CN111087470B - 一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用 - Google Patents

一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用。本发明提出一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示。本发明所制备的抗体能识别肿瘤细胞表面CD47，包括但不限于Hela细胞、SiHa细胞、MDA‑MB‑231细胞、A549细胞、K562细胞、SBC‑5细胞，识别表面CD47后与肿瘤细胞发生结合，且与红细胞的结合率低于1%。

Description

一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用。
背景技术
CD47是一种跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族。CD47具有一种“别吃我”信号，可以与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α (SIRPα)结合，从而抑制巨噬细胞对靶细胞的吞噬清除作用。Oldenborg等在研究体内红细胞更替的过程中发现，年轻红细胞表面高水平表达CD47蛋白保护其不被吞噬；而衰老的红细胞表面CD47表达下调，则被巨噬细胞吞噬清除。因此CD47是机体内年轻、衰老细胞更替的重要调节分子。然而CD47的这种“don't eat me”保护效应被肿瘤细胞所利用，逃避免疫系统清除。研究显示，CD47在多种类型的肿瘤细胞表面高表达，与患者的病理分级、转移和不良预后相关。CD47近几年已成为炙手可热的肿瘤治疗靶点。体内外实验表明，通过封闭肿瘤细胞表面CD47分子，可以阻断CD47SIRPα信号通路，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。由于红细胞上有高表达的CD47分子，更容易与抗CD47抗体药物结合，导致巨噬细胞清除红细胞，诱发贫血症状，以及引起红细胞凝集等不良反应，引起药物毒性。
免疫疗法近些年成为肿瘤治疗的明星，多个免疫检查点治疗药物（抗PD1抗体、抗PDL1抗体）表现出较好的临床疗效。因此急需开发一种对肿瘤细胞具有特异性结合能力，且与红细胞结合率低于1%的抗CD47抗体。
发明内容
本发明提供一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb(以下简称7G4mAb)，该单克隆抗体7G4mAb可以结合多种肿瘤细胞，而且与红细胞结合率较低，可以为肿瘤治疗的抗体开发提供支持。
本发明所述一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示。
优选地，该抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO3所示，重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID.NO4所示。
进一步地，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb可结合的肿瘤细胞包括但不限于Hela细胞或SiHa细胞或MDA-MB-231细胞或A549细胞或K562细胞或SBC-5细胞。
更进一步地，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb与人体红细胞的结合率低于1%。
本发明提出一种用于构建基因工程抗体的应用。
特别提出一种用于抗肿瘤药物的单链抗体的应用。
或者特别提出一种用于抗肿瘤药物的嵌合抗体的应用。
本发明提出一种用于抗肿瘤药物的应用，所述肿瘤包括宫颈癌、肺癌、乳腺癌。
本发明提出一种用于肿瘤诊断、治疗指导、预后判断或复发监测试剂盒的应用。
优选地，所述试剂盒包含特异性检测CD47表达水平的试剂，该特异性检测CD47表达水平的试剂是特异性识别CD47抗原的抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明所制备的抗体能有效识别肿瘤细胞表面CD47并与之发生结合，而与红细胞结合率小于1%，有效地避免了巨噬细胞清除红细胞，诱发贫血症状，及引红细胞凝集等不良反应，降低副作用。
附图说明
图1为利用SDSPAGE检测7G4mAb的纯化结果。
图2为利用流式细胞术检测7G4mAb分别与Hela细胞、SiHa细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞、K562细胞、SBC-5细胞结合的结果。
图3为利用流式细胞术检测7G4mAb与红细胞结合的结果。
图4为流式细胞术检测B6H12.2与红细胞的结合的结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提出一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，该抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示，该抗体能够有效识别并结合人体肿瘤细胞，而与人体红细胞的结合率小于1%。可结合的肿瘤细胞包括但不限于Hela细胞或SiHa细胞或MDA-MB-231细胞或A549细胞或K562细胞或SBC-5细胞；
本实施例提出抗人CD47单克隆抗体7G4mAb的制备方法。本实施例用CD47重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备了一株分泌小鼠抗人CD47单克隆抗体7G4mAb的杂交瘤细胞株，然后提取该杂交瘤细胞的总RNA，反转录后扩增该抗体轻链、重链的可变区基因，并确认该基因序列和相应氨基酸序列的唯一性；
一、本实施例利用A549细胞制备单克隆抗体7G4mAb，具体制备步骤为下：
小鼠抗人CD47单克隆抗体7G4mAb的制备；
S11：提取A549细胞总RNA，利用TakaRa公司逆转录试剂盒将其反转录为cDNA；利用PCR法扩增CD47全长编码DNA并且在3，端加6HIS标签序列，测序后与GenBank提供的序列比对，将正确的基因片段经过BamHI、EcoRI双酶切后连接入Prsetc大肠杆菌表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中；IPTG诱导6h表达，利用镍柱纯化CD47蛋白；
S12：将步骤S11纯化的CD47蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠（购自空军军医大学实验动物中心）；
初次免疫：将50μgCD47与150μl弗氏完全佐剂等体积混合，背部皮下多点注射；
二次免疫：初次免疫四周后进行二次免疫，使用50μgCD47与150μl弗氏不完全佐剂等体积混合，背部皮下多点注射，20天后测定小鼠血清抗体效价，血清效价应大于1:5000；
加强免疫：1周后，在合格小鼠腹腔注射50μgCD47加强免疫，3天后处死小鼠，取脾进行细胞融合；
S13：采用PEG1500为融合剂，将免疫小鼠脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。融合细胞接种至含滋养细胞（6周龄BALB/c鼠胸腺细胞）96孔细胞培养板中，采用含1%HAT及20%FBS的1640培养基进行培养；
当融合细胞克隆生长至培养板1/3 ～ 1/2底面积时，收集培养上清液，Elisa方法检测培养上清液中的抗体，筛选稳定分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤克隆，得到1株可稳定分泌单克隆抗体7G4mAb的杂交瘤细胞株，此处所指稳定分泌是指该细胞连续传代五代之后抗体不丢失；
S14：获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，取BALB/c小鼠每只注射石蜡油0.5ml，两周后取2x106/ml浓度的杂交瘤细胞0.5ml注射到小鼠腹腔制备腹水，一周后收取腹水，利用正辛酸硫酸铵沉淀方法纯化腹水中的单克隆抗体，该抗体即为抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，利用SDSPAGE检测纯化抗体，结果如图1所示；
二、单克隆抗体7G4mAb轻链和重链可变区基因的克隆
提取分泌7G4mAb的杂交瘤细胞RNA，利用takara反转录试剂盒合成cDNA，利用小鼠抗体基因简并引物，以cDNA为模板进行PCR扩增；回收PCR产物，连接至pMD18T载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆进行测序，测序后得到核苷酸序列。7G4mAb编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO3所示，重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO4所示；
三、可变区基因翻译后氨基酸序列
将克隆后的单克隆抗体7G4mAb轻链和重链可变区核苷酸序列进行翻译后，获得单克隆抗体7G4mAb的轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
四、与肿瘤细胞结合效果
本发明所述7G4mAb与Hela细胞的结合率可达到80%-94%，与MDA-MB-231细胞的结合率可达到85%-90%，与SiHa细胞的结合率可达到80%-85%，与A549细胞的结合率可达到80%-97%，与K562细胞的结合率可达到65%-75%，与SBC-5细胞的结合率可达到70%-80%。
实施例2
本实施例是单克隆抗体7G4mAb分别与肿瘤细胞和红细胞的结合能力检测；
1、与肿瘤细胞的结合能力检测
分别取Hela细胞、SiHa细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞、K562细胞、SBC-5细胞1x106个，处理组加入2μg/ml浓度的7G4mAb，对照组加入2μg/ml浓度的鼠IgG，在37℃孵育30min，然后PBS洗涤3次，加入0.25μg APC标记的山羊抗鼠二抗，37℃避光孵育30min。利用流式细胞术检测，其中激发波长633nm；发射波长660nm，检测结果如图2所示。从图2中可以看出7G4mAb与Hela细胞的结合率为93.35%，与MDA-MB-231细胞的结合率为89.19%，与SiHa细胞的结合率为84.72%，与A549细胞的结合率为96.63%，与K562细胞的结合率为67.56%，与SBC-5细胞的结合率为73.26%,mAb7G4即为所述单克隆抗体7G4mAb；
2、与红细胞的结合能力检测
取1x106个红细胞，处理组加入2μg/ml浓度的7G4mAb，对照组加入2μg/ml浓度的鼠IgG，37℃孵育30min，然后PBS洗涤3次，加入0.25μg APC标记的山羊抗鼠二抗，37℃避光孵育30min。流式细胞术检测，其中激发波长633nm；发射波长660nm，检测结果如图3所示，从图2中可以看出7G4mAb与红细胞的结合率低于1%；
3、商业化B6H12.2与红细胞结合能力检测
本实施例取商品化抗CD47抗体B6H12.2作为对照来说明本发明与红细胞的结合效果。该商品化抗CD47抗体B6H12.2，购自Novus Biologicals公司，货号为NBP231106，批号为AB010610-07。检测结果如图4所示，可以看出7G4mAb与红细胞的结合率为99.2%；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表1各类细胞与抗体结合效果量化表。
实施例3
本实施例利用抗人CD47单克隆抗体7G4mAb的轻链、重链可变区核苷酸序列，可以设计构建单链抗体、嵌合抗体及其他基因工程抗体；
1)单链抗体的构建：利用本发明的抗人CD47单克隆抗体7G4mAb的轻、重链可变区基因通过linker连接，插入原核或真核表达载体,转化宿主菌或转染真核细胞，可制备具有治疗作用的单链抗体，或用于肿瘤细胞转导研究；
2)嵌合抗体的构建（人一鼠抗CD47嵌合抗体的构建）：利用本发明的单克隆抗体的轻链、重链可变区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中，获得含嵌合基因的载体转染真核细胞，用于制备具有治疗作用的嵌合抗体；
3）根据本发明所述的抗人CD47单克隆抗体7G4mAb抗肿瘤药物的应用，包括但不限于宫颈癌、肺癌或乳腺癌。
实施例4
本发明所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb用于肿瘤诊断、治疗指导、预后判断或复发监测试剂盒的应用，其包含特异性检测CD47表达水平的试剂，该特异性检测CD47表达水平的试剂是特异性识别CD47抗原的抗体；
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种结合肿瘤细胞的抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用
<130> 2020-01-16
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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atgcagttca acagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagagagatt 300
tattactacg gtagtagcct gtactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 360
gtctcctcag ccaaaacgac acccccaccg gtctatcccc tggcccctgg a 411

Claims (9)

1.一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，其特征在于，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb轻链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
2.根据权利要求1所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，其特征在于，该抗体轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
3.根据权利要求1所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，其特征在于，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb可结合肿瘤细胞；其所结合的肿瘤细胞包括Hela细胞、SiHa细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞、K562细胞或SBC-5细胞。
4.根据权利要求1-3任一所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb，其特征在于，所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb与人体红细胞的结合率低于1%。
5.权利要求2所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb用于构建基因工程抗体的应用。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于，所述应用为构建用于抗肿瘤药物的单链抗体。
7.根据权利要求5所述应用,其特征在于，所述应用为构建用于抗肿瘤药物的嵌合抗体。
8.权利要求4所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌或乳腺癌。
9.权利要求4所述抗人CD47单克隆抗体7G4mAb在制备用于肿瘤诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒中的应用。
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