CN104894074B

CN104894074B - 分泌s100a9单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104894074B
Application number: CN201510375757.3A
Authority: CN
Inventors: 刘文弟; 张改平; 张振强; 宋军营; 孙向东; 段睿; 米丹阳; 赵书民; 闫敏; 张钟允
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2035-06-29
Also published as: CN104894074A

Abstract

本发明公开了一种分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明中杂交瘤细胞株的名称为杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCC No.10596，保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该杂交瘤细胞株能稳定分泌S100A9单克隆抗体，且抗体滴度高、亲和性好、特异性强，与S100A9重组蛋白特异性结合，与钙结合蛋白S100家族的S100A8、S100A12和S100A13均无交叉反应，可用于科研或临床免疫组化检测S100A9蛋白的表达。

Description

分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时还涉及由该杂交瘤细胞株分泌产生的S100A9单克隆抗体，以及该单克隆抗体的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

S100A9是S100钙结合蛋白家族的一个重要成员，又称钙粒蛋白B(calgranulin B，CAGB)、骨髓相关蛋白-14(myeloid related protein of molecular weight 14kDa，MRP-14)、迁移抑制因子相关蛋白-14(migration inhibitory factor-related protein ofmolecular weight 14kDa，MRP-14)等。S100A9主要分布于脾脏、肺脏和皮肤等器官，表达于嗜中性粒细胞、单核细胞、角化细胞等的胞浆和细胞外液中，是一种与炎症、创伤、肿瘤关系密切的钙结合蛋白。S100A9结合Ca²⁺、Zn²⁺、花生四烯酸、角蛋白中间丝、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll-样受体4(TLR4)、基质金属蛋白酶(MMPs)等，具有细胞内、外调节活性，参与炎症反应和肿瘤发展过程。

近年来，研究发现S100A9与多种疾病相关，例如其在肿瘤及炎症组织中呈高表达，在急性和慢性炎症中扮演重要角色。S100A9蛋白的检测对研究多种疾病的发生、发展、治疗及预后均有指导意义，其潜在应用价值正逐渐突出，有可能成为这些疾病临床诊断的新指标。目前，S100A9相关抗体药物的研发已成为国内外研究的热点，例如开发在炎性疾病或癌症位点(如前列腺癌、皮肤癌、动脉粥样硬化等)阻止S100A9和/或其活动的治疗策略等。因此，获得表达量更多、亲和性更好、稀释度更高、特异性更好的S100A9单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株对临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能稳定分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体滴度高、亲和性好、特异性强，单克隆抗体与S100A9重组蛋白特异性结合，与钙结合蛋白S100家族的S100A8、S100A12和S100A13均无交叉反应。

同时，本发明还提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌产生的S100A9单克隆抗体。

最后，本发明还提供一种S100A9单克隆抗体的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCC No.10596，保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

S100A9单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞CGMCC No.10596分泌产生。

S100A9单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将分泌S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞CGMCC No.10596接种至小鼠腹腔，采集腹水，提取(纯化)抗体，即得。

S100A9单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码重链可变区氨基酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.3所示，编码轻链可变区氨基酸序列的DNA分子序列如SEQID NO.4所示。

S100A9单克隆抗体的应用，包括单克隆抗体在免疫组化检测中的应用，如检测人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌等癌症组织中S100A9蛋白的表达等。还包括利用单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列构建基因工程抗体。

基因工程抗体，包含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的有益效果：

本发明应用人外周血白细胞为免疫原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过免疫细胞化学对杂交瘤细胞进行阳性筛选，应用免疫沉淀-质谱法对单克隆杂交瘤细胞进行特异性鉴定，经Western Blot验证，获得一株能稳定分泌抗人S100A9蛋白的杂交瘤细胞株，其名称为杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCC No.10596，保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明采用动物体内诱生法制备单抗，亚型鉴定抗体为IgG1型，轻链为Kappa链。采用Protein A亲和层析法对S100A9单抗进行纯化，SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上，分子量大小符合鼠源抗体的特点。ELISA测定单抗的滴度均在1:10000以上，抗体亲和常数Ka为3.54×10⁸L/moL，亲和力较高，特异性鉴定中该单克隆抗体能够与S100A9重组蛋白特异性结合，与钙结合蛋白S100家族S100A8、S100A12和S100A13均无交叉反应。人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织石蜡切片经抗S100A9抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，免疫组化结果表明该单克隆抗体能识别人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织中的S100A9蛋白。

本发明中高效价、高纯度、较高亲和力和高特异性的S100A9单克隆抗体对细胞内S100A9蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测，例如检测人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织中S100A9蛋白的表达。另外，本发明提供的鼠抗人S100A9单克隆抗体的可变区序列能够为基因工程抗体的构建奠定基础。

保藏证明和存活证明说明

保藏菌株：杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCC No.10596，保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明实施例1中免疫细胞化学检测杂交瘤细胞培养上清抗体分泌；

图2为实施例1中免疫沉淀获得与Ⅱ D4B10细胞分泌抗体结合的抗原；

图3为实施例1中Western Blot验证S100A9抗体性质；

图4为实施例2中SDS-PAGE鉴定纯化后S100A9单克隆抗体的纯度及分子量；

图5为试验例中ELISA法测定S100A9单克隆抗体滴度；

图6为试验例中S100A9单克隆抗体交叉反应性分析；

图7为试验例中S100A9单克隆抗体的亲和常数测定曲线图；

图8为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片图；

图9为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人结肠癌石蜡切片图；

图10为实施例3中免疫组织化学检测S100A9单克隆抗体染色人肝细胞性肝癌石蜡切片图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

分泌小鼠抗人S100A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备，包括以下步骤：

1、免疫原制备

河南省红十字血液中心成分室取回的健康人外周血改良白膜法制备血小板过程中的白膜(富含白细胞)，用两倍体积的PBS稀释混匀，取15mL离心管加4mL淋巴细胞分离液，将8mL稀释的血液缓慢平稳加于淋巴细胞分离液液面上，水平低温离心机(500×g，缓升缓降，18℃)离心20min，收集环状乳白色层至新的离心管中，加PBS离心洗涤2次，重悬后台盼蓝染色计数并调整浓度，制备成细胞悬液；经流式细胞术检测，淋巴细胞约占50％，单核细胞约占5％，粒细胞约占10％；

2、单抗的制备和纯化

(1)免疫动物

选用7周龄(6～8周龄均可)雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行四次免疫，首次免疫以约1×10⁶个细胞、200μL背部皮下分点注射，二次免疫(间隔三周)以约1×10⁶个细胞、200μL腹腔注射，三次、四次免疫均同二次免疫，采集每次免疫后小鼠血清，用建立的免疫细胞化学法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合，融合前3天加强免疫，以约1×10⁷个细胞、300μL腹腔注射，3天后取脾脏融合；

(2)细胞融合

小鼠摘眼球取血收集血清，拉颈处死，无菌操作取出脾脏并研磨，制备脾细胞悬液，将准备好的骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按1:9的比例混合(1:8～1:10均可)，加入促融合剂聚乙二醇1500，采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选；

用免疫细胞化学方法检测杂交瘤细胞培养上清：制备白细胞悬液(含有淋巴细胞、粒细胞、单核细胞等成分)，以每孔1×10⁵个细胞接种至96孔板中，无血清1640培养基37℃培养2h，离心后吸取上清，甲醇:双氧水＝100:1固定，弃上清，PBS-T(含0.05％的吐温-20)洗4次，5％脱脂奶37℃封闭1h，PBS-T洗4次；加一抗:免疫后血清或细胞培养上清100μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，PBS-T洗4次；加二抗:100倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，PBS-T洗4次；AEC显色液室温避光显色10min(5～15min均可)，倒置显微镜下观察并记录(见图1，AEC显色×100，图中A为阳性对照，B为阴性对照，C为阳性样品)；设加强免疫后血清阳性对照和未免疫血清阴性对照，选取强着色阳性孔杂交瘤细胞扩大培养，经检测仍为阳性者予以冻存，并分批进行有限稀释法亚克隆；

经3次亚克隆后，为确定阳性单克隆细胞分泌抗体的性质，进行免疫沉淀-质谱法鉴定，用NP40细胞裂解液裂解白细胞，每10⁷个细胞加入1mL裂解液，冰上裂解1h后，(4℃，10000×g)离心20min，收集上清，BCA法测定蛋白质浓度，-20℃保存；将50μL 50％ProteinG-Agarose加入1.5mg(1～2mg均可)裂解的蛋白中，4℃混合30min，1000r/min，4℃离心3min，沉淀与Protein G非特异性结合的蛋白；收集上清至新的EP管中，加200μL细胞培养上清，4℃混合2h，再加50μL Protein G，4℃混合2h，(4℃，1000r/min)离心30s，沉淀与细胞培养上清中的抗体结合的抗原蛋白；弃上清，PBS洗3次，加5×SDS上样缓冲液，95℃加热5min，10000×g离心3min，每个泳道取20μL进行SDS-PAGE，剩余样品-80℃保存；在进行SDS-PAGE的同时，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，ECL显色，进行Western Blot分析，以确定抗体结合的抗原条带(见图2，图中A为考马斯亮蓝染色结果，B为Western Blot的ECL显色结果，图2-A、2-B中，M:Marker，1:白细胞裂蛋白+细胞培养上清+ProteinG，2:细胞培养上清+ProteinG，3:白细胞裂蛋白+ProteinG)，对SDS-PAGE分离得到的与抗体相互做用的蛋白切胶，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，检索UniProt_human数据库，通过确定抗原的性质鉴定抗体；

为验证免疫沉淀-质谱法鉴定结果，在得知抗原性质后，进行Western Blot抗体鉴定，将测得的抗原重组蛋白溶于上样缓冲液，进行SDS-PAGE并转PVDF膜，5％脱脂奶封闭，以细胞培养上清为一抗，培养基代替一抗作为阴性对照，室温孵育1h，TBS-T洗3次，加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h，洗膜3次后显色观察结果(见图3，图中A为重组人S100A9蛋白SDS-PAGE，B为Western Blot的AEC显色，培养基阴性对照，C为Western Blot的AEC显色，细胞培养上清)；筛选鉴定得到一株分泌S100A9单克隆抗体性能最佳的杂交瘤细胞株，命名为ⅡD4B10，经传代培养3个月及3次冻存复苏检测结果稳定；亚型鉴定重链为IgG1，轻链为Kappa链；

将ⅡD4B10细胞株扩大培养，并冻存保种；所述阳性杂交瘤细胞的名称为杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCC No.10596，保藏日期：2015年05月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2

小鼠抗人S100A9单克隆抗体的制备，包括以下步骤：

(1)将实施例1中获得的细胞株ⅡD4B10接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体；

(2)S100A9单克隆抗体的纯化

采用Protein A亲和层析法，首先制备Protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗S100A9单抗腹水过亲和柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/L pH2.7的柠檬酸溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。

SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上(见图4，图中M:Marker，1:小鼠未纯化腹水，2:硫酸铵沉淀后腹水，3:蛋白A亲和层析流出杂蛋白，4:蛋白A亲和层析纯化后腹水)。

试验例

1、直接ELISA法测定纯化抗体的滴度

以重组S100A9蛋白(0.25μg/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃包板过夜，甩掉包被液，加入3％的BSA，37℃封闭2h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800等进行稀释，以每孔100μL加入酶标板中(阴性对照为不表达S100A9的腹水抗体，空白对照为PBS100μL)，37℃孵育1小时；洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂100μL，室温静置5分钟，加终止液50μL；用酶标仪检测450nm波长处的OD值。

ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1：10000以上(见图5)。

2、S100A9单克隆抗体交叉反应性及特异性分析

SDS-PAGE蛋白质电泳：抗原分别以S100A9、S100A8、S100A12和S100A13重组蛋白每孔2μg上样，电泳完成后取出凝胶并转PVDF膜，5％脱脂奶4℃封闭12h，以S100A9单抗为一抗(稀释倍数为1:1000)，室温孵育1h，TBST洗3次；二抗为羊抗鼠IgG(稀释倍数为1:2000)，室温孵育1h；ECL显色后经GE超灵敏化学发光成像仪拍照分析(见图6，A为蛋白的分子量大小，其中M:Marker，1:S100A9重组蛋白，2:S100A8重组蛋白，3:S100A12重组蛋白，4:S100A13重组蛋白；图B中M:Marker，1:S100A9重组蛋白，2:S100A8重组蛋白，3:S100A12重组蛋白，4:S100A13重组蛋白，一抗均为单克隆抗体S100A9)。从图6可以看出，S100A9单克隆抗体只与S100A9蛋白有反应，与S100A8、S100A12、S100A13蛋白无交叉反应。S100A9单克隆抗体的亲和常数测定曲线图见图7。

实施例3

小鼠抗人S100A9单克隆抗体在免疫组化检测中的应用：用S100A9单抗按常规法作病理切片，对人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织石蜡切片进行免疫组化染色。

具体方法为：

(1)脱蜡：切片依次置于二甲苯I、II脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡5分钟，移至95％酒精中浸泡5分钟，移至85％酒精中浸泡5分钟，再移至70％酒精中浸泡5分钟，流水冲洗2分钟；

(2)抗原修复：将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000mL左右的Tris抗原修复(pH9.0)，放入修复液中加热20min，修复完毕冷却20min，取出片子，擦干水，避免组织干枯，水洗一次5min；

(3)阻断：用过氧化物酶封闭剂3％H₂O₂中浸泡5分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗，取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈(注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性)，TBS缓冲液冲洗；

(4)滴加一抗：甩去待测组织切片上多余的TBS，滴加一抗，其中一抗为实施例2中制备并纯化的S100A9单克隆抗体，稀释度为1:1000，放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时；

(5)滴加二抗：将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用TBS洗3次，每次5分钟，滴加通用型二抗-HRP聚合物，将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟；

(6)显色、衬染、封片：取出切片，擦掉组织周围的多余的TBS，加入DAB显色液中显色4(3～5分钟均可)，在显微镜下控制染色的强度，待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗8分钟(5～10分钟均可)，苏木素染液复染1分钟，0.5％盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗8分钟(5～10分钟均可)，脱水、透明、封片、镜检。

结果判定：按照国外学者对组织中S100A9的判定标准，S100A9蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于胞浆。人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织石蜡切片经S100A9抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。

实验结果如图8～10所示(图8为S100A9单抗染色人乳腺癌石蜡切片阳性(×100)，图9为S100A9单抗染色人结肠癌石蜡切片阳性(×100)，图10为S100A9单抗染色人肝细胞性肝癌石蜡切片阳性(×100))，在人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织中S100A9抗原表达阳性，细胞浆被染成棕黄色。试验结果证实S100A9单克隆抗体可检测S100A9蛋白的表达，其对人乳腺癌、结肠癌、肝细胞性肝癌组织中的S100A9蛋白具有高识别能力，可特异性的应用于科研等免疫组化实验。

实施例4

小鼠抗人S100A9单克隆抗体的可变区测序，根据抗体基因的恒定区序列合成引物对A9H1(如SEQ ID NO.5所示)和A9H2(如SEQ ID NO.6所示)、A9L1(如SEQ ID NO.7所示)和A9L2(如SEQ ID NO.8所示)；Trizol Reagent试剂分别提取5×10⁶杂交瘤细胞3G7的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA；用引物A9H1和A9H2PCR扩增单克隆抗体S100A9重链可变区，用引物A9L1和A9L2PCR扩增单克隆抗体S100A9轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃2分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，25个循环；72℃2分钟；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度318bp，重链长度354bp)；克隆到pMD18-T(Takara)载体中，转化大肠杆菌DH5a细胞后在氨苄青霉素抗性平板上进行筛选阳性克隆，并进行测序，确定单克隆抗体S100A9的重链和轻链可变区序列。

小鼠抗人S100A9单克隆抗体中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码重链可变区氨基酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.3所示(5′→3′，372bp)，编码轻链可变区氨基酸序列的DNA分子序列如SEQ IDNO.4所示(5′→3′，345bp)。

Claims

1.杂交瘤细胞株，其特征在于：杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞ⅡD4B10，保藏编号：CGMCCNo.10596。

2.单克隆抗体，其特征在于：由保藏编号为CGMCC No.10596的杂交瘤细胞株产生。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述免疫组化检测试剂用于检测癌症组织中S100A9蛋白的表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述癌症为人乳腺癌、结肠癌或肝细胞性肝癌。

6.基因工程抗体，其特征在于：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。