CN102539778A - 一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人TNF-α双抗夹心法检测试剂盒，主要包括抗TNF-α小鼠单克隆包被抗体，酶标TNF兔多克隆抗体以及重组表达的TNF-α蛋白标准品。本发明可以用于定性或定量检测样本中的TNF水平，优点是检验方法方便易行，检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本，可在TNF-α相关基础和临床研究中发挥重要作用。

Description

一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及酶联免疫分析技术领域中的一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒

背景技术

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)主要由单核细胞和巨噬细胞产生，包括膜结合前体蛋白和可溶性蛋白两种形式。膜结合前体蛋白包括35个氨基酸组成的胞内区，21个氨基酸的跨膜部分，以及177个氨基酸的胞外区共三个部分。可溶性TNF由膜结合前体蛋白胞外区酶切后释放，并形成具有生物学活性的同源三聚体，分子量为17kDa，每个亚单位包含157个氨基酸残基。TNF-α通过与细胞表面的TNFI型和II型受体结合发挥作用，是一种具有广泛生物学作用的细胞因子，如可以刺激巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌多种细胞因子和介质，促进炎症反应，引起组织损伤和中毒性休克；能够抑制病毒并对病毒感染的细胞具有杀伤作用；通过调控细胞增值，分化和凋亡，影响淋巴组织发育；调控造血干细胞的分化等。

临床研究发现，TNF由于能够上调炎症反应，因此是内毒素诱发的感染性休克的重要介导物质。同时，TNF又称恶液素，可诱发肿瘤病人发生恶液质，主要表现为进行性体重下降，食欲减退和顽固性机体消耗，导致肿瘤患者死亡率升高。另外，TNF还与多种临床疾病密切相关，如在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，血清中TNF可升高，而且与脑部病变的严重程度相关；人骨髓移植后，如果TNF水平升高，常有合并症发生；TNF可能还是急性肝坏死形成的重要因素。与TNF相关的其它疾病还包括哮喘、II型糖尿病以及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。

TNF、TNF抗体及TNF拮抗剂目前均有上市药品用于临床治疗。其中由于TNF在免疫反应中具有重要的作用，因此抗TNF抗体及TNF拮抗剂目前已经被批准广泛应用于自身免疫性疾病，如克罗恩病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎，效果明显。同时，在TNF的众多生物学功能中，它的抑瘤作用尤为受到关注，大量实验研究证实TNF对部分肿瘤细胞具有明显的细胞毒和抑制生长的作用，但由于天然TNF的毒副作用较大，因此严重限制了其临床应用，需要研发出高效低毒的改构重组TNF。

TNF-α作为免疫学研究的重要生物学指标之一，涉及感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的发生机理、预后判断和临床治疗，因此建立简单易行的定量方法，准确测定不同样本中的TNF水平对于基础及临床研究均具有重要的意义。酶联免疫法由于检测设备要求低，易于实现快速高通量，定量较为准确，因此是目前测定可溶性TNF的主要手段，本发明完全自主开发出了新型鼠抗TNF单克隆抗体和兔抗TNF多克隆抗体，采用双抗夹心法组成了TNF检测试剂盒，可以被广泛应用于TNF的基础及临床研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的人TNF-α双抗夹心法检测试剂盒。

本发明所提供的检测试剂盒包括特异性的TNF-α包被抗体，酶标TNF-α检测抗体以及人TNF-α蛋白标准品。

其中所述TNF-α包被抗体为单克隆抗体，所述酶标TNF-α检测抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体可以为鼠源或兔源抗体，所述多克隆抗体可以为兔源、羊源、马源抗体，所述包被用单克隆抗体优选为鼠单克隆抗体，其轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，所述酶标检测抗体优选为兔多克隆抗体。所述人TNF-α蛋白标准品为大肠杆菌表达的具有生物活性的重组人TNF-α蛋白。

所述单克隆抗体采用重组人TNF-α蛋白免疫动物，利用杂交瘤技术制备获得。所述多克隆抗体采用重组人TNF-α蛋白免疫动物，通过蛋白A纯化和抗原亲和纯化技术制备获得。酶标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记抗体获得。所述重组人TNF-α蛋白是经大肠杆菌表达后纯化获得。

本发明的技术方案为优选具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体与酶标多克隆抗体配对组合，将单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上，包被抗体可以特异性的捕获样本中的TNF-α以及TNF-α蛋白标准品，加入酶标检测抗体后，形成包被抗体、抗原、检测抗体复合物，相应底物显色后终止，读取样本吸光值，通过与标准曲线比较即可得出TNF-α的含量。

本发明采用双抗夹心法定量或定性检测样本中的TNF-α水平，检验方法方便易行，检测灵敏度和准确度高、特异性强、能够同时快速检测大批样本，制备抗体所需免疫原和筛选抗原以及试剂盒中的蛋白标准品全部采用具有生物活性的重组人TNF-α蛋白，试剂盒主要组成部分的抗体和蛋白标准品均为自主研发，因此成本低，可靠性强，预计将在TNF-α相关基础和临床研究中发挥重要作用。

附图说明

图1重组人TNF-α蛋白标准品电泳鉴定图

图2人TNF-α酶联免疫试剂盒检测标准曲线图

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述和说明。

实施例1酶联免疫试剂盒的组分制备

1.人TNF-α蛋白小鼠单克隆抗体的制备：

1)动物免疫

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以义翘神州生物技术有限公司生产的具有生物学活性的重组人TNF-α蛋白为免疫原，免疫剂量为50μg/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次，4天后取脾细胞进行融合。

2)细胞融合和克隆化

取免疫小鼠脾细胞，按4∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞混合，利用聚乙二醇法进行融合，获得杂交瘤细胞。采用重组人TNF-α蛋白作为包被抗原，用ELISA法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，直至得到稳定分泌TNF特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3)单克隆抗体的生产与纯化

选取杂交瘤细胞株，采用专业技术领域人员已知的技术方案，利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清，利用蛋白G进行亲和纯化，鉴定抗体纯度和浓度后分装，于-20℃低温保存。

4)单克隆抗体基因的获得及重组单克隆抗体的表达

收集培养的细胞，按照说明书(Invitrogen)加入TRIzol，提取总RNA，电泳检测RNA质量，UV测定浓度。按Roche反转录试剂盒操作说明反转为cDNA，-20℃冻存备用。采用专业技术领域人员已知的技术方案，参考文献(Ying Wet al.，BMC Bioinformatics.2006；7(Suppl 4)：S9)设计引物，以cDNA为模板分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。将轻链和重链片段TA到可用于真核细胞表达的pcDNA3T载体上，构建pcDNA3-anti-TNF-L和pcDNA3-anti-TNF-H表达载体。转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定。分析测序结果，获得正确的轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2。

取处于对数生长期的人胚肾细胞293细胞，离心传代到细胞密度为0.5×10⁶cells/ml，100ml的三角瓶中每瓶放30ml的培养物。放摇床中，100～130rpm，36.5℃，5％CO₂下培养。第二天进行转染，分别取轻链pcDNA3-anti-TNF-L和重链pcDNA3-anti-TNF-H载体DNA各15ug，混合稀释到1.5ml的150mM NaCl溶液中，混合均匀，取90ul的高效转染试剂Sinofection(北京义翘神州生物技术有限公司)稀释到1.5ml的150mM NaCl溶液中，混合均匀，然后将两中溶液混合均匀，配制成DNA-Sinofection的混合液。室温下孵育10～20min，然后逐滴加入要转染的细胞悬浮液中。转染后的细胞继续在100～130rpm，36.5℃，5％CO₂摇床中培养5天。

收获细胞培养液，3000g离心10分钟，取上清，0.45um微滤膜过滤。取装有1ml protein G Sepharose(GE)的层析柱，用20mM磷酸盐pH7.0缓冲液平衡层析柱，细胞培养液的上清以0.5ml/分钟流过层析柱，再用20mM磷酸盐pH7.0缓冲液洗至流出液的吸光度降至基线。用100mM甘氨酸pH3.0溶液洗脱抗体，洗脱液立即用1M Tris pH8.0溶液中和至中性。所得抗体-20℃保存。

2.人TNF-α蛋白兔多克隆抗体的制备：

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以重组人TNF-α蛋白为免疫原，免疫剂量为500μg/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫一次，共免疫四次，测定血清效价，心脏取血，经蛋白A和TNF-α蛋白抗原亲和纯化后得到纯化的多克隆抗体。

3.酶标抗体的制备：

1)称取5mg HRP溶解于0.5ml蒸馏水中。

2)于上液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。

3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM的醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。

4)加0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。

5)加0.2ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，于4℃放置2小时。

6)将上述液装入透析袋中，于pH7.4，0.15M的PBS透析，4℃过夜。

实施例2检测人TNF-α的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测人TNF-α的酶联免疫试剂盒，包含以下试剂：

1)小鼠抗人TNF-α单克隆包被抗体；

2)HRP标记的兔多克隆抗体；

3)重组人TNF-α蛋白标准品；

4)包被缓冲液为pH9.6，50mM的碳酸盐缓冲液；

5)封闭液是含有2％牛血清白蛋白的pH7.4，25mM的Tris缓冲液(TBS)；

6)样品稀释液为含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％吐温的TBS；

7)20X浓缩洗涤液为含有2％吐温的pH7.4，500mM的Tris缓冲液或含有2％吐温的pH7.4，200mM的磷酸盐缓冲液洗涤液；

8)显色液A和显色液B组成，显色液A为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为四甲基联苯；

9)终止液为2M的硫酸

实施例3检测人TNF-α的酶联免疫试剂盒的制备

1.利用正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体浓度

按照紫外分光光度计法，测定抗体及抗原的浓度。采用正交试验方法，将抗TNFα单克隆抗体稀释至浓度为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，重组TNF蛋白浓度稀释至1000pg/ml、100pg/ml、0pg/ml，HRP标记的抗TNF兔多克隆抗体稀释浓度至4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择抗体的包被浓度为2μg/ml，HRP标记抗体的工作浓度为1μg/ml。

2.试剂盒的批量制备

1)包被酶标板：用碳酸盐包被缓冲液(称取3.18g Na2CO3，5.86g NaHCO3，1g Na2N3，定容至2L的去离子水中，调pH值为9.6)，将抗TNF α抗体稀释至浓度为2μg/ml，100μL/孔，包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。

2)封闭：倒去未包被的液体，用含0.1％吐温的TBS(TBST)200μl/孔，洗板1次。加入300μl封闭液封闭非特异性结合位点，室温孵育1小时。TBST洗板2次，拍干后用真空包装机包装，4℃保存备用。

3)蛋白标准品的制备：用含0.5％BSA的PBS稀释重组的TNF蛋白，分装后冻干，4℃保存备用。

4)酶标抗体的制备：将亲和纯化后的抗TNF α多抗用HRP标记，加入50％甘油，分装后-20℃保存备用。

实施例4试剂盒主要参数的测定

对影响试剂盒质量的主要参数包括特异性、灵敏度和精密度进行测定，具体方法和结果如下：

1.试剂盒的特异性：将重组的人TNFRI、TNFRII和小鼠TNF稀释至50ng/ml，用人TNF酶联免疫检测试剂盒测试，试验结果证明，该试剂盒与50ng/ml的人TNFRI、TNFRII和小鼠TNF无交叉反应。

2.试剂盒的灵敏度

1)将TNFα蛋白用含0.1％BSA的TBST稀释成，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.6pg/ml 0pg/ml，100μl/孔加入到上述包被好的酶标板中，室温孵育2小时。TBST洗板3遍。

2)将HPR标记抗体用含0.5％BSA的TBST稀释成1μg/ml，100μl/孔加入反应孔中，室温孵育1小时。TBST洗板3遍。

3)加入200μl新鲜配置的TMB底物，室温避光显色20分钟，加入50μl 2M硫酸终止反应，酶标仪450nm波长的下读值。

4)实验结果显示，TNFα酶联免疫试剂盒的检测灵敏度能够达到15.6pg/ml，说明本试剂盒有较高的检测灵敏度。

3.试剂盒的精密度测定

1)重复性实验

选择6份含有不同TNFα浓度的血清样品，每个样品5个重复，平行在3块酶标板检测，各板分别设置标准品对照曲线，分别计算每个检测结果的变异系数(C.V)，平均变异系数为7.7％(见表1)。

表1 TNFαELISA试剂盒的重复性实验

2)中间精密度实验

选择6份含有不同TNFα浓度的血清样品，每个样品5个重复，重复检测10次，每次板内设置标准品对照曲线，计算同一份样品10次检测结果间的变异系数(C.V)，6份样品10次检测结果的变异系数平均为8.93％(见表2)。

表2TNFα试剂盒的中间精密度实验

实施例5TNF酶联免疫试剂盒的检测步骤

1.样品的收集、处理和保存

1)细胞培养上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物，将上清收集-20℃保存备用。

2)血清：静脉采血，使用不含热源和内毒素的试管收集血液后，4℃1000×g离心15分钟，避免溶血，收集血清，-20℃保存备用。

3)血浆：静脉采血，使用EDTA试管收集血液，4℃1000×g离心15分钟，去除细胞和颗粒，-20℃保存备用。

2.加样

1)取出包被好的酶标板及冻干的标准品，加1ml含0.5％BSA的TBST将标准品将其溶解。室温下放置20分钟。将标准品从1000pg/ml起，做2倍的倍比稀释，稀释6个点，将稀释液各取100μl按照下表的顺序加入96孔酶标板中。

2)取不同稀释度的待测血清或血浆样本，100μL/孔加入反应孔中。

3)室温孵育2小时。洗液200μL/孔洗板3次，拍干酶标板。

3.加入检测抗体

将HRP标记抗体用0.5％BSA的TBST稀释至2ug/ml，100μl/孔加入反应孔中。室温孵育1小时。洗液200μl/孔洗板3次，拍干酶标板。

4.显色

加入200μL新鲜配制的TMB显色液，室温反应20分钟。加入50μL 2M硫酸终止反应。酶标仪450nm波长的下读值。

5.标准曲线的建立

以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标建立对数曲线(图2)。将测得的样品OD值代入公式，算出样品中的TNF α含量。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变型。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变型，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种检测人肿瘤坏死因子的检测试剂盒，其特征在于，包括以识别人肿瘤坏死因子的单克隆抗体作为捕获抗体，以识别人肿瘤坏死因子的单克隆抗体或多克隆抗体作为检测抗体，以重组表达的人肿瘤坏死因子作为抗原标准品。

2.权利要求1所述的抗原标准品为哺乳细胞表达的重组人肿瘤坏死因子。

3.权利要求2所述的抗原标准品为293细胞表达的重组人肿瘤坏死因子。

4.权利要求1所述的捕获抗体为小鼠单克隆抗体或兔单克隆抗体。

5.权利要求4所述的小鼠单克隆抗体，其特征在于：轻链氨基酸序列为SEQ IDNO：1，重链氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

6.权利要求1所述的检测抗体为小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体。

7.权利要求1所述的捕获抗体是固定在微量滴定板或其他固相支持物上的。

8.权利要求1所述的捕获抗体的量为2～4ug/ml。

9.权利要求1所述的检测抗体的量为1～2ug/ml。

10.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括包被缓冲液、封闭液、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液、反应终止液。

11.权利要求10所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；所述封闭液是含有2％牛血清白蛋白的Tris缓冲液；所述浓缩洗涤液为含有2％吐温的Tris缓冲液或含有2％吐温的磷酸盐缓冲液；所述样品稀释液为含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％吐温的Tris缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，显色液A为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为四甲基联苯胺；所述终止液为2M的硫酸。

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