CN103173413A - 小鼠抗人β-Catenin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents
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Abstract
一种小鼠抗人β-Catenin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌β-Catenin单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为13C6,保藏编号为CGMCC No.6854。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株13C6产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7,它编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9;一种DNA分子SEQ ID NO:8,它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测β-Catenin表达。
Description
技术领域
本发明涉及以原核表达的β-Catenin蛋白免疫小鼠获得的分泌β-Catenin单克隆抗体的杂交瘤细胞株13C6,属于生物工程技术领域。
背景技术
Catenin即连接素,是连接粘附蛋白和肌动蛋白的一种细胞骨架蛋白,也是一组与钙粘蛋白(cadherin)在细胞膜内起作用的粘附蛋白,分为α、β、γ三种亚型,在细胞的信号传导和形态形成等方面起重要的作用。β-Catenin是由定位于人染色体3q21.3,全长23.2kb的原癌基因编码的一种可溶性蛋白,相对分子量约为92kDa,在个体进化上具有高度保守性。
β-Catenin最早作为一种黏附因子被发现,后来人们发现β-Catenin还是一种多功能的蛋白质。β-Catenin主要位于细胞膜,而在胞浆中游离量较少,广泛存在于各种类型的细胞,如内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞中;在参与这些细胞的增殖、分化和凋亡等方面发挥了重要的调节作用。
β-Catenin的功能主要为介导细胞间黏附和参与基因的表达,作为上皮钙黏素-链接素系统(E-cad/Cat)和Wnt信号传导通路中的关键分子,具有双重功能:其一是连接E-钙粘蛋白(E-cadherin)形成上皮钙黏素-链接素系统(E-cad/Cat),调节细胞粘附系统,影响细胞的粘附性、运动性,进而影响组织结构和形态的发生;其二是作为关键成员参与Wnt信号路径的传导。结合型的β-Catenin与细胞膜上的E-cad胞质区结合,介导同型细胞间的黏附;游离型的β-Catenin与Wnt蛋白、GSK-3β、APC、Axin等共同构成Wnt信号传导通路调节细胞的增殖。Wnt/β-Catenin是生物进化中一条极为保守的信号通路,对胚胎的正常发育起重要调控作用,Wnt信号通路异常激活与肿瘤的发生发展相关。β-Catenin作为关键成员参与Wnt信信号通路的传导,是此路径的关键调控位点,与多种肿瘤密切相关,包括黑色素瘤、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌和肝癌等。
以结直肠癌为例。在正常上皮细胞中,β-Catenin的水平极低,主要分布与细胞与细胞接触间的细胞膜上,APC基因及β-Catenin基因的突变会使β-Catenin蛋白的浓度升高,并异位聚与细胞浆和细胞核上。有研究结果表明,在正常粘膜及癌旁粘膜中,β-Catenin阳性染色主要位于细胞膜;但在腺癌中,其阳性染色主要位于细胞浆,而细胞膜阳性却明显下降。β-Catenin在胞浆的阳性表达率与分化程度有关,分化程度越高,其阳性表达率也越高,而且β-Catenin的表达程度与浸润深度有关,越靠近浆膜层,其阳性表达程度越高。因此,检测β-Catenin在细胞中的定位,可为患者的预后估计提供参考。
目前,国内外已经获得了多种β-Catenin的单克隆抗体,但一直以来都需要表达量更多,亲和性更好,稀释度更高,具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的β-Catenin的单 克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、用于科研或临床、可用于科研或临床免疫组化检测β-Catenin表达的小鼠抗人β-Catenin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下的技术方案:
(1)根据β-Catenin的基因序列(NM_001098209.1)的编码框,设计1对特异引物,Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA,将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增β-Catenin基因,构建重组表达载体PET28a-β-Catenin,转化大肠杆菌BL21感受态,IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。
(2)采用经典的细胞融合技术制备β-Catenin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白,SDS-PAGE测定抗体纯度,直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。
(3)通过免疫组织化学分析β-Catenin单克隆抗体染色人乳腺癌和人结肠腺癌石蜡切片。
(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物,PCR扩增单克隆抗体β-Catenin重链可变区和轻链可变区,回收目的片段,克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆,抽提质粒后测序确定了单克隆抗体β-Catenin的重链和轻链可变区序列。
本发明提供的以原核表达的β-Catenin蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌β-Catenin单克隆抗体的杂交瘤细胞株,名称为13C6,分类命名为小鼠抗β-Catenin杂交瘤细胞系,该细胞株13C6已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏编号为CGMCC No.6854。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株13C6,CGMCC No.6854产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8,DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:10。
本发明的优点和有益效果:
本发明应用重组人的β-Catenin蛋白为免疫抗原,免疫Balb/c小鼠,采用经典的细胞融合技术,通过ELISA筛选,获得一株能稳定分泌抗β-Catenin的杂交瘤细胞株,命名为13C6,亚型鉴定为IgG1,将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清,采用Protein A亲和层析法对β-Catenin单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示,纯化后抗体纯度在95%以上;ELISA滴度测定结果显示,单抗的滴度均在1∶10000以上。人乳腺癌和人结肠腺癌石蜡切片经抗β-Catenin抗体免疫组化染色,可于光镜下观察到细胞膜或胞浆中出现均匀着色的黄到棕黄色颗粒,背景清晰,无非特异性着色。从实验结果上来看,本发明制备了高效价,高 特异性的β-Catenin单克隆抗体,用该抗体检测证实,其对细胞中的β-Catenin蛋白具有高识别能力,可用于科研或临床免疫组化检测β-Catenin表达。
附图说明
图1SDS-PAGE分析纯化后的β-Catenin单克隆抗体。
图2ELISA法测定β-Catenin单克隆抗体滴度。
图3是免疫组织化学检测分析β-Catenin单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。
图4是免疫组织化学检测分析β-Catenin单克隆抗体染色人结肠腺癌石蜡切片。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
实施例1:杂交瘤细胞株13C6及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
(1)获得目的基因
在该实施例中,根据β-Catenin的基因序列(NM_001098209.1)的编码框,设计1对特异引物:
引物1:5′-CGGATCCATGGCTACTCAA GCTGATTTG-3′(SEQ ID NO:1)
引物2:5′-GGCTCGAGAATC AGGTCAGTAT GA-3′;(SEQ ID NO:2)
Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA,将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增β-Catenin基因。
(2)构建重组表达载体
将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a,构建重组质粒PET28a-β-Catenin。
(3)获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态,用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(4)诱导表达和蛋白纯化
将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态,用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选,挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养,37℃,220rpm培养10h,取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养,培养至OD值为0.8,加入0.2mMIPTG诱导表达,16℃诱导过夜,收集菌液超声,取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化β-Catenin蛋白。
2、单抗的制备和纯化
(1)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
首次免疫。纯化的重组蛋白β-Catenin(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂,100ug/只,颈背部皮下多点注射;
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白β-Catenin(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂,100ug/只,颈背部皮下多点注射;
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白β-Catenin(用适量生理盐水稀释),不完全弗氏佐剂,100ug/只,颈背部皮下多点注射;
三次免疫后7~10天采血,用建立的ELISA法检测效价,选择效价最高者用于细胞融合。
加强免疫(融合前3天),用纯化的重组蛋白50ug腹腔注射。3天后,取脾脏融合。
(2)、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1∶5~1∶10),并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基,进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的β-Catenin蛋白(10μg/ml)包被酶标板,每孔100μl,4℃包板过夜。甩掉包被液,加入200μl 5%的脱脂奶粉,37℃封闭1h后,洗涤3次,加杂交瘤细胞培养检测上清100μl(阴性对照为PBS100μl),37℃孵育1小时。洗涤3遍后,加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP),37℃孵育1小时,去掉酶标二抗,洗涤3遍,加底物显色剂50μl,室温静置5分钟,加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗β-Catenin杂交瘤细胞株,命名为13C6,亚型鉴定为IgG1。
将选出的阳性杂交瘤细胞株13C6克隆化培养(有限稀释法),获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养,并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人β-Catenin杂交瘤细胞系13C6,该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.6854。
(3)单克隆抗体的大量制备与纯化
将步骤(2)获得的细胞株13C6接种至Balb/c小鼠腹腔,制备腹水,然后从腹水中提取抗体。
单克隆抗体β-Catenin的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱,用PBS平衡柱子后,取抗β-Catenin的腹水过柱,然后用PBS洗至OD值接近于零,以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱,收集峰值区的洗脱液,经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示,纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。
(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度
以纯化的β-Catenin蛋白(10μg/ml)包被酶标板,每孔100μl,4℃包板过夜。甩掉包被液,加入200μl 5%的脱脂奶粉,37℃封闭1h后,洗涤3次,将纯化的抗体按1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600,1∶3200,1∶6400,1∶12800进行稀释,以每孔100μl加入酶标板中(阴性对照为PBS100μl),37℃孵育1小时。洗涤3遍后,加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP),37℃孵育1小时,去掉酶标二抗,洗涤3遍,加底物显色剂50μl,室温静置5分钟,加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示,单抗的滴度均在1∶10000以上(参见图2)。
实施例2:单克隆抗体免疫组化应用检测
用β-Catenin单抗,按常规法作病理切片,对人乳腺癌、结肠腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。
具体方法为:
(1)脱蜡
切片依次置于二甲苯I、II、III脱蜡每次5分钟,移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟,移至95%酒精中浸泡4分钟,移至85%酒精中浸泡4分钟,再移至70%酒精中浸泡4分钟,流水冲洗2分钟。
(2)抗原修复
将已冲洗干净组织切片放入高压锅内,加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0),高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟,关掉电磁炉开关,两分钟后将高压锅移至冷水中冷却,待高压锅内抗原修复液完全冷却后,打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。
(3)阻断
3%H2O2中浸泡10分钟,流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片,擦干组织周围的水,用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好,防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。
(4)滴加一抗
甩去待测组织切片上多余的PBS,滴加一抗,其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的CD20单克隆抗体,稀释度为1∶1000。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时。
(5)滴加二抗
将孵育盒从冰箱取出,恢复至室温后取出切片,用PBS洗3次,每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中,盖上盖子,连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。
(6)显色、衬染、封片
取出切片,擦掉组织周围的多余的PBS,加入DAB显色液中显色3-5分钟,在显微 镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色,再用流水冲洗5-10分钟,苏木素染液复染1分钟,0.5%盐酸酒精分化3秒钟,流水冲洗5-10分钟,脱水、透明、封片、镜检。
结果判定:按照国外学者对组织中β-Catenin的判定标准,β-Catenin蛋白阳性反应为黄到棕黄色颗粒,定位于细胞膜和胞浆。人乳腺癌(参见图4)、人结肠腺癌石蜡切片经抗β-Catenin抗体免疫组化染色,可于光镜下观察到细胞膜或胞浆中出现均匀着色的黄到棕黄色颗粒,背景清晰,无非特异性着色。说明此β-Catenin小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。
实施例3:单克隆抗体可变区测序
根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:
zh07 5′-GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3′(SEQ IDNO:3)
zhr11 5′-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3′(SEQID NO:4)
zl01 5′-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3′(SEQ lDNO:5)
zlr05 5′-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3′(SEQID NO:6)
Trizol Reagent试剂分别提取5×106杂交瘤细胞13C6的总RNA,将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体β-Catenin重链可变区,用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体β-Catenin轻链可变区,PCR反应均采用热启动,反应条件:94℃5分钟;94℃45秒,60℃45秒,72℃1分10秒,30个循环;72℃7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp,重链长度420bp)。克隆到pGEM-T(Promega)载体中,转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选,取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆,用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序,确定了单克隆抗体β-Catenin的重链和轻链可变区序列。
单克隆抗体β-Catenin可变区的DNA序列和氨基酸序列:
单克隆抗体β-Catenin重链可变区DNA序列(5′→3′,419bp)(SEQ ID NO:7);
单克隆抗体β-Catenin的轻链可变区DNA序列(5′→3′,359bp)(SEQ 1D NO:8);
单克隆抗体β-Catenin重链可变区的推断氨基酸序列(139氨基酸)(SEQ ID NO:9);
单克隆抗体β-Catenin轻链可变区的推断氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10ID NO:10)。
Claims (5)
1.一种以原核表达的β-Catenin蛋白免疫小鼠获得的分泌β-Catenin单克隆抗体的杂交瘤细胞株13C6,保藏编号为CGMCC No.6854。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株13C6产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体,包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
4.一种DNA分子SEQ ID NO:7,它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO:8,它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:10。
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