CN103214573A - 抗人loc339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途涉及生物医药领域，其特征在于：通过设计独特的免疫原免疫动物获得了抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体及杂交瘤细胞株，实验数据证明，获得的单克隆抗体具有优异的特异性，适合于研究LOC339524蛋白的分布、功能和作用机制。

Description

抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术，特别是涉及抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途。 

背景技术

人LOC339524(Genbank)基因位于染色体1p22.3位点上，由39,440个碱基组成。LOC339524蛋白心、脑、肺、肝等重要脏器都有表达，而且主要在细胞核内表达，部分组织细胞浆内也有表达，并能释放到血清中。LOC339524蛋白的功能尚不清楚。免疫检测技术是基于抗原—抗体反应的原理对待测物（抗原/抗体）进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、便捷等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。构建基于免疫检测技术的LOC339524蛋白检测体系对于深入研究LOC339524蛋白的分布、功能和作用机制等都具有重要的意义，同时具有巨大的社会和经济价值。目前国内外均未发现有关于LOC339524蛋白的抗体。因此，制备高特异性的LOC339524单克隆抗体成为迫切需要。 

发明内容

基于上述领域的空白，本发明提供一种制备抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体的方法，由该方法获得一株特异性好、效价高的产生抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。技术方案具体如下： 

一种制备抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体的方法，包括如下步骤： 

（1）制备免疫原， 

（2）免疫动物，进行细胞融合得杂交瘤细胞， 

（3）培养杂交瘤细胞，分离杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体， 

其特征在于：所述免疫原是氨基酸序列如Seq ID No.5所示的重组融合蛋白。 

所述筛选原是氨基酸序列如Seq ID No.6所示的重组融合蛋白。 

所述免疫动物指所述免疫原免疫Balb/c小鼠。 

所述免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行基础免疫，2周后，将免疫原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行追加免疫；2周后，再采用同样方式追加免疫一次。 

上述任一方法产生的杂交瘤细胞株。 

所述杂交瘤细胞株，名称为5-D3，保藏号为CCTCC C201330。 

一种抗LOC339524蛋白的单克隆抗体，由权利要求6所述的杂交瘤细胞株5-D3所分泌产生。 

所述的单克隆抗体的作为抗原抗体反应中识别LOC339524蛋白的抗体的用途。 

一种检测LOC339524蛋白的试剂盒，其特征在于，在采用酶联免疫原理检测LOC339524蛋白的试剂盒中，包被抗体采用权利要求7所述的单克隆抗体。 

本发明的第一贡献在于提供了一种制备抗LOC339524蛋白的单克隆抗体的方法，其要点在于：本发明设计并制备的免疫原及免疫方法能够有效制备出效价高、特异性好的单克隆抗体，具体如下：发明人从GENEBANK中获得人LOC339524蛋白的核苷酸编码序列（Seq ID No.1），通过分析选取LOC339524蛋白分子中第75-106位氨基酸的蛋白片段作为免疫单位，通过人工设计的连接蛋白基因序列将3段编码该免疫单位的基因序列连接起来获得LOC339524免疫蛋白基因序列（如Seq ID No.4所示）。本发明通过将Seq ID No.1及Seq ID No.4所示的基因分别克隆原核表达载体PET32a中构建原核表达重组质粒。将重组质粒稳化到BL21（DE3）中，表达人LOC339524重组蛋白及LOC339524免疫重组蛋白。本发明将LOC339524免疫重组蛋白作为免疫原免疫小鼠。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞。。 

本发明的第二个贡献在于，基于上述方法，获得了一株经验证，并进行专利保藏的杂交瘤细胞株，能分泌相应的LOC339524蛋白特异性单克隆抗体，经亚类鉴定均为IgG2b，单抗效价均在1：20万以上，亲和力分别为7.2×10¹⁰M^-1，特异性鉴定表明该株单克隆抗体均具有较高的特异性。 

保藏信息如下： 

分类命名：杂交瘤细胞株5-D3 

保藏号：CCTCC No:C201330 

保藏日期：2013年3月10日 

保藏单位：中国典型培养物保藏中心 

保藏单位地址：中国武汉武汉大学430072 

基于本发明的以上贡献，本发明还请求保护上述方法产生的单克隆抗体以及单克隆抗体的用途。 

附图说明

图1：逆转录获得cDNA为模板验证结果 

图2：PET32a-LOC339524（1-274）的诱导表达经SDS-PAGE电泳分析结果。 

图3：LOC339524的糖基化预测结果。 

图4：LOC339524的B细胞线性表位的预测结果。 

图5：构建免疫原蛋白表达载体PET32a-LOC339524（75-106）的验证。 

图6：连接成功的免疫原表达载体PET32a-LOC339524（75-106）重组质粒双酶切鉴定。 

图7：为PET32a-LOC339524（75-106）重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌进诱导表达及可溶性鉴定的SDS-PAGE电泳结果。 

图8：为PET32a-LOC339524（75-106）诱导蛋白的Ni亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳结果。 

图9：为单克隆抗体5D3腹水的Protein G纯化监测图。 

图10：为以ELISA法检测抗体的特异性及效价检测结果。 

其中鉴定抗原为梯度稀释的：PET32a-LOC339524（1-274）重组蛋白、PET32a-LOC339524（75-106）免疫重组蛋白、BSA和Trx-eppin融合蛋白。 

结果抗体5D3与LOC339524免疫原及检测原反应，但不与其他无关蛋白反应，抗体效价大于1:20万。 

图11：为用sigma抗体亚类试剂盒测定5-D3的亚类为IgG2b。 

图12：为单克隆抗体5-D3对人血清标本的Western-blot结果。 

图13：为单克隆抗体5-D3对人细胞株的荧光染色。 

图14：为单克隆抗体5-D3对人组织细胞的免疫组化染色。 

具体实施方式

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 

材料和来源 

实验动物：Balb/c小鼠购自第三军医大学实验动物中心（中国重庆）。 

细胞株、菌种及质粒：Sp2/0细胞株中国典型培养物保藏中心购买（CCTCC,中国上海），PET32a质粒、BL21(DE3)菌种为实验室保存。 

细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司，Lipo2000购自Novagen公司。 

酶及试剂盒：限制性内切酶NcoI及Xhol和质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，琼脂糖凝胶回 收试剂盒购自天根公司。 

其它试剂：HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。 

实施例1.筛选原制备—LOC339524全长重组蛋白的制备 

1）LOC339524编码序列全基因获得 

根据GeneBank提供的LOC339524基因序列（BC：126240.1），确定人LOC339524蛋白基因拟克隆序列，如SEQ ID NO:1所示。 

设计LOC339524全长引物：分别为SEQ ID NO:1和2所示 

SEQ ID NO.2：LOC339524-1：5’-CATGCCATGGCATCATTACAAGGGTGTGGGGTAC’； 

SEQ ID NO.3:LOC339524-2：5’-CCGCTCGAGCAAAAGGCAACTTCTGGGGAAG-3’ 

引物分别含酶切位点：LOC339524-1：NcoI；LOC339524-2：Xhol，由Invitrogen公司合成。 

通过Trizol Reagent法提取白细胞T-RNA，通过逆转录获得白细胞cDNA，通过PCR扩增获得人LOC339524，建立PCR体系，在不同的退火温度下进行PCR。 

取25μL PCR产物1%TAE电泳进行分析（图1）。使用北京天根的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）回收PCR产物。 

2）LOC339524重组质粒构建及酶切鉴定 

将PET32a载体及LOC339524PCR回收产物分别用NcoI及Xhol双酶切消化1h后，进行ＤＮＡ凝胶电泳，回收目的条带，用T4DNA连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，将菌液混匀后涂于含氨苄青霉素的LB培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基扩大培养过夜。 

用质粒提取试剂盒从培养细菌中提取质粒，用NcoI及Xhol双酶切后跑1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约960bp处可见特异性条带，表明PET32a质粒中已插入大小约为960bp的片段，连接产物PET32a-LOC339524重组质粒。 

3）重组质粒目的片断测序 

将PET32a-LOC339524重组质粒送往上海英骏公司测序，并应用Vector5.0工具将测序结果与GeneBank的LOC339524序列进行同源性分析。测序的结果显示，插入片段长度为960bp，与GeneBank中报道的LOC339524序列完全一致。 

4）LOC339524重组蛋白的表达及纯化 

经测序验证的PET32a-LOC339524（1-274）质粒转化入表达宿主BL21(DE3),经1.0mmol/LIPTG37℃诱导表达5h。电泳结果表明PET32a-LOC339524（1-274）在BL21中表达融合蛋白， 分子量为45KD左右，表达量占菌体总蛋白的15%以上。经鉴定表达蛋白破菌后部分存在上清中，为部分可溶性表达（图2）。 

将大量诱导的PET32a-LOC339524（1-274）表达菌超声破菌后收集培养上清，使用Ni亲和层析柱（Ni Sepharose Fast Flow）纯化重组蛋白。收集得到成品蛋白，然后分别取样行SDS-PAGE电泳。 

5）LOC339524重组蛋白浓度 

Lowry法测定重组蛋白浓度：按常规方法制备用于分析的标准曲线并测定标本浓度，多管计算平均值，测得浓度为0.6mg/ml。 

实施例2.生物信息学分析及免疫原的确定 

1）从GENBANK中查找LOC339524蛋白的氨基酸序列，该蛋白除信号肽由274个氨基酸残基组成。2）在线生物信息学糖基化预测分析LOC339524蛋白 

（http://www.cbs.dtu.dk/services/index.php）中第50个及150个氨基酸区域有明显糖基化（图3）。 

3）在线生物信息学及B细胞线性表位分析LOC339524蛋白 

（http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input）中的可能的暴露B细胞线性表位（图4）。 

综合以上分析选择第75-106位的32个氨基酸的编码序列 

(GATGCACAGTGCGCTTGCACGGTGGGGCCTAGTGCTAGCCCGAGGAGCGGACGGGGGCCGGGCAGGGGCGGTGGGCGCCGGCCTCGTCTCGGTGCT），通过蛋白Linker（GGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCC） 

将3段75-106个氨基酸连接成一个新序列，用以提高免疫原的免疫效果。 

实施例3.免疫原制备—LOC339524（75-106）重组蛋白的制备 

1）LOC339524免疫原表达载体的构建 

选取LOC339524分子中第75-106位32个氨基酸的编码序列 

GATGCACAGTGCGCTTGCACGGTGGGGCCTAGTGCTAGCCCGAGGAGCGGACGGGGGCCGGGCAGGGGCGGTGGGCGCCGGCCTCGTCTCGGTGCT， 

通过蛋白Linker（GGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCC）将3段编码含32个氨基酸（第75-106位）的氨基酸的核苷酸序列连接成一个新序列，在两端分别加入NcoI 及Xhol酶切位点得到编码免疫原的核苷酸序列Seq ID No.4委托合成。 

2）重组LOC339524免疫原的表达及纯化 

将合成的基因经NcoI及Xhol双酶切后与原核表达载体PET32a连接，构建原核表达重组质粒PET32a-LOC339524（75-106）（图5、6）。将构建的重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达，经IPTG诱导后表达具有Trx标签与人LOC339524（75-106）蛋白的融合蛋白。经SDS-PAGE电泳分析显示，表达的重组蛋白分子量约为35kD（图7）。为上清可溶性表达。采用镍柱亲和层析柱纯化LOC339524重组蛋白，纯化蛋白最终浓度约为2mg/mL（图8）。 

实施例4.抗LOC339524单克隆抗体的制备 

1）LOC339524单克隆抗体的制备 

将实施例3中制备得到的重组LOC339524（75-106）蛋白与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠，进行基础免疫（注射剂为乳化的免疫原，浓度为100μg/ml，注射剂量为100μg/只小鼠）。2周后，LOC339524（75-106）蛋白与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只Balb/c小鼠，进行追加免疫（注射剂为乳化的免疫原，浓度为100μg/ml，注射剂量为100μg/只小鼠）；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。 

融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0）以8：1混合，以聚乙二醇为融合剂。 

融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6%CO₂中在37℃培养。 

用ELISA法进行筛选。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆，并置于6%CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。 

采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行扩大培养。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡0.5mL，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×10⁵个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。 

2）LOC339524单克隆抗体的纯化 

收集腹水后对其进行纯化，具体方案为： 

配置抗体纯化所需buffer： 

Binding Buffer（A液)）100mmol/L磷酸钠，100mmol/L柠檬酸钠，pH7.0； 

Elution Buffer（B液）：100mmol/L磷酸钠，100mmol/L柠檬酸钠，pH3.0； 

Regeneration buffer（C液）：1mol/L Tris-HCl，pH9.0； 

将单抗腹水与A液以1：10的比例混合，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用Mabselest XtraHP柱接入AKTA Explorer primer蛋白纯化仪，A、B液充分平衡各自管道；将单抗腹水与A液1：1混合液样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰至事先加入少量C液的收集管中。调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻保存。经纯化的单克隆抗体中含有加入的Tris及甘氨酸成分，此类氨基酸成分对抗体标记、生物素化都有很大的影响，同时pH高于8.0对抗体的保存不利，易造成抗体失活及聚集。为此，我们采用透析袋透析法进一步对抗体进行置换缓冲及浓缩至一定浓度保存（图9）。 

3）纯化LOC339524单克隆抗体的鉴定 

以ELISA法检测抗体效价及特异性。 

以包被稀释液（0.1M NaCO3缓冲pH9.6）稀释鉴定抗原（PET32a-LOC339524（1-274）重组蛋白、PET32a-LOC339524（75-106）重组蛋白、BSA（小牛血清），Trx-eppin融合蛋白的浓度为5μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜。甩去包被液，以洗涤缓冲液（0.1%PBST）过洗一遍（即注满孔后即甩去）后重新注满洗液后浸泡3分钟，间歇摇动；甩去孔内液体，拍板，用纸吸干，重复3次。加入封闭液，加满各反应孔，37℃孵育2小时。抗体稀释液（1‰PBST）作阴性对照，将纯化的抗体依照1：1000，2倍倍比稀释，每孔100μl，37°C温育1h。弃待测样品以洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。加1‰PBST稀释的工作浓度的酶标二抗100μl/孔，37℃1小时。以1‰PBST洗涤缓冲液洗涤5次。每孔加入TMB底物液100μl，37℃避光显色，10-30分钟，每孔加入终止液（2M H₂SO₄）50μl。在波长450nm读取吸光度值，结果如图10所示，抗体与BSA（牛血清白蛋白），Trx-eppin融合蛋白不发生交叉反应。 

4）单克隆抗体5D3亚类测定 

采用美国Sigma公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(ELISA/Ouchterlony Double Diffusion,Stock No.ISO-2LOT114k4817)，操作按说明书进行。 

(1)包被酶标板：用包被液将PET32a-LOC339524（75-106）稀释为最佳工作浓度5ug/ml，每孔加100μl抗原液，每株加12孔，于4℃过夜，洗涤5遍，空干。 

(2)封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1h～1.5h，洗涤5遍，空干。 

(3)每孔加入100μl新鲜的杂交瘤细胞培养上清或稀释单抗，室温(20℃～25℃)静置1h，摇洗3min，共5次。 

(4)用抗体稀释液以1：2000稀释IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、IgA。 

(5)每孔加入100μl已稀释的抗体，每种抗体均加2孔，室温静置30min，摇洗3min，共5 次。 

(6)每孔加入100μl1：1000稀释的兔抗羊IgG抗体，室温静置15min，摇洗3min，共5次。(7)每孔加入100μl底物显色液，室温避光反应10min～15min。 

(8)每孔加入50μl终止液，观察结果，确定Ig亚类（图11）。 

5）单克隆抗体亲和力鉴定 

以Friguent法测定亲和力常数，将LOC339524抗原溶解在0.05mol/L碳酸缓冲液（pH9.6）中，终浓度为lμg/ml，以每孔100μ1的量将溶液加到96孔板中4℃包被过夜，以含1%BSA的PBS溶液对板进行封闭，将板干燥后在4℃保存备用。 

反应系统的建立：反应系统中抗LOC339524单抗的初始浓度为20ng/mL。 

LOC339524抗原的初始浓度从1000ng/ml（1250x l0mol/L）往下倍比稀释，形成8个/反应系统，在37℃反应l h；以每孔100ul将反应液以双孔加入到包被了LOC339524抗原的免疫反应板，37℃孵育l h后洗板5次；加入100μ1山羊抗鼠二抗每结合物溶液37℃反应l h，洗板5次，加入底物显色15min后加人终止液，测定D450值计算各个反应系统的抗原结合率推算亲和力常数，得出5-D3亲和力为7.2×10¹⁰M^-1。 

6）ELISA鉴定抗LOC339524单克隆抗体5-D3的效价 

将纯化的LOC339524抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入二抗，1:3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。结果可见，抗LOC339524单克隆抗体5-D3呈现肉眼可见的浓度梯度（图10）。 

7）抗LOC339524单克隆抗体5-D3的Western-blot鉴定 

取两名正常成人血清标本，用蛋白定量测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）测定血清样品蛋白浓度后，调整样品的蛋白浓度约为2μg/μl;配制5%浓缩胶和10%的分离胶，将蛋白质分子量Marker3μl、人血清样品A20μl、人血清样品B20μl上样后打开电泳仪（Bio-Rad公司）开始电泳（80V跑浓缩胶，120V跑分离胶）。电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。将0.22μm PVDF膜先用无水甲醇处理20s，再用ddH2O洗涤5min。然后再浸入Transfer Buffer10min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。转膜：从下至上依次排列：滤纸—PVDF膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪（Bio-Rad公司），100V恒压电转移1.5-2h（低温）。转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH2O清洗两遍，TBST洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每 次15min。加入以1∶500稀释的5-D3抗体，4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次，每次15min。加入已稀释到1：1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育2h。1×TBST洗涤3次，每次15min。用化学发光显色，显影定影后，在凝胶成象系统（Bio-Rad公司）上进行观察分析结果并摄像。结果在29KD处可见抗LOC339524单克隆抗体结合清晰条带（图12）。 

8)抗LOC339524单克隆抗体5-D3的免疫荧光鉴定： 

培养在盖玻片上的人Lo2肝细胞（上海科兴生物科技有限公司）和人A549肺癌细胞（上海研晶生物科技有限公司）传代培养3天后，倒掉细胞培养液,PBS洗1次;用冰甲醇固定细胞10min,然后PBS洗3次,5min/次;0.1%Triton通透15min,然后PBS洗3次,5min/次;5%山羊血清室温孵育30min；去掉多余的血清后滴加一抗5-D3（稀释度1：200），4℃过夜;室温复温,PBS洗3次,5min/次;滴加荧光二抗(罗丹明标记山羊抗小鼠1:200,北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育60min;PBS洗3次,5min/次;DAPI（1:1000,碧云天生物技术研究所）染3min,PBS洗1次;水溶性封片剂封片,激光共聚焦显微镜下观察。结果，Lo2肝细胞和A549肺癌细胞核有明显的红色荧光（图13）。 

9)抗LOC339524单克隆抗体5-D3的组化鉴定 

取人食道和小肠正常组织石蜡切片,60℃烤片30分钟，常规脱蜡水化；以0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)高压2分钟修复抗原，冷却至室温，磷酸盐缓冲液（PBS）洗5分钟×3次；用3％H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS洗5分钟×3次；滴加正常非免疫动物血清，室温10分钟；滴加一抗5-D3（1：200），4℃冰箱过夜;用0.1%Tween-20PBS洗5分钟×3次；滴加聚合物增强剂，室温孵育20分钟；用0.1%Tween-20PBS洗5分钟×3次；滴加酶标抗鼠/兔聚合物(福州迈新生物技术有限公司,KIT-9902)，室温孵育30分钟;DAB(福州迈新生物技术有限公司,DAB-0031)显色5分钟，蒸馏水洗终止显色;苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝;常规脱水透明，中性树胶封片,显微镜下观察。阴性对照片与检测片操作方法相同，一抗改用同种的IgG，其余的条件都是一样的。结果人食道和小肠正常组织细胞核和部分胞浆有明显着色，而阴性对照无着色（图14）。 

Claims (9)

1.一种制备抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

（1）制备免疫原，

（2）免疫动物，进行细胞融合得杂交瘤细胞，

（3）培养杂交瘤细胞，分离杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，

其特征在于：所述免疫原是氨基酸序列如Seq ID No.5所示的重组融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，所述筛选原是氨基酸序列如Seq ID No.6所示的重组融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，所述免疫动物指所述免疫原免疫Balb/c小鼠。

4.根据权利要求3所述的方法，所述免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行基础免疫，2周后，将免疫原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行追加免疫；2周后，再采用同样方式追加免疫一次。

5.权利要求1-4任一方法产生的杂交瘤细胞株。

6.权利要求5所述的所述杂交瘤细胞株，名称为5-D3，保藏号为CCTCC C201330。

7.一种抗LOC339524蛋白的单克隆抗体，由权利要求6所述的杂交瘤细胞株5-D3所分泌产生。

8.权利要求7所述的单克隆抗体的作为抗原抗体反应中识别LOC339524蛋白的抗体的用途。

9.一种检测LOC339524蛋白的试剂盒，其特征在于，在采用酶联免疫原理检测LOC339524蛋白的试剂盒中，包被抗体采用权利要求7所述的单克隆抗体。

Images