 있다. 그러한 시험에는 항핵 항체(ANA)를 유도하는 것으로 알려진 약물의 부재 하에 항체(ANA)(문헌 [Rahman, A. and Hiepe, F. Lupus.(2002). 11(12):770-773]), 항-이중 가닥 항-DNA(문헌 [Keren, D.F. Clin. Lab. Med.(2002) 22(2):447-474]), 항-Sm, 항인지질 항체, 예컨대 항카르디올리핀(문헌 [Gezer, S. Dis. Mon. 2003. 49(12): 696-741])에 대한 시험, 또는 위 양성 매독 시험(VDRL)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 시험에는 이하의 것들이 포함될 수 있다: 보체 시험(C3, C4, CH50, CH100)이 혈액 중 보체 단백질 순환의 양을 측정하기 위해 사용될 수 있고(문헌 [Manzi et al. Lupus 2004. 13(5):298-303]), 침강 속도(ESR) 또는 C-반응성 단백질(CRP)을 염증 수준의 측정을 위해 사용할 수 있으며, 소변 분석을 신장 문제의 검출을 위해 사용할 수 있고, 흉부 X-선을 폐 손상 검출을 위해 취할 수 있으며, EKG를 심장 문제의 검출을 위해 사용할 수 있다.
만성 SLE는 관련 기관, 특히 신장에 대한 부대적 손상의 누적과 관련된다. 따라서, 초기 치료 개입이 바람직한데, 즉 예를 들어, 신부전 전 개입이 바람직하다. SLE에 대한 이용가능한 치료는 류마티스성 관절염에 대해 이용가능한 치료와 유사하다. 이에는 진통제 또는 비스테로이드계 항-염증성(NSAID) 화합물 중 하나를 이용한 초기 치료가 포함된다. 질환이 진행되고/되거나 증상의 중증도가 증가함에 따라, SLE는 덱사메타손 및 프레드니손을 포함하나 이에 국한되지 않는 스테로이드의 투여에 의해 치료될 수 있다.
더욱 심한 경우, 메토트렉세이트 또는 사이톡신을 포함하나 이에 국한되지 않는 화학요법제를 투여하여, SLE의 증상을 경감시킬 수 있다. 그러나, 이 접근법은, 환자가 가임기 연령의 여성인 경우에 바람직하지 않다. 그러한 경우, 환자의 재생 능력을 저해하지 않는 당해 치료 접근법이 바람직하다.
특정 경우에, SLE는 생물 제제, 예컨대 항체 또는 수용체(또는 수용체 유사체)의 투여에 의해 치료될 수 있다. 그러한 치료 항체의 예는 리툭신 및 레미케이드이다. SLE를 치료하기 위해 투여될 수 있는 염증성 사이토킨에 대한 가용성 수용체의 예시적 예는 엔브렐이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 SLE의 치료를 위해 사용되는, 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 진통제, NSAID, 스테로이드, 또는 상기 언급한 화학요법제 중 임의의 것과 조합하여, 또한 SLE의 치료를 위해 투여되는 생물 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.24.5. 특발성/자가면역 혈소판감소 자반증(ITP)
특발성/자가면역 혈소판감소 자반증(ITP)은 혈소판 세포와 상호 작용하는 면역글로불린 G(IgG) 자가항체에 의해 특징화되는 혈액 장애로서, 그 혈소판 세포의 파괴를 초래한다. 전형적으로 항체는 혈소판 막 당단백질에 대해 특이적이다. 장애는 급성(일시적, 2개월 미만 지속)이거나 만성(6개월 초과 지속)일 수 있다. ITP의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 환자의 병력, 신체적 증상, 및/또는 실험실 시험 결과를 조사함으로써 확인될 수 있다. (문헌 [Pro van, D., and Newland, A., Br. J. Haematol.(2002) 118(4):933-944]; 문헌 [George, J.N. Curr. Hematol.(2003) 2(5):381-387]; 문헌 [Karptkin, S. Autoimmunity.(2004) 37(4):363-368]; 문헌 [Cines, D.B., and Blanchette, V. S., N. Engl. J. Med.(2002) 346(13)995-1008]).
신체적 증상에는 혈소판 세포수의 감소 결과로서 출혈이 일어날 때, 피부 및 점막(예컨대, 입 내 내층)의 부분이 자줏빛으로 보이는 증상이 포함된다. 주요 증상은 출혈로서, 이는 타박상("반상 출혈") 및 피부 또는 점막 상의 작은 붉은 점("점상 출혈")을 포함할 수 있다. 코, 잇몸, 소화관 또는 요로로부터의 출혈도 일어날 수 있다. 드물게는, 뇌 내의 출혈이 일어난다. 통상적 징후, 증상 및 석출 인자는 또한 갑작스러운 발병(소아기 ITP), 점진적 발병(성인 ITP), 비감지성 점상 출혈, 자반증, 월경과다증, 코피, 잇몸 출혈, 점막 상의 수포 출혈, GI 출혈 징후, 과다부정 자궁출혈, 두개강내 출혈 징표, 비감지성 비장, 망막 출혈, 최근의 생 바이러스 번역화(소년기 ITP), 최근의 바이러스 질병(소년기 ITP), 혈소판 계수가 20,000/mm3 미만인 자발적 출혈, 및 타박 성향이 포함되나, 이에 국한되지 않는다
ITP의 진단에 사용될 수 있는 실험실 시험에는 전체 혈구 시험, 또는 골수 내 적절한 혈소판-형성 세포(거핵구)가 있음을 입증하고 다른 질환, 예컨대 전이암 및 백혈병을 입증하기 위한 골수 검사가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 단리된 혈소판감소증은 실험실 평가에 관한 핵심적 조사결과이다. 말초 도말 상의 거대 혈소판은 선천성 혈소판감소증을 가리킨다. 두개강내 출혈에 관한 우려가 존재하는 경우, 두부의 CT 스캔에 의존할 수 있다.
ITP에 대한 현 치료에는 혈소판 수혈 및 비장절제술이 포함된다. 다른 치료에는 글루코코르티코이드의 투여, 면역억제제의 투여, 혈소판 생성을 증진시키는 제제, 예컨대 IL-11, 및 혈소판을 생성하도록 거핵구를 활성화하는 제제, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)의 투여가 포함된다.
더욱 심한 경우에는, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함하나 이에 국한되지 않는 화학요법제를 투여하여, ITP의 증상을 경감시킬 수 있다. 그러나, 이 접근법은, 환자가 가임기 연령의 여성인 경우에 바람직하지 않다. 그러한 경우, 환자의 재생 능력을 저해하지 않는 당해 치료 접근법이 바람직하다.
특정 경우에, ITP는 생물 제제, 예컨대 항체 또는 수용체(또는 수용체 유사체)의 투여에 의해 치료될 수 있다. 그러한 치료 항체의 예는 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 ITP의 치료를 위해 사용되는, 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 상기 언급한 제제 중 임의의 것과 조합하여, 또한 ITP의 치료를 위해 투여되는 생물 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.24.6. 천포창 및 유천포창-관련 장애
천포창-관련 장애 및 유천포창-관련 장애 모두는 피부 및/또는 점막 표면의 수포성 상태에 의해 특징화되는 자가면역 질환의 이종 군이다. 양 질환 모두에서, 수포는 진피 및/또는 표피 내 상피 세포의 표면 상에 발현되는 각종 단백질을 인식하는 자가면역 항체에 의해 유발된다.
천포창-관련 질환을 갖는 환자에 있어서, 수포성은 표피 내에서 발생하고, 데스모글레인 1(Dsg1) 및/또는 데스모글레인 3(Dsg3)에 대해 특이적인 자가항체의 결합으로 인한 것이다. 천포창의 통상적 서브타입을 구별할 수 있다. 항-데스모글레인 항체 특이성에 따라, 낙엽상 천포창(PF)을 갖는 환자는 단지 항-Dsg1 항체만을 생산한다. 심상성 천포창(PV) 및 부종양성 천포창(PNP)을 갖는 환자는, 그 병변이 점막 조직에 국한되는 경우에 항-Dsg3 항체를 생산한다. 이와 대조적으로 피부 및 점막의 병변을 갖는 PV 및 PNP 환자는 항-Dsg1 및 항-Dsg3 자가항체 모두를 생산한다. (문헌 [Nagasaka, T., et al. J. Clin. Invest. 2004. 114:1484-1492]; 문헌 [Seishema, M., et al. Arch Dermatol. 2004. 140(12):1500-1503]; 문헌 [Amagai, M., J. Dermatol. Sci. 1999. 20(2):92-102]).
수포성 유천포창, 색소성 수포성 유천포창, 반흔성 유천포창, 후천성 수포성 표피박리증 및 선상 IgA 수포성 표피박리증을 포함하나 이에 국한되지 않는 유천포창-관련 질환을 갖는 환자에 있어, 수포성은 표피와 진피의 계면에서 발생된다. 가장 통상적인 형태의 유천포창 질환은 수포성 유천포창 항원 180(BP180), 수포성 유천포창 항원 230(BP230), 라미닌(laminin) 5, 및/또는 베타 4 인테그린에 결합하는 자가항체의 존재에 의해 특징화되는 수포성 유천포창(BP)이다. (문헌 [Fontao, L., et al. Mol. Biol. Cell. 2003) 14(5): 1978-1992]; 문헌 [Challacombe, S. J., et al. Acta Odontol. Scand.(2001). 59(4):226-234])
천포창-관련 장애 또는 유천포창-관련 장애의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 환자의 병력, 신체적 증상, 및/또는 실험실 시험 결과를 조사함으로써 확인될 수 있다(문헌 [Mutasim, D. F. Drugs Aging.(2003).20(9):663-681]; 문헌 [Yeh, S.W. et al. Dermatol. Ther.(2003). 16(3):214-223]; 문헌 [Rosenkrantz, W.S. Vet. Dermatol. 15(2):90-98]에 검토됨.).
전형적으로, 이 천포창-관련 장애 또는 유천포창-관련 장애에 대한 진단은 피부 생검에 의해 행해진다. 생검 피부 샘플을 현미경으로 조사하여, 수포의 해부학적 부위(예를 들어 표피, 또는 진피와 표피 사이)를 결정할 수 있다. 이 조사결과는 병변의 부위에서 자가항체의 존재를 검출하기 위한 직접 또는 간접 면역조직화학적 분석과 상관된다. 환자로부터의 혈청 샘플을 또한 특정 단백질에 대한 ELISA-기재 시험을 이용하여 순환 자가항체의 존재에 대해 조사할 수 있다. 인간 샘플 내 데스모글레인 항체를 검출하기 위한 수가지 ELISA-기초 검정법이 기재되었다(문헌 [Hashimoto, T. Arch. Dermatol. Res.(2003) 295 Suppl.1:S2-11]). 생검 샘플 내 이 데스모글레인 자가항체의 존재는 천포창의 특징이다.
임상적으로, 입 내 수포의 존재에 의해 심상성 천포창을 진단할 수 있다. 염증 또는 미란이 또한 눈 및 눈꺼풀의 내층, 및 코 및 생식관의 막 내에 존재할 수 있다. 환자의 절반은 또한 종종은 사타구니, 겨드랑이밑, 얼굴, 두피 및 흉부에서, 피부의 수포 또는 피부 미란을 발생시킨다. 낙엽상 천포창은 상피적이고 비교적 마일한 형태의 천포창이다. 그것은 통상 얼굴 및 두피 상에 나타나나, 또한 등 및 흉부와 관련되기도 한다. 입 내에는 병변이 일어나지 않는다. 수포는 최외면에 더욱 국한되고, 종종 가렵다. 부종양성 천포창은 매우 드물고, 일반적으로 암을 가지는 사람들에게서 발생된다. 병변은 통증이 있고, 입, 입술 및 식도(삼키는 관), 및 피부에 영향을 준다. 기도와 관련되기 때문에, 호흡기 질환의 징후가 일어날 수 있고, 생명을 위협할 수 있다.
천포창 또는 유천포창-관련 질환의 현 치료에는, 피부 상태와 관련된 불편함을 경감시키기 위한 크림 및 연고의 국소 투여, 항-염증성 제제의 투여, 또는 면역억제제의 투여가 포함된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 유천포창 또는 유천포창 관련 질환의 치료를 위해 사용되는, 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 상기 언급한 제제들 중 임의의 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.24.7. 자가면역 당뇨병
본 발명의 특정 측면에 따라, 1A형 당뇨병로도 알려진 자가면역 당뇨병의 치료가 필요한 환자를 항-CD19 항체 조성물 및 방법으로 치료할 수 있다. 1A형 당뇨병은 궁극적으로 췌장 베타 세포를 파괴하는, 유전적, 환경적 및 면역학적 인자의 상승효과적 영향에 의해 유발되는 자가면역 질환이다. 췌장 베타 세포 파괴의 결과는 베타 세포 질량의 감소, 인슐린 생산/분비 감소, 및 혈중 포도당 수준의 점진적 증가이다.
1A형 당뇨병의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군을 환자의 병력, 신체적 증상, 및/또는 실험실 시험 결과를 조사함으로써 확인할 수 있다. 증상은 종종 갑자기 나타나며, 이에는 낮은 혈중 인슐린 수준 또는 부재하는 혈중 인슐린 수준, 갈증 증가, 배설 증가, 공복감 지속, 체중 감량, 흐린 시력, 및/또는 피로가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 현성 당뇨병은 통상 대부분의 베타 세포가 파괴될 때(>80%)까지 명백해지지 않는다. 전형적으로 환자가 무작위(마지막 식사 후 경과 시간과 무관함) 혈중 포도당 농도 ≥11.1 mmol/L(200 mg/dL) 및/또는 공복(적어도 8시간 동안 열량 비섭취) 혈장 내 포도당 ≥7.0 mmol/L(126 mg/dl) 및/또는 2-시간 혈장 내 포도당 ≥11.1 mmol/L(200mg/dL)을 가질 경우, 당뇨병이 임상적으로 진단된다. 이상적으로 진단이 확인되기 전에 필적하는 결과와 함께 상이한 일들에 상기 시험이 반복되어야 한다. (문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York]).
1A형 당뇨병의 자세한 원인은 알려져 있지 않으나, 특정 HLA 혈청형에 대한 명백한 유전적 연관이 있다. 특히, 자가면역 당뇨병이 HLA DR3 및 DR4 혈청형과 관련된 경우, DR3 및 DR4 양자 모두의 존재는 가장 큰, 알려진 유전적 위험을 제공한다. 자가면역 당뇨병에 대한 감수성은 또한 HLA 부류 II(HLA-DQB1*0302와 연관된다. 이와 대조적으로 DRB1-1501 및 DQA1-0102-DQB1-0602를 갖는 HLA 일배체형은 1A형 당뇨병으로부터의 보호와 관련된다. (문헌 [Redondo, M. J., et al. J. Clin. Endocrinol. Metabolism(2000) 10:3793-3797].)
인슐린 생산 베타 섬 세포의 파괴는 섬 세포 자가항체, 췌장 및 누출 림프절 내 활성화 림프구성 침투물, 섬 세포 단백질에 대해 반응성을 갖는 T 림프구, 및 섬 내 염증성 사이토킨의 방출을 동반할 수 있다. (문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York]).
1A형 당뇨병과 관련된 자가항체에는 인슐린, 글루탐산 데카르복실라제(GAD), ICA-512/IA-2, 포그린, 섬 강글리오시드 및 카르복시펩티다제 H에 결합하는 항체가 포함되나 이에 국한되지 않는다(문헌 [Gianani, R. and Eisenbarth, G. S. Immunol. Rev.(2005) 204:232-249]; 문헌 [Kelemen, K. et al., J. Immunol.(2004) 172(6):3955-3962)]; 및 문헌 [Falorni, A. and Borozzetti, A. Best Pr act. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. 19(1): 119-133])
자가면역 당뇨병에 대한 현 치료는 비타민 D, 코르티코스테로이드, 혈압 조절제, 및 혈당증(혈당 수준) 조절제의 투여가 포함된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 자가면역 당뇨병의 치료를 위해 사용되는 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 상기 언급한 제제들 중 임의의 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.24.8. 전신성 경화증(경피증) 및 관련 장애
경피증으로도 알려진 전신성 경화증은 제한성 경피 질환, 미만성 경피 질환, 경피증 없는 경화증, 미분화 연결 조직 질환, 동반 증후군, 국한성 경화증, 경피증, 선상 경피증, 칼맞은 모양의 병소, 버쉬케 성인 피부경화증, 경화점액부종, 만성 이식편대숙주 질환, 호산성 근막염, 당뇨병 중 디지털 경화증, 및 원발성 아밀로이드증 및 다발성 골수종-관련 아밀로이드증을 포함하나 이에 국한되지 않는 질환의 이종성 군을 포함한다(문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th ed./editors, Dennis L. Kasper, et al. McGraw-Hill Companies, Inc. 2005 New York, New York]에서 검토).
경피증과 관련된 임상적 특성에는 레이노 현상, 피부 비후, 피하 석회증, 모세혈관확장증, 관절통/관절염, 근질환, 식도 기능장애, 폐 섬유증, 단리된 폐 동맥 고혈압, 울혈성 심부전 및 신장 발증이 포함될 수 있다. 환자가 상기 질환 증상들 중 하나 이상을 나타내는 정도는 진단 및 잠재적 치료안에 영향을 줄 수 있다.
자가항체에는 항-토포이소머라제 1, 항동원체, 항-RNA 폴리머라제 I, II 및/또는 III, 항-Th RNP, 항-U, RNP(항-피브릴라린), 항-PM/Sci, 항핵 항체(ANA)가 포함된다.
경피증의 치료가 필요한 환자 및 환자 개체군의 확인은 병력 및 신체적 조사결과에 기초할 수 있다. 경피증의 치료가 필요한 환자 또는 환자 개체군은 환자의 병력, 신체적 증상, 및/또는 실험실 시험 결과를 조사함으로써 확인될 수 있다. 유의적 피부 비후가 없는 환자에 있어서는 진단이 지연될 수 있다. 실험실, X-선, 폐 기능 시험, 및 피부 또는 신장 검시를 사용하여, 내부 기관 관련의 정도 및 중증도를 결정할 수 있다.
질환 발병의 초기 월 또는 년도에, 경피증은 전신성 홍반 루푸스, 다발성근염 및 류마티스성 관절염을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 많은 연결 조직 질환과 유사할 수 있다.
전신성 경화증(경피증)의 가장 통상적 증상은 손가락 경화증이다. 초기 증상에는 손 종창이 포함되고, 이는 종종 상기 테퍼링 및 갈고리발톱-유사 기형으로 진전된다. 경피증이 있는 자들에게서 모두 이러한 정도의 피부 경화가 발생되는 것은 아니다. 기타 증상에는 경피증, 선상 손가락 경화증(경화된 손가락), 레이노병 증후군, 석회증 및 모세혈관확장증이 포함될 수 있다.
혈액 시험, 예컨대 항핵 항체(ANA) 시험을 사용하여, 국소화 경피증 및 전신성 경피증 모두를 진단할 수 있다. 예를 들어, 항동원체 항체(ACA) 및 항-Scl-70 항체는 전신성 경화증의 치료가 필요한 환자를 가리키고(문헌 [Ho et al., 2003, Arthritis Res Ther. 5:80-93); 항-토포 II 알파 항체는 국소 경피증의 치료가 필요한 환자를 가리키며; 항-토포 I 알파 항체는 전신성 경피증의 치료가 필요한 환자를 가리킨다. 연소자 경피증(문헌 [Foeldvari, Curr Opin Rheumatol 14:699-703(2002)]; 문헌 [Cefie et al., Int J Clin Pract. 58:635-638(2004))]; 국소화 경피증; 결절 경피증(문헌 [Cannick, J Rheumatol. 30:2500-2502(2003)]); 및 석회증, 레이노병, 식도, 손가락경화증 및 모세혈관확장증(CREST), 제한성 전신성 경피증 및 미만성 전신성 경피증을 비제한적으로 포함하는 전신성 경피증을 포함하나 이에 국한되지 않는, 수가지 유형의 경피증 및 이 유형들을 진단하기 위한 방법이 당업계에 인식되고 공지되어 있다. 전신성 경피증은 또한 전신성 경화증(SSc)로도 알려져 있다. 그것은 또한 진행성 전신성 경화증(PSSc), 또는 가족형 진행성 전신성 경화증(FPSSc)으로도 칭해질 수 있다(문헌 [Nadashkevich et al., Med. Sci. Monit. 10:CR615-621(2004)]; 문헌 [Frances et al., Rev Prat. 52: 1884-90(2002)]). 전신성 경화증은 연결 조직 경화증, 작은 크기의 동맥 및 미세순환과 관련된 혈관 이상, 자가면역 변화의 존재에 의해 특징화되는 다중계 장애이다.
CREST로 알려진 전신성 경피증의 유형은 어떠한 피부 당김에 의해서도 특징화되지 않는다. CREST는 통상 손가락 내, 석회증(칼슘 침착); 레이노병; 삼키는 것을 곤란하게 할 수 있는 식도의 근육 조절 손실; 손가락경화증, 손가락 뼈의 테퍼링 기형; 및 모세혈관확장증, 손가락, 얼굴 또는 입 내의 피부 상의 작은 붉은 점에 의해 특징화된다. 전형적으로, 이들 증상들 중 2가지면 CREST의 진단에 충분하다. CREST는 단독으로 또는 임의의 다른 형태의 경피증 또는 다른 자가면역 질환과 조합하여 발생할 수 있다.
제한성 경피증은, 우묵 디지털 궤양(레이노병에 대해 2차적) 및/또는 폐 섬유증과 함께, 손가락에 제한되는 탕기는 피부에 의해 특징화된다. 얼굴 및 목의 피부가 또한 제한성 경피증과 관련될 수 있다.
근위 당기는 피부가 있는 모든 경우에 미만성 경피증이 진단된다. 근위는 기준점에 가장 가까이 위치함을 의미한다. 근위 당기는 피부는 손목 위 또는 팔꿈치 위의 피부 당김일 수 있다. 전형적으로 팔꿈치와 손목 사이에만 피부 당김이 있는 환자는 진단 임상의가 어떠한 의미의 근위를 사용하는지에 따라 미만성 또는 제한성 전신성 경피증 중 하나의 진단을 받게 된다.
경피증에 대한 현 요법에는 6-메톡시소랄렌 및 자가 줄기 세포 이식 후의 체외 발광요법이 포함된다.
경피증에 대한 현 치료에는 페니실아민, 콜치신, 인터페론 알파, 인터페론 감마, 클로람부실, 시클로스포린, 5-플루오로우라실, 시클로포스파미드, 미노사이클린, 탈리도마이드, 에타너셉트 또는 메토트렉세이트의 제제의 투여가 포함된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 환자를 자가면역 당뇨병의 치료를 위해 사용되는, 상기 개시된 요법들 중 임의의 요법의 전, 동시 또는 후에 항-CD19 항체로 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD19 항체를 상기 언급한 제제들 중 임의의 제제와 조합하여 투여할 수 있다.
5.25. 샘플 및 대상 내 CD19 밀도 결정
반드시 필요한 것은 아니지만, 환자의 진단을 더욱 특징화하기 위하여 CD19 밀도에 대한 검정법을 이용할 수 있다. 세포에 대한 항체 결합의 밀도를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(문헌 [Sato et al., J. Immunology 165:6635-6643 (2000)]; 상기 문헌은 특정 CD 항원의 세포 표면 밀도를 평가하는 방법을 개시함). 다른 표준 방법에는 스캐차드(Scatchard) 분석이 포함된다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 분리하고, 방사성표지하고, 방사성표지된 항체의 비활성을 결정할 수 있다. 이어서, 항체를 CD19를 발현하는 표적 세포와 접촉시킨다. 상기 세포와 관련된 방사성을 측정할 수 있고, 비활성에 기초하여, 세포에 결합된 항체 또는 항체 단편의 양을 결정할 수 있다.
형광 활성화된 유세포분석법(FACS)을 또한 이용할 수 있다. 일반적으로 항체 또는 항체 단편은 CD19를 발현하는 표적 세포에 결합된다. 이어서, 상기 항체에 결합하는 두 번째 시약, 예를 들어 형광색소 표지 항-면역글로불린 항체를 추가한다. 그 다음, 형광색소 염색을 측정하고, 이를 이용하여 세포에 대한 항체 또는 항체 단편 결합의 밀도를 결정할 수 있다.
다른 적합한 방법으로서, 항체 또는 항체 단편은 검출가능 표지, 예를 들어 형광단(fluorophore)으로 직접적으로 표지하고, 표적 세포에 결합시킬 수 있다. 표지 대 단백질 비율을 결정하고, 이를 공지되어 있는 양의 표지가 결합된 표준 비드와 비교한다. 세포에 결합된 표지의 양과 공지된 표준의 비교가 상기 세포에 결합된 항체가 양을 산정하는 데 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 또는 대상 내에서 CD19의 존재 및/또는 밀도를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제시한다. 이는 또한 질병과 치료 효과를 모니터링하고 투여되는 항체의 양을 결정하고 조정하는 데 이용될 수 있다. 이러한 생체내 방법은 PET(양전자 방출 단층 촬영) 또는 SPECT(단일 광양자 방출 컴퓨터 단층 촬영)와 같은 영상화 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 공유 부착된 킬레이터를 이용하여 항-CD19 항체를 인듐으로 표지할 수 있다. 생성된 항체는 CD20 항원을 영상하기 위하여 제발린™(인듐 표지 항-CD20 mAb)(바이오젠 이디(Biogen Idee))(미국 메사츄세츠주 캠브리지 소재)을 이용할 때와 동일한 방식으로 표준 감마 카메라를 이용하여 영상화할 수 있다.
한 실시양태에서, 생체내 방법은 본 발명의 항체와 인간 CD19 항원 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 임의적으로 대조 샘플과 함께, 검사되는 샘플을 본 발명의 인간 항-CD19 항체와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, 복합체 형성을 검출한다(예를 들어, 형광 활성화 유세포분석법 또는 웨스턴 블로팅(Western blotting))을 이용함). 검사 샘플과 함께 대조 샘플을 이용하는 경우에, 복합체는 양쪽 샘플 모두에서 검출되고, 샘플 사이에 복합체의 형성에서 임의의 통계학적으로 유의한 차이는 검사 샘플 내에서 인간 CD19의 존재를 가리킨다.
다른 실시양태에서, CD19 밀도의 척도로서 평균 형광 강도를 이용할 수 있다. 그러한 실시양태에서, B 세포는 환자로부터 채취되고 형광 표지로 표지된 CD19 항체로 염색되며, 형광 강도는 유세포분석법을 이용하여 측정된다. 형광 강도는 B 세포에 대한 강도의 평균으로서 측정되고 표시될 수 있다. 이들 방법을 이용하여, CD19 밀도의 대표적인 평균 형광 강도는 본 발명의 조성물 및 방법을 이용한 치료 전 및 후에 1명의 환자에서 비교하거나, 환자 및 B 세포 상의 hCD19의 정상 수준 사이에 비교할 수 있다.
B 세포 상의 CD19 발현의 밀도가 결정된 환자에서, CD19의 밀도는 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체의 투약량 및/또는 상기 항체와 병용되는 치료 처방의 결정 및/또는 조정에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, CD19의 밀도가 높은 경우에, 인간에서 ADCC를 덜 효율적으로 매개하는 항-CD19 항체를 이용하는 것이 가능할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 환자가 낮은 CD19 밀도를 보유하는 특정 실시양태에서, 더욱 높은 용량의 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체가 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 환자가 낮은 CD19 밀도를 가지는 다른 실시양태에서, 낮은 용량의 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체가 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 환자가 높은 CD19 밀도를 가지는 특정 실시양태에서, 더욱 낮은 용량의 본 발명의 조성물 및 방법의 항-CD19 항체가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, CD19 밀도를 환자에서 CD20 밀도와 비교하거나, CD19 밀도를 인간 또는 특정 환자 개체군에 대한 CD19 밀도와 비교하거나, 또는 CD19 밀도를 치료 이전에 또는 B 세포 질환이나 질병의 발병 이전에 환자에서 CD19 수준과 비교할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료되는 환자는 CD19가 B 세포의 표면 상에 존재하는 B 세포 악성 종양을 가진다.
5.26. 면역요법 프로토콜
본원에서 "항-CD19 면역요법"으로 칭해지는 치료 처방/프로토콜에 사용되는 항-CD19 항체 조성물은 네이키드 항체, 면역접합체 및/또는 융합 단백질일 수 있다. 본 발명의 조성물은 단일 치료제로서, 또는 다른 치료제 또는 처방과 조합하여 이용될 수 있다. 항-CD19 항체 또는 면역접합체는 하나 이상의 치료제의 투여 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과의 조합 치료 처방에 사용될 수 있는 치료제는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고/하거나 세포의 파괴를 유도하는 임의의 물질이 포함된다. 그 예에는 방사성 동위원소, 화학요법제 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그것의 단편과 같은 독소가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 기재된 치료 처방, 또는 임의의 요망되는 치료 처방은 유전자도입 동물 모델, 예를 들면, 고유 CD19 항원에 이를 대신하여 인간 CD19 항원을 발현하는 유전자도입 모델을 이용하여 효능에 대해 검사할 수 있다. 따라서, 항-CD19 항체 치료 처방은 인간에게 투여하기 전에 효능을 결정하기 위하여 동물 모델에서 검사될 수 있다.
항-CD19 항체, 조성물 및 방법은 B 세포 악성 종양을 비롯한 B 세포 질환을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 용어 "B 세포 악성 종양"은 B 세포 계열의 세포로부터 유래된 임의의 악성 종양을 포함한다. 예시적인 B 세포 악성 종양에는 하위 등급/여포성 NHL, 소형 림프구성(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 상위 등급 면역아구성 NHL, 상위 등급 림프성 NHL, 상위 등급 소형 비-분할 세포 NHL, 맨틀 세포 림프종, 치료하기 어려운 질병 NHL를 비롯한 B 세포 아형 비-호지킨 림프종(NHL); 버킷 림프종; 다발성 골수종; 예비-B 급성 림프아구성 백혈병 및 초기 B 세포 전구체로부터 유래되는 다른 악성 종양; 통상적인 급성 림프구성 백혈병(ALL); 면역글로불린-돌연변이화된 CLL 및 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 비롯한 만성 림프구성 백혈병(CLL); 모발상 세포 백혈병; 무-급성 림프아구성 백혈병; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 종자 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL 및 3형 DLBCL을 비롯한 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL); 전림프구성 백혈병; 경쇄 질환; 형질세포종; 골경화성 골수종; 형질 세포 백혈병; 미결정 유의성 단클론 감마병증(MGUS); 아급성 다발성 골수종(SMM); 무통성 다발성 골수종(IMM); 표준형 및 결절성 림프구 우세형을 비롯한 호지킨 림프종; 림프형질세포 림프종(LPL); 및 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종을 비롯한 변연부 림프종이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 한 실시양태에서 본 발명은 여포성 림프종; 맨틀 세포 림프종; 버킷 림프종; 다발성 골수종; 종자 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL 및 3형 DLBCL을 비롯한 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL); 표준형 및 결절성 림프구 우세형을 비롯한 호지킨 림프종; 림프형질세포 림프종(LPL); 위 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종을 비롯한 변연부 림프종; 및 면역글로불린-돌연변이화된 CLL 및 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 비롯한 만성 림프구성 백혈병(CLL)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 성숙 B 세포 악성 종양(즉, 세포 표면 상에서 Ig를 발현함)을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
또한, CD19는 예를 들어, CD20보다 B 세포 발달 시에 더 초기에 발현되기 때문에, 예를 들어 골수 내에서 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양(즉, 세포 표면 상에 Ig를 발현하지 않음)을 치료하는데 특히 적합하다. 예시적 예비-B 세포 및 미성숙 B 세포 악성 종양에는 급성 림프성 백혈병이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 특별한 실시양태에서, 본 발명은 림프절외 종양을 치료하기 위해 수행될 수 있다.
5.27. 항-CD19 면역요법
본 발명에 따라, "항-CD19 면역요법"은 본원에 기재된 임의의 치료 처방에 따른 본 발명의 항-CD19 항체의 투여를 포함한다. 항-CD19 항체는 네이키드 항체, 또는 면역접합체 또는 융합 단백질로서 투여될 수 있다.
항-CD19 면역요법은 B 세포 악성 종양의 치료를 위한 단일 치료제로서 항-CD19 항체의 투여를 포함한다. 항-CD19 면역요법은 B 세포 악성 종양으로부터 유래되는 초기 단계 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 항-CD19 면역요법은 B 세포 악성 종양을 치료하는 방법을 포함하는데, 여기서 항-CD19 항체는 ADCC를 매개한다. 항-CD19 면역요법은 B 세포 악성 종양을 치료하는 방법을 포함하는데, 여기서 항-CD19 항체는 상기 요법이 화학요법, 방사성 화학물질 기재 요법 또는 외과 요법인 지에 상관없이, 환자가 악성 종양에 대한 치료를 받기 이전에 투여된다.
한 실시양태에서, B 세포 악성 종양을 앓는 인간 대상은 인간 ADCC를 매개할 수 있는 인간 또는 인간화 항체를 투여함으로써 치료될 수 있다. 초기 단계 질병, 또는 단일 치료제의 경우에, ADCC를 매개할 수 있는 임의의 항-CD19 항체(쥐과 동물 및 키메라 항체 포함)가 인간 대상에 사용될 수 있으나; 인간 및 인간화 항체가 바람직할 수 있다.
IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입의 항체가 일부의 경우에 치료에 바람직하다. 그러나, 관련 이펙터 기능, 예컨대 인간 ADCC를 가지는 IgG2 또는 IgG4 인간 이소타입도 역시 이용될 수 있다. 그러한 이펙터 기능은 시험관내 또는 생체내 이펙터 세포에 의한 표적 세포 용해를 매개하는 해당 항체의 능력을 측정함으로써 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 사용되는 항체의 용량은 순환 B 세포를 고갈시키기에 충분해야 한다. 요법의 진전은 혈액 샘플을 분석함으로써 환자에게 있어 모니터링할 수 있다. 치료를 모니터링하기 위하여 임상적 개선의 다른 징후가 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 연계하여 사용될 수 있는, B 세포 고갈을 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이에는 이하 실시양태들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 한 실시양태에서, 순환 B 세포 고갈은 B 세포에 결합하여 B 세포의 양을 결정하는 항-CD19 항체 이외의 시약을 이용한 유세포분석법으로 측정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 혈액 내에서 항체 수준은 표준 혈청 분석을 이용하여 모니터할 수 있다. 그러한 실시양태에서, B 세포 고갈은 B 세포에 의해 생산되는 것으로 알려져 있는 항체의 양을 정의함으로써 간접적으로 측정된다. 이어서, 상기 항체의 수준을 모니터링하여 B 세포의 고갈 및/또는 기능적 고갈을 결정한다. 또 다른 실시양태에서, B 세포 고갈은 B 세포를 동정하는 면역화학 염색으로 측정될 수 있다. 환자 조직으로부터 추출된 B 세포는 현미경 슬라이드 상에 위치시키고, 표지하고, 존재 또는 부재를 검사할 수 있다. 관련 실시양태에서, 치료 전 및 후에 추출된 B 세포를 비교하여 B 세포의 존재의 차이를 결정한다.
종양 부하량(tumor burden)을 측정하고, 이를 본 발명의 조성물 및 방법에 연계하여 이용할 수 있다. 종양 부하량을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이에는 하기 실시양태가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 물질대사 활성을 측정하고 종양을 제시하는 더욱 높은 활성 부위를 확인하는데 PET 스캔이 사용될 수 있다. CT 스캔 및 MRI도 역시 연조직에서 종양의 존재 및 크기를 검사하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 종양 부피와 위치를 측정하는데 골 스캔(bone scan)이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종양 부하량은 도플러 기술(doppler technology)(예를 들어, 초음파)을 이용하여 종양의 혈액 유입과 유출을 검사함으로써 측정할 수 있다. 그러한 실시양태에서, 종양 부하량에 대한 추정치를 산정하기 위하여 환자의 적당한 조직 내에서 시간의 추이에서 혈류의 변화 또는 정상적인 혈류로부터 이탈이 사용될 수 있다. 종양 부하량을 측정하는 그러한 방법은 본 발명의 치료 방법 전 및 후에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, B 세포는 고갈되고/되거나 종양 부하량은 감소되는 반면, ADCC 기능은 유지된다.
항-CD19 항체가 단일 치료제로서 투여되는 본 발명의 실시양태에서, 본 발명은 상이한 치료 처방의 사용을 고려한다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 네이키드 항체이다. 관련 실시양태에서, 사용하는 네이키드 항-CD19 항체의 용량은 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20 또는 20.5 ㎎/환자 체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 사용하는 네이키드 항-CD19 항체의 용량은 적어도 약 1 내지 10, 5 내지 15, 10 내지 20, 또는 15 내지 25 ㎎/환자 체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 이용된 네이키드 항-CD19 항체의 용량은 적어도 약 1 내지 20, 3 내지 15, 또는 5 내지 10 ㎎/환자 체중 kg이다. 바람직한 실시양태에서, 이용된 네이키드 항-CD19 항체의 용량은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ㎎/환자 체중 kg이다.
특정 실시양태에서, 용량은 4 내지 8주 연속 동안 매주 투여되는 약 375 ㎎/㎡의 항-CD19 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용량은 4 내지 8주 연속 동안 매주 투여되는, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ㎎/환자 체중 kg이다.
상기 기재된 예시적 용량의 항-CD19 항체는 단락 5.21.3에 기재된 바와 같이 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 용량은 단일 주사 용량이다. 다른 실시양태에서, 용량은 일정한 기간 동안 투여된다. 다른 실시양태에서, 용량은 일정한 기간 동안 수회 투여된다. 기간은 수일, 수개월 또는 수주내 측정될 수 있다. 항-CD19 항체의 다회 용량이 독성 부작용과 균형을 맞추면서 치료 이익을 달성하는 데 적합한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 복수 분량이 이용되는 경우에, 항체로 반복 처리 전에 환자의 단핵구 총수를 회복시킬 수 있는 시간 간격을 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 투약 처방은 치료 효능을 최적화하게 되는데, 그 이유는 단핵구 개체군이 환자의 ADCC 기능을 반영하기 때문이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 치료에 반응하는 인간 환자에 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 질병이 진행되지 않는 인간 환자에 투여된다. 관련 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 질병이 진행되지 않고 일정한 기간 동안 진행되지 않았던 인간 환자에 투여되고, 이후에 환자는 상기 질병이 재발하거나 다시 진행되지 않으면 본 발명의 조성물이 투여되지 않는다. 예를 들어, 환자는 약 4 내지 8주 동안 상기 언급된 임의의 용량으로 치료될 수 있는데, 이 기간 동안 상기 환자는 질병 진행이 모니터링된다. 질병 진행이 중단되거나 반전되면, 환자는 재발할 때까지, 즉, 치료되는 질병이 재발하거나 진행될 때까지 본 발명의 조성물이 투여되지 않는다. 이러한 재발 또는 진행 이후, 환자는 초기에 사용된 동일한 투약 처방으로 다시 치료되거나, 또는 상기 기재된 다른 용량을 이용하여 치료될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1회 적하량(loading dose)으로 투여된 후, 일정한 기간 동안, 감소된 복수 분량(유지량)으로 투여될 수 있다. 그러한 실시양태에서, 효과적인 B 세포 고갈을 유지하기 위하여 용량이 시간별로 분배되고 양이 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적하량은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 ㎎/환자 체중 ㎏이고, 유지량(maintenance dose)은 적어도 약 5 내지 10 ㎎/환자 체중 ㎏이다. 바람직한 실시양태에서, 유지량은 매 7, 10, 14 또는 21일의 간격으로 투여된다. 유지량은 독성이 나타날 때까지, 혈소판 수가 감소할 때까지, 질병 진행이 없을 때까지, 환자가 약물에 대한 면역 반응을 나타낼 때까지, 또는 질병이 말기 상태로 진행될 때까지, 무한히 지속될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 질병이 말기 단계로 진행될 때까지 인간 환자에 투여된다.
환자의 순환 단핵구 수준이 치료 처방의 일부로서 모니터링되는 본 발명의 실시양태에서, 투여되는 항-CD19 항체의 용량은 단핵구 총수가 회복될 수 있도록 일정한 간격으로 분배될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 매 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일의 간격으로 투여될 수 있다.
항-CD19 항체가 독소에 접합되거나 독소와 공동으로 투여되는 본 발명의 실시양태에서, 당업자가 인지하는 바와 같이, 항-CD19 항체의 용량은 독소 용량에 기초하여 조정될 수 있고, 상기 독소 용량은 이용되는 독소의 특정 유형에 좌우된다. 전형적으로 독소가 사용되는 경우에, 항-CD19 항체의 용량은 네이키드 항-CD19 항체가 사용될 때의 용량보다 적다. 적절한 용량은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 특정 독소에 대하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량 범위 연구를 수행하여, 독소와 함께 투여되거나 독소에 접합될 때 항-CD19 항체의 최대 허용량을 결정할 수 있다.
항-CD19 항체가 방사선요법제에 접합되거나 방사선요법제와 공동으로 투여되는 본 발명의 실시양태에서, 항-CD19 항체의 용량은 이용된 방사선요법제에 좌우된다. 바람직한 특정 실시양태에서, 2 단계 공정이 이용된다. 첫째, 인간 환자는 네이키드 항-CD19 항체를 함유하는 조성물이 투여되고, 약 6, 7, 8, 9, 또는 10일후, 소량의 방사선요법제가 투여된다. 둘째, 저용량 요법의 내성(tolerance), 분배 및 클리어런스(clearance)가 결정되면, 환자는 일정한 용량의 네이키드 항-CD19 항체가 투여된 후, 치료량의 방사선요법제가 투여된다. 그러한 치료 처방은 제발린™(인듐 표지 항-CD20 mAb)(바이오젠 이디) 또는 벡사르(BEXXAR)™(GSK, 코울터 파마슈티칼(Coulter Pharmaceutical))을 이용한 비-호지킨 림프종의 치료를 위하여 승인된 것들과 유사하다.
5.28. 화학요법제와의 조합
항-CD19 면역요법(네이키드 항체, 면역접합체, 또는 융합 단백질 이용)은 화학요법, 방사선면역요법(RIT), 화학요법 및 외부 방사선(병용요법, CMT), 또는 병용 방사선면역요법(CMRIT) 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는 다른 요법과 병용될 수 있다. 바람직한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD19 항체요법은 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 가장 통상적인 화학요법 처방인 CHOP(시클로포스파미드-히드록시독소루비신-온코빈(빈크리스틴)-프레드니솔론)와 공동으로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 "~와 공동으로 투여하는"이란 항-CD19 면역요법이 이용하는 다른 요법 전, 중 또는 후에 투여될 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 세포독성 방사성핵종 또는 방사성치료 동위원소, 예를 들어 알파-방출 동위원소, 예컨대 225Ac, 224Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra 또는 223Ra와 병용된다. 세포독성 방사성핵종은 또한 베타-방출 동위원소, 예컨대 186Re, 188Re, 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 153Sm, 166Ho 또는 64Cu일 수 있다. 또한, 세포독성 방사성핵종은 오거(Auger) 및 낮은 에너지 전자를 방출할 수 있는데, 이에는 동위원소 125I, 123I 또는 77Br이 포함된다. 다른 실시양태에서, 동위원소는 198Au, 32P 등일 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상에게 투여되는 방사성핵종의 양은 약 0.001 mCi/㎏ 내지 약 10 mCi/㎏이다.
일부 실시양태에서, 대상에게 투여되는 방사성핵종의 양은 약 0.1 mCi/㎏ 내지 약 1.0 mCi/㎏이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상에게 투여되는 방사성핵종의 양은 약 0.005 mCi/㎏ 내지 0.1 mCi/㎏이다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 화학 독소 또는 화학요법제와 병용된다. 적절하게는, 화학 독소 또는 화학요법제는 칼리케아마이신 및 에스페라마이신과 같은 엔다이인, 듀오카르마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티넘, 에토포시드, 블레오마이신 및 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
항-CD19 면역요법과의 복합 요법으로 사용될 수 있는 적합한 화학 독소 또는 화학요법제에는 칼리케아마이신 및 에스페라마이신과 같은, 엔다이인 계통 분자의 구성원이 포함된다. 화학 독소는 또한 듀오카르마이신(예를 들어, 미국 특허 제5,703,080호; 및 미국 특허 제4,923,990호 참조), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티넘, 에토포시드, 블레오마이신, 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레(도세탁셀), 부설판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라마이신(미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련된 질소 머스타드가 포함된다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 "CVB"(1.5 g/㎡ 시클로포스파미드, 200 내지 400 ㎎/㎡ 에토포시드, 및 150 내지 200 ㎎/㎡ 카르무스틴)가 본 발명의 조합 요법에 사용될 수 있다. CVB는 비-호지킨 림프종을 치료하는 데 이용되는 처방이다(문헌 [Patti et al., Eur. J. Haematol., 51:18 (1993)]). 다른 적합한 복합 화학요법 처방은 당업자에게 공지되어 있다. 문헌 [Freedman et al., "Non-Hodgkin's lymphomas," in CANCER MEDICINE, Volume 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds.), pp. 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)]를 참조한다. 예시로서, 중간-등급 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 1세대 화학요법 처방에는 C-MOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), 및 CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)가 포함된다. 유용한 2세대 화학요법 처방은 m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린)이고, 한편 적합한 3세대 처방은 MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)이다. 다른 유용한 약물에는 페닐 부티레이트 및 브로스타틴-1이 포함된다. 복수양식 요법에서, 화학요법 약물 및 사이토카인 모두 본 발명에 따른 항체, 면역접합체 또는 융합 단백질과 공동-투여된다. 사이토카인, 화학요법 약물과 항체, 면역접합체 또는 융합 단백질은 임의의 순서로, 또는 모두 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 다른 독소에는 유독성 렉틴(lectin); 식물성 독소, 예를 들어 리신, 아브린, 모데신, 보툴리나 및 디프테리아 독소가 포함된다. 물론, 다양한 독소의 조합 역시 하나의 항체 분자에 결합되어 다양한 세포독성을 도모할 수 있다. 본 발명의 복합 요법에 적절하게 이용되는 독소의 예는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 포도상구균 장독소-A, 섬자리공 항-바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소이다(문헌 [Pastan et al., Cell, 47:641 (1986)]; 문헌 [Goldenberg et al., Cancer Journal for Clinicians, 44:43 (1994)] 참조). 사용될 수 있는 효소 활성 독소와 그것의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균으로부터의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
적합한 독소 및 화학요법제는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)], 및 문헌 [GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)]에 기재되어 있다. 다른 적합한 독소 및/또는 화학요법제가 당업자에 공지되어 있다.
본 발명의 항-CD19 면역요법은 또한 프로드러그(예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)를 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드러그-활성화 효소와 병용될 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다. 그러한 조합의 효소 성분에는 프로드러그에 이런 방식으로 작용하여 상기 프로드러그를 활성 세포독성 형태로 전환시키는 효소가 포함된다. 본원에서 "프로드러그"는 모 약물에 비하여 종양 세포에 대한 세포독성이 덜하고 효소적으로 활성화되거나 더욱 강한 활성을 갖는 모 형태로 전환될 수 있는 약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)]; 문헌 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.)5 pp. 247-267, Humana Press (1985)]를 참조한다. 본 발명의 항-CD19 항체와 조합하여 사용될 수 있는 프로드러그에는 더욱 강한 세포독성을 갖는 유리 약물로 전환될 수 있는 인산염-함유 프로드러그, 티오인산염-함유 프로드러그, 황산염-함유 프로드러그, 펩티드-함유 프로드러그, D-아미노산-변형된 프로드러그, 당화된 프로드러그, α-락탐-함유 프로드러그, 임의적으로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드러그가 포함되나 이에 국한되지 않는다. 본 발명에 유용한 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물에는 상기 기재된 화학요법제가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 투입은 독성 요법의 연기를 가능하게 할 수 있고, 화학요법과 관련된 불필요한 부작용 및 합병증 위험을 피하는 데 도움이 될 수 있고, 화학요법에 대한 내성의 발생을 지연시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 독성 요법 및/또는 독성 요법에 대한 내성은 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료된 환자에서 약 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년 이하 동안 지연된다.
5.29. 치료 항체와의 조합
본원에 기재된 항-CD19 면역요법은 항-CD20 mAb, 항-CD52 mAb, 항-CD22 항체 및 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭산™(C2B8; 리툭시맙™; 바이오젠 이디)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 다른 항체와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체와 조합하여 이용되거나 본 발명의 조성물의 이용될 수 있는 치료 항체의 다른 예에는 헤르셉틴™(트라추주맙(Trastuzumab); 제넨테크), 마일로타그(MYLOTARG)™(젬추주맙 오조가미신(Gemtuzumab ozogamicin); 웨이쓰 파마슈티칼즈(Wyeth Pharmaceuticals)), 캄파쓰™(알렘투주맙(Alemtuzumab); 베르렉스(Berlex)), 제발린(ZEVALIN)™ (이프리투모맙 티욱세탄(Ipritumomab tiuxetan); 바이오젠 이디), 벡사르™(토시투모맙; 가락소스미쓰클라인 코릭사(GlaxoSmithKline Corixa)), 에르비툭스™(세툭시맙); 임클론), 및 아바스틴(AVASTIN)™(베바시주맙; 제넨테크)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 기재된 항-CD19 면역요법은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIII 및/또는 FcγRIV로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 수용체에 대해 특이적인 항체와 조합하여 투여될 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 면역요법은 FcγRIIB에 대해 특이적인 조합하여 투여될 수 있다. 이 목적을 위해 적합한 항-FcγRIIB 항체는 미국 특허 공보 제2004185045호, PCT 공개 제WO05051999A호, 제WO05018669호 및 제WO04016750호에 기재되었다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 및 항-CD20 및/또는 항-CD22 mAb 및/또는 항-CD52 mAb는 임의적으로 동일한 약학적 조성물 내에 임의의 적절한 비율로 제공될 수 있다. 예시로서, 항-CD19와 항-CD20 항체의 비율은 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1,2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000, 또는 그 이상의 비율일 수 있다. 마찬가지로, 항-CD19 및 항-CD22 항체의 비율은 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000, 또는 그 이상의 비율일 수 있다. 유사하게, 항-CD19 및 항-CD52 항체의 비율은 약 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90. 1:100, 1:250, 1:500 또는 1:1000, 또는 그 이상의 비율일 수 있다.
5.30. 단핵구 또는 대식세포 기능을 증진시키는 조합 화합물
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 단핵구 또는 대식세포 수 또는 기능을 (예를 들어, 적어도 약 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상) 증진시키는 화합물이 항-CD19 면역요법과 병용될 수 있다. 이들 화합물은 당업계에 공지되어 있는데, 이에는 비제한적으로 인터류킨(예를 들어, IL-12)과 같은 사이토카인 및 인터페론(예를 들어, 알파 또는 감마 인터페론)이 포함된다.
단핵구 또는 대식세포 기능 또는 증진을 강화시키는 화합물은 항체, 면역접합체 또는 항원-결합 단편과 동일한 약학적 조성물 내에서 제형될 수 있다. 개별적으로 투여되는 경우에, 항체/단편과 상기 화합물은 동시에(서로 수 시간 이내에) 투여되거나, 동일한 치료 과정 동안 투여되거나, 또는 순차적으로(즉, 환자는 먼저, 항체/단편 치료 과정을 받고, 이어서 대식세포/단핵구 기능을 증진시키는 화합물 등의 과정이 적용되거나, 이와 역순의 과정이 적용됨) 투여될 수 있다. 그러한 실시양태에서, 단핵구 또는 대식세포 기능을 증진시키는 화합물은 다른 치료 처방 및/또는 본 발명의 조성물을 이용한 치료에 전, 동시 또는 후에, 인간 대상에 투여된다. 한 실시양태에서, 인간 대상은 인간에 대한 정상 범위의 혈액 백혈구, 단핵구, 호중구, 림프구 및/또는 호염기구 수를 가진다. 인간 혈액 백혈구(총)에 대한 정상 범위는 약 3.5 내지 약 10.5(109/L)이다. 인간 혈액 호중구에 대한 정상 범위는 약 1.7 내지 약 7.0(109/L)이고, 단핵구는 약 0.3 내지 약 0.9(109/L)이고, 림프구는 약 0.9 내지 약 2.9(109/L), 호염기구는 약 0 내지 약 0.3(109/L)이고, 호산구는 약 0.05 내지 약 0.5(109/L)이다. 다른 실시양태에서, 인간 대상은 인간에 대한 정상 범위보다 낮은 혈액 백혈구 수, 예를 들면, 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8(109/L)개의 백혈구를 보유한다.
본 발명의 이 실시양태는 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 항체 단편, 또는 당업계에 공지된 다른 항체로 수행될 수 있고, 항-CD22, 항-CD52 및/또는 항-CD20 항체 요법(예를 들어, C2B8과 같은 기존 항체로 치료)에 내성을 보이는 대상, 현재 화학요법을 받고 있거나 이전에 받은 적이 있는 대상, B 세포 질환이 재발된 대상, 면역약화된 대상, 또는 이와 달리 대식세포 또는 단핵구 기능이 손상된 대상에 특히 적합하다. 치료에 내성이거나 B 세포 질환이 재발된 환자의 유병율(prevalence)은 적어도 부분적으로 대식세포 또는 단핵구 기능의 손상에 기인한다. 따라서, 본 발명은 항-CD19 항체와 항원-결합 단편을 투여하는 방법과 공동으로 이용되는 ADCC 및/또는 대식세포 및/또는 단핵구 기능을 증진시키는 방법을 제공한다.
5.31. 면역조절제와의 조합
본 발명의 항-CD19 면역요법은 면역조절제와 병용될 수도 있다. 이 접근법에서, 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 항체가 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 복합 요법을 위한 "면역조절제"는 숙주의 면역계를 억제하거나, 감추거나, 또는 증진시키는 역할을 하는 물질을 지칭한다. 이에는 사이토카인 생산을 억제하거나, 자기-항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나, 또는 MHC 항원을 마스킹하는 물질이 포함된다. 그러한 제제의 예에는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘(미국 특허 제4,665,077호 참조), 아자티오프린(또는, 아자티오프린에 대한 부작용이 있는 경우에, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드(이는 미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 마스킹함); MHC 항원과 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 사이클로스포린 A; 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손과 같은 스테로이드; 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체를 비롯한 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항물질; 항-종양 괴사 인자-α 항체; 항-종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종성 항-림프구 글로불린; 범(pan)-T 항체, 바람직하게는, 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 보유하는 가용성 펩티드(1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나아제; TGF-β; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스퍼구알린; 라파마이신; T-세포 수용체(미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편(문헌 [Offner et al., Science 251:430-432 (1991)]; WO90/11294; 및 WO 91/01133); 및 T-세포 수용체 항체(EP 340,109), 예를 들어 T10B9이 포함된다. 사이토카인의 예에는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 이들 사이토카인에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 송아지 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상성 자극 호르몬(TSH), 황체화 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 최유물질; 종양 괴사 인자-α; 뮬러리안(mullerian)-억제 물질; 마우스 생식호르몬 관련된 펩티드; 인히빈(inhibin); 악티빈(activin); 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이오틴(TPO); NGF-α와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-CgP(GM-CSP); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 및 IL-15와 같은 인터류킨(IL); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 비롯한 기타 폴리펩티드 인자가 포함되나 이에 국한되지 않는다. 본원에 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원, 또는 재조합 세포 배양액과 고유 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물로부터의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 방법은 대상에게 하나 이상의 면역조절제, 바람직하게는, 사이토카인을 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 바람직한 사이토카인은 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, IL-18, G-CSF, GM-CSF, 트롬보포이에틴 및 γ 인터페론에서 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
이 면역조절제는 항-CD19 항체와 동일한 시점에 또는 별개의 시점에 투여된다. 바람직한 면역조절제는 치료 장애의 유형 및 환자의 병력을 비롯한 여러 인자에 좌우될 것이나, 그 제제는 빈번하게 시클로스포린 A, 글루코코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손 또는 메틸프레드니솔론), OKT-3 단클론 항체, 아자티오프린, 브로모크립틴, 이종성 항-림프구 글로불린, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
5.32. 다른 치료제와의 조합
종양 신생혈관구조(neovasculature)에 작용하는 약물도 역시 항-CD19 면역요법과 병용될 수 있는데, 여기에는 콤브레스타틴(combrestatin) A4과 같은 튜불린-결합제(문헌 [Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, (2001)]) 및 안지오스타틴 및 엔도스타틴(본원에 참조 인용되는 문헌 [Rosen, Oncologist 5:20, 2000]에서 검토됨)이 포함된다. 항-CD19 항체와의 병용에 적합한 면역조절인자에는 α-인터페론, γ-인터페론 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 이용한 조합 요법에 이용되는 치료제는 펩티드이다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 하나 이상의 칼리케아마이신(calicheamicin) 분자와 병용된다. 칼리케아마이신 계통의 항생제는 피코몰이하(sub-picomolar) 농도에서 이중-가닥 DNA 파단을 생성시킬 수 있다. 이용되는 칼리케아마이신의 구조 유사체에는 γ1I, γ2I, γ3I, N-아세틸-γ1I, PSAG, 011이 포함되나, 이에 국한되지 않는다(문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌 [Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)]).
항-CD19 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 또한 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-CD19 항체는 종양 선표적화(tumor pretargeting)에 사용되는 "수용체"(가령, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있는데, 여기서 상기 길항물질-수용체 접합체가 환자에 투여되고, 이어서 결합되지 않은 접합체가 소거제(clearing agent)에 의해 순환계로부터 제거된 후, 치료제(예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 비오틴)가 투여된다.
특정 실시양태에서, 치료 처방은 항-CD19 항체 조성물의 세포독성 효과를 완화시키는 화합물을 포함한다. 그러한 화합물에는 진통제(예를 들어, 아세트아미노펜), 비스포스포네이트, 항히스타민제(예를 들어, 클로로페닐아민 말레인산염), 및 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론 및 프로게스틴)가 포함된다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법과 조합하여 이용되는 치료제는 소형 분자(즉, 대략 2500 달톤 미만의 분자량을 갖는 무기 또는 유기 화합물)이다. 예를 들어, 소형 분자 라이브러리는 스펙스 앤드 바이오스펙스(Specs and BioSpecs) B.V.(네덜란드 리스위크 소재), 켐브리지 코포레이션(Chembridge Corporation)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 콤제넥스 USA 인코포레이티드(Comgenex USA Inc.)(미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 매이브리지 케미칼즈 리미티드(Maybridge Chemicals Ltd.)(영국 콘월 PL34 OHW 소재)로부터 상업적으로 구입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 항세균제와 조합하여 투여될 수 있다. 항세균제의 비제한적 예에는 세균 감염을 억제 및/또는 감소시키거나, 세균의 복제를 억제 및/또는 감소시키거나, 또는 세균의 다른 세포 또는 대상으로의 확산을 억제 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기 분자, 무기 분자 및 소형 분자가 포함된다. 항세균제의 구체예에는 페니실린, 세팔로스포린, 이미페넴, 악스트레남, 반코마이신, 시클로세린, 바시트라신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 젠타마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 트리메토프림, 노르플록사신, 리팜핀, 폴리믹신, 암포테리신 B, 니스타틴, 케토카나졸, 이소니아지드, 메트로니다졸 및 펜타미딘과 같은 항생제가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 항진균제와 조합하여 투여될 수 있다. 항진균제의 구체예에는 아졸 약물(예를 들어, 미코나졸, 케토코나졸(니조랄(NIZORAL)
Figure 112009021231361-pct00033
), 아세트산카스포푼진(칸시다스(CANCIDAS)
Figure 112009021231361-pct00034
), 이미다졸, 트리아졸(예를 들어, 플루코나졸(디플루칸(DIFLUCAN))
Figure 112009021231361-pct00035
), 이트라코나졸(스포라녹스(SPORANOX)
Figure 112009021231361-pct00036
)), 폴리엔(예를 들어, 니스타틴, 암포테리신 B(펀지존(FUNGIZONE)
Figure 112009021231361-pct00037
), 암포테리신 B 액상 복합체("ABLC")(아벨세트(ABELCET)
Figure 112009021231361-pct00038
), 암포테리신 B 콜로이드성 분산액("ABCD")(암포테크(AMPHOTEC)
Figure 112009021231361-pct00039
), 리포좀성 암포테리신 B(암비손(AMBISONE)
Figure 112009021231361-pct00040
)), 요오드화칼륨(KI), 피리미딘(예를 들어, 플루시토신(안코본(ANCOBON)
Figure 112009021231361-pct00041
), 및 보리코나졸(브펜드(VFEND)
Figure 112009021231361-pct00042
)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 항세균제 및 항진균제의 투여는 환자의 B 세포를 현저하게 고갈시키는 본 발명의 방법에서 발생할 수 있는 감염성 질환의 효과 또는 점증(escalation)을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 본 발명의 조성물의 투여에 동반될 수 있는 독성 부작용을 완화시키기 위하여 상기 기재된 하나 이상의 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-CD19 면역요법은 항체 투여, 화학요법, 독소, 또는 약물의 부작용을 완화시키기 위하여 이용되는, 당업계에 공지된 하나 이상의 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
다발성 골수종을 치료하기 위하여 항-CD19 면역요법이 투여되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 고용량 화학요법(멜팔란, 멜팔란/프레드니손(MP), 빈크리스틴/독소루비신/덱사메타손(VAD), 리포좀성 독소루비신/빈크리스틴, 덱사메타손(DVd), 시클로포스파미드, 에토포시드/덱사메타손/시타라빈, 시스플라틴(EDAP)), 줄기 세포 이식물(예를 들어, 자가 줄기 세포 이식 또는 동종 줄기 세포 이식 및/또는 미니-동종(비-골수형성) 줄기 세포 이식), 방사선 요법, 스테로이드(예를 들어, 코르티코스테로이드, 덱사메타손, 탈리도마이드/덱사메타손, 프레드니손, 멜팔란/프레드니손), 지지 요법(예를 들어, 비스포스포네이트, 성장 인자, 항생제, 정맥내 면역글로불린, 저-용량 방사선요법, 및/또는 정형외과 개입), 탈로미드(THALOMID)™(탈리도마이드, 셀젠(Celgene)) 및/또는 벨케이드(VELCADE)™(보르테조밉, 밀레니엄(Millennium))과 조합하여 또는 치료 처방으로 투여될 수 있다.
항-CD19 면역요법이 또 다른 항체 또는 항체들 및/또는 제제와 조합하여 투여되는 본 발명의 실시양태에서, 부가적인 항체 또는 항체들 및/또는 제제가 본 발명의 항체의 투여에 상대적인 임의의 순서로 투여될 수 있다. 예를 들어, 부가적인 항체 또는 항체들은 본 발명의 항-CD19 항체 또는 면역접합체를 인간 대상에게 투여하기 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 부가적인 항체 또는 항체들은 본 발명의 항체와 동일한 약학적 조성물 내에 존재하거나, 또는 상이한 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체들의 용량과 투여 방식 및 부가적인 항체 또는 항체들의 용량은 본원에 제공되고 당업계에 공지된 바와 같은 용량 및 투여 방식의 임의의 교시에 따라, 동일하거나 상이할 수 있다.
5.33. 세포 악성 종양의 진단에서 항-CD19 항체의 용도
본 발명은 또한 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합하는 항-CD19 항체 및 그것의 조성물을 포함하는데, 상기 항-CD19 항체는 진단 또는 검출가능 제제에 접합된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항-CD19 항체이다. 그러한 항-CD19 항체는 임상적 검사 절차, 예를 들면 특정 치료제의 효능을 결정하는 절차의 일부로서 B 세포 악성 종양의 발생 또는 진행을 모니터링하거나 예측하는 데 사용될 수 있다. 그러한 진단 및 검출은 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 포함되나, 이에 국한되지 않는 다양한 효소; 스트렙타비딘/비오틴과 아비딘/비오틴이 포함되나, 이에 국한되지 않는 보결분자족; 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 염화단실, 피코에리트린이 포함되나, 이에 국한되지 않는 형광 물질; 루미놀(luminol)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 발광 물질; 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin), 에쿼린(aequorin)이 포함되나, 이에 국한되지 않는 생물발광 물질; 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In) 및 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tm이 포함되나, 이에 국한되지 않는 방사성 물질; 다양한 양성자 방출 단층촬영에 사용되는 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온, 및 방사성표지되거나 특정 방사성동위원소에 접합된 분자가 포함되나, 이에 국한되지 않는 검출가능 물질에 인간 CD19 항원에 특이적으로 결합하는 항-CD19 항체를 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 용이하게 측정될 수 있는 임의의 검출가능 표지가 항-CD19 항체에 접합되고 B 세포 악성 종양의 진단에 사용될 수 있다. 검출가능 물질은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접적으로 또는 중간물질(예를 들어, 당업계에 공지된 링커)을 통하여 간접적으로 결합되거나 접합될 수 있다. 본 발명에 따른 진단제로서 이용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 진단 또는 검출가능 제제에 접합된 항-CD19 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
5.34. 면역 재구성을 모니터링하기 위한 항-CD19 항체의 용도
본 발명은 또한 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합하는 항-CD19 항체 및 그것의 조성물을 포함하는데, 상기 항-CD19 항체는 진단 또는 검출가능 제제에 접합된다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항-CD19 항체이다. 그러한 항-CD19항체는 면역억제 요법 또는 골수 이식 후 면역계 재구성을 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 그러한 모니터링은, 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합하는 항-CD19 항체를, 각종 효소, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 호스라디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제; 보형(prosthetic) 기들, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이드, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린; 발광 물질들, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬 (3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In) 및 테크네튬 (99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 제논 (133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 각종 양전자 방출 단층촬영기를 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온, 및 방사성표지되거나 특정 방사성동위원소에 접합된 분자가 포함하나 이에 국한되지 않는 포함하는 검출가능 물질에 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 용이하게 측정될 수 있는 임의의 검출가능 표지가 항-CD19 항체에 접합되고 B 세포 악성 종양의 진단에 사용될 수 있다. 검출가능 물질은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접적으로 또는 중간물질(예를 들어, 당업계에 공지된 링커)을 통하여 간접적으로 연결되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로서 이용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 진단 또는 검출가능 제제에 접합된 항-CD19 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
5.35. 자가면역 질환 또는 장애를 진단하기 위한 항-CD19 항체의 용도
본 발명은 또한 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합하는 항-CD19 항체 및 그것의 조성물을 포함하는데, 상기 항-CD19 항체는 진단 또는 검출가능 제제에 접합된다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항-CD19 항체이다. 그러한 항-CD19항체는 자가면역 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 임상적 시험 절차의 일부로서 모니터링 또는 예후하기 위해, 예컨대 특별한 요법의 효능을 결정하기 위해 유용할 수 있다. 그러한 진단 및 검출은 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합하는 항-CD19 항체를, 각종 효소, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 호스라디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제; 보형 기들, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이드, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린; 발광 물질들, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대 이에 국한되는 것은 아니나 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬 (3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In) 및 테크네튬 (99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴 (99Mo), 제논 (133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 각종 양전자 방출 단층촬영기를 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온, 및 방사성표지되거나 특정 방사성동위원소에 접합된 분자가 포함하나 이에 국한되지 않는 검출가능 물질에 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 용이하게 측정될 수 있는 임의의 검출가능 표지가 항-CD19 항체에 접합되고 자가면역 질환 또는 장애의 진단에 사용될 수 있다. 검출가능 물질은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접적으로 또는 중간물질(예를 들어, 당업계에 공지된 링커)을 통하여 간접적으로 연결되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로서 이용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 진단 또는 검출가능 제제에 접합된 항-CD19 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
5.36. 키트
본 발명은 세포 악성 종양, 또는 B 세포 악성 종양에 의해 증진되거나 B 세포 악성 종양을 증진시키는 B 세포 악성 종양의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 경감을 위한 본 발명의 조성물로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 기재된 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 본 발명의 조성물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 본 발명의 조성물 및 하나 이상의 다른 용기 내에 B 세포 악성 종양, 또는 B 세포 악성 종양에 의해 증진되거나 B 세포 악성 종양을 증진시키는 B 세포 악성 종양의 하나 이상의 증상의 예방, 관리 또는 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 포함한다. 키트는 B 세포 악성 종양을 예방, 치료, 관리 또는 경감시키기 위한 사용설명서 및 투여 방법에 대한 부작용과 투약량 정보를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로 이 용기(들)에는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 첨부될 수 있는데, 이러한 통지서는 인간 투여용의 제조, 이용 또는 판매에 관한 감독기관의 승인을 반영한다.
6. 특정 실시양태
1. 인간 CD19 항원에 결합하는 키메라, 인간화, 또는 인간 단클론 항체 또는 그것의 단편.
2. 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 및 127로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 실시양태 1의 항체.
3. HB12B-(A10-Jk4), HB12B-3649, 또는 HB12B-364987 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 프레임워크 영역을 포함하는, 실시양태 1의 항체.
4. HB12B-(3-72＼JH4) 또는 HB12B-9m 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 프레임워크 영역을 포함하는, 실시양태 1의 항체.
5. 서열 번호 2, 18, 34, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 1의 항체.
6. 서열 번호 4, 20, 52, 62, 68, 70, 110, 111, 112 및 113으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 1의 항체.
7. 서열 번호 12, 14, 16, 28, 30, 32, 123, 124, 125, 126 및 127로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 경쇄 CDR을 추가로 포함하는, 실시양태 5의 항체.
8. 서열 번호 6, 8, 10, 22, 24, 26, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 및 122로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 중쇄 CDR을 추가로 포함하는, 실시양태 3의 항체.
9. 서열 번호 2, 18, 34, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 중쇄 폴리펩티드, 및 4, 20, 52, 62, 68, 70, 110, 111, 112 및 113으로 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 적어도 하나의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 1의 항체.
10. 적어도 하나의 경쇄 폴리펩티드 및 적어도 하나의 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 1의 항체로서, 상기 경쇄 폴리펩티드가 HB12A VK(서열 번호 4); 및 HB12B VK(서열 번호 20)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 폴리펩티드가 HB12A VH(서열 번호 2); 및 HB12B VH(서열 번호 18)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
11. HB12B-(3-72＼JH4) 중쇄 가변 영역 및 HB12B-3649 경쇄 가변 영역을 포함하는, 실시양태 1의 항체.
12. VH 및 VK를 포함하는, 실시양태 1의 항체로서, 상기 VH가 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VK가 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 1의 항체.
13. 서열 번호 2, 18, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
14. 서열 번호 4, 20, 52, 62, 64, 66, 68, 70, 110, 111, 112 및 113으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
15. 실시양태 13 및/또는 14의 핵산을 포함하는 벡터.
16. 실시양태 15의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
17. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 발현하는 단리된 세포.
18. 실시양태 17의 단리된 세포를 항체의 생산을 위해 충분한 조건 하에 배양하는 단계, 및 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
19. 약학적으로 허용가능한 담체 중에 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 포함하는 약학적 조성물.
20. 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 인간 이소타입의 것인, 실시양태 19의 약학적 조성물.
21. 치료적 유효량의 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 B 세포 악성 종양의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양의 치료 방법.
22. 치료적 유효량의 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 자가면역 질환 또는 장애의 치료가 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 또는 장애의 치료 방법.
23. 치료적 유효량의 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체를 체액성 거부반응의 치료 또는 예방이 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 체액성 거부반응의 치료 또는 예방 방법.
24. 쥐과 동물 단클론 HB12B 항체와 동일한 효율로 B 세포를 고갈시키는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체.
25. B 세포 아포프토시스를 유도하는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체.
26. 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은, 변이 Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드 연결 당 사슬을 가지는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체.
27. Fc 변이 항체로서, 상기 Fc 변이체가 증진된 ADCC 활성을 초래하는 돌연변이를 포함하는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체.
28. 치료적 유효량의 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나의 항체를 B 세포 고갈이 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자의 B 세포를 고갈시키는 방법.
29. Fc 변이 항체로서, 상기 Fc 변이체가 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도보다 적어도 약 5배 더 낮은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도를 가지고, 상기 Fc 변이체가 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도보다 약 2 배 이내인 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도를 가지는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 항체.
30. 치료적 유효량의 실시양태 29의 항체를 B 세포 고갈이 필요한 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자의 B 세포를 고갈시키는 방법.
7. 실시예
7.1. 인간화 항-CD19 항체의 작제, 발현 및 결합 특성
하기 단락은, 마우스 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 인간 IgHγ1 및 인간 IgLκ 영역으로 각기 치환된, 모 HB12B 항체(chHB12B)의 키메라 변이체의 설계 및 작제에 대해 기재한다. 이 단락은 또한 HB12B 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 변이체의 생성 전략에 대해 기재한다.
(키메라 또는 인간화) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 각종 조합으로부터 생산된 항체의 CD19-결합 활성이 또한 기재되어 있다. 예를 들어, chHB12B의 CD19 결합 프 로파일에 필적하는 CD19 결합 프로파일을 나타내는 인간화 형태의 HB12B가 기재되어 있다.
하기 단락은 또한, 특정 인간화 항-CD19 항체에 도입될 때, 기준 항체인 HB12B VH 및 HB12B VK를 포함하는 chHB12B의 결합에 필적하는 인간 CD19 결합을 초래하는, 인간 프레임워크 영역 내 수가지 돌연변이를 기재한다. VK에서, 이 잔기는 예를 들어, 베니어 잔기 F36 및 H49, 및 사슬간 잔기 F87를 포함한다.
7.1.1. 유전자 어셈블리 및 발현 클로닝
Stemmer에 의해 처음으로 기재된 PCR-기재 유전자 어셈블리 방법(문헌 [Stemmer, W. P. et al. 1995 Gene, 164:49-53])에 의해 작제물을 생성시켰다. 이 방법은 4 단계, 즉 올리고뉴클레오티드 합성; 유전자 어셈블리; 유전자 증폭 및 클로닝으로 구성된다. 8개 유전자 특이적 프라이머를 각 VH 및 VK 분절에 대해 합성하였다. HB12B-(3-72/JH4) VH 영역 및 HB12B-(A10-Jk4) VK의 어셈블리에 대한 대표적인 프라이머 세트가 표 3에 나와 있고; 주어진 아미노산 잔기를 코딩하는 프라이머의 핵산 서열을 변형시킴으로써 아미노산 치환을 포함하는 변이 VH 및 VK 영역에 대한 프라이머 세트를 생성시켰다. 15 내지 20개 뉴클레오티드가 중첩되도록 프라이머를 설계하여, 열 사이클링 동안 완전 가변 영역에 결찰시켰다. VH의 경우, 부가적 벡터 특이적 프라이머(표 3 내 유니버셜 VH FW)가 PCR 매개 유전자 어셈블리 공정에 포함되었다. VH 영역에 대한 외부 5' 및 3' 프라이머에는 XbaI 및 ApaI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 특유의 인식 부위가 각기 도입되어, 후속 클로닝 단계를 도모하였고, VK에 대한 외부 5' 및 3' 프라이머에는 XmaI 및 BsiWI 제한 엔도뉴클 레아제에 대한 특유의 인식 부위가 각기 도입되어, 후속 클로닝 단계를 도모하였다. 수정된 크기의 PCR 산물을 제한 절단하여, 발현 벡터에 인-프레임 결찰하였고, 거기에서 제조자의 사용설명서에 따라 VH 영역은 XbaI 및 ApaI로 절단되었고, VK 영역은 XmaI 및 BsiWI로 절단되었다. 중쇄 어셈블리를 위해 사용된 벡터는 MGDNDIHFAFLSTGVHS VH 리더(서열 번호 83) 및 인간 IgHγ1 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작용적으로 연결된 진핵생물 전사 조절 요소를 포함하는데, 상기 전사 조절 요소는 CMV 즉시 초기 프로모터 및 SV40 폴리 A 부가 신호를 포함한다. VH 어셈블리에 대해 적합하게 설계된 프라이머를 사용함으로써, VH 리더, VH 영역 및 IgHγ1 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 최종 중쇄 발현 벡터에 인-프레임에 결합되도록 확실히 하였다. 경쇄 어셈블리를 위한 벡터는 인간 VKI-L12 리더(아미노산 서열 MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(서열 번호 84)(문헌 [Bentley, D. L. & Rabbitts, T. H., Nature 288,730-733(1980)]) 및 인간 IgLκ 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작용적으로 연결된 진핵생물 전사 조절 요소를 포함하는데, 상기 전사 조절 요소는 CMV 매개 조기 프로모터 및 SV40 폴리 A 부가 신호를 포함한다. VK 어셈블리에 대해 적합하게 설계된 프라이머를 사용함으로써, VKI-L12 리더, VK 영역 및 IgLκ 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 최종 중쇄 발현 벡터에 인-프레임에 결합되도록 확실히 하였다. 결찰 산물을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 DH10B 경쟁 E. 콜라이 세포를 형질전환하였다. 당업계에 공지된 각종 방법(예를 들어 벡터 DNA 제제의 제한 절단, 벡터 서열의 PCR 증폭)을 이용하여, 플라스미드 및 수정된 삽입물을 포함하는 콜로니를 동정 하였다. 수정된 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드 클론을 데옥시 시퀀싱 반응(예를 들어, 빅다이(BigDye)
Figure 112009021231361-pct00043
터미네이터 v3.0 사이클 시퀀싱 레디 리엑선 키트(Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit), ABI)을 이용하여 시퀀싱하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 키아젠(QIAGEN) 미니 및 맥시(Maxi) 플라스미드 키트를 이용하여 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다.
인간화 또는 키메라 면역글로불린 중쇄 및 인간화 또는 키메라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 제제의 쌍을 사용하여, HEK293 세포를 공동-형질감염시켰다. 이 공동-형질감염된 HEK293 세포를 3일 동안 배양하여, 총 IgG 농도 및 CD19 결합 활성을 결정하기에 적합한, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 생성시켰다.
HEK293 세포 상등액 내 총 Ig 농도를 포획 ELISA 검정법을 이용하여 정량화하였다. IgG 분자를 고정화된 염소 항-인간 IgG H+L 특이적 항체를 통해 96-웰 플레이트 상에 포획하여, HRP 접합 항-인간 카파 경쇄 항체로 검출하였다. 무관 특이성의 기준 IgG1 mAb를 이용하여 검정법을 적정하였다.
[표 3]
HB12B-(3-72/JH4) VH 영역 및 HB12B-(A10-Jk4) VK 영역 어셈블리에 대한 대표적인 프라이머 세트. 유전자 특이적 뉴클레오티드가 대문자로 표시되어 있고, 벡터 특이적 뉴클레오티드는 소문자로 표시되어 있다. VH 및 VK 단편 클로닝을 위해 사용되는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위에 밑줄이 그어져 있다.
Figure 112009021231361-pct00044
7.1.2. 300B4-CD19 결합 검정
세포-기초 재조합 인간 CD19 ELISA 검정법을 이용하여 CD19 결합 활성을 평가하였고, 동등 농도의 각 인간화 또는 키메라 항체를 이용하여 상기 검정법을 수행함으로써, 또 다른 인간화 양태의 HB12B 항체 및 chHB12B 간의 직접적 비교를 용이하게 하였다.
hCD19에 대한 chHB12B 및 그것의 인간화 변이체의 결합 능력을, 재조합 세포 -표면 인간 CD19를 발현하는 300B4 세포를 포획제로 이용하는 세포 기초 CD19 결합 검정법으로 평가하였다. 300B4 세포를 L-글루타민을 함유하고 10% 우태 혈청, β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 1 mg/㎖ G418의 존재 하에 배양하였다. 세포 기초 CD19 결합 검정법을 위해 표준 ELISA 프로토콜을 사용할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 U 바닥 플레이트의 개별 웰에 1×105개 300B4 세포를 접종하여, 하룻밤 동안 항온 배양하였다. 세포를 ELISA 완충액으로 1회 세정한 후, 인간, 인간화 또는 키메라 HB12B 항체와 함께 빙상에서 항온 배양하였다. 시험한 각 항체 농도에 대해 3벌로 결합 반응을 수행한다. 무관 특이성의 이소타입 정합 항체를 이용한 음성 대조군 웰을 검정에 포함시켜야 한다. 항체와 함께 항온 배양한 후에, 300B4 세포를 200 마이크로리터의 ELISA 완충액으로 3회 세정하였다. 표준 프로토콜에 따라 호스라디쉬 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-인간 카파 항체를 이용하여 300B4 세포에 결합된 키메라, 인간화, 또는 인간 항-CD19 항체의 양을 검출할 수 있다.
7.1.3. chHB12B의 작제, 발현 및 결합 특성
인간 IgHγ1 불변 영역 및 쥐과 동물 HB12B VH를 포함하는 chHB12B 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 작제하였다. 인간 IgLκ 불변 영역 및 쥐과 동물 HB12B VK를 포함하는 chHB12B 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 작제하였다.
HEK293 세포를 chHB12B 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터로 동시에 공동- 형질감염시켰다. 이 형질감염된 세포를 3일 동안 배양하여, 항체를 생산하였다. 가용성의 분비된 chHB12b 항체를 포함하는 배양 배지를 수거하여, chHB12B 항체의 농도를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 결정하였다.
인간 CD19에 대한 chHB12B의 결합을 단락 6.2에 기재된 300B4 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여 평가하였다. 무관 특이성의 이소타입 정합 인간 항체를 음성 대조군으로서 검정에 포함시켰다. 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여 수득된 결과는, 100 ng/㎖ 초과의 항체 농도에 있어, 300B4 세포의 표면 상에 발현된 재조합 인간 CD19에 대한 키메라 항체의 유의적 결합이 있었음을 나타냈는데, 이는 chHB12B가 hCD19 결합 활성을 보유하였음을 가리킨다(도 2).
7.1.4. 인간화 HB12B VH 코딩 발현 벡터의 작제
하기 단락은 적합한 인간 또는 실질적으로 인간형인 프레임워크 영역 및 쥐과 동물 HB12B CDR 영역을 포함하는 HB12B VH 영역의 인간화 변이체의 설계를 기재한다. 이 단락은 또한 인간화 HB12B Ig 중쇄의 변이체를 생산하기 위한 전략을 기재한다.
7.1.4.1. 인간 중쇄 어셉터 프레임워크 영역의 확인
모든 인간 배선 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 영역의 프레임워크 잔기를 포함하는 아미노산 서열 데이터베이스를 편집하였다 필수 정보를 각종 출처, 예를 들어 V Base: 인간 항체 유전자의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)로부터 입수할 수 있다. 데이터베이스를, 핵심 잔기, 예를 들어 정준, 사슬간 및 베니어 잔기에 있는 쥐과 동물 HB12b VH의 상응하는 프레임워크 영역과 서열 유사성 을 나타내는 인간 배선 V 및 J 분절에 대해 질의하였다.
HB12B 쥐과 동물 항-CD19 항체의 인간화를 위한 어셉터 프레임워크로 작용하도록 하기 위한 인간 배선 V3-72(문헌 [Tomlinson, I. M. et al., J. Mol. Biol., 227:776-798(1992)]) 및 JH4(문헌 [Ravetch, J. V. et al., Cell 27: 583-591(1981)) 분절을 선택하였다.
7.1.4.2. 인간화 HB12B 중쇄의 생성
HB12B VH의 CDR을 인간 배선 V3-72/JH4 영역의 프레임워크 잔기와 조합함으로써 HB12B-(3-72/JH4) VH(서열 번호 34)를 설계하였다. HB12B-(3-72/JH4) VH를 포함하는 발현 벡터를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 생성시켰다.
HB12B-9m VH(서열 번호 44)는 하기 9개 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(3-72/JH4) VH의 변이체이다: L20I, F27Y, T28A, R38I, V49I, F67A, R71A, L80M, 191Y (잔기는 카밧에 준해 넘버링됨). HB12B-9m에 대한 유전자 특이적 프라이머를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 설계하였다. 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 HB12B-9m VH를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
7.1.5. 인간화 HB12B Ig 경쇄 코딩 발현 벡터의 작제
하기 단락은 적합한 인간 또는 실질적으로 인간형인 프레임워크 영역 및 쥐과 동물 HB12B CDR 영역을 포함하는 HB12B VK 영역의 인간화 변이체의 설계를 기재한다. 이 단락은 또한 인간화 HB12B Ig 경쇄의 변이체를 생산하기 위한 전략을 기재한다.
7.1.5.1. 인간 경쇄 어셉터 프레임워크 영역의 동정
모든 인간 배선 면역글로불린 경쇄 V 및 J 영역의 프레임워크 잔기를 포함하는 아미노산 서열 데이터베이스를 편집하였다 필수 정보를 각종 출처, 예를 들어 V Base: 인간 항체 유전자의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)로부터 입수할 수 있다. 데이터베이스를, 핵심 잔기, 예를 들어 정준, 사슬간 및 베니어 잔기에서 쥐과 동물 HB12b VH의 상응하는 프레임워크 영역과 서열 유사성을 나타내는 인간 배선 V 및 J 분절에 대해 질의하였다.
HB12B 쥐과 동물 항-CD19 항체의 인간화를 위한 어셉터 프레임워크로 작용하도록 하기 위한 인간 배선 Vk A10(Straubinger, B. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369:601-607(1988)) 및 Jk4(Hieter, P. A. et al., J. Biol. Chem. 257: 1516-1522(1982)) 분절을 선택하였다.
7.1.5.2. 인간화 HB12B 경쇄의 생성
인간 배선 A-10/Jk4 영역의 프레임워크 잔기와 조합함으로써 HB12B-(A10-Jk4) VK(서열 번호 52)를 HB12B VK CDR을 설계하였다. HB12B-(A10-Jk4) VK를 포함하는 발현 벡터를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 생성시켰다.
HB12B-364987 VK(서열 번호 62)는 하기 3개 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: Y40F, K53H, Y91F(잔기는 카밧에 준해 넘버링됨). HB12B-9m에 대한 유전자 특이적 프라이머를 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 설계하였다. 단락 6.1에 기재된 방법에 따라 HB12B-364987 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
7.1.6. 인간화 HB12B 항체의 결합 특성
(인간화 또는 키메라) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 제제의 쌍을 사용하여, HEK293 세포를 형질감염시켰다. 이 형질감염된 HEK293 세포를 3일 동안 배양하여, 총 IgG 농도 및 CD19 결합 활성을 결정하기에 적합한, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 생성시켰다.
키메라 및 인간화 HB12B 항체의 인간 CD19 결합 활성을 단락 6.2에 기재된 300B4 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여 평가하였다. 무관 특이성의 이소타입 정합 인간 항체를 음성 대조군으로서 검정에 포함시켰다. 도 2에 나와 있는 바와 같이, chHB12B 중쇄 및 chHB12B 경쇄를 포함하는 키메라 항체와 HB12B-(3-72/JH4) VH 및 HB12B-364987 VK 영역을 포함하는 신규 인간화 항체 #1의 결합은 필적하는 것으로 나타났다. 100 ng/㎖ 초과의 항체 농도에 있어, CD19에 대한 양 항체의 유의적인 특이적 결합이 있었고, 이는 HB12B-(3-72/JH4) VH 및 HB12B-364987 VK 영역을 포함하는 인간화 항-CD19 항체 #1이 CD19 결합 활성을 보유하였음을 가리킨다. 놀랍게도, HB12B-9m VH 영역을 포함하는 인간화 항체는 chHB12B 대조군 대비 CD19 유의적 손실율을 나타냈다.
키메라 또는 인간화 HB12B 중쇄 및 경쇄의 쌍을 시험하였고, 그것의 인간 CD19 결합 활성이 표 4에 요약되어 있다.
[표 4]
키메라 및 인간화 HB12B 항체의 CD19 결합. 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여 각종 키메라 및 인간화 HB12B 항체의 CD19 결합 활성을 평가하였다. 유의적 결합 활성을 나타내는 VH-VK 조합은 "++"로 표시되어 있다. 인간 CD19에 대한 유의 적 결합이 없는 VH-VK 조합은 "-"로 표시되어 있다.
Figure 112009021231361-pct00045
7.1.7. 인간화 HB12B 경쇄의 작제, 발현 및 결합 특성
항체 인간화 프로토콜은 일반적으로 HAMA 반응을 최소화하기 위해 비인간 프레임워크 잔기의 수를 제한하기 위한 것이다. 따라서, 인간화 HB12B VK의 부가적 변이체를 생성시켜, 그것의 hCD19 결합 활성을 평가하였다.
HB12B-3649 VK(서열 번호 68)는 하기 2개의 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: Y40F, K53H(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-364987 VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지(QuickChange) 키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-3649 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
HB12B-3687 VK(서열 번호 74)는 하기 2개의 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: Y40F 및 Y91F(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-364987 VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-3687 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
HB12B-4987 VK(서열 번호 76)는 하기 2개의 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: K53H 및 Y91F(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-364987 VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-4987 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
HB12B-36 VK(서열 번호 70)는 하기 산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: Y40F(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-(A10-Jk4) VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-36 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
HB12B-49 VK(서열 번호 80)는 하기 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: K53H(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-(A10-Jk4) VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-49 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
HB12B-87 VK(서열 번호 78)는 하기 아미노산 치환을 포함하는 HB12B-(A10-Jk4) VK의 변이체이다: Y91F(카밧에 따라 넘버링). 제조자의 사용설명서에 따라 HB12B-(A10-Jk4) VK를 포함하는 발현 벡터의 DNA 제제 상에, 퀵체인지키트(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 부위 지정 돌연변이유발을 통해, HB12B-87 VK를 포함하는 발현 벡터를 생성시켰다.
단락 6.1.7에 기재된 각각의 VK 변이체 및 HB12B-(3-72/JH4) VH를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 제제의 쌍을 사용하여, HEK293 세포를 공동-형질감염시켰다. 이 공동-형질감염된 HEK293 세포를 3일 동안 배양하여, 총 IgG 농도 및 CD19 결합 활성을 결정하기에 적합한, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 생성시켰다.
단락 6.1.2에 기재된 300B4 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여 인간화 HB12B 항체의 인간 CD19 결합 활성을 평가하였다. chHB12B를 양성 대조군으로 검정에 포함시켰다. 도 3에 나와 있는 바와 같이, chHB12B VH 및 chHB12B VK를 포함하는 chHB12B 항체와 HB12B-(3-72/JH4) VH 및 HB12B-3649 VK를 포함하는 신규 인간화 HB12B 항체 #2의 결합이 필적하는 것으로 나타났다. 100 ng/㎖ 초과의 항체 농도에 있어 hCD19에 대한 양 항체의 유의적인 특이적 결합이 있었고, 이는 HB12B-(3-72/JH4) VH 및 HB12B-3649 VK를 포함하는 인간화 항체가 hCD19 결합 활성을 보유하였음을 가리킨다. HB12B-364987 VK를 포함하는 인간화 HB12B 항체 #1도 또한 인간 CD19의 결합을 나타냈다. HB12B-36 VK를 포함하는 인간화 HB12B 항체 #3은 chHB12B 대조군 항체의 결합에 비해, hCD19에 대한 유의적으로 감소된 결합을 나타냈다.
취합해보면, 이들 데이터는, HB12B 하이브리도마로부터 유래된 모 마우스 항체의 결합 성질을 보유하는, 다수의 인간화 양태의 HB12B VH 및 VK 사슬이 산출되었음을 가리킨다.
7.2. 인간화 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성.
하기 단락은 인간화 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성의 특징화를 기재한다.
7.2.1. 인간화 항-CD19 항체 제제.
HB12B-(3-72/JH4) VH, HB12B-3649 VK, 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 정제된 인간화 항-CD19 항체 #2(이후 "3649 항체" 또는 "3649"로 칭함)를 표준 기법을 이용하여 제조한다. 간략히, 3649의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 제제를 사용하여, HEK293F 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 제3일 및 제6일에 공급하여, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 제9일에 수거한다. 항체를 예비-주조 단백질 A 칼럼(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제한다. 낮은 pH 완충액으로 칼럼으로부터 항체를 용리하고, 중화하며, PBS에 대해 투석한다. 정제된 항체의 농도를 280 nm에서의 용액의 광학 밀도로부터 계산한다.
US 2004/0132101 및 미국 2005/0054832(양 특허 모두 Lazar 등)에 기재된 방법을 이용하여, S239D, A330L 및 I332E 아미노산 치환을 포함하는 3649 Fc 변이체(이후 "3649-3M"로 칭함)를 코딩하는 항체 발현 벡터를 생성한다. 간략히, 필수 뉴클레오티드 잔기 치환을 중쇄 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하여, 부위 지정 돌연변이유발 키트(예를 들어, 퀵체인지(프로메가))를 이용하여 3649를 코딩하는 항체 발현 벡터를 변형시킴으로써, 3649-3M 항체 발현 벡터를 생성시킨다. HEK239F 세포를 3649-3M 항체 발현 벡터로 형질감염시킴으로써, 정제된 3649-3M 항체를 생성시킨다. 형질감염된 세포를 제3일 및 제6일에 공급하여, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 제9일에 수거한다. 항체를 예비-주조 단백질 A 칼럼(GE 헬쓰케어)을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제한다. 낮은 pH 완충액으로 칼럼 으로부터 항체를 용리하고, 중화하며, PBS에 대해 투석한다. 정제된 항체의 농도를 280 nm에서의 용액의 광학 밀도로부터 계산한다.
US 2004/0132101 및 미국 2005/0054832(양 특허 모두 Lazar 등)(이는 각기 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재된 방법을 이용하여, L234F, L235E 및 P331S 아미노산 치환을 포함하는 3649 Fc 변이체(이후 "3649-TM"로 칭함)를 코딩하는 항체 발현 벡터를 생성한다. 간략히, 필수 뉴클레오티드 잔기 치환을 중쇄 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하여, 부위 지정 돌연변이유발 키트(예를 들어, 퀵체인지(프로메가))를 이용하여 3649를 코딩하는 항체 발현 벡터를 변형시킴으로써, 3649-TM 항체 발현 벡터를 생성시킨다. HEK239F 세포를 3649-TM 항체 발현 벡터로 형질감염시킴으로써, 정제된 3649-TM 항체를 생성시킨다. 형질감염된 세포를 제3일 및 제6일에 공급하여, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 제9일에 수거한다. 항체를 예비-주조 단백질 A 칼럼(GE 헬쓰케어)을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제한다. 낮은 pH 완충액으로 칼럼으로부터 항체를 용리하고, 중화하며, PBS에 대해 투석한다. 정제된 항체의 농도를 280 nm에서의 용액의 광학 밀도로부터 계산한다.
US 6,946,292(Kanda et al.)(전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 나와 있는 방법에 따라, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은, Fc 영역 내 Asn297에 연결된 복합 N-글리코시드 연결 당 사슬을 가지는 복수개의 항체를 포함하는 3649 항체 조성물(이후 3649-aFuc로 칭함)을 제조하였다. 간략히, 푸코실 트랜스퍼라제 녹아웃(knock-out) CHO 세포를 3649의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 제제로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 제3일 및 제6일에 공급하여, 컨디셔닝된 항체-함유 배지를 제9일에 수거한다. 항체를 예비-주조 단백질 A 칼럼(GE 헬쓰케어)을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제한다. 낮은 pH 완충액으로 칼럼으로부터 항체를 용리하고, 중화하며, PBS에 대해 투석한다. 정제된 항체의 농도를 280 nm에서의 용액의 광학 밀도로부터 계산한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 항체 제제는 오염 단백질 없이 실질적으로 순수하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 3649-aFuc의 항원 결합 친화도는 3649의 항원 결합 친화도에 필적한다.
7.2.2. 시험관내 ADCC 검정
사이톡스 96
Figure 112009021231361-pct00046
비방사능 세포독성 검정법(프로메가)은 51Cr 방출 세포독성 검정법에 대한 열량측정 대체법이다. 사이톡스 96
Figure 112009021231361-pct00047
검정법은 세포 용해 시에 방출되는 안정한 세포질 효소인 락테이트 탈수소효소(LDH)를 정량적으로 측정한다. 배양액 상등액 중 방출된 LDH를 30분 결합 효소 검정법으로 측정하고, 이에 따라 테트라졸륨 염(INT)이 적색 포르마잔 생성물로 전환되게 된다. 형성된 색의 양은 용해된 세포 수에 비례한다.
제조자의 지시에 따라 검정법을 수행한다. 간략히, 표적 세포를 PBS로 세정하고, 0.4×106 /㎖의 세포 밀도로 RPMI-5 무페놀 배지에 재현탁한다. NK 이펙터 세포를 PBS 중에 1회 세정하고, 1×106 /㎖의 농도로 RPMI-5 무페놀 배지에 재현탁한다. U 바닥 96-웰 플레이트에서 검정법을 수행한다. 각 검정 플레이트는 실험군 웰 및 대조군 웰의 조합을 포함한다. 50 ㎕의 적합한 항체 희석액, 50 ul의 표적 세포 현탁액 및 50 ul의 이펙터 세포 현탁액을 조합함으로써 실험군 웰을 셋팅한다. 상기 세포 밀도는 1:2.5의 표적 대 이펙터 세포 비를 초래하고; 상이한 표적 대 이펙터 비가 요망되는 경우, 이펙터 스톡액을 추가 희석하거나 농축할 수 있다. 수가지 상이한 유형의 대조군 웰을 사용하여, (i) 표적 세포로부터의 자발적 LDH 방출(표적 자발성), (ii) 이펙터 세포로부터의 자발적 LDH 방출(이펙터 자발성), (iii) 표적 세포로부터의 최대 LDH 방출(표적 최대), 및 (iv) 배양 배지 내 오염물질의 존재(배경)을 설명한다. 96-웰 플레이트 상에 사용되는 모든 웰은 동일한 최종 체적을 포함한다. 3벌로 반응을 셋팅한다. 셋업 후에, 플레이트를 3분 동안 120×g로 회전하여, 세포를 펠렛화한다. 플레이트를 4시간 동안 37℃/5% CO2에서 항온 배양한다. 항온 배양 종료 45분 전에, 15 ㎕의 제조자 제공 용해 완충액을 표적 세포 최대 방출 대조군 웰에 첨가한다. 항온 배양 후에, 플레이트를 4분 동안 120×g로 원심분리한다. 각 웰로부터의 50 ㎕의 상등액을 새로운 편평 바닥 96-웰 플레이트로 옮긴다. 50 ㎕의 재구성된 기질 믹스(제조자 제공 성분들로부터 어셈블리됨)를 첨가하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 10 내지 20분 동안 실온에서 항온 배양한다. 50 ㎕의 제조자 제공 중지 완충액을 첨가하고, 490 또는 492 nm에서의 흡광도를 플레이트 리더에서 측정한다. % 세포독성은 (실험군 - 이펙터 자발성 - 표적 자발성)/(표적 최대 - 표적 자발성)에 상당하다. % 세포독성을 계산하기 전에, 다른 모든 값을 배경만큼 차감시킨다.
3649는 ADCC 검정법에서 이펙터 세포 대 인간 CD20 발현 표적 세포를 효율적으로 재보충한다. 비푸코실화 형태(3649-aFuc)로부터의 ADCC 활성은 더욱 더 강하다. 증가되거나(3649-3M의 경우), 감소된(3649-TM의 경우) Fcγ 수용체에 대한 친화도를 갖는 Fc 변이체는 예상한 바대로 각기 증가되거나 감소된 ADCC 활성을 나타낸다. 불멸화된 인간 표적 세포 및 단리된 인간 표적 세포 모두에서 ADCC 활성을 관찰하였다. 이 주장을 지지하는 실험 데이터의 대표적 샘플이 도 5 내지 9에 제시되어 있다.
7.2.3. 시험관내 항-CD19 항체 매개 ADCC는 FcγRIIIA 수용체에 대한 Fc 영역 친화도에 의해 영향을 받는다.
인간 FcγRIIIA 수용체(CD16)에 대한 각종 인간화 항-CD19 항체 제제의 상대 결합 친화도는 ELISA 검정법을 이용하여 확인될 수 있다. 마이크로티터 플레이트를 하룻밤 동안 4℃에서 50 ㎕ 항체 제제(50 ㎍/㎖)로 코팅한다. 임의의 나머지 결합 부위를 37℃에서 1시간 동안 PBS 완충액(블로킹 완충액) 내 4% 탈지유로 블로킹한다. 웰을 세정한 후, 50 ㎕의 일련 희석된 단량체성 FcγRIIIA-플래그 단백질을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 항온 배양한다. 50 ㎕의 2.5 ㎍/㎖ 항-플래그-ME-비오틴(시그마)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 항온 배양한다. 웰을 각각의 하기 시약으로 항온 배양 사이에 세정한다: 50 ㎕의 0.1 ㎍/㎖ 아비딘-접합 HRP(피어스(PIERCE))를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 항온 배양한다. 30 ㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(피어스)을 첨가한 후, 30 ㎕의 0.2 M H2SO4로 중 화함으로써 검출을 수행한다. 450 nm에서 흡광도를 읽는다.
도 15에 나와 있는 바와 같이, FcγRIIIA에 대한 증진된 ADCC Fc 변이 3649 항체(3649-3M) 및 비푸코실화 3649 항체(3649-aFuc)의 결합 친화도는 푸코실화 야생형 3649 항체의 결합 친화도보다 높다. V158 고친화도 이소형의 인간 FcγRIIIA의 세포외 도메인을 포함하는 FcγRIIIA-플래그 단백질을 이용하여 실험을 수행하였다.
Fc 수용체-Fc 영역 상호작용, 및 이에 따른 항체의 이펙터 기능은 또한 Fc 수용체에서의 대립형질 변화에 의해 영향을 받는다. 상이한 대립형질 변이 수용체를 포함하는 새로 단리된 NK 이펙터 세포로 ADCC 반응을 수행함으로써, ADCC에 대한 고친화도 및 저친화도 FcγRIIIA 수용체의 영향을 연구할 수 있다. 도 16은 그러한 실험의 결과를 요약한다. 다우디 표적 세포를 이용하여 상기 기재된 바대로 ADCC 반응을 수행한다. 푸코실화(3649) 및 비푸코실화(3649-aFuc) 항-CD19 항체 #2 모두를 시험한다. 항-CD20 항체를 이용하여 대조군 반응을 행한다. 표준 프로토콜애 따라 NK 이펙터 세포를 건강한 도너로부터 단리한다. 대립형질 특이적 PCR 반응을 이용하여 NK 세포 유전자형을 결정할 수 있다(문헌 [Leppers-van de Straat et al., J. Immunol. Methods. 242(1-2): 127-32(2000)] 참조). 도 16 A 및 B는, 시험한 3개의 모든 항체가 사용한 반응 조건 하에서 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다. ADCC 활성은 NK 세포주 (A) 또는 새로 단리된 NK 세포 (B)를 이펙터로 사용함으로써 검출가능하다. 고친화도 이소형의 FcγRIIIA 수용체(V158/V158 및 V158/F158 유전자형)의 적어도 하나의 카피를 포함하는 NK 세포가 저친화도 수용체 대립형 질(F158/F158 유전자형)에 대해 동형인 NK 세포보다 더욱 효율적인 이펙터 세이다(도 16C-E). 푸코실화의 결여는 이펙터 세포의 FcγRIIIA 유전자형에 무관하게 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다. V158/V158 또는 V158/F158 NK 세포에 의해 매개되는 푸코실화 항체(3649)의 관찰된 ADCC 활성(C, D)이 F158/F158 NK 세포에 의해 매개되는 비푸코실화 항체(3649-aFuc)의 ADCC 활성(E)에 필적한다.
7.3. 항체 및 면역 형광 분석
인간 CD19 항원에 결합하는 상기 항-CD19 항체는 이하 개시되는 접근법들에 사용될 수 있다. 하기 기재되는 실험에 이용될 수 있는 다른 항체에는 마우스 CD22에 결합하는 단클론 마우스 항-CD22 항체, 예를 들어 HIB22(아브캄(Abcam); 문헌 [Dorken B et al., J. Immunol. 136:4470-9(1986)]); 단클론 마우스 CD20-특이적 항체(문헌 [Uchida et al., Intl. Immunol., 16:119-129 (2004)]); B220 항체 RA3-6B2(DNAX 코포레이션, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재); 및 CD5, CD43 및 CD25 항체(BD 파밍젠™, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)가 포함된다. 이소타입-특이적 항-마우스 Ig 또는 IgM 항체는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates, Inc.)(미국 알라바마주 버밍검 소재)로부터 입수될 수 있다.
당업계에 공지된 방법 및 재료를 이용하여 개발될 수 있는 hCD19 cDNA로 형질감염된 마우스 예비-B 세포주(예를 들어, 문헌 [Alt et al., Cell, 27:381-388(1981)] 및 문헌 [Tedder and Isaacs, J. Immunol., 143:712-717 (1989)] 참조), 또는 단일-세포 백혈구 현탁액은 확립된 방법(문헌 [Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)])에 따라, 20 내지 30분간 소정의 최적 농도의 각 형광 표지된 항체를 이용하여 빙상에서 염색하였다. 림프구의 전방 및 측면 광 산란 속성을 갖는 세포는 FACSCAN
Figure 112009021231361-pct00048
또는 FACSCALIBUR
Figure 112009021231361-pct00049
유세포분석기(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 캘리포니아주 산호세 소재) 상에서 분석할 수 있다. 배경 염색은 비생육성 세포를 배제하도록 배치된 게이트를 보유하는 비반응성 대조군 항체(칼탁(CALTAG)™ 라보라토리즈(Laboratories), 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)를 이용하여 결정할 것이다. 조사한 각 샘플에서, 가능하면, 단핵 세포의 전방 및 측면 광 산란 속성을 갖는 수만개의 세포를 분석하고, 형광 강도를 4-데케이드(four-decade) 대수 척도(log scale)로 나타내는 표시한다.
마우스. hCD19를 발현하는 유전자도입 마우스 및 그것의 야생형(WT) 한배 새끼는 당업계에 기재된 바대로[Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894 (1994)] 생산할 수 있다. 예를 들어, hCD19tg 마우스는 원래의 hCD19 설립체(C57BL/6x B6/SJL)로서부터 생성시킨 후, 적어도 7세대 동안 C57BL/6 배경과 교잡할 수 있다. 복수 세대의 역교잡(backcrossing)이후, B 세포가 인간 B 세포에서 관찰되는 밀도와 거의 동일한 세포 표면 밀도로 인간 CD19를 발현하는 마우스를 수득할 것이다.
FcR (Fc 수용체) 통상적γ 사슬(FcRγ)-결핍 마우스(FcRγ-/-, B6.129P2- 들어, Fcerg1tml)로 배양된 마우스는 타코닉 팜즈(Taconic Farms)(미국 뉴욕주 저먼타운 소재)로부터 입수가능하고, hCD19+/-, FcRγ-/- 및 WT 새끼를 발생하기 위해 사용 될 수 있다. c-Myc 도입유전자에 대해 반접합성(hemizygous)인 마우스(Eμ-cMycTG, C57Bl/6J-TgN(IghMyc); 더 잭슨 라보라토리(The Jackson Laboratory), 미국 메인주 바 하버 소재)는 당업계에 기재되어 있다(문헌 [Harris et al., J. Exp. Med., 167:353 (1988)]; 문헌 [Adams et al., Nature, 318:533 (1985)]). c-MycTG 마우스(B6/129 배경)를 hCD19tg 마우스와 교배하여, PCR 스크리닝에 의해 반접합성 hCD19tg cMycTG+/- 후손을 발생시킬 수 있다. Rag1-/-(B6.129S7-Rag1tmlMom/J) 마우스는 더 잭슨 라보라토리로부터 입수가능하다. 대식세포-결핍 마우스는 표준 방법(문헌 [Van Rooijen and Sanders, J. Immunol. Methods, 174:83-93 (1994)])에 따라, 제-2, 1 및 4일에 C57BL/6 마우스 내로 클로드로네이트(clodronate)-캡슐화 리포좀(0.1 ㎖/체중 10 그램; 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)(미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 꼬리 정맥 주입으로 생성시킬 수 있다. 모든 마우스는 특정 무-병원균 장벽 시설에서 사육하고, 6 내지 9주령 시점에 사용하여야 한다.
ELISA. 혈청 Ig 농도는 당업계에 기재된 바와 같이(문헌 [Engel et al., Immunity, 3:39 (1995)]), 친화도-정제 마우스 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA(서던 바이오테크놀로즈 어소시에이츠)를 이용한 ELISA로 결정하여, 표준 곡선을 생성한다. dsDNA, ssDNA 및 히스톤에 대한 혈청 IgM과 IgG 자기항체 수준은 당업계에 기재된 바와 같이(문헌 [Sato et al., J. Immunol., 157:4371 (1996)]), 송아지 흉선 이중-가닥(ds) DNA(시그마-알드리히, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 끓여진 송아지 흉선 DNA(이는 단일-가닥(ss) DNA를 보유함), 또는 히스톤(시그 마-알드리히) 코팅된 마이크로역가 평판을 이용한 ELISA에 의해 결정한다.
면역요법. 200 ㎕ 인산염-완충 염수(PBS) 중 무균 항-CD19와 비반응성 이소타입 대조군 항체(0.5-250 ㎍)는 측면 꼬리 정맥을 통하여 주사한다. 예를 들어, 실험에는 고정량(250 ㎍)의 항체가 사용된다. 혈액 백혈구 총수는 적혈구 용해 이후 혈구계(hemocytometer)로 정량하고, B220+ B 세포 빈도수는 유세포분석과 함께, 면역 형광 염색으로 결정한다. 인간과 마우스에서 항체 용량은 종양학 툴 용량 계산기(Oncology Tool Dose Calculator)(www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)를 이용하여 비교한다.
면역학. 2개월령 WT 마우스는 염수 중 50 ㎍의 2,4,6-트리니트로페닐(TNP)-접합 지질다당류(LPS)(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 또는 25 ㎍ 2,4-디니트로페놀-접합된(DNP)-FICOLL
Figure 112009021231361-pct00050
(바이오서치 테크놀로지즈(Biosearch Technologies)(미국 캘리포니아주 산라파엘 소재)로 i.p. 면역화한다. 마우스는 또한 완전 프로인트(Freund) 어쥬번트 중 100 ㎍의 DNP-접합 키홀 림펫 헤모시아닌(DNP-KLH, 칼바이오켐(CALBIOCHEM)
Figure 112009021231361-pct00051
-노바바이오켐(NOVABIOCHEM)
Figure 112009021231361-pct00052
(미국 캘리포니아주 라졸라 소재)로 i.p. 면역화하고, 21일후, 불완전 프로인트 어쥬번트 중 DNP-KLH로 추가로 면역화한다. 마우스는 지시된 바와 같은 면역화 전후에 채혈한다. 개별 항체 내에서 DNP- 또는 TNP-특이적 항체 역가는 표준 방법에 따라(문헌 [Engel et al., Immunity, 3:39-50 (1995)]), DNP-BSA(칼바이오켐
Figure 112009021231361-pct00053
-노바바이오켐
Figure 112009021231361-pct00054
, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재) 또는 TNP-BSA(바이오서치 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 산라파엘 소재)로 코팅된 ELISA 평판을 이용하여 이벌 측정한다. ELISA 분석을 위하여, TNP-LPS 면역화된 마우스로부터의 혈청은 1:400 희석하고, DNP-FICOLL
Figure 112009021231361-pct00055
및 DNP-BSA 면역화 마우스로부터의 혈청은 1:1000로 희석한다.
통계학적 분석. 모든 데이터는 표준±SEM으로 표시된다. 스튜던트 t-검증(Student's t-test)을 이용하여, 샘플 평균간 차이의 유의성(significance)을 결정한다.
7.4. 유전자도입 마우스 내 인간 CD19 발현
본원에 기재된 바대로 개발될 수 있는 유전자도입 hCD19tg 마우스 또는 인간 CD19를 발현하는 다른 유전자도입 동물이 항-CD19 항체를 포함하는 상이한 치료 처방, 예를 들어 투약 농도, 양 및 시기에서 변화를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 치료 처방의 인간 환자에서의 효능은 아래에 기재된 2가지 지표, 즉 특정 체액 및/또는 조직 내의 B 세포 고갈, 및 B 세포에 결합하는 단클론 인간 또는 인간화 항-CD19 항체의 능력을 이용하여 예측할 수 있다. 특별한 실시양태에서, B 세포 악성 종양을 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환, 및 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위하여, 인간 CD19 유전자도입 마우스에서 효과적인 치료 처방이 본 발명의 조성물 및 방법과 병용될 수 있다.
인간 CD19가 인간 CD19 도입유전자를 발현하는 유전자도입 마우스 (hCD19tg)로부터의 B 세포 상에서 발현되는지의 여부를 결정하기 위해, 이들 마우스의 골수, 혈액, 비장 및 복막 세척액으로부터 B 세포를 추출한다. 이들 세포 내에서 인간 CD19, 마우스 CD19 발현은, 인간 CD19 또는 마우스 CD19(mCD19)에 특이적으로 결합 하는 항-CD19 항체와 상기 세포를 접촉시킴으로써 평가될 것이다. B 계열 세포에 대한 항체의 결합은 유세포분석과 함께, 이색 면역 형광 염색을 이용하여 검출될 것이다. mCD19 및 hCD19의 상대적 발현 수준은 각기 평균 형광 강도(hCD19에 대해서는 항-hCD19, 및 mCD19에 대해서는 항-mCD19)를 이용하여 평가될 것이다.
인간 CD19 및 인간 CD20 도입유전자의 발현 수준은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 결정되었다. 순환 림프구는 표준 절차를 이용하여 C57B16 hCD19 tg+/-, C57B16 hCD19 tg+/+, Balb/c hCD20 tg+/-, 및 Balb/c 야생형 마우스로부터 단리된다. 동물을 무-병원균 시설에서 사육하였다. 각 유전자형으로부터 사용된 동물의 나이 및 수가 도 10에 열거되어 있다. 단리된 세포를 PerCP Cy5.5 접합 항-마우스 CD19(클론 1D3, BD 바이오사이언시스), PE 접합 항-CD3(예를 들어, 클론 17A2, BD 바이오사이언시스), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)
Figure 112009021231361-pct00056
488 접합 항-인간 CD19(클론 HIB 19, BD 바이오사이언시스) 및 알렉사 플루오르
Figure 112009021231361-pct00057
647 접합 항-인간 CD20 항체(예를 들어, 클론 2H7, AbD 세로텍(serotec))로 염색한다. 면역염색된 세포를 유세포분석기에서 분석하였다. B 세포 개체군을 항-마우스 CD19+, 항-CD3-세포로 정의한다. hCD19 및 hCD20 통로에서 검출된 항-마우스 CD19+, 항-CD3-세포의 평균 형광 강도가 도 10A에 기재되어 있다. 인간 CD19 발현은 예상된 대로 단지 hCD19 유전자도입 세포에서만 검출된다. hCD19 발현은 용량 의존성이고; tg+/+ 내 염색 수준은 tg+/- B 세포에서 보여지는 염색 수준의 대략 2배이다. hCD19 발현 수준은 조사한 모든 나이 군에서 안정하였다.
순환 림프구 중 B 세포의 백분율을 모든 샘플들에 대해 계산하였다. B 세포 를 계산의 목적으로 항-마우스 CD19+, 항-CD3-세포로 정의하였다. 결과가 도 10B에 나와 있다. hCD19 도입유전자를 갖는 동물은 순환 림프구 중 감소된 B 세포 수를 가진다. B 세포 수의 감소는 hCD19 tg+/+ 동물에서 더욱 현저하다. 이 결과들은 과거 공개된 관찰과 일치한다(문헌 [Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 14:3884-3894(1994)]).
7.5. 생체내 B 세포의 항-CD19 항체 매개 고갈
인간 CD19에 결합하는 본 발명의 항-CD19 항체는 생체내 hCD19tg 혈액, 비장, 림프절 B 세포를 고갈시키는 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 각 항체는 인간에서의 항-CD20 요법에서 주로 4회 제공되는 375 ㎎/㎡ 용량보다 10 내지 50-배 적은 250 또는 50 ㎍/마우스의 단일 용량으로 마우스에 주입될 것이다(문헌 [Maloney et al., J. Clin. Oncol., 15:3266-74(1997)]; 및 문헌 [McLaughlin et al., Clinical status and optimal use of rituximab for B cell lymphomas, Oncology (Williston Park), 12:1763-9 (1998)]. hCD19tg 마우스의 혈액, 비장 및 림프절로부터의 B 세포 고갈은 유세포분석법과 함께 면역형광 염색에 의해 결정될 것이다. B 세포를 고갈시킬 수 있는 것으로 확인된 항-CD19 항체의 결과는 인간에서의 사용과 상관될 수 있고, 확인된 항체의 성질을 갖는 항체를 B 세포 악성 종양을 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환, 및 자가면역 질환 또는 장애의 치료를 위해 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
3649 인간화 항-CD19 항체를 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 B 세포 고갈 검정법에서 검사하였다. C57B16 hCD19 tg+/- 및 C57B16 hCD19 tg+/+ 마우스에 50 또는 250 ㎍의 단일 i.v. 용량의 3649 항체를 주입한다. 2개의 대조군을 사용한다. 제1 군의 구성원에 50 또는 250 ㎍의 무관 특이성의 R347 항체를 주입하고; 제2 군의 구성원에 50 또는 250 ㎍의, 감소된 ADCC 활성을 갖는 3649-TM Fc 변이체를 주입한다(도 6 참조). 각 군에서의 동물의 수가 도 11 및 12에 기재되어 있다. 동물을 병원균이 없는 시설에 사육한다. 처리 후 7일에, 단핵 세포를 순환 혈액 및 비장으로부터 단리한다. 단리된 세포를 PerCP Cy5.5 접합 항-마우스 CD19(클론 1D3, BD 바이오사이언시스) 및 Apc-Cy5.5 접합 항-마우스 B220(클론 RA3-6B2, 인비트로겐) 항체로 염색한다. 면역염색된 샘플을 유세포분석기에서 분석한다. B 세포는 실험의 목적을 위해 항-마우스 CD19+, 항-마우스 B220+ 세포로 정의된다. 순환 림프구 중 B 세포의 백분율이 도 11에 제시되어 있다. 비장 세포 중 B 세포의 백분율 및 절대 수가 도 12에 기재되어 있다. 50 mg의 단일 용량의 3649 항-CD19 항체는 순환 및 비장 B 세포의 유의적 고갈을 달성하기에 충분하다. 고갈 수준은 항체 용량 및 hCD19 표면 밀도에 의해 영향을 받는다. 고갈은 250 ㎍ 항체를 주입한 hCD19 tg+/+ 동물에서 가장 완전하다. 고갈은 시험한 모든 동물들에 있어 비장에서보다 순환 림프구 중에서 가장 광범하다.
각종 3649 항-CD19 항체 제제가 hCD19 tg+/- 동물에서 순환, 비장, 복강 및 골수 B 세포 부분개체군을 고갈하는 능력을 측정하기 위해, 별도의 연구를 또한 수행하였다. 실험을 하기와 같이 수행하였다: 3 내지 4개월령 성별 정합 C57B16 hCD19 tg+/- 마우스에는 측면 꼬리 정맥을 통해 PBS 중에 희석된 무균 내독소-비포함 항-CD19 항체 제제를 10, 50 또는 250 ug/마우스 용량으로 주사하였다. 하기 항-CD19 항체를 시험하였다: 푸코실화 항-CD19 항체 #2(3649), 비푸코실화 항-CD19 항체 #2(3649-aFuc), ADCC가 증진된 Fc 변이 항-CD19 항체 #2(3649-3M) 및 ADCC가 감소된 ADCC Fc 변이 항-CD19 항체 #2(3649-TM). 대조군 동물의 한 군에 무관 특이성의 이소타입 정합 대조군 항체(R347)를 주사하였다. 주사 후 7일에, 마우스를 희생하고, 혈액, 비장, 골수 및 복강으로부터의 세포를 수집하였다. 적 세포를 표준 프로토콜에 따라 용해시키고, 총 생육성 세포 계수를 비아-세포 자동화 세포 계수기를 이용하여 결정하였다. 단리된 단일 세포 현탁액을 면역염색하여, 표준 프로토콜에 따라 유세포분석기에서 분석하였다. 면역염색을 위해 사용되는 항체가 표 5에 열거되어 있다. 고갈 결과가 표 6 내지 21에 요약되어 있다. 비푸코실화 항-CD19 항체 #2(3649-aFuc)를 이용하여 수득된 고갈 결과가 도 28에 제시되어 있다. 비푸코실화 또는 푸코실화 항-CD19 항체 #2(각기 3649-aFuc 또는 3649)로 처리된 동물의 NK 세포 활성화 표현형이 도 29에 제시되어 있다. 분석 중에 사용되는 B 세포 부분집합 정의는 하기와 같다:
혈액: B 세포: B220+, 마우스 CD19+
비장: B 세포: B220+, 마우스 CD19+
이행 B 세포: B 세포에서 게이팅 후, CD93+
이행 1 B 세포(T1): IgM+CD23-
이행 1 B 세포(T2): IgM+CD23+
이행 1 B 세포(T3): IgMlowCD23+
성숙 B 세포: B 세포에서 게이팅 후, CD93-
여포성 B 세포: IgM+CD23+
변연부 B 세포: IgMhighCD23-
골수: B 세포: B220+, 마우스 CD19+
전구-B 세포: B 세포에서 게이팅 후, CD43+IgM-
예비-B 세포: B 세포에서 게이팅 후, CD43-IgM-
미성숙 및 성숙 B 세포: B 세포에서 게이팅 후, CD43-IgM+
미성숙 B 세포: CD43-IgM+CD93+
성숙 B 세포: CD43-IgM+CD93+low/-
복강: B 세포: IgM+
[표 5]
생체내 고갈 실험에서 B 세포 동정에 사용되는 항체. 사멸된 세포를 7-AAD 염색에 의해 검출하였다,
Figure 112009021231361-pct00058
[표 6]
순환 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 기재된 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. % B 세포는 혈액 림프구 중 B220+, 마우스 CD19+ 분율로 정의되고; 림프구 개체군을 특징적 전방 및 측방 산란 프로파일에 기초하여 검출한다(상세 내용에 대해 도 17A 참조 ). % 고갈율은 [100×(% B 세포(대조군 항체) - % B 세포(실험군 항체))/% B 세포(대조군 항체)]로 계산하였다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00059
[표 7]
비장 B 세포 고갈 결과의 요약. 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 상기 기재된 프로토콜에 따라 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. %B 세포는 림프구 중 B220+, 마우스 CD19+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00060
[표 8]
비장 이행 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. % 이행 B 세포는 B 세포 중 CD93+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다.
Figure 112009021231361-pct00061
[표 9]
비장 T1 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. T1 B 세포는 이행 B 세포 중 IgM+, CD23- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다.
Figure 112009021231361-pct00062
[표 10]
비장 T2 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. T2 B 세포는 이행 B 세포 중 IgM+, CD23+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다.
Figure 112009021231361-pct00063
[표 11]
비장 T3 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. T3 B 세포는 이행 B 세포 중 CD93+, IgM저(low), CD23+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00064
[표 12]
비장 성숙 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 성숙 B 세포는 B 세포 중 CD93- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00065
[표 13]
비장 여포성 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 여포성 B 세포는 성숙 B 세포 중 IgM+, CD23+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00066
[표 14]
비장 변연부 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 변연부 B 세포는 성숙 B 세포 중 IgM 고(high), CD93- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17B 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00067
[표 15]
골수 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. B 세포는 림프구 중 B220+, 마우스 CD19+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다.
Figure 112009021231361-pct00068
[표 16]
골수 전구-B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 전구-B 세포는 B 세포 중 CD43+, IgM- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00069
[표 17]
골수 예비-B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 예비-B 세포는 B 세포 중 CD43-, IgM- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다.
Figure 112009021231361-pct00070
[표 18]
골수 미성숙/성숙 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 미성숙/성숙 세포는 B 세포 중 CD43-, IgM+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00071
[표 19]
골수 미성숙 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 미성숙 세포는 미성숙/성숙 B 세포 중 CD93+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00072
[표 30]
골수 성숙 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 성숙 세포는 미성숙/성숙 B 세포 중 CD93 저/- 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17C 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00073
[표 31]
복강 B 세포 고갈 결과의 요약. 상기 프로토콜에 따라 3649, 3649-3M, 3649-TM 또는 대조군 R347 항체를 hCD19tg+/- 마우스에 투여하였다. 복막 세포는 복막 림프구 중 IgM+ 분율로 정의된다(상세 내용에 대해 도 17D 참조). % 고갈율은 [100×(세포수(대조군 항체) - 세포수(실험군 항체))/세포수(대조군 항체)]로부터 계산되었다. 처리한 동물에서의 세포 개체군의 크기가 대조군 동물에서의 상응하는 크기보다 더 큰 경우, 음의 고갈 수가 사용된다.
Figure 112009021231361-pct00074
7.5.1. CD19 밀도는 CD19 항체-유도 B 세포 고갈에 대한 효능에 영향을 준다.
항-CD19 항체의 B 세포 고갈 능력이 CD19 밀도에 의존하는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명의 항-CD19 항체를 다양한 수준의 hCD19 발현을 갖는 마우스에 투여할 수 있다. 수득된 결과는, B 세포 및 항체 이소타입에 대한 인간 CD19 밀도가 항-CD19 항체의 존재 하에 B 세포의 고갈에 영향을 줄 수 있는지의 여부를 입증할 것이다. 동일한 검정법을 사용하여, 다른 항-CD19 항체가 B 세포를 효율적으로 고갈시킬 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 결과는 다양한 수준의 CD19 발현을 갖는 인간 환자의 치료와 상관될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 CD19 존재 및 밀도에 대한 조사 방법은 특정 항-CD19 항체가 B 세포를 고갈시킬 수 있는 환자 또는 환자 개체군을 확인하기 위해 또한/또는 적합한 용량을 결정하기 위한 용량을 결정 하기 위해 인간 대상에게 사용될 수 있다.
항-CD19 항체-유도 B 세포 고갈 대표적 혈액 및 비장 B 세포 고갈의 효능에 영향을 주는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명의 항-CD19 항체로 처리한 후(7일, 250 ㎍/마우스), hCD19tg 마우스에서 조사할 수 있다. 결과는 CD19 밀도가 생체내 항-CD19 항체에 의해 B 세포 고갈의 효율에 영향을 미침을 입증할 것으로 예상된다. 예를 들어, hCD19tg 마우스 내 저수준 CD19 발현은 투여된 항체에 의해 순환 또는 조직 B 세포 고갈에 대한 현저한 영향을 미칠 것으로 예상된다. B 세포 thru율은 개별 마우스를 항-CD19 또는 대조군 mAb 처리 후 24시간에 평가될 수 있다.
7.5.2. 조직 B 세포 고갈이 FCγR-의존성인지의 여부에 대한 결정
본 발명의 항-CD19 mAb의 투여가 조직 B 세포 고갈을 초래하는 경우, 하기 검정법을 사용하여 FcγR 발현에 대한 의존성을 입증할 수 있다. 특정 FcγR의 발현이 결여된 마우스와 hCD19tg 마우스를 이종교배하는 공정을 통해, hCD19를 발현하고 특정 FcγR의 발현이 결여된 마우스를 생성시킬 수 있다. 그러한 마우스를 FcγR 발현과 관련된 경로를 통해 B 세포를 고갈하는 항-CD19 항체의 능력, 예를 들어 ADCC을 평가하는 검정법에 사용될 수 있다. 따라서, 이 검정법에서 동정된 항-CD19 항체를 사용하여, 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 항체를 상기 기법을 이용하여 조작할 수 있다. 그러한 항체는 다시 자가면역 질환 및 장애를 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
본연의 면역 시스템은 FcγR-의존성 공정을 통해 항-CD20 항체 처리 후에 B 세포 고갈을 매개한다. 마우스 이펙터 세포는 IgG에 대한 4가지 상이한 FcγR 부류, 즉 고친화도 FcγRI(CD64) 및 저친화도 FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIV 분자를 발현한다. FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV는, 각각의 리간드-결합 α 사슬이 통상적 γ 사슬(FcRγ)과 결합한 이형-올리고머성 복합체이다. FcRγ 사슬 발현은 FcγR 어셈블리 및 대식세포에 의한 식균작용을 비롯한 이펙터 기능의 FcγR 촉발을 위해 필요하다. FcRγ-/- 마우스는 고친화도 FcγRI(CD64) 및 저친화도 FcγRIII(CD16) 및 FcγRIV 분자가 결여되어 있어, hCD19를 발현하는 FcRγ-/- 마우스를 항-CD19 항체 처리 후에 조직 B 세포 고갈에 있어서의 FcγR의 역할을 평가하기 위해 사용할 수 있다.
7.5.3. 항-CD19 항체-유도 B 세포 고갈의 기간
B 세포 고갈의 효능 및 기간을 평가하기 위해, hCD19tg 마우스에 단일 저용량(예를 들어, 250 ㎍)의 주사로 항-CD19 항체를 투여할 수 있고, B 세포 고갈의 기간 및 용량 반응은 시간의 함수에 따른다. 결과는, 상당한 시간양(예를 들어 1주 내지 6개월) 동안 고갈된 후, 혈액-매개 B 세포가 점차 회수됨을 입증할 것으로 예상된다.
7.6. 항-CD19 항체 투여 후, B 세포의 표면 상에서의 CD19의 지속
본 발명의 항-CD19 항체 투여 후, 세포-표면 CD19 발현을 비교함으로써, CD19 내재화가 생체내 B 세포 고갈에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 평가할 수 있다. 예를 들어, 생체내 본 발명의 항-CD19 항체 또는 이소타입-정합 대조군 항 체(250 ㎍)로 처리한 hCD19tg 마우스 내 세포 표면 CD19 발현 및 B 세포 클리어런스를 시간의 함수로서 연구할 수 있다. 이에 따라, 비장 B 세포를 수거하여, 0 시점(항-CD19 투여 전) 및 항체 투여 후 1, 4, 및 24시간째에 CD19에 대해 검정할 수 있다. 단리된 B 세포를 또한 유세포분류 분석법으로 시험관내 포화 농도의 각 항-CD19 항체 및 이소타입-특이적 이차 항체로 처리하여, 총 세포 표면 CD19 발현을 가시화할 수 있다. B 세포 표면 상의 CD19가 유지되는 경우, 그것은 ADCC, CDC 및 아포프토시스에 대한 연속된 감수성을 가리킬 것이다. CD19가 항-CD19 항체의 결합 후 세포 표면 상에 지속되는 경우, B 세포가 ADCC, CDC, 또는 아포프토시스 활성에 대한 접근가능성을 유지할 것이다. 그러한 결과는, 본 발명의 항-CD19 항체 및 치료 처방이 이식편 거부반응 및 자가면역 질환 및 장애를 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환에 대한 치료법을 제공함에 있어 효능적인 이유를 부분적으로 입증할 것이다.
7.7. 항-CD19 항체 처리는 체액성 면역 및 자가면역을 폐기할 수 있다.
CD19 요법이 B 세포 출현을 감소시키는 경우, 본 실시예에 기재된 검정법을 사용하여, 본 발명의 항-CD19 항체가 면역 반응을 제거하거나 경감시킬 수 있음을 입증할 수 있다. 이 검정법은 또한, 상기 기재된 기법을 이용하여 키메라, 인간 또는 인간화 항-CD19 항체를 조작하기 위해 사용될 수 있는 다른 항-CD19 항체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 항체는 다시 인간의 자가면역 질환 및 장애 치료, 및 이식 요법을 위한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
hCD19tg 마우스에 단일 주사의 항-CD19 항체를 주입한 후, 그 마우스에서의 면역글로불린 수준의 감소를 평가함으로써, 혈청 항체 수준에 대한 항-CD19 항체-유도 B 세포 고갈의 영향을 평가할 수 있다. 예를 들어, 0일째에 2개월령 한배 새끼를 단일 주사의 본 발명의 항-CD19 항체 또는 대조군 항체(예를 들어 250 ㎍)로 처리할 수 있다. 이어서, 항체 수준을 ELISA에 의해 결정한다. 결과가 1 내지 2주 후에, 혈청 IgM, IgG2b, IgG3 및 IgA 항체 수준이 유의적으로 감소되어, 적어도 10주 동안 감소된 채로 유지됨을 보여줄 것으로 예상된다.
T 세포-비의존성 유형 1(TI-I) 및 유형 2(TI-2) 항체 반응에 대한 B 세포 고갈 영향을 또한 hCD19tg 마우스를 항-CD19 항체 또는 대조군 항체 처리 후 제7 일에 TNP-LPS 또는 DNP-Ficoll(0일째)로 면역화함으로써 평가할 수 있다. 유의적 합텐-특이적 IgM, IgG 및 IgA 항체 반응은 어느 임의의 항원으로 면역화된 항-CD19 항체-처리 마우스에서 관찰되지 않을 것으로 예상된다. T 세포-의존성(TD) Ag, DNP-KLH에 대한 항체 반응을 또한 면역 전 제7일에 항-CD19 항체로 처리한 마우스로 평가할 수 있는데, 여기서 항-CD19 항체로 처리한 DNP-KLH 면역화 마우스는 감소된 체액성 면역을 나타낼 것으로 예상된다.
7.8. 항-CD22 항체 처리와 병용되는 항-CD19 항체 처리
본원에 기재된 검정법을 사용하여, 조합 요법, 예를 들어 화학요법, 독소 요법 또는 방사성 요법과 조합되는 항-CD19 항체가 이로운 영향, 예컨대 B 세포의 부가적 고갈을 가지는지의 여부를 결정할 수 있다. 동물 모델에서 시험한 조합 요법의 결과는 당업계에 공지된 수단에 의해 인간과 상관될 수 있다.
항-CD20 항체는 생체내 인간 및 마우스 B 세포를 고갈시키는 데 효과적이다. 그러므로, 본 발명의 항-CD19 항체 및 항-CD20(예를 들어, MB20-11; 문헌 [Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102(42): 15178-83(2005)] 참조) 항체를 이용한 동시 처리의 이익을 평가하여, 이것이 B 세포 고갈을 증진할 것인지의 여부를 결정할 수 있다. 마우스를 최적 이내의 용량(예를 들어 2 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 또는 50 ㎍)의 각 항체로 개별적으로 또는 양 항체를 조합하여 처리할 수 있다. 결과는 동시의 항-CD19 및 항-CD20 항체 처리가 유익하다는 것을 입증할 것으로 예상된다. 유사한 방식으로, 본 발명의 항-CD19 항체의 항-CD22 항체와의 조합, 또는 본 발명의 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 및 항-CD22 항체의 조합으로 처리함에 대한 효능을 결정할 수 있다.
7.9. 본 발명의 항-CD19 항체의 피하(S. C.) 투여의 치료 효능
본원에 기재된 검정법을 사용하여, 본 발명의 항-CD19 항체의 피하 투여 경로가 B 세포를 효과적으로 고갈시킬 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 동물 모델에서 시험한 상이한 전달 경로의 효능 결과는 당업계에 공지된 수단에 의해 인간과 상관될 수 있다.
예를 들어, hCD19tg 마우스를 피하(s.c), 복강내(i.p.) 또는 정맥내(i.v.) 투여에 의해 250 ㎍의 본 발명의 항-CD19 항체로 처리할 수 있다. 유세포분석법을 이용하여 평가한 제7일에서의 평균(±SEM) 혈액(mL 기준), 골수, 비장, 림프절 및 복강 B220+ B 세포수에 대해 값을 결정한다. 결과는 본 발명의 항-CD19 항체의 피하(s.c), 복강내(i.p.) 및 정맥내(i.v.) 투여는 생체내 순환 및 조직 B 세포를 효과적으로 고갈시킬 것임을 입증할 것으로 예상된다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 그 범주가 제한되지 않도록 한다. 실제로, 기재된 양태에 부가하여 본 발명의 각종 변형은 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
7.10. 항-CD19 항체는 생체내 림프종 모델에서의 종양 성장을 감소시킨다.
인간 CD19에 결합하는 본 발명의 항-CD19 항체를, 생체내 동물 모델에서 종양 성장을 감소시키는 능력에 대해 평가할 수 있다. 예를 들어, SCID 마우스에 인간 림프종 세포주를 주입하여, 종양 이종이식편(예를 들어, 라지 세포의 s.c. 주사)을 확립할 수 있다. 후속하여, 마우스에 수가지 용량의 본 발명의 항-CD19 항체(예를 들어, 100 ㎍ 항체/마우스 5회)를 주입한다. 표준 방법을 이용하여 종양 성장을 추적한다(예를 들어, 종양 체적, 동물 체중, 마비). 종양 성장에 대한 항-CD19 처리의 영향은 항-CD19 또는 대조군 항체 처리를 투입한 동물을 비교함으로써 결정될 수 있다. 종양 성장을 억제할 수 있는 것으로 동정된, 항-CD19 항체를 이용하여 수득된 결과는 인간에서의 사용과 상관될 수 있고, 종양 성장을 감소시킬 수 있는 항체는 B 세포 악성 종양을 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
항-CD19 항체의 종양 성장 억제 능력이 CD19 밀도에 의존하는지의 여부를 결정하기 위해, 상이한 CD19 발현 프로파일을 갖는 종양 세포주를 상기 생체내 종양 성장 검정법으로 시험할 수 있다. 예를 들어, 다우디, 라지, 나말와 및 라모스 세 포 모두는 그 세포 표면 상에 유의적 수준의 CD19을 가지고; 한편 RPMI 8226 다발성 골수종 세포주는 CD19를 발현하지 않는다. 수득된 결과는, 종양 세포 표면 상의 인간 CD19 밀도가 항-CD19 항체의 종양 성장 감소 활성에 영향을 줄 수 있는지의 여부를 입증할 수 있다. 결과는 다양한 수준의 CD19 발현을 갖는 인간 환자의 치료와 상관될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 CD19 존재 및 밀도에 대한 조사 방법은 특정 항-CD19 항체가 악성 B 세포의 성장을 감소시킬 수 있는 환자 또는 환자 개체군을 확인하기 위해 또한/또는 적합한 투약량을 결정하기 위해 인간 대상에게 사용될 수 있다.
항-CD19 항체의 종양 성장 억제 능력이 FcγR 의존성의 여부를 결정하기 위해, 상기 생체내 종양 성장 검정법이 절충 Fcγ 수용체 활성(예를 들어, FcRγ-/-)을 갖는 SCID 마우스를 이용하여 수행될 것이다. SCID 마우스를 특정 FcγR의 발현이 결여된 마우스와 이종교배하는 공정을 통해, 특정 FcγR의 발현이 또한 결여된 마우스(예를 들어, SCID, FcRγ-/- 마우스)를 생성시킬 수 있다. 그러한 마우스를 FcγR 발현과 관련된 경로를 통해 종양 성장을 감소시키는 항-CD19 항체의 능력, 예를 들어 ADCC을 평가하는 검정법에 사용될 수 있다. 그 결과에 기초하여, 증가된 ADCC를 갖는 항-CD19 항체를 상기 기법을 이용하여 조작할 수 있다. 그러한 항체는 다시 자가면역 질환 및 장애를 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 B 세포 장애 및 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
이하는 생체내 동물 모델 내 종양 성장을 감소시키는 3649 인간화 항-CD19 항체의 능력을 입증하는 실험에 대한 상세 내용이다. 실험 제1일에, 4-6 주령 암컷 CB-17 SCID 마우스의 뒷옆구리에 5×106개 라지 인간 림프종 세포를 s.c. 주사한다. 라지 세포는 그 표면 상에 유의적 수준의 CD19를 발현하고, 3649 지정 ADCC에 민감하다(도 7 및 8 참조). 10개 라지 세포 주입 동물의 군을 인간화 항-CD19 항체, 대조군 항-CD20 항체, 및 무관 특이성의 이소타입 대조군 항체로 처리한다. 다중의 상이한 용량의 항체를 병렬 시험할 수 있다. 처리 스케줄의 비제한적 예는 제4일에 시작하여 격주 5회, 10 mg/kg 항체의 i.p. 용량이다. PBS만을 주입한 동물의 부가적 대조군도 또한 포함된다. 표준 방법을 이용하여 종양 체적을 측정한다. 2000 ㎣ 초과의 종양 크기 또는 유의적 질병율의 표시를 갖는 동물을 인간과 같이 마취한다. 종양 성장을 시간 경과에 따라 플로팅한다.
도 13에 요약된 실험에서, 10개의 라지 세포를 주사한 동물을 각기 제4일부터 시작하여, 격주 5회로 10 mg/kg의 i.p. 용량의 (i) 항-CD20 항체, (ii) 감소된 ADCC를 갖는 3649-TM Fc 변이체, (iii) 3649 항체, 또는 (iv) R347 대조군 항체로 처리하였다. 10마리 동물의 부가적 대조군에 PBS만을 주입하였다. 3649 항-CD20 항체 및 양성 대조군 항-CD20 항체를 이용한 처리는 종양 성장을 유의적으로 감소시켰다. 3649 또는 항-CD20 항체를 주입한 군에 대한 종양 크기의 표준편차는 양 처리군에서의 완전히 종양이 없는 개체의 존재로 인해 시간 경과에 따라 증가하였다. 3649-TM Fc 변이체는 종양 성장에 대한 유의적 영향을 미치지 않았고, 이는 3649 인간화 항-CD19 항체의 종양 성장 감소 효과가 ADCC를 통해 매개됨을 제시한다.
도 14에 요약된 실험에서, 10개의 라지 세포를 주사한 동물을 각기 제4일부터 시작하여, 격주 5회로 i.p. 용량의 (i) 10 mg/kg의 항-CD20 항체(항-CD20), (ii) 10 mg/kg의 감소된 ADCC를 갖는 3649-TM Fc 변이체(3649TM), (iii) 10 mg/kg의 3649 항체(3649), (iv) 2.5 mg/kg의 3649 항체(3649*), 또는 (v) 10 mg/kg의 R347 대조군 항체로 처리하였다. 3649 항-CD19 항체, 3649-3M 인간 ADCC 증진된 항-CD-19 항체 및 양성 대조군 항-CD20 항체를 이용한 처리는 종양 성장을 유의적으로 감소시켰다. 3649-TM Fc 변이 항-CD19 항체는 종양 성장에 대한 유의적 영향을 미치지 않았고, 이는 3649의 종양 성장 감소 효과가 ADCC를 통해 매개됨을 제시한다.
도 30에 요약된 실험에서, 10개의 라지 세포를 주사한 동물을 각기 제4일부터 시작하여, 격주 5회로 i.p. 용량의 (i) 10 mg/kg의 항-CD20 항체(항-CD20), (ii) 10 mg/kg의 3649 항체(3649), (iii) 2.5 또는 10 mg/kg의 비푸코실화 3649 항체(3649-aFuc), 또는 (iv) 10 mg/kg의 R347 대조군 항체로 처리하였다. 3649 항-CD19 항체, 3649-aFuc 항-CD-19 항체 및 양성 대조군 항-CD20 항체를 이용한 처리는 종양 성장을 유의적으로 감소시켰다.
7.11. 친화도 성숙 3649 항-CD19 항체
하기 단락은 모 3649 항-CD19 항체에 비해 세포 표면에 표시된 인간 CD19 항원에 대한 증가된 결합 친화도를 나타내는 3649 항-CD19 항체의 친화도 성숙 CDR 변이체의 동정에 대해 기재한다. 그 단락은 또한 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 특징화에 대해서도 기재한다.
7.11.1. 증가된 친화도를 갖는 3649 변이 항체의 동정.
변이 CDR 서열을 포함하는 Fab 단편 라이브러리를 스크리닝함으로써, 3649 변이 항-CD19 항체를 동정하였다(미국 특허 출원 공보 제US2006/0121042호; 문헌 [Wu, H., Methods Mol. Biol., 207:197-212(2003)]; 문헌 [Wu & An, Methods Mol. Biol., 207:213-33(2003)]; 문헌 [Wu et al., J. Mol. Biol., 350:126-144(2005)]; 문헌 [Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042(1998)] 참조).
시약: 모든 화학약품은 분석용 등급의 것들이었다. 제한 효소, DNA-변형 효소, T4 리가제 및 T7 DNA 폴리머라제는 뉴 잉글런드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.)(미국 메사츄세츠주 비버리 소재)로부터 구매하였다. 통상의 올리고뉴클레오티드는 오페론(Operon)(미국 알라바마주 헌츠빌)에 의해 합성되었다. 스트렙타비딘 자기 비드는 다이날(Dynal)(미국 뉴욕주 레이스석세스 소재)로부터 구매하였다.
3649 Fab 파지 발현 벡터의 작제: 3649 항-CD19 항체의 VH 및 VK 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 lacZ 프로모터의 조절 하에 Fab 단편의 발현을 용이하게 하는 M13-기재 파지 발현 벡터에 클로닝하였다(문헌 [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60(2005)]). 벡터는 인간 γ1 중쇄의 제1 불변 영역, 인간 카파(κ) 경쇄의 불변 도메인, 및 VH 및 VK 유전자를 클로닝하기 위한 2개의 어닐링 부위를 포함한다. 문헌 [Wu & An, Methods Mol. Biol., 207:213-33(2003)]에 기재된 바와 같은 혼성화 돌연변이유발(문헌 [Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82(1985)])에 의해 클로닝을 수행하였다. 간략히, 3649의 VH 및 VK 영역을 코 딩하는 폴리뉴클레오티드를 대략 0.5 pmol의 각각의 하기 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭시켰다: 3649 VH Fab Fw(서열 번호 128), 3649 VH Fab Rev(서열 번호 129), 3649 VK Fab Fw(서열 번호 130) 및 3649 VK Fab Rev(서열 번호 131)(표 32 참조). 각 프라이머의 5' 뉴클레오티드 서열은 PCR 산물과 단일 가닥 벡터 사이의 어닐링을 허용하는 M13 벡터 특이적 서열을 포함한다. 3649 VH Fab Fw(서열 번호 128) 및 3649 VK Fab Fw(서열 번호 130) 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 각기 M13 유전자 3 리더 서열에 상응하는 28/25 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 3649 VH Fab Rev(서열 번호 129) 및 3649 VK Fab Rev(서열 번호 131) 프라이머의 5' 뉴클레오티드 서열은 인간 γ1 중쇄의 제1 불변 영역 및 인간 카파(κ) 경쇄의 불변 도메인에 각기 상응하는 28/30 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전방 프라이머 3649 VH Fab Fw(서열 번호 128) 및 3649 VK Fab Fw(서열 번호 130)를 비오티닐화하여, PCR 단편의 마이너스 가닥의 단리를 도모하였다. 3649 VH 및 VK 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 3649 VH Fab Fw(서열 번호 128)/3649 VH Fab Rev(서열 번호 129) 및 3649 VK Fab Fw(서열 번호 130)/3649 VK Fab Rev(서열 번호 131) 프라이머 조합을 각기 이용하여 상기 상응하는 3649 IgG 발현 작제물로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동/전기용리에 의해 정제한 후, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(로쉐(Roche))를 이용하여 인산화하였다. 이중 가닥 PCR 산물을 수산화나트륨으로 해리하고, 스트렙타비딘-코팅 자기 비드를 이용하여 플러스 비오티닐화 가닥을 고갈시키며, 에탄올 침전에 의해 마이너스 가닥을 회수함으로써, PCR 단편의 마이너스 가닥을 단리하였다. VH 및 VK PCR 단편의 등몰량의 단리된 마이너스 가닥을 유리디닐화 단일 가닥 M13 MD101-5A 주형에 어닐링하고, 제조자의 사용설명서에 따라, T4 DNA 폴리머라제(로쉐), T4 DNA 리가제(로쉐)로 처리하였다. 단리된 VH 및 VK 마이너스 가닥 폴리뉴클레오티드에 도입된 M13 특이적 뉴클레오티드 서열은 이들을, XbaI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하는 회문형(palindromic) 루프를 각기 함유하는 M13 벡터 DNA의 두 분리된 영역에 각기 어닐링되도록 한다. 회문형 루프 그 자체가 어닐링된 VH 또는 VK 서열의 존재 하에서도 어닐링하기 때문에, 어닐링된 T4 DNA 폴리머라제/T4 DNA 리가제 처리 DNA 복합체의 XbaI 절단은, 절단된 모 주형 플러스 가닥의 결과로서, 인간 카파 κ 불변 및 제1 인간 γ1 불변 영역과 함께 인-프레임으로 각기 융합된 VH 및 VK 도메인을 모두 포함하는, 새로 합성된 마이너스 벡터 가닥이 선택되도록 한다. 반응 산물을 XbaI로 절단하고, 열 불활성화하며, DH10B 세포 내로 전기천공한다. 형질전환된 DH10B 세포를 에쉐리키아 콜라이 EXL-I 블루 론이 있는 세균 플레이트 상에 역가 적정하였다. 수가지 비의존성 플라크로부터 단리된 파지 DNA를 시퀀싱하여, 3649 Fab 단편을 코딩하는 클론의 동정을 도모하였다.
[표 32]
혼성화 돌연변이유발에 사용되는 3649 VH 및 VK 코딩 폴리뉴클레오티드를 생성시키기 위해 사용되는 PCR 프라이머. 3649 특이적 잔기에 밑줄이 그어져 있다.
Figure 112009021231361-pct00075
단일 CDR 집중 Fab 라이브러리의 생성: 3649 항체의 각각의 6개 CDR 영역에 대해 2개의 분리된 단일 아미노산 치환 라이브러리를 제조하였다. "NSS" 라이브러리는 주어진 CDR의 모든 가능한 단일 아미노산 치환 변이체를 포함하였는데, 여기서 치환 아미노산은 NSS 퇴화 코돈에 의해 코딩된 8개 아미노산들 중 임의의 하나이다. "NWS" 라이브러리는 주어진 CDR의 모든 가능한 단일 아미노산 치환 변이체를 포함하는데, 여기서 치환 아미노산은 NWS 퇴화 코돈에 의해 코딩된 12개 아미노산들 중 임의의 하나이다. 개별 라이브러리는 상기 3649 Fab 코딩 파지 벡터의 혼성화 돌연변이유발에 의해 제조되었다(문헌 [Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4778-82(1985)]; 및 문헌 [Wu & An, Methods Mol. Biol., 207:213-33(2003)]). 간략히, 각각의 6개 CDR에 대해 2 세트의 퇴행 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. "NSS" 및 "NWS" 세트는 각기 퇴행 코돈인 NSS 및 NWS를 갖는 CDR 영역의 모든 가능한 단일 코돈 치환을 포함하였다. 중쇄 CDR1 집중 라이브러리의 제조를 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드 세트가 표 33에 예로서 열거 되어 있다. 각 퇴행 마이너스 가닥 올리고뉴클레오티드를 인산화한 후, 유리디닐화 단일 가닥 3649 Fab 파지 주형 DNA에 10:1 몰비로 어닐링하였다. 어닐링 반응의 온도를 1시간 동안 95℃에서 55℃로 저하시켰다. T4 리가제 및 T7 DNA 폴리머라제를 어닐링된 물질에 첨가하여, 37℃에서 1.5시간 동안 항온 배양하였다. 단일 CDR 특이적 세트로부터의 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수득된 최종 네가티브 가닥 합성 산물을 풀링하였으나; NSS 및 NWS 풀을 별도로 유지시켜, 독립적으로 스크리닝하였다. 전형적으로 XL1-블루 세균 론 상에 플라크를 생성시키기 위해, 1 ㎕의 풀링된 네가티브 가닥 합성 반응을 XL1-블루 내로 전기천공하였다. 개별 파지 클론을 200 ㎕의 10 mM 트리스(Tris)(pH 7.4), 100 mM NaCl 완충액으로 용리하여, 4℃에서 저장하였다. 라이브러리는, 24개의 무작위로 선택된 파지 클론을 시퀀싱하여 CDR 내 돌연변이의 분포를 결정하고 또한 돌연변이유발율을 계산함으로써 특징화될 수 있다.
[표 33]
3649 중쇄 CDR1 집중 라이브러리의 생성을 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드. NSS 및 NWS 코돈 포함 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 분리된 "NSS" 및 "NWS" 라이브러리를 생성시켰다. CDR 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드에 밑줄이 그어져 있다.
Figure 112009021231361-pct00076
단일 CDR 집중 Fab 라이브러리의 일차 스크린: 일차 스크린은 포획제로서의 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포 및 1 ㎖ 파지 배양액의 상등액을 포함하는 분비된 Fab를 이용하여 수행된 단일 점 ELISA(SPE)로 구성되었다. 라이브러리의 소모적 스크린은 통상 돌연변이유발 발생율을 고려하여 라이브러리의 크기의 3배인 다수의 개별 클론을 시험함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 50% 돌연변이유발 발생율과 함께 VH CDR1(5 아미노산 잔기) "NSS" 치환 라이브러리 (퇴행 NSS 코돈에 의해 코딩된 8개의 가능한 아미노산)의 소모는 5×8×2=80가지 무작위 선택 개별 클론을 스크리닝함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 실험에서, ~400 클론을 CDR 길이 또는 합성 효율에 무관하게 각 라이브러리에 대해 스크리닝하였다. 작은 규모의 파지 배양의 상등액을 문헌 [Wu & An, Methods Mol. Biol., 207:213-33(2003)]에 기재된 바대로 단리하였다. 간략히, 0.75 mL의 지수 성장 TG1 세포를 0.5 mM IPTG의 존재 하에 75 ㎕의 용리된 파지 스톡에 접종하고, 96-웰 플레이트에서 1시간 동안 37℃에서 항온 배양하였다. 플레이트 배양액을 실온으로 맞추고, 오비탈 쉐이커에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 0.36 ml의 하룻밤 둔 배양액으로부터의 세균을 저 단백질 결합 나일론 막(예를 들어, 날젠(Nalgene)사의 사이런트(Silent) 스크린 플레이트)을 통한 여과에 의해 수집하고, 실온에서 10분 동안 2 mg/㎖ 리소좀을 갖는 200 ㎕의 TES 완충액(30 mM 트리스 pH 8.0, 2 mM EDTA, 20% 수크로스)이 있는 필터 상에서 처리하여, 분비된 Fab를 주변 세포질로부터 방출시켰다. Fab 단편 함유 추출액을 여과에 의해 수집한다. 추출액 내 Fab 단편 농도를 표준 검정법을 이용하여 결정한다. 300B4 세포 기초 ELISA를 상기 기재된 바대로 수행하였다. 파지 클론을 발현하는 모 3649 Fab를 세포 기초 ELISA 검정법에 양성 대조군으로 포함시켰다. ELISA 신호를 Fab 농도에 대해 플로팅함으로써, 변이 Fab 단편의 상대 결합 친화도를 비교하였다. 예를 들어, 도 18은 VH CDR3 내에 무작위 단일 아미노산 치환을 포함하는 3649 변이 Fab로 수득된 결과를 보여준다. Fab 4B7 및 4G6은 모 3649 Fab의 결합 친화도에 비해, 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 유의적으로 증가된 결합 친화도를 나타낸다.
단일 CDR 집중 Fab 라이브러리의 이차 스크린: 일차 스크린 ELISA 신호가 3649 모 Fab의 것보다 적어도 10% 더 높은 CDR 변이 Fab 클론을 15 ml 규모로 재성장시키고, 이벌체 웰 내에서 동일한 300B4 세포 기초 ELISA에 의해 재검정하여, 양성 결과를 확인하였다. 문헌 [Wu, H., Methods Mol. Biol., 207: 197-212(2003)]에 기재된 프로토콜에 따라, 15 ml 규모의 Fab 추출액을 제조하였다. Fab 단편 농도를 표준 검정법을 이용하여 결정하였다. 300B4 세포 기초 ELISA를 상기 기재된 바대로 수행하였다. 3649 모 Fab를 검정법에 양성 대조군으로 포함시켰다. 이차 스크린 신호가 3649 대조군 Fab의 것보다 적어도 10% 더 높은 클론을 시퀀싱하여, 증가된 인간 CD19 항원 결합을 초래하는 단일 아미노산 치환의 실체를 결정하였다. 단리된, 친화도가 개선된 항-CD19 Fab 클론을 시퀀싱함으로써 확인된 아미노산 치환이 표 34에 열거되어 있다.
[표 34]
단일 CDR 집중 Fab 라이브러리로부터 단리된 유익한 단일 아미노산 치환의 목록. 아미노산 위치는 카밧에 따라 넘버링된다.
Figure 112009021231361-pct00077
조합 Fab 라이브러리의 생성: CDR 집중 라이브러리로부터 동정된 유익한 단일 아미노산 치환의 모든 가능한 조합을 포함하는 2개의 조합 라이브러리를 혼성화 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. 모 3649 잔기를 코딩한 퇴행 올리고뉴클레오티드의 세트, 및 확인된 유익한 단일 아미노산 치환을 이용하여 제1 조합 라이브러리를 생성시켰다(표 35). 가장 유익한 단일 아미노산 치환 잔기만을 코딩하고 3649 모 잔기는 코딩하지 않는 퇴행 올리고뉴클레오티드의 세트를 이용하여 제2 조합 라이브러리를 생성시켰다(표 36). 2개의 라이브러리를 생성시켜, 분리하여 스크리닝하 였다. 문헌 [Wu, H., Methods Mol. Biol., 207:197-212(2003)]; 문헌 [Wu & An, Methods Mol. Biol., 207:213-33(2003)]에 기재된 바와 같이, 라이브러리 생성을 행하였다. 간략히, 퇴행 프라이머 세트를 합성하고, 인산화하였다. 단일 어닐링 및 합성 반응에서 모든 프라이머를 이용하여 혼성화 돌연변이유발을 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이, 라이브러리 생성, 시험 및 스크리닝을 수행하였다. 인간 재조합 CD19 발현 300B4 세포에 대한 최대 결합 친화도를 갖는 6개 조합 Fab 클론의 ELISA 프로파일이 도 19에 나와 있다. 클론 7E12를 모 잔기 및 유익한 CDR 치환 잔기를 모두 코딩하는 퇴행 올리고뉴클레오티드로 생성된 제1 조합 라이브러리로부터 회수하였다. 클론 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4를 가장 유익한 CDR 치환 잔기만을 코딩하는 퇴행 올리고뉴클레오티드로부터 생성된 제2 조합 라이브러리로부터 회수하였다. 도 19에 열거된 모든 파지 클론을 시퀀싱하여, 증가된 인간 CD19 결합 친화도를 갖는 변이 CDR 영역의 아미노산 서열을 결정하였다.
[표 35]
조합 파지 라이브러리 생성을 위한 퇴행 올리고뉴클레오티드. 본원에 열거된 올리고뉴클레오티드 세트는 CDR 집중 단일 치환 라이브러리로부터 동정된 모 잔기 및 유익한 치환 잔기를 모두 코딩한다.
Figure 112009021231361-pct00078
[표 36]
조합 파지 라이브러리 생성을 위한 퇴행 올리고뉴클레오티드. 본원에 열거된 올리고뉴클레오티드 세트는 CDR 집중 단일 치환 라이브러리로부터 동정된 가장 유익한 치환 잔기만을 코딩한다.
Figure 112009021231361-pct00079
7.11.2. 증가된 친화도 변이 항-CD19 항체의 특징화
개선된 항-CD19 결합 활성을 갖는 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 Fab 변이체의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 pfu DNA 폴리머라제를 이용하여 상응하는 V 영역-코딩 M13 파지 벡터로부터 PCR-증폭시켰다(문헌 [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60(2005)]). 이어서, 폴리뉴클레오티드를 인간 거대세포바이러스 주요 즉시 초기(hCMVie) 인핸서, 프로모터 및 5'-미번역 영역을 코딩하는 발현 벡터에 개별적으로 클로닝하였다(문헌 [M. Boshart, et al., Cell 41:521-530(1985)]). 이 시스템에서, 인간 γ1 사슬이 인간 κ 사슬을 따라 분비된다(문헌 [S. Johnson, et al., Infect. Dis. 176:1215-1224(1997)]). 상이한 작제물이 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현되었고, 형질감염후 72시간 및 144시간에 수거하였다. 분비된 가용성 인간 IgG1을, 제조자의 사용설명서에 따라 1 ml의 HiTrap 단백질 A 칼럼을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 직접 정제하였다(AP바이오테크 인코포레이티드(APBiotech, Inc.; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재). 정제된 인간 IgG1(SDS-PAGE에 의해 판단 시, 전형적으로 동종성 >95%)를 인산염 완충 염수(PBS)에 대해 투석하고, 플래쉬 냉동하고, -70℃에서 저장하였다.
7.11.2.1. 세포 기초 ELISA 검정법
7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 IgG 항체의 인간 CD19에 대한 결합 능력을 세포 기초 CD19 결합 검정법으로 평가하였다. 3개의 상이한 세포주를 포획 시약으로 사용하였다: (i) 인간 재조합 CD19 발현 300B4 세포(도 20.), (ii) 라지 세포(도 21.) 및 (iii) 다우디 세포(도 22.). 3개의 모든 세포주를 표준 프로토콜에 따라 배양하였다. 세포 기초 CD19 결합 검정법을 위해 표준 ELISA 절차를 사용할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 U 바닥 플레이트의 개별 웰에 1×105개 300B4 세포를 접종하여, 하룻밤 동안 항온 배양하였다. 세포를 ELISA 완충액으로 1회 세정한 후, 각종 양의 항-CD19 항체와 함께 빙상에서 항온 배양하였다. 시험한 각 항체 농도에 대해 3벌로 결합 반응을 수행한다. 3649 항-CD19 항체를 이용한 양성 대조군 웰을 검정에 포함시키도록 한다. 항체와 함께 항온 배양한 후에, 300B4 세포를 200 마이 크로리터의 ELISA 완충액으로 3회 세정한다. 표준 프로토콜에 따라 호스라디쉬 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-인간 카파 항체를 이용하여 세포 표면 결합 항-CD19 항체를 검출한다.
포획 시약으로서 300B4 세포, 라지 세포, 또는 다우디 세포를 이용한 3649, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 항-CD19 IgG 항체의 ELISA 결합 곡선이 도 20 내지 22에 나와 있다. 16C9 및 15D1을 제외한 모든 시험 항체는 대조군 3649 항체에 비해 세포 표면에 표시된 인간 CD19에 대한 보다 높은 결합 친화도를 나타낸다. 300B4 세포가 포획 시약으로 사용될 때, 16C9 및 15D1의 결합 친화도는 3649 항체의 결합 친화도에 정합된다. 라지 세포 또는 다우디 세포가 포획 시약으로 사용될 때, 16C9 및 15D1 항체의 인간 CD19에 대한 결합 친화도는 대조군 3649 항체의 결합 친화도보다 높다.
7.11.2.2. 변형된 탈아미드화 부위를 갖는 14H5 항-CD19 항체 변이체.
3649, 7E12, 14H5, 15D7 및 16C9 항체의 일차 아미노산 서열은 NG(VH CDR2의 잔기 60-61) 탈아미드화 모티프를 포함한다. 카밧 위치 60에 있는 아스파라긴 (N) 잔기를 티로신(Y), 아스파르트산(D), 또는 류신(L)로 바꿈으로써 14H5의 변이체를 제외한 3개의 탈아미드화를 발생시켰다. 14H5 변이 VH 영역을 포함하는 Y60, D60, 및 L60은 14H5-YG(서열 번호 107), 14H5-DG(서열 번호 108) 및 14H5-LG(서열 번호 109)로 각기 표시된다. 탈아미드화 마이너스 14H5 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항체 발현 벡터를 표준 분자 클로닝 기법을 이용하여 생성시켰다. 일시 발현된 14H5-YG, 14H5-DG 및 14H5-LG 항-CD19 IgG를 상기 기재된 바와 같이 정제하였다. 인간 재조합 CD10 발현 300B4 세포를 포획 시약을 이용한 세포 기초 ELISA 검정법을 이용하여, 14H5-YG, 14H5-DG 및 14H5-LG 항체의 결합 친화도를 확인하였다. 14H5 및 16C4 항-CD10 항체를 양성 대조군으로 이용하였다. 수득된 결과가 도 23에 제시되어 있다. 14H5-YG, 14H5-DG 및 14H5-LG 항체의 재조합 인간 CD19 발현 300B4 세포에 대한 결합 친화도는 14H5 또는 16C4 항체 중 임의의 하나에 대한 결합 친화도보다 낮다.
7.11.2.3. 친화도 성숙 항-CD19 항체의 역학 오프레이트.
세포 표면에 결합된 항-CD19 항체를 시간 경과에 따라 추적함으로써 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 항-CD19 IgG 항체의 역학 오프레이트를 확인하였다. 간략히, 라모스 세포를 표준 염색 프로토콜에 따라 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 또는 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체와 함께 항온 배양하였다. 세포를 항온 배양 후에 세정하여, 임의의 결합되지 않은 일차 항체를 제거하고, 추가로 37℃에서 0, 30, 또는 60분 동안 항온 배양하였다. 항온 배양 기간의 종료 시에, 세포를 표준 프로토콜에 따라 RPE 접합 마우스 항-인간 IgG Fc 단편 이차 시약으로 염색하고, 유세포분석기에서 분석하였다. 세포의 대조군 배치를 3649 항-CD19 항체 또는 기준 대조군 항-CD20 항체와 함께 항온 배양한 후, 37℃에서 항온 배양하였다. 상이한 항체를 이용하여 각종 시점에서 측정된 평균 형광 강도가 도 24A에 표시되어 있다. 100% 평균 형광 강도는 주어진 항체로 시점 0에서 보여진 염색 강도에 상응한다.
친화도 성숙 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 항-CD19 항체에서 관찰 된 평균 형광 강도의 손실율은 항-CD20 기준 대조군 항체에서 관찰된 평균 형광 강도의 손실율보다 낮다. 이와 대조적으로 3649 항-CD19 항체로 염색된 라모스 세포는 기준 대조군 항-CD20 항체로 염색된 세포의 평균 형광 강도의 보다 빠른 손실율을 나타낸다(도 24A).
별도의 실험에서, 라모스 세포를 표준 프로토콜에 따라 Alexa 647 접합 16C4, 3649 또는 HB12B 항-CD19 항체로 염색하였다. 염색 후, 세포를 세정하여, 결합되지 않은 항체를 제거하였고, 추가로 37℃에서 0, 30, 또는 60분 동안 항온 배양하였다. 세포를 후속하여 유세포분석기에서 분석하였다. 형광 접합 항-CD20 항체를 기준 대조군으로서 실험에 포함시켰다. 각종 시점에서 보여지는 평균 형광 강도(MFI)가 도 24B에 나와 있다. MFI는 시점 0에서 보여지는 MFI 값에 대한 분율로 표시된다. 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체로 관찰되는 MFI의 손실율은 3649 또는 HB12B 항-CD19 항체로 관찰되는 MFI의 손실율보다 유의적으로 더 낮다. 항-CD20 기준 대조군 항체는 3649 및 HB12B 항-CD19 항체와 동일한 오프레이트를 나타낸다.
7.11.2.4. 친화도 성숙 항-CD19 항체에 의한 세포 표면 염색
다우디 세포를 표준 프로토콜에 따라 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 16C9 및 16C4 항-CD19 항체 및 RPE 접합 염소 항-인간 IgG(Fab')2 단편 이차 시약으로 면역염색하였다. 면역염색된 세포를 유세포분석기에서 분석하였다. 각종 일차 항체 농도에서 염색된 세포의 중위 형광 강도(MFI)가 도 25에 플로팅되어 있다. 3649 항-CD19 항체로 염색된 세포를 기준 대조군으로 포함시켰다. 7E12, 14H5, 15D7, 16C9 및 16C4 항-CD19 항체로 관찰되는 염색 강도는 시험한 모든 농도에서의 3649 항체 염 색 세포의 염색 강도보다 높았다. 15D1로 검출된 염색 강도는 낮은 항체 농도(0.5 mg/㎖ 이하)의 3649 항체로 검출된 염색 강도와 유사하였다. 그러나, 15D1 염색 세포의 MFI는 상승된 항체 농도(1 mg/㎖ 이상)에서 3649 항체 염색 세포의 MFI보다 높았다.
7.11.2.5. 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성.
친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 본원에 기재된 검정법을 이용하여 측정하였다. 예를 들어, 다우디 표적 세포를 이용하여 16C4, 14H5 및 14H5-DG 항체로 수득된 결과가 도 26에 제시되어 있다. 3549 항-CD19 항체를 기준 대조군으로 사용하였다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체는 3649 기준 대조군 항체에 비해 0.1 mg/㎖ 이하의 항체 농도에서 증가된 ADCC 활성을 나타냈다. 16C4, 14H5 및 14H5-DG 항체의 ADCC 활성은 1 mg/㎖ 이상의 항체 농도에서의 3649 항체의 활성에 정합되었다.
친화도 성숙 비푸코실화 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 또한 본원에 기재된 검정법을 이용하여 측정하였다. 예를 들어, 비푸코실화 16C4 항체(16C4-aFuc) 매개 ADCC를 다우디 표적 세포를 이용하여 측정하였다(도 26). 실험은 또한 16C4, 3649-aFuc 및 항-CD20 항체를 기준 대조군으로 포함하였다. 16C4-aFuc의 ADCC은 3649-aFuc, 항-CD20, 또는 푸코실화 16C4 기준 항체의 ADCC보다 유의적으로 높다. 16C4-aFuc에 의해 매개되는 ADCC는 항체의 ADCC에 필적한다.
16C4, 16C4-aFuc 및 3649-aFuc 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 각종 표적 세포를 이용한 표준화 시험관내 ADCC 검정법으로 추가 특징화하였다. 항-CD20 항체를 대조군으로서 검정법에 포함시켰다. 사용한 표적 세포는 각종 B 세포 악성 종양 및 상이한 CD19 세포 표면 밀도를 나타낸다(표 37). 표적 세포의 CD19 및 CD20의 상대 표면 발현을 표준 프로토콜에 따라 유세포분석법에 의해 결정하였다. 표 37은 형광 표지 항-CD20 또는 16C4 항-CD19 항체로 염색한 표적 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 열거한다. 상기 프로토콜에 따라 ADCC 반응을 수행하였다. 50,000개 이펙터 세포 대 20,000개 표적 세포를 이용하여 3벌로 반응을 셋업하여, 2.5:1의 E:T 비를 달성하였다. CD16를 발현하고 신호전달 폴리펩티드 FCεRI-γ와 관련된 유전자도입 NK 세포가 이펙터 세포로 작용하였다. ADCC 반응을 37℃에서 4시간 동안 진행시켰다. ADCC 활성을 각종 항체 농도에서 결정하였다. 데이터를 % 세포독성으로서 항체 농도에 대한 함수로 플로팅하였다. 최대 세포 살해 및 EC50 값(사용 조건 하에서 최대의 절반인 세포독성을 위해 필요한 항체 농도)을 표적 세포/항체 조합에 대해 표준 방법을 이용하여 확립하였다. 표 37은 최대 결과를 제시한다. DLCL, NHL, ALL 및 버키트 림프종을 각기 나타내는 Oci-LY19, 카르파스(KArpas)-422, Nalm-6 및 나말와 세포는 16C4-aFuc 항체 매개 세포독성에 대해 민감하였으나, 대체로 항-CD20 매개 ADCC에 대해 민감하지 않았다. 다우디, 톨레도(Toledo), RL 및 라지 세포를 항-CD20 매개 ADCC에 대해서보다 16C4-aFuc 항체 매개 세포독성에 대해 유의적으로 더 민감하였다.
[표 37]
16C4, 16C4-aFuc 및 3649-aFuc 항-CD19 항체 매개 ADCC의 정량적 평가. 1 ㎍/㎖에서의 MFI: 1 ㎍/㎖ 형광 표지 항체로 염색된 세포의 평균 형광 강도; ADCC EC50: 사용 조건 하에서 최대 살해 절반을 발생시키는 항체 농도; 10 ㎍/㎖에서의 최대 세포 살해율 %: 사용 조건 하에서의 ADCC 검정법에서 10 ug/㎖ 항체로 달성된 최대 표적 세포 살해율
Figure 112009021231361-pct00080
7.11.2.6. 친화도 성숙 항-CD19 항체에 의한 생체내 B 세포 고갈
친화도 성숙 항-CD19 항체를 본질적으로 상기와 같이 B 세포 고갈 검정법으로 시험하였다. C57B16 hCD19 tg+/- 동물을 10, 50, 또는 250 ㎍의 단일 i.v. 용량의 16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체(16C4) 또는 14H5DG 친화도 성숙 항-CD19 항체(14H5DG)로 처리하였다. 기준 대조군 동물을, (i) 3649 항-CD19 항체(3649), (ii) 3649 항-CD19 항체의 ADCC 증진된 Fc 변이체(3649 3M), 및 (iii) 비푸코실화 3649 항-CD19 항체(3649-aFuc)로 처리하였다. 음성 대조군 동물을, (i) 3649 항-CD19 항체의 ADCC 절충 Fc 변이체(3649 TM), 또는 (ii) 무관 특이성의 항체(R347)로 처리하였다. 순환 림프구 및 비장 림프구를 항체 처리 후 7일에 단리하였다. 단 리된 세포를 표 5에 기재된 바와 같이 면역염색하여, 각종 B 세포 개체군을 확인하였다. 샘플을 표준 프로토콜에 따라 유세포분석법으로 분석하였다.
16C4 친화도 성숙 항-CD19 항체는 3649 항-CD19 모 항체보다 약간 더 높은 B 세포 고갈을 달성하였다. 3649-aFuc 및 3649 3M 항체는 16C4 친화도 성숙 항체보다 더 양호한 고갈을 달성하였다. 14H5DG 친화도 성숙 항-CD19 항체는 3649 항-CD19 모 항체보다 B 세포 고갈에 있어 덜 효율적이다.
7.11.2.7. 단일 고갈 용량의 친화도 성숙 항-CD19 항체의 투여 후, B 림프구의 장기 회수.
단일 결실 용량의 16C4-aFuc 항-CD19 단클론 항체를 투여한 후에 B 세포 분획의 장기 회수를 연구하였다. 25마리 C57B16 hCD19 tg+/- 마우스(13마리 수컷, 12마리 암컷, 2.5-3개월령)를 5개 군으로 나누었다. 실험군 항체를 투여하기 1주 전(-1주)에, 동물을 전반적 건강에 대해 조사하고, 체중을 재고, 분석을 위해 각 마우스에 대해 소분취량의 혈액을 수집하였다. 실험 0일에, 250 ㎍의 16C4-aFuc mAb, 50 ㎍의 16C4-aFuc mAb, 10 ㎍의 16C4-aFuc mAb, 250 mg의 무관 특이성의 R347 대조군 항체, 또는 PBS를 각기 군 1, 2, 3, 4 및 5의 동물에 정맥내 투여하였다. 그 후 주간격으로 제7일(제1주)에, 각 군의 마우스를 조사하고 채혈하였다. 혈액 샘플을 유세포분석법에 적용하여, B 세포, T 세포, NK T 세포, 호중구, 단핵구 및 수지상 세포수를 결정하였다. 혈액 샘플을 추가 분석하여, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgA, 항-dsDNA IgM, 항-dsDNA IgG, 항-ssDNA IgM, 항-ssDNA IgG, 및 IL-7, CXCL12, CXCL13 및 BAFF의 혈청 수준을 추가 분석하였다. 표준 절차에 따라 측정을 수행하였다. 실험 개요 및 수득된 결과가 도 38에 제시되어 있다.
약물 처리 후에 명백한 부작용은 관찰되지 않았다. 모든 실험군의 동물들은 정상 활성 수준 및 체중을 유지하였다(도 38B). 16C4-aFuc 항-CD19 항체를 주입한 동물의 B 세포 수준은 대조군 동물의 B 세포 수준보다 유의적으로 낮았다(도 38C 및 D). B 세포 고갈은 10 mg의 16C4-aFuc를 주입한 동물에서도 완전하였다. B 세포 고갈 기간은 용량 의존성이었고; 고갈 기간은 16C4-aFuc 항체의 용량이 높을수록 증가하였다. 10 ㎍ 16C4-aFuc를 주입한 동물에서의 B 세포는 제3주경에서 회수되기 시작하였고, 제5주경에 정상 수준에 도달하였다. 50 ㎍의 16C4-aFuc를 주입한 동물의 회수는 9주가 소요되었다. 250 mg의 16C4-aFuc를 주입한 동물은 실험 제11주에 여전히 거의 완전히 B 세포를 가지지 않았다. T 세포, NK-T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 호중구 및 단핵구의 혈액 농도는 16C4-aFuc 항체에 의해 영향을 받지 않았다(데이터 미도시). IgM, IgG1 및 IgG2b의 혈청 수준은 또한 16C4-aFuc 항체 처리에 의해 감소되었다(도 38E-G). 면역글로불린 수준의 감소는 용량에 민감하였고; 수준의 유의적 감소는 단지 50 또는 250 ㎍ 16C4-aFuc 항체로 처리한 동물에서만 보여졌다. 면역글로불린 수준의 회수는 대체로 B 세포 분획의 회수에 따른다.
7.11.2.8. 항-CD19 항체의 IEF-PAGE 분석.
표준 프로토콜에 따라, 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG 및 3649 항-CD19 항체에 대해 네이티브 등전점 포커싱 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(IEF-PAGE) 분석을 수행하였다. 예비-주조 암폴린 겔(아머샴 바이오사이언시스, pI 범위 3.5-9.5)에 8 ㎍의 정제된 단백질을 적하하였다. 단백질 샘플을 10 mM 히 스티딘 pH 6.0 완충액 중에 투석한 후, 겔에 적하하였다. 넓은 범위의 pI 마커 표준(아머샴, pI 범위 3-10, 8 ㎕)을 사용하여, 상대 pI 값을 결정하였다. 1500 V, 50 mA에서 105분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔을 45분 동안 고정하고, 심플리 블루 염색제(Simply Blue stain)(인비트로겐)을 이용하여 실온에서 하룻밤 동안 염색하였다. 25% 에탄올, 8% 아세트산 용액을 사용하여, 탈염색을 수행하였다. 퀀터티 원 이미징 소프트웨어(Quantity One Imaging Software)와 함께 바이오-래드 GS-800 농도계(Bio-Rad GS-800 Densitometer)를 이용하여, 등전점을 결정하였다. 쿠마씨로 염색된 겔이 도 27에 나와 있다. 16C4, 16C9, 7E12, 14H5, 15D7, 15D1, 14H5-DG 및 3649 항체의 등전점은 각기 7.83, 8.04, 7.69, 7.76, 7.61, 7.72, 7.48 및 7.75이다.
7.11.3. Fc 변이 친화도 성숙 항-CD19 항체
US 2004/0132101 및 미국 2005/0054832(양 특허 모두 Lazar et al.)에 기재된 방법을 이용하여, L234F/L235F/P331S 또는 L234F/L235Y/P331S 아미노산 치환을 포함하는 16C4 Fc 변이 항체(이후 "16C4-235F" 또는 "16C4-235Y"로 칭해짐)를 코딩하는 항체 발현 벡터를 생성시킨다. 간략히, 필수 뉴클레오티드 잔기 치환을 중쇄 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하여, 부위 지정 돌연변이유발 키트(예를 들어, 퀵체인지(프로메가))를 이용하여 16C4를 코딩하는 항체 발현 벡터를 변형시킴으로써, 16C4-235F 또는 16C4-235Y 항체 발현 벡터를 생성시킨다. HEK239F 세포를 적합한 항체 발현 벡터로 형질감염시킴으로써, 정제된 16C4 Fc 변이 항체를 생성시킨다. 형질감염된 세포를 제3일 및 제6일에 공급하고, 항체를 포 함하는, 컨디셔닝된 배지를 제9일에 수거한다. 항체를 예비-주조 단백질 A 칼럼(GE 헬쓰케어)을 이용하여 컨디셔닝된 배지로부터 정제한다. 낮은 pH 완충액으로 칼럼으로부터 항체를 용리하고, 중화하며, PBS에 대해 투석한다. 정제된 항체의 농도를 280 nm에서의 용액의 광학 밀도로부터 계산한다.
평형 결합 상수(KD)의 측정: 모든 Fcγ 수용체(인간 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA-V158, 및 쥐과 동물 FcγRIIB, FcγRIII 및 FcγRIV)의 16C4 및 그것의 Fc 변이체에 대한 평형 결합 상수를 바이아코어 3000 기기(스웨덴 웁살라 소재)에서 측정하였다. 간략히, 모든 IgG를 제조자에 의해 권장되는 표준 아미노 결합 화학을 이용하여 2개의 CM5 센서 칩의 분리된 유세포 상에 고정화하였다. 고정화된 IgG 수준은 8194 내지 8725 RU 범위 내였다. 4000 또는 16000 nM 중 하나의 모든 FcγR의 재조합 발현된 세포외 도메인의 원액을 제조한 후, 기기 완충액(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% P-20를 함유하는 50 mM HBS 완충액)을 이용하여 원하는 농도까지 하향으로 일련 희석하였다. 각 농도의 FcγR를 5 ㎕/분의 유속으로 IgG 표면 모두에 이벌 주사액을 주사하였다. 대략 50분 동안 결합 데이터를 수집한 후, IgG 표면을 재생하기 위해 주사액 간에 30초 펄스의 5 mM HCl를 적용하였다. 수개의 완충 주사액을 일련 주사액 전반에 걸쳐 산재시켰다. 이 완충 주사액들 중 하나를 기준 세포 데이터를 따라 사용하여, 원 데이터 세트를 수정하였다. 모든 결합 데이터를 수집한 후, 개별 데이터 세트를 각 γ 농도에 대해 평균낸 후, 1:1 결합 등온에 피팅하여, 이로부터 평형 결합 상수, KD를 유 도하였다. 이는 바이아이벨루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어, v. 4.1을 이용하여 수행하였다. KD 값(nM)이 표 38에 제시되어 있다.
[표 38]
인간 및 마우스 FcγR에 대한 각종 인간 IgGI의 결합 친화도(KD, nM)
Figure 112009021231361-pct00081
7.12. 16C4 항-CD19 항체의 친화도 성숙 변이체의 단리
본원에 기재된 프로토콜을 이용하여 16C4 항체의 친화도 성숙 변이체를 동정하였다. 스크린은 2 단계로 구성되었다. 제1 단계는 세포 표면에 표시된 인간 CD19 항체에 대한 증가된 결합 활성을 초래한 단일 아미노산 치환을 포함하는 16C4 변이 Fab의 동정에 집중되었다. 유익한 단일 아미노산 치환을 포함하는 16C4 변이 Fab를 스크리닝 단일 CDR 집중 파지 표시 라이브러리를 통해 동정하였다. 스크린의 두 번째 단계는 (i) 16C4 친화도 성숙 공정의 제1 단계에서, 또는 (ii) 3649 항-CD19 항체의 친화도 성숙 공정 중에 동정된 유익한 단일 아미노산 치환의 모든 가능한 조합을 나타내는 Fab 클론의 조합 라이브러리를 스크리닝하는 것으로 구성되었다.
상기와 같이 CDR 특이적 파지 표시 라이브러리를 생성하였다. 단일 점 세포 기초 결합 검정법에서 다수의 파지 클론(라이브러리 당 대략 400개 클론)을 시험함으로써 라이브러리를 스크리닝하였다(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 시약 및 일회용품을 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)로부터 구매하였고; 제조자의 사용설명서에 따라 검정법을 수행하였다. 간략히, 5,000개의 라지 세포 또는 300B4 세포/웰을 도말하고, 25 ㎕ 1× PBS 중에서 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였으며; 웰을 실온에서 20분 동안 25 ㎕ 30% FBS로 블로킹하였고; 상등액을 폐기하며; 25 ㎕의 항-CD19 Ab을 각 웰에 부가하고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였으며; 웰을 1× PBS로 3× 세정하였고; 25 ㎕의 0.25 ㎍/㎖ 염소-항-인간 Fab'2MSDTag을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였으며; 웰을 1× PBS로 3× 세정하였으며; 신호를 150 ㎕의 1× T 리드 완충액(Read Buffer)로 읽는다. VH CDR2 내 유익한 아미노산 치환을 포함하는 대표적 클론의 결합 곡선이 도 32에 나와 있다. 16C4 CDR 특이적 라이브러리로부터 동정된 유익한 단일 아미노산 치환이 표 39에 열거되어 있다.
[표 39]
16C4 항체 기재 CDR 특이적 파지 표시 라이브러리로부터 동정된 유익한 단일 아미노산 치환.
Figure 112009021231361-pct00082
상기와 같이 조합 파지 표시 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리 생성을 위해 사용되는 16C4 Fab 특이적 올리고뉴클레오티드가 표 40에 열거되어 있다. 조합 라이브러리로부터의 개별 Fab 클론을 300B4 세포 및 라지 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 대표적 Fab 클론의 결합 곡선이 도 33A-B에 나와 있다. 300B4 세포, 라지 세포, 또는 양자 모두에 대한 증가된 결합 활성을 갖는 Fab 클론을 표준 방법을 이용하여 시퀀싱하였다. 특유의 Fab 클론의 CDR 서열에서 발견되는 아미노산 변화의 요약이 도 33C에 제시되어 있다.
[표 40]
조합 파지 라이브러리 생성에 대한 퇴행 올리고뉴클레오티드.
Figure 112009021231361-pct00083
세포 표면에 표시된 인간 CD19 항원에 대한 개선된 결합 활성을 갖는 6개의 친화도 성숙 16C4 변이 Fab 클론을 본원에 기재된 방법을 이용하여 전장 IgG1 항체로 형질전환하였다. 3C3, 6F7, 2B11, 6C11, 9G7 및 5C4 친화도 성숙 항-CD19 항체의 결합 활성을 각종 세포 기초 검정법으로 특징화하였다. 도 34는 세포 기초 ECL 검정법에서 300.B4 세포를 이용하여 수득된 결과를 제시한다(문헌 [Lu et al., J. Immunol. Methods 314:74-79(2006)]). 친화도 성숙 16C4 변이 항체의 CD19 결합 활성은 대조군 16C4 또는 3649 항체의 CD19 결합 활성보다 높다.
친화도 성숙 항-CD19 항체에 의한 세포 표면 염색. 다우디 세포 및 라지 세포를 표준 프로토콜에 따라 3C3, 6C11 및 9G7 항-CD19 항체, 및 RPE 접합 염소 항-인간 IgG(Fab')2 단편 이차 시약으로 면역염색하였다. 면역염색된 세포를 유세포분석기에서 분석하였다. 각종 일차 항체 농도에서 염색된 세포의 중위 형광 강도(MFI)가 도 35에 플로팅되어 있다. 16C4 항-CD19 항체로 염색된 세포를 기준 대조군으로 포함시켰다. 0.0625 내지 0.25 ㎍/㎖ 항체 농도의 라지 세포 상의 3C3 및 6C11 친화도 성숙 항체로 검출된 염색 강도는 16C4 대조군으로 검출되는 염색 강도보다 높다. 친화도 성숙 및 대조군 항체의 라지 세포 염색 강도는 0.5 내지 10 ㎍/㎖ 항체 농도에서 동일하다. 9G7 항체에 의한 라지 세포 염색은 보다 낮은(0.0625-0.25 ㎍/㎖) 항체 농도에서 대조군 항체와 유사하고, 보다 높은(0.5-10 ㎍/㎖) 항체 농도에서는 대조군보다 약하다. 9G7 및 6C11 염색 다우디 세포의 중위 FI는 16C4 염색 세포의 중위 FI보다 높다. 3C3 염색 다우디 세포의 중위 FI는 0.0625 및 0.125 ㎍/㎖ 항체 농도에서 대조군의 중위 FI보다 높고; 0.25 내지 10 ㎍/㎖ 항체 농도에서 대조군 세포의 중위 FI와 실질적으로 동일하다.
친화도 성숙 16C4 변이 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성. 본원에 기재된 검정법을 이용하여 친화도 성숙 항-CD19 항체의 시험관내 ADCC 활성을 측정하였다. 예를 들어, 라지 세포 및 다우디 표적 세포를 이용하여 3C3, 6C11 및 9G7 항체로 수득된 결과가 도 36 및 37에 각기 제시되어 있다. 16C4 항-CD19 항체를 기준 대조군으로 사용하였다. 3개의 모든 친화도 성숙 항체는 90.0001-10 ㎍/㎖의 시험 농도 전반에 걸쳐 대조군과 실질적으로 동일한 ADCC 활성을 나타냈다.
16C4 항-CD19 항체의 친화도 성숙 변이체는 본원에 기재된 프로토콜에 따라 추가 변형될 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 구체적으로 3C3, 6C11 및 9G7 항체는 본원에 기재된 변이 Fc 영역 중 어느 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 비푸코실화 양태의 항체가 또한 제조될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 또한 본원에 기재된 검정법을 이용하여 특징화될 수 있다. 구체적으로 3C3, 6C11, 및 9G7 항체가 ADCC를 매개하여 B 세포를 생체내 고갈시키고, 종양 이식편의 크기를 감소시키며, 항-IgM/CpG 자극 B 세포 증식을 억제하는 능력을, 본원에 기재된 프로토콜에 따라 시험할 수 있다.
7.13. B 세포 증식의 항-CD19 항체 매개 억제
7.13.1. 항-CD19 항체 처리 유도 CD19 인산화
수천만개 세포를 5 ㎍/㎖ 3649, 3649-3M, 3649-aFuc, 3649-TM 또는 16C4 항-CD19 항체의 존재 하에 15분 동안 항온 배양하였다. 무관 특이성의 R347 항체로 처리한 대조군 세포 및 항체 처리하지 않은 대조군 세포를 실험에서 음성 대조군으로 포함시켰다. 항온 배양 후에, 세포 용해물을 제조하여, 표준 프로토콜에 따라 면역석출법에 적용하였다. 면역석출된 물질 및 투입 세포 용해물을 램리(Laemmli) SDS-PAGE로 분리하여, 고체 지지체(니트로셀룰로스 인비트로겐 Cat# LC2001)로 옮기고, 웨스턴 블로팅에 적용하였다. 표준 프로토콜에 따라 2 ㎍ HB12B 항-CD19 항체를 이용하여 면역석출을 수행하였다. 총 CD19 단백질 및 인산화 CD19 수준을, (1:1000) 항-CD19(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) #3574) 또는 (1:250) 항-포스포티로신(PY20)(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)(#sc-508 HRP) 항체를 각기 이용하여 웨스턴 블로팅에 의해 면역석출된 물질 중에서 검출하였다. 투입 세포 용해물 중 인산화된 Erk1/2 단백질 및 총 Erk1/2 단백질 수준을, (1:2000) 항-포스포 Erk1/2(셀 시그널링 테크놀로지 #9106S) 및 (1:1000) 항-Erk1/2(셀 시그널링 테크놀로지 #9102) 항체를 각기 이용하여 웨스턴 블로팅에 의해 검출하였다.
도 39A는 HB12B 면역석출, 및 그에 이어 웨스턴 블로팅을 행한 결과를 나타낸다. 각종 실험군 세포 용해물("3649", "3649-3M", "3649-aFuc", "3649-TM" 또는 "16C4"), 및 대조군 세포 용해물("nil" 및 "R347")로부터의 면역석출된 샘플에 부가하여, 막은 또한 HB12B 항체 단독의 대조군 레인("Ab 단독")을 포함하였다. 총 CD19 단백질 수준은 모든 면역석출된 샘플에서 실질적으로 동일하였다. 인산화 CD19 수준은 대조군 샘플에서보다 항-CD19 처리 세포로부터 제조된 세포 용해물로부터 면역석출된 샘플에서 유의적으로 더 높았다. 도 39B는 총 세포 용해물에 대한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 총 Erk1/2 단백질 수준은 모든 세포 용해물에서 실질적으로 동일하였다. 인산화 Erk1/2 수준은 대조군 샘플에서보다 항-CD19 처리 세포로부터 제조된 세포 용해물에서 유의적으로 더 높았다.
7.13.2. 항-CD19 처리는 항-IgM 매개 Erk1/2 활성화를 억제하지 않는다.
1백만개 세포를 10 ㎍/㎖ 3648-3M 항-CD19 항체 또는 10 ㎍/m R347 대조군 항체의 존재 하에, 5 ㎍/㎖ 항-IgM 항체 또는 PMA(50 ng/㎖)/이오노마이신(1 μM)로 5분 또는 10분 동안 자극하였다. 단지 3649 또는 R347 처리만 행한 세포를 대조군으로 포함시켰다. 세포를 수거하고, 항온 배양 기간의 종료 시에 용해시켰다. 총 세포 용해물을 라엠리 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스 지지체 막으로 옮겨, 표준 프로토콜에 따라 웨스턴 블로팅에 적용하였다. 항-포스포 Erk1/2 항체 및 항-Erk1/2 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 수행하여, 세포 용해물 내 인산화 Erk1/2 및 총 Erk1/2 수준을 각기 결정하였다. 결과가 도 39C-D에 나와 있다.
총 Erk1/2 수준은 모든 세포 용해물에서 실질적으로 동일하였다. 3649 항체로만 처리한 세포 내 기준선 인산화 Erk1/2 수준은 R347로만 처리한 세포의 상기 수준보다 높았다. 항-IgM 또는 PMA/이오노마이신 자극은 인산화 Erk1/2 수준을 3649 또는 R347 처리 세포 모두에서 기준선보다 높게 증가시켰다. Erk1/2 인산화 수준은, 항-IgM 항체를 이용한 자극 후보다 PMA/이오노마이신 자극 후에 유의적으로 더 높았다.
7.13.3. 항-CD19 항체 처리는 항-IgM/CD40 유도 B 세포 증식을 억제한다.
말초 B 세포를 B 세포 단리 키트(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec) # 130-091-151)를 사용하여 200 ml의 혈액으로부터 정제한다. 100,000개 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 접종한다(100 ul의 1×106개 세포/㎖). 그 다음, 적합한 농도의 항체를 50 ul의 체적으로 세포에 첨가한다. 플레이트를 15분 동안 항온배양기에 되돌려보낸다. 이어서, 자극을 50 ul의 체적으로 세포에 부가한다. 세포/항체/자극 혼합물의 최종 체적은 200 ul이다. 세포를 3일 동안 항온 배양한다. 세포수를 셀티터(CellTiter)-Glo
Figure 112009021231361-pct00084
발광 세포 생육성 검정법(프로메가)을 이용하여 제3일에 읽는다. 불멸화 세포주에 대한 실험군에 웰당 10,000개 세포를 접종하였다.
항-IgM/CD40 유도 B 세포 증식에 대한 항-CD19 항체 처리의 영향이 도 40에 나와 있다. B 세포를 10 ㎍/㎖ 3649, 3649-TM 및 3649-3M 항-CD19 항체의 존재 하에 도말하였다. 15분 후에 B 세포를 항-IgM(5 ㎍/㎖) 단독, 항-IgM(5 ㎍/㎖)/CD40 (1 ㎍/㎖), 또는 CpG(1 ㎍/㎖) 단독으로 자극하였다. B 세포 자극이 3일 동안 진행되도록 하였다. 셀티터-Glo
Figure 112009021231361-pct00085
발광 세포 생육성 검정법(프로메가)을 이용하여 생육성 세포수를 실험 종료 시에 측정하였다. 무관 특이성의 R347 항체로 처리한 세포를 대조군으로 포함시켰다. 생육성 세포수는 항-IgM/CD40 또는 CpG 자극에 의해 증가되었으나, IgM 단독의 자극에 의해서는 증가되지 않았다. 항-IgM/CD40 유도 세포 증식은 항-CD19 항체 처리에 의해 유의적으로 억제되었다. 억제 수준(40%)은 시험한 모든 항-CD19 항체에 대해 동일하였다. CpG 유도 세포 증식은 항-CD19 항체 처리에 의해 영향을 받지 않았다.
7.13.4. 항-CD19 항체 처리는 항-IgM/CpG 유도 B 세포 증식을 억제한다.
각종 자극에 대한 세포 증식을 CFSE 검정법을 이용하여 평가하였다. 간략히, 정제된 B 세포를 대략 천만개 세포/밀리리터로 인산염 완충 염수(PBS) 내에 재현탁한다. 거기에 PBS 중 동등 체적의 1 uM CFSE를 첨가한다. CFSE의 최종 농도는 5 uM이고, 세포는 5백만개/밀리리터이다. 현탁액을 10분 동안 암상태로 유지시킨다. 동등 체적의 우태 혈청(FCS)을 혼합물에 첨가하여, 세포외 CFSE를 켄칭한다. 세포를 세정하고, 배지 내 희석한다. 100,000개 CFSE 표지된 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 접종한다(100 ul의 1×106개 세포/㎖). 그 다음, 적합한 농도의 항체를 50 ul 의 체적으로 세포에 첨가한다. 플레이트를 15분 동안 항온배양기에 되돌려보낸다. 이어서, 자극을 50 ul의 체적으로 세포에 부가한다. 세포/항체/자극 혼합물의 최종 체적은 200 ul이다. 세포를 4일 동안 항온 배양한다. 항온 배양 종료 시에, 세포를 세정하고, 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)(BD 바이오사이언스)로 염색하고, 유세포분석기에서 분석한다. 세포의 CFSE 신호를 검출한다. 세포 개체군의 CFSE 프로파일에서의 CFSE 신호 감소는 세포 분할을 가리킨다. CFSE 신호 감소 정도는 세포 증식 수준과 상관된다.
정제된 말초 B 세포를 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖) 또는 CpG(2 ㎍/㎖) 단독으로 4일 동안 자극하였다. CFSE 검정법으로 세포 증식을 평가한다. 도 41A는 자극 및 비자극 대조군 세포의 CFSE 프로파일을 보여준다. IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖) 자극 세포의 CFSE 신호는 대조군 세포의 CFSE 신호보다 유의적으로 낮으며, 이는 IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖) 자극이 광대한 세포 증식을 초래하였음을 가리킨다. CpG 단독 자극의 세포의 CFSE 프로파일은 단지 제한된 세포 증식을 가리킨다.
16C4 항-CD19 항체는 항-IgM/CpG 유도 B 세포 증식을 억제한다. 정제된 말초 B 세포를 5 ㎍/㎖의 R347 대조군 항체 또는 5 ㎍/㎖의 16C4 항-CD19 항체의 존재 하에 4일 동안 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극하였다. CFSE 검정법을 이용하여 세포 증식을 평가한다. 도 41B는 R347 또는 16C4 항체의 존재 하에 IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일을 보여준다. R347 항체의 존재 하에서의 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일은 광대한 세포 증식을 가리킨다. 16C4 항-CD19 항체의 존재 하에서의 항-IgM(1 ㎍/ ㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일은 대조군 세포에서 보여지는 세포 증식보다 덜 광대한 세포 증식을 가리킨다.
7.13.5. Fc 변이 항-CD19 항체는 변경된 억제 성질을 나타낸다.
정제된 말초 B 세포를, 5 ㎍/㎖의 R347 대조군 항체, 3649-3M Fc 변이 항-CD19 항체 또는 3649-TM Fc 변이 항-CD19 항체의 존재 하에 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 4일 동안 자극하였다. CFSE 검정법을 이용하여 세포 증식을 평가한다. 도 42A는 R347 대조군 항체의 존재 하에 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일을 보여준다. CFSE 프로파일은, B 세포의 23.5+26.5+23.2=73.2%가 세포 분할의 적어도 한 회기(round)를 겪었음을 보여준다. 도 42B 및 C는 각기 3649-TM 및 3649-3M Fc 변이 항-CD19 항체의 존재 하에 항-IgM(1 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일은 광대한 세포 증식을 가리킨다. CFSE 프로파일은, 각기 3649-TM 및 3649-3M Fc 변이 항-CD19 항체의 존재 하에 자극된 B 세포의 44.8% 및 30.3%가 4일간의 항온 배양 기간 중에 적어도 한 회기를 겪었음을 보여준다. 3개의 모든 CFSE 프로파일을 보다 면밀히 조사한 결과, 적어도 하나의 분할을 겪는 세포의 수뿐만 아니라, 하나 초과의 분할을 겪는 세포의 수도 각기 R347 및 3649-3M의 존재 하에서 보여지는 최고 또는 최저 세포 증식으로 하락함이 밝혀진다. 3649-TM을 이용한 처리는 3649-3M를 이용한 처리보다 덜 효과적으로 세포 증식을 억제한다.
정제된 B 세포를 5 ㎍/㎖ R347, R347-3M Fc 변이체, 3649, 3649-3M Fc 변이체, 또는 3649-TM Fc 변이 항체의 존재 하에, 항-IgM(5 ㎍/㎖)/CpG(1 ㎍/㎖)로 4일 동안 자극하였다. CFSE 검정법을 이용하여 세포 증식을 평가한다. R347의 존재 하에서 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일이 모든 패널에서 기준 표준물로 포함된다. R347-3M Fc 변이체, 3649, 3649-3M Fc 변이체, 및 3649-TM Fc 변이 항체의 존재 하에서 자극된 B 세포의 CFSE 프로파일이 패널 A-D에 나와 있다. R347-3M Fc 변이체의 존재 하에서의 세포 증식은 R347 기준 표준의 존재 하에서 보여지는 세포 증식과 동일하다. 세포 증식은 3개의 모든 항-CD19 항체에 의해 억제된다. 야생형 3649 및 3649-TM Fc 변이 항체는 동일한 정도로 세포 증식을 억제하였다. 3649-3M은 3649 또는 3649-TM 항체보다 B 세포 증식의 억제에 있어 더욱 효과적이었다.
항-CD19 및 항-Fc감마 수용체 IIB(FcγRIIb 또는 CD32b) 항체의 억제 상승효과: 하기 실험 설계는 B 세포 증식의 항-CD32b 및 항-CD19 항체 매개 억제 간에 상승효과적 상호작용이 있는지의 여부를 추가로 시험하게 된다. 정제된 B 세포를 (i) 항-CD32b 항체(예를 들어, AT10), (ii) 항-CD19 항체, 또는 (iii) 항-CD32b 및 CD19 항체 모두의 존재 하에 항-IgM(2 ㎍/㎖)/CpG(2 ㎍/㎖)로 4일 동안 자극한다. CFSE 검정법을 이용하여 세포 증식을 평가한다. B 세포 증식의 항-CD32b 및 항-CD19 항체 매개 억제 간에 상승효과는, 항체 단독의 존재 하에서 보여지는 세포 증식보다 양 항체 모두의 존재 하에서의 B 세포 증식을 저하시키게 될 것으로 예상된다.
7.13.6. 항-CD19 항체가 효율적으로 내재화된다.
항체 내재화 검정: 세포를 60분 동안 37℃에서 5 ㎍/㎖ Alexa 플로르 488-표지 항체와 함께 항온 배양한다. 분취량의 세포를 10분 간격으로 제거하고, 세정하 며, 2 부분으로 나누어, 빙상에 둔다. 절반의 분취량은 처리하지 않은 채 빙상에 둔다. 나머지 절반의 분취량을 45초 동안 빙상에서 0.03 M 수크로스 및 10% FCS를 함유하는 저 pH(2.0) PBS 용액으로 처리하여, 모든 세포 표면 결합 항체 분자를 제거한다. 산 처리 샘플 및 비처리 샘플 모두를 세정하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하며, 유세포분석기에서 분석한다. 항체 내재화 %는, 산으로 세정된 세포의 형광 신호(단지 내부 신호) 및 비처리 세포의 신호(세포 표면 및 내부 구획으로부터의 총 신호)의 비로 계산된다.
도 44는 60분의 시간 동안의 라지 세포에 의한 HB12B, 3649 및 16C4 항체의 내재화를 보여준다. 내재화 곡선은, 항-CD19 흡수가 약 20 내지 30분경에 최대에 도달함을 보여준다. 최대 내재화는 HB12B 및 3649 항체에 대해 약 50%이고, 및 16C4 항체에서는 ~30%이다.
7.13.7. 24시간 동안의 항-CD19 항체 처리 후의 세포 표면으로부터의 CD19 손실율.
세포를 항-CD19 항체의 존재 하에 24시간 동안 항온 배양한다. 대조군 세포 개체군을 무관 특이성의 R347 항체의 존재 하에 항온 배양한다. 항온 배양 후에, 세포를 수거하고, 세정하며, 10분 동안 5 ㎍/㎖ 항-CD19 항체를 포함하는 염색 용액 중에서 10분 동안 얼음 상에서 항온 배양한다. 세포를 10분 동안 PE 접합 염소 항-인간 IgG 이차 항체로 염색함으로써, 표면 결합 항-CD19 항체를 검출한다. 면역염색된 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 고정하고, 유세포분석기에서 분석한다. 항-CD19 항체 처리 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 면역염색된 R347 처리 세포(0% 표면 손실율) 및 이차 항체로만 염색된 R347 처리 세포(100% 표면 손실율)의 MFI와 비교함으로써, CD19 표면 손실율을 계산한다.
도 45는 5 ㎍/㎖의 3649, 3649-3M, 3649-TM, 3648-aFuc 및 16C4 항-CD19 항체의 존재 하에 24시간 동안 항온 배양 후에 라지 세포 및 일차 B 세포 상의 CD19 표면 손실율을 표시한다. 항-CD19 항체로 처리한 후에, CD19 표면 발현의 55-70% 및 65-90% 손실율이 라지 세포 및 일차 B 세포에서 각기 검출된다.
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등양태를 통상적 수준 이하의 실험을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등양태는 하기 특허청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
개시내용이 모든 목적을 위해 전체적으로 참조 인용되는 각종 공보들이 본원에 인용된다. 2006년 9월 8일에 출원된 미국 가출원 제60/842,935호, 2006년 11월 22일에 출원된 제60/866,917호, 2007년 4월 12일에 출원된 제60/911,397호, 2007년 5월 1일에 출원된 제60/915,309호, 및 2007년 5월 22일에 출원된 제60/939,429호가 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참조 인용된다.
전술한 발명은 본 발명 이해의 선명성을 목적으로 한 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기술한 것이지만, 특정 변경예 및 변형예가 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 수행될 수 있다는 것이 명백히 이해될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, Inc. Damschroder, Melissa Kiener, Peter Wu, Herren Dall'Acqua, William Herbst, Ronald Coyle, Anthony <120> HUMANIZED ANTI CD19 ANTIBODIES AND THEIR USE IN TREATMENT OF ONCOLOGY, TRANSPLANTATION AND AUTOIMMUNE DISEASE <130> BC105PCT <150> 60/842,935 <151> 2006-09-08 <150> 60/866,917 <151> 2006-11-22 <150> 60/911,397 <151> 2007-04-12 <150> 60/915,309 <151> 2007-05-01 <150> 60/939,429 <151> 2007-05-22 <160> 238 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 367 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat tttaatcctt acaatgatgg tactgattac 180 tatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggacc 300 tattactacg gtagtagcta cccctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctcag 367 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Glu 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cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 240 agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccattc 300 acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa 333 <210> 78 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 78 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 79 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 79 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgca gagccagcga aagtgttgat 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Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 128 gctggtggtg ccgttctata gccatagcga ggtgcagctg gtggagtctg g 51 <210> 129 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 129 ggaagaccga tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt ccttg 55 <210> 130 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 130 ggtcgttcca ttttactccc actccgaaat tgtgctgact cagtctccag actttcag 58 <210> 131 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 131 gatgaagaca gatggtgcag ccacagtacg tttgatctcc accttggtcc ctccgccgaa 60 cg 62 <210> 132 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 132 gcctggcgga cccassncat ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 133 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 133 gcctggcgga cccagttssn ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 134 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 gcctggcgga cccagttcat ssnagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 135 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 135 gcctggcgga cccagttcat ccassngcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 136 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a, c, g, or t <400> 136 gcctggcgga cccagttcat ccaagassna ctgaaggtga atccag 46 <210> 137 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 137 gcctggcgga cccawsncat ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 138 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 138 gcctggcgga cccagttwsn ccaagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 139 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 139 gcctggcgga cccagttcat wsnagagcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 140 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 140 gcctggcgga cccagttcat ccawsngcta ctgaaggtga atccag 46 <210> 141 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a, c, g, or t <400> 141 gcctggcgga cccagttcat ccaagawsna ctgaaggtga atccag 46 <210> 142 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 142 ctggcggacc cagthcatcm aagwgctact gaaggtgaat cc 42 <210> 143 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 143 ctggcggacc cagthcatct cagwgctact gaaggtgaat cc 42 <210> 144 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 144 ctggcggacc cagagcatcm aagwgctact gaaggtgaat cc 42 <210> 145 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 145 ctggcggacc cagagcatct cagwgctact gaaggtgaat cc 42 <210> 146 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 146 ctgcccttga acttcscatw gtagttagda tctccatctc cag 43 <210> 147 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 147 ctgcccttga acttcscatw gtagttatta tctccatctc cag 43 <210> 148 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 148 ctgcccttga acttcscaag gtagttagda tctccatctc cag 43 <210> 149 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 149 ctgcccttga acttcscaag gtagttatta tctccatctc cag 43 <210> 150 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 150 cccagtagtc aaagtcgtra accgtagkaa taaatcctga tctagc 46 <210> 151 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 151 cccagtagtc aaagtcsaaa accgtagkaa taaatcctga tctagc 46 <210> 152 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 152 cccagtagtc aaagtctcga accgtagkaa taaatcctga tctagc 46 <210> 153 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 153 ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaatgaata acactttcgc tggc 54 <210> 154 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 154 ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaatgatca acactttcgc tggc 54 <210> 155 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 155 ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaagtaata acactttcgc tggc 54 <210> 156 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 156 ctgctggaac cagttyvtaa aactaakgcc aaaagtatca acactttcgc tggc 54 <210> 157 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 157 ggggaccccg gatccttgat tggatgcata atggatgagg agctttgg 48 <210> 158 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 158 ggggaccccg gagtattgat tggatgcata atggatgagg agctttgg 48 <210> 159 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 159 ggggaccccg gatcctgkat tggatgcata atggatgagg agctttgg 48 <210> 160 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 160 ggggaccccg gatccttgat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48 <210> 161 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 161 ggggaccccg gagtattgat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48 <210> 162 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 162 ggggaccccg gatcctgkat tggatgcckc atggatgagg agctttgg 48 <210> 163 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 163 ctccgccgaa cgtgawtgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48 <210> 164 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 164 ctccgccgaa cgtgtttgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48 <210> 165 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 165 aactaatgcc aaaagtaata acactttcgc tggctctg 38 <210> 166 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 166 cataaaacta atgccaaaat gaataacact ttcgctggct ctgcagg 47 <210> 167 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 167 ccagttcata aaactaatgc caaaatgatc aacactttcg ctggctc 47 <210> 168 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 168 ggatccttga ttggatgcct catggatgag gagctttgg 39 <210> 169 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 169 gtccctccgc cgaacgtgwt tggaacctcc ttactttgc 39 <210> 170 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 170 cctggcggac ccagttcatc tcagagctac tgaaggtgaa tcc 43 <210> 171 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 171 cctggcggac ccagtacatc tcagagctac tgaaggtgaa tcc 43 <210> 172 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 172 cctggcggac ccagtacatc caagagctac tgaaggtgaa tcc 43 <210> 173 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 173 gaatctgccc ttgaacttcg cattgtagtt agtatctcca tc 42 <210> 174 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 174 cttggcccca gtagtcaaag tctcgaaccg tagtaataaa tcctg 45 <210> 175 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 175 cttggcccca gtagtcaaag tcgygaaccg tagtaataaa tcctg 45 <210> 176 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 176 ggaccccgga tcctstattg gatgcctcat gg 32 <210> 177 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 177 cctcgagggg accccggagt atstattgga tgcctcatgg atg 43 <210> 178 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 178 ggaccccgga tcctgsattg gatgcctcat gg 32 <210> 179 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 179 cctcgagggg accccggagt atgsattgga tgcctcatgg atg 43 <210> 180 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 180 ctccgccgaa cgtgwttgga acctccttag wttgctgaca gtaatacg 48 <210> 181 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 181 cgccgaacgt gaatggaacc cgcttagwtt gcgcacagta atacgttgca gc 52 <210> 182 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 182 cgccgaacgt gaatggaacc cgcttagwtt gctgacagta atacgttg 48 <210> 183 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 183 ctccgccgaa cgtgwttgga acctccttag wttgcgcaca gtaatacgtt gc 52 <210> 184 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 184 cctggcggac ccagttcatc caaacgctac tgaaggtgaa tcc 43 <210> 185 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 185 gcctggcgga cccagtwcat cmaaacgcta ctgaaggtga 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Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 224 Ala Gln Ser Lys Arg Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 225 Ala Gln Thr Lys Arg Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 226 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Ile Thr 1 5 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 227 Ala Gln Thr Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 228 Ala Gln Thr Lys Glu Val Pro Asn Thr 1 5 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 229 Gln Gln Thr Lys Arg Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 230 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa=Ser, Thr, Val <400> 230 Ser Xaa Trp Met Asn 1 5 <210> 231 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa=Pro, Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa=Asn, Tyr, Asp, Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa=Gly, Ala, Val <400> 231 Arg Ile Tyr Xaa Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 232 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa=Leu, Arg, Tyr, His <400> 232 Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Xaa Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 233 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa=Asp, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa=Thr, His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa=Ile, Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa=Met, Ile, Arg <400> 233 Arg Ala Ser Glu Ser Val Xaa Xaa Phe Gly Xaa Ser Phe Xaa Asn 1 5 10 15 <210> 234 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=Ala, Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa=Gln, Pro, Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa=Gly, Tyr <400> 234 Xaa Ala Ser Asn Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa=Gln, Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa=Ser, Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa=Glu, Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa=Phe, Ile, Asn <400> 235 Xaa Gln Xaa Lys Xaa Val Pro Xaa Thr 1 5 <210> 236 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <400> 236 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 237 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa=Leu, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa=Phe, Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa=Thr, Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa=Ser, Thr, Val <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa=Arg, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa=Val, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa=Leu, Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa=Asn, Tyr, Asp, Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa=Gly, Ala, Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa=Phe, Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa=Arg, Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> Xaa=Leu, Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa=Tyr, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa=Leu, Arg, Tyr, His <400> 237 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Xaa Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Ser Ser Xaa 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Xaa Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Xaa Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Xaa Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 238 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant polynucleotide/polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa=Asp, Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa=Thr, His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa=Ile, Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa=Met, Ile, Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa=Phe, Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa=Lys, His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa=Ala, Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa=Gln, Pro, Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa=Gly, Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa=Tyr, Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa=Gln, Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa=Ser, Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa=Glu, Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa=Phe, Ile, Asn <400> 238 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Xaa Xaa Phe 20 25 30 Gly Xaa Ser Phe Xaa Asn Trp Xaa Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Xaa Xaa Ala Ser Asn Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Xaa Cys Xaa Gln Xaa Lys 85 90 95 Xaa Val Pro Xaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (23)

  1. 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 단리 정제된 인간화 단클론 항체 또는 그것의 단편으로서, 상기 항체는 인간 CD19 항원에 결합하는 것인 항체 또는 그것의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드 연결 당 사슬을 가지며, 여기서 상기 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 카르파스(Karpas)-422, 카르파스-1106P 및 DB 세포주에 대한 시험관내 ADCC 활성을 효율적으로 매개하지만, 그란타(Granta)-519 세포주에 대해서는 그렇지 않은 것인 항체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 동물 모델에서 B 세포를 고갈시킬 수 있고, 여기서 상기 B 세포는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 복강 B 세포 및 골수 B 세포로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 고갈은 2.5 mg/kg 용량의 상기 항체 투여 7일 후 B 세포 수준을 50% 이상 감소시키는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 Fc 변이체이고, 상기 Fc 변이체는 C1q, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 및 FcγRIV로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Fc 리간드에 대한 증가된 또는 감소된 친화도를 갖는 것인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도보다 5배 이상 더 낮은 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 친화도를 가지고, 상기 Fc 변이체는 비교 분자의 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도의 2배 이내인 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 친화도를 갖는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 증강된 ADCC 활성을 유도하는 돌연변이를 포함하는 것인 항체.
  8. 서열 번호 106 또는 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 단리된 세포.
  10. 인간에서의 B 세포 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 약학적으로 허용가능한 담체 중에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 B 세포 질환 또는 장애는 B 세포 악성 종양, 자가면역 질환, 자가면역 장애, 인간 이식 환자의 체액성 거부반응, 이식편대숙주 질환(GVHD) 및 인간 이식 수령자의 이식후 림프증식성 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 치료는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 복강 B 세포, 골수 B 세포, 전구(progenitor) B 세포, 초기 프로(pro) B 세포, 후기 프로 B 세포, 대형 프리(pre) B 세포, 소형 프리 B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원 자극 B 세포 및 형질 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 B 세포의 고갈을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 고갈은 B 세포 수준을 20% 이상 감소시키고, 상기 고갈은 1주 이상의 기간 동안 지속되는 것인 약학적 조성물.
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