CN105837689B - 抗cd19单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗CD19单克隆抗体、其制备方法和应用。本发明的抗CD19的单克隆抗体不仅能够有效识别高表达CD19蛋白的细胞,而且能够成功用于Western Blot检测,亲和力检测表明,该单克隆抗体具有极高的与靶蛋白的亲和力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及抗CD19单克隆抗体及其制备方法。
背景技术
CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达,被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物。在正常淋巴组织中,CD19表达于生发中心的B细胞和滤泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞。事实上CD19分子主要表达于早期的B细胞,是一个95KDa左右的B细胞系特有的跨膜糖蛋白。
作为B细胞在其分化和增殖期间表达的细胞表面分子。CD19通常被认为是治疗B细胞失调或疾病如B细胞恶性肿瘤,自身免疫病和移植排斥的治疗靶点,其在B细胞系恶性肿瘤上表达,B细胞系恶性肿瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和急性成淋巴细胞性白血病。因此本领域技术人员致力于开发了与CD19特异性结合的抗体。
然而,目前的针对CD19蛋白的抗体性能尚难以令人满意。因此本领域需要开发新的、性能优异针对上述靶点的CD19蛋白抗体试剂或抗体药物,以满足临床上的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗CD19单克隆抗体、其制备方法及其应用。
本发明的第一方面,提供了一种抗体的重链可变区,所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:5所示的CDR1,
SEQ ID NO:6所示的CDR2,和
SEQ ID NO:7所示的CDR3。
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面,提供了一种抗体的重链,所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中,所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第三方面,提供了一种抗体的轻链可变区,所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
SEQ ID NO:11所示的CDR1’,
SEQ ID NO:12所示的CDR2’,和
SEQ ID NO:13所示的CDR3’。
在另一优选例中,所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面,提供了一种抗体的轻链,所述的轻链具有本发明第四方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中,所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第五方面,提供了一种抗体,所述抗体具有:
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区;和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中,所述抗体具有:如本发明第二方面所述的重链;和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中,所述的抗体为特异性抗CD19蛋白的抗体。
在另一优选例中,所述的抗体包括:单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、人源化抗体、双特异性抗体(BiTE)以及嵌合抗原受体抗体(CAR)。
本发明的第六方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白具有:
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列;以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中,所述的重组蛋白特异性地与CD19蛋白结合。
本发明的第七方面,提供了一种多核苷酸,它编码选自下组的多肽:
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体;或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中,所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:1、3、8、9、10、14、15、或16所示的序列。
本发明的第八方面,提供了一种载体,它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面,提供了一种免疫偶联物,该免疫偶联物含有:
(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中,所述偶联物选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十一方面,提供了一种药物组合物,它含有:
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物;以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中,所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物,所述的肿瘤选自下组:胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明的第十二方面,提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;
所述试剂、检测板或试剂盒用于:检测样品中CD19蛋白;
所述药剂用于治疗或预防表达CD19蛋白的肿瘤。
在另一优选例中,所述肿瘤包括:胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
在另一优选例中,所述肿瘤选自:胃癌和滤泡性淋巴瘤。
在另一优选例中,所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十三方面,提供了一种检测样品中CD19蛋白的方法,所述方法包括步骤:
(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在CD19蛋白。
本发明的第十四方面,提供了一种重组多肽的制备方法,该方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养本发明第九方面所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为抗CD19单克隆抗体(PGC3D6H10)的流式检测图。
其中选用的目的细胞系是Ramos,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,阳性率83.83%。
图2为抗CD19单克隆抗体(PGC3D6H10)的流式检测图。
其中选用的目的细胞是人PBMC(外周血单核细胞),抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,阳性率15.44%。
图3为抗CD19单克隆抗体(PGC3D6H10)的流式检测图。
其中选用的目的细胞是Jurkat,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,抗CD19抗体几乎不会与Jurkat细胞发生结合,阳性率为0.54%。
图4为抗CD19单克隆抗体(PGC3D6H10)的免疫印迹(WB)图。
其中抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,泳道1和2是两个平行实验组,上样蛋白为裂解Ramos细胞的总蛋白,泳道3是作为阴性对照的裂解Jurkat细胞的总蛋白。
图5为抗CD19单克隆抗体(PGA6E2D5)的流式检测图。
其中选用的目的细胞系是Ramos,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,阳性率82.65%。
图6为抗CD19单克隆抗体(PGA6E2D5)的流式检测图。
其中选用的目的细胞是Jurkat,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,抗CD19抗体几乎不会与Jurkat细胞发生结合,阳性率为0.00%。
图7为抗CD19单克隆抗体(PGB8D5C6)的流式检测图。
其中选用的目的细胞系是Ramos,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,阳性率72.33%。
图8为抗CD19单克隆抗体(PGB8D5C6)的流式检测图。
其中选用的目的细胞是Jurkat,抗CD19单克隆抗体工作浓度为1ug/ml,左图是不加抗CD19抗体的阴性对照,右图为抗CD19的荧光检测图,抗CD19抗体几乎不会与Jurkat细胞发生结合,阳性率为0.08%。
图9为抗CD19单克隆抗体(PGC3D6H10)的抗原亲和力检测图。
图10为克隆抗CD19单克隆抗体(克隆号为PGC3D6H10)可变区VH和VL的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图。
泳道1为DL5000DNA Marker;泳道2为VH基因;泳道3为RT-PCR扩增VH基因阴性对照;泳道4为VL基因;泳道5为RT-PCR扩增VL基因阴性对照。
图11为随机的选取9个克隆做菌落PCR,琼脂糖凝胶电泳图(克隆号为PGC3D6H10)。
其中Marker左边是对应的随机挑取的VH克隆进行的菌落PCR鉴定;Marker右边是对应的随机挑取的VL克隆进行的菌落PCR鉴定。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,获得一种抗CD19的单克隆抗体,实验结果表明,该抗CD19的单克隆抗体不仅能够有效识别高表达CD19蛋白的细胞,而且能够成功用于Western Blot检测。亲和力检测表明,该单克隆抗体与靶蛋白的亲和力是常规抗体的20倍以上。在此基础上完成了本发明。
本发明的抗CD19单克隆抗体PGC3D6H10可特异性靶向肿瘤细胞表面的CD19分子表位,可用于抗体药物制备,这些抗体药物对B细胞系来源的肿瘤的诊断治疗,病情进展,转移潜能以及预后的评价等方面具有巨大的潜能。基于本发明的PGC3D6H10单克隆抗体所能制备的抗体有重组抗体,ScFv抗体,人源化抗体,双特异性抗体(BiTE)以及嵌合抗原受体抗体(CAR)等。
CD19蛋白
CD19分子主要表达于早期的B细胞,是一个95KDa左右的B细胞系特有的跨膜糖蛋白。CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达,被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述CD19蛋白的氨基酸序列为:
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR(SEQ ID NO.:11)
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用,术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗CD19蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗CD19蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
如本领域技术人员所知,免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗CD19蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CD19蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab’)2片段;抗体重链;抗体轻链。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
CDR1,其氨基酸序列为GYSFTDYT(SEQ ID NO:5),其编码核苷酸序列为,GGTTACTCATTCACTGACTACACC(SEQ ID NO.:8);
CDR2,其氨基酸序列为INPYTGGT(SEQ ID NO.:6),其编码核苷酸序列为,ATTAATCCTTACACTGGTGGTACT(SEQ ID NO.:9);
CDR3,其氨基酸序列为ARWDYRYDGGAMDY(SEQ ID NO.:7),其编码核苷酸序列为,GCAAGATGGGACTATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTAC(SEQ ID NO.:10)。
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列为:
EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQNLGQNLEWIGLINPYTGGTRYNQNFKDKATLTVDTSSTTAYMELLSLTSDDSAVYFCARWDYRYDGGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:2);
其编码核苷酸序列为:
GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAACCTTGGGCAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACACTGGTGGTACTAGGTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCACATTAACTGTAGACACGTCATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGACTATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO.:1)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区,所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用,术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,根据本发明的抗体的轻链可变区,具有选自下组的互补决定区CDR:
CDR1’,其氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:11),其编码核苷酸序列为,AAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTAT(SEQ ID NO.:14);
CDR2’,其氨基酸序列为LVS(SEQ ID NO:12),其编码核苷酸序列为,CTTGTATCC(SEQ ID NO.:15)
CDR3’,其氨基酸序列为QHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO:13),其编码核苷酸序列为,CAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA(SEQ ID NO.:16)
在另一优选例中,所述的轻链可变区的氨基酸序列为:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKNGLMLHQL(SEQ ID NO.:4);
其编码核苷酸序列为:
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG(SEQ ID NO.:3)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区,所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中,术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用,都指特异性结合CD19蛋白的抗体,例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:2的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:4的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中,所述的抗体为抗CD19蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体,它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地,所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有CD19蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽,如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中,“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1、3、8、9、10、14、15、16所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列,但与SEQID NO.:1、3、8、9、10、14、15、16所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素(Koppe等,2005,癌转移评论(Cancer metastasi s reviews)24,539);2.生物毒(Chaudhary等,1989,自然(Nature)339,394;Epel等,2002,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51,565);3.细胞因子如IL-2等(Gi ll ies等,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Card等,2004,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53,345;Hal in等,2003,癌症研究(Cancer Research)63,3202);4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等,2005,癌症通信(Cancer letters)239,36;Huang等,2006,美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128,2115);5.病毒颗粒(Peng等,2004,基因治疗(Gene therapy)11,1234);6.脂质体(Mamot等,2005,癌症研究(Cancerresearch)65,11631);7.纳米磁粒;8.前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL));10.化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD19蛋白分子,因而可用于预防和治疗肿瘤。此外,还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对CD19蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株;优选的,本发明提供了高效价的针对CD19蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的CD19蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后,本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外,本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区),然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,本发明抗原,可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体,可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerl ing等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,包括骨髓瘤细胞株,例如鼠类的骨髓瘤细胞株,包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection,洛克维尔,马里兰,美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications),51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned),并通过标准方法生长(Goding,单克隆抗体(MonoclonalAntibodies):原则和实践(Principles and Practice),Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离,这些纯化工艺为例如,蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对CD19蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液,经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内,10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水,经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
可以通过鼠源单抗来制备高亲和力,低免疫源性,高效的重组或人源化抗体。对鼠源抗体进行人源化改造,可保留抗体可变区与人源抗体恒定区融合,提高抗体亲和力;或改造抗体结构,构建只保留抗体可变区的ScFv或含抗体可变区和部分恒定区的Fab,可提高抗体在体内的吸收百分比和半衰期。
标记的免疫球蛋白
在本发明的一个优选例中,所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地,所述的标记物选自下组:胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中,CD19蛋白的单克隆抗体用胶体金标记,得到胶体金标记的单克隆抗体。
本发明的CD19蛋白单克隆抗体具有很好的特异性,很高的效价和亲和力。
检测板及其材料
本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料,采用常规的检测板制备方法制成。
本发明检测CD19蛋白的免疫检测板,包括测试条和支撑测试条的支撑板,如可采用PVC聚脂胶板等;所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成,搭接部位可以采用常规的方法,如胶带等固定连接;其中:层析材料预包被胶体金标记或有色标记的CD19蛋白单克隆抗体或多克隆抗体,优选被胶体金标记的CD19蛋白单克隆抗体,硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线;
在一个优选的方案中:层析材料上预包被胶体金标记的CD19蛋白单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的CD19蛋白单克隆抗体溶液进行预包被的,包被量为50μl/cm2;优选的浓度为0.5或1.5mg/ml,50μl/cm2;
检测方法与结果判定
平放检测板,将试样滴在滤样纸上,试样约120μl,3~5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
阴性:质控区、检测区均出现明显的色带,示为阴性;
阳性:只在质控区出现明显色带,而在检测区无色带,示为阳性;
无效:质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带,表明检测方法错误或检测板变质或失效,应重新换取检测板检测。
方法和样本
本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测肿瘤的方法。该方法步骤大致如下:获得细胞和/或组织样本;将样本溶解在介质中;检测在所述溶解的样本中CD19蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本,正如在液基细胞检测法中所使用的。优选地使用Western Blot方法进行检测。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明进一步设计用于检测CD19蛋白水平的检测试剂盒,该试剂盒包括识别CD19蛋白的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明中经过大量筛选获得的抗CD19单克隆抗体PGC3D6H10能够有效识别高表达CD19蛋白的细胞;
(2)本发明PGC3D6H10单克隆抗体能够识别细胞表面的天然CD19分子。
(3)本发明PGC3D6H10单克隆抗体能够成功用于Western Blot检测。
(4)本发明PGC3D6H10单克隆抗体具有极高的亲和力,与靶蛋白的亲和力是常规抗体的20倍以上。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
步骤一:杂交瘤细胞的制备
用B细胞系肿瘤细胞或CD19真核重组蛋白抗原分别免疫雌性健康的BALB/c小鼠,挑选出血清ELISA,WB,FC检测呈阳性的小鼠,对其提取脾脏细胞,与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞;将杂交瘤细胞在HAT培养基中培养,对高通量流式筛选呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛,获得阳性克隆36株,再进行WB复筛,获得阳性克隆9株,对WB阳性细胞进行亚克隆,经过2次亚克隆,排除亚克隆过程中返阴细胞株6株,最终筛选出能够稳定分泌CD19抗体的单克隆细胞3株(包括:PGC3D6H10单克隆抗体细胞株、PGA6E2D5单克隆抗体细胞株、PGA6D5C6单克隆抗体细胞株);运用亚型鉴定试剂盒,鉴定单克隆抗体的亚型。
步骤二:抗CD19单克隆抗体的制备
(1)单克隆抗体的生物学鉴定
将步骤一鉴定合格的阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产,将产生的腹水通过Prote in A层析纯化后得到抗CD19单克隆抗体。采用流式细胞术,免疫荧光术和Western Blot鉴定抗体的特异性。具体操作如下:
(1.1)流式细胞术检测抗体的特异性
收集高表达CD19的淋巴瘤细胞系Ramos(购自美国ATCC),以及Ficol法分离的人PBMC(外周血单核细胞)以及阴性对照Jurkat细胞系(购自美国ATCC),4%多聚甲醛室温固定20min,PBS配制的3%BSA封闭液中室温放置30min,用抗CD19单克隆抗体(1ug/ml)室温孵育1h,PBST离心洗涤2次,FITC或Alexa Fluor 647-羊抗鼠IgG(H+L)二抗避光共孵育1h,PBST离心洗涤3次,去掉未结合上的荧光二抗,流式细胞仪检测CD19阳性率。
(1.2)免疫荧光术检测抗体的特异性
收集高表达CD19的淋巴瘤细胞系Ramos,以及Ficol法分离的人PBMC(外周血单核细胞)以及阴性对照Jurkat细胞系,4%多聚甲醛室温固定20min,PBS配制的3%BSA封闭液中室温放置30min,用抗CD19单克隆抗体(1ug/ml)室温孵育1h,PBST离心洗涤2次,FITC或Alexa Fluor 488-羊抗鼠IgG(H+L)二抗避光共孵育1h,PBST离心洗涤2次,DAPI室温核染10min,PBST离心洗涤3次,去掉未结合上的染料,Confocal检测CD19染色情况。
(1.3)Western Blot检测抗体的特异性
收集高表达CD19的淋巴瘤细胞系Ramos,T淋巴白血病细胞系Jurkat,蛋白裂解液冰上裂解30min,离心取上清,BSA法测定上清蛋白浓度,加入loading Buffer,10%SDS-PAGE,120V凝胶电泳90min,转膜400mA,90min。5%脱脂牛奶室温封闭1h,anti-CD19单克隆抗体(1ug/ml)4℃孵育过夜,PBST(含0.1%Tween-20的PBS)洗涤3次,HRP-羊抗鼠IgG(H+L)二抗室温孵育1h,PBST洗涤3次,ECL法显影,曝光2min。
实验结果:
对所获得的3株阳性单克隆抗体(编号:PGC3D6H10、PGA6E2D5、PGB8D5C6)分别进行流式检测和Western Blot实验的应用,结果如图1-8示(图1-4,克隆号PGC3D6H10;图5-6,PGA6E2D5;图7-8,PGB8D5C6)。从这些应用数据可以看出,克隆号为PGC3D6H10的单克隆抗体应用效果最佳,流式细胞术分析中,Ramos的CD19染色阳性率达到83.83%(图1),而且PGC3D6H10单克隆抗体的Western Blot应用结果为阳性,说明PGC3D6H10单克隆抗体能够成功用于Western Blot中进行相关抗原的检测,而PGA6E2D5单克隆抗体和PGB8D5C6单克隆抗体的Western Blot应用结果为阴性,无法用于Western Blot检测。
通过进一步的抗体亲和力分析,克隆号为PGC3D6H10的鼠抗人CD19单克隆抗体与真核重组rCD19蛋白的KD亲和力常数为434.6pM(图9),较于常规的亲和力常数为纳摩尔级的抗体(如,本发明中其它单克隆抗体)亲和力常数高出20倍以上。
结合上述流式检测和Western Blot实验的应用结果,以及亲和力测定分析,本发明筛选到了一株可以分泌有效结合CD19表面蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株(克隆号PGC3D6H10),并制备出了抗CD19的单克隆抗体,这一抗体具有较强的抗原亲和力和抗原特异性。
实施例2抗CD19单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆
所用细胞株为采用上述方法获得的能分泌高亲和力、高特异性的抗CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对应的编号为PGC3D6H10,所对应的抗体分子亚型为:重链IgG1型,轻链κ型。
取对数生长期的杂交瘤细胞2×106,Tri zol法提取细胞总RNA,
取少量用Nanodrop定量及1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测,随后用SuperScript.III First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒(K1622,Thermo)反转录cDNA,用特异性引物扩增抗CD19抗体基因的重链或轻链可变区。将含有相应重链可变区或轻链可变区片段的PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳,胶回收。将回收得到的相应重链可变区和轻链可变区克隆至测序载体pCR2.1,并进行测序,对测序结果进行同源性和结构分析。
具体操作步骤:
(1)RT-PCR扩增CD19抗体轻链和重链可变区
引物设计:本发明人选用mouse-IgG(Mouse Ig-Primer Set,Novagen)引物进行重链可变区克隆,mouse-IgGκ(Mouse Ig-Primer Set,Novagen)通用引物进行轻链可变区克隆。
1.1杂交瘤细胞总RNA提取:Trizol法;
1.2反转录PCR:以杂交瘤细胞总RNA为模板,反转录cDNA,具体操作如下:
1.2.1按表1配成20ul体系,轻轻混匀,离心,42℃孵育60min,70℃终止反应5min,分装,-20℃保存。
表1
成分 | 体积(ul) |
RNA | 1 |
Oligo(dT)<sub>18</sub>Primer | 1 |
5×Reaction Buffer | 4 |
Riblock<sup>TM</sup>RNA酶抑制剂 | 1 |
10mM dNTP MIX | 2 |
RevertAid<sup>TM</sup>逆转录酶 | 1 |
H<sub>2</sub>O | 10 |
1.3抗体可变区特异引物PCR,具体操作如下:
按表2,表3中的反应体系,以反转录得到的cDNA为模板,用特异引物合成抗体重链和轻链可变区。
表2
成分 | 体积(ul) |
dNTP(10mM) | 5 |
10×Buffer | 5 |
Taq | 0.5 |
5’-primers | 1 |
3’-primers | 1 |
cDNA | 1 |
H<sub>2</sub>O | 36.5 |
表3
步骤四:PCR产物克隆和测序
将PCR得到的重链可变区和轻链可变区核苷酸片段产物胶回收(09114KE1,AxyGEN)后,按表四中体系进行TA克隆,16℃连接过夜,分别构建到测序载体上,按表五中体系挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳选取有阳性条带的克隆,提质粒(07714KA1,AxyGEN)测序。
表4
表5
成分 | 体积(ul) |
dNTP(10mM) | 5 |
10×Buffer | 5 |
Taq | 0.5 |
5’-primers | 1 |
3’-primers | 1 |
克隆 | 1 |
H<sub>2</sub>O | 36.5 |
本实施例通过单克隆杂交瘤细胞的抗体基因提取(图10-11,克隆号PGC3D6H10),来获得可以分泌有效结合CD19表面蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株的抗体基因序列(SEQID NO.:1-4,克隆号PGC3D6H10),PGC3D6H10单克隆抗体的测序结果如下。
PGC3D6H10单克隆抗体的VH核苷酸序列:
GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAACCTTGGGCAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTTACACTGGTGGTACTAGGTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCACATTAACTGTAGACACGTCATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGACTATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO.:1)
PGC3D6H10单克隆抗体的VH编码氨基酸序列:
EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQNLGQNLEWIGLINPYTGGTRYNQNFKDKATLTVDTSSTTAYMELLSLTSDDSAVYFCARWDYRYDGGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:2)
PGC3D6H10单克隆抗体的VL核苷酸序列:
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG(SEQ ID NO.:3)
PGC3D6H10单克隆抗体的VL编码氨基酸序列:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKNGLMLHQL(SEQ ID NO.:4)
表6PGC3D6H10单克隆抗体的的重链可变区
SEQ ID NO.:2中位置 | 序列 | |
FR1 | 1-25 | EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKAS |
CDR1 | 26-33 | GYSFTDYT(SEQ ID NO.:5) |
FR2 | 34-50 | MNWVKQNLGQNLEWIGL |
CDR2 | 51-58 | INPYTGGT(SEQ ID NO.:6) |
FR3 | 58-96 | RYNQNFKDKATLTVDTSSTTAYMELLSLTSDDSAVYFC |
CDR3 | 97-110 | ARWDYRYDGGAMDY(SEQ ID NO.:7) |
FR4 | 111-121 | WGQGTSVTVSS |
表7PGC3D6H10单克隆抗体轻链可变区
SEQ ID NO.:4中位置 | 序列 | |
FR1' | 1-26 | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS |
CDR1' | 27-36 | KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.:11) |
FR2' | 37-53 | MHWNQQKPGQPPRLLIY |
CDR2' | 54-56 | LVS(SEQ ID NO.:12) |
FR3' | 57-92 | NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC |
CDR3' | 93-108 | QHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO.:13) |
FR4' | 109-116 | NGLMLHQL |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
1.一种抗CD19的单克隆抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:5所示的CDR1,
SEQ ID NO:6所示的CDR2,和
SEQ ID NO:7所示的CDR3;
并且,所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:11所示的CDR1’,
SEQ ID NO:12所示的CDR2’,和
SEQ ID NO:13所示的CDR3’。
2.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区,其中所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
5.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的轻链包括轻链可变区和轻链恒定区,其中所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2所示,并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白由以下构成:
(i) 如权利要求1所述的抗体的序列;以及
(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。
8.一种多核苷酸,其特征在于,它编码选自下组的多肽:
(1) 如权利要求1所述的抗体;或
(2) 如权利要求7所述的重组蛋白。
9.如权利要求8所述的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸中,用于编码所述抗体或所述重组蛋白中的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,而用于编码所述抗体或所述重组蛋白中的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
10.一种载体,其特征在于,它含有权利要求8所述的多核苷酸。
11.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求10所述的载体或基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。
12.一种免疫偶联物,其特征在于,该免疫偶联物含有:
(a) 如权利要求1所述的抗体、或如权利要求7所述的重组蛋白;和
(b) 选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
13.一种药物组合物,其特征在于,它含有:
(i) 如权利要求1所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、或如权利要求12所述的免疫偶联物;以及
(ii)药学上可接受的载体。
14.如权利要求1所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、或如权利要求12所述的免疫偶联物的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;
所述试剂、检测板或试剂盒用于:检测样品中CD19蛋白;
所述药剂用于治疗或预防表达CD19蛋白的肿瘤。
15.一种重组多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a) 在适合表达的条件下,培养权利要求11所述的宿主细胞;
(b) 从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或权利要求7所述的重组蛋白。
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