CN104987380A - 一种检测血浆炎性细胞因子自身抗体的组合物、试剂盒与方法 - Google Patents

一种检测血浆炎性细胞因子自身抗体的组合物、试剂盒与方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测血浆炎性细胞因子自身抗体(inflammatory cytokine autoantibodies,ICA)的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测血浆中ICA浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在检测血浆ICA中的应用。本发明利用与目标ICA完全互补的4种线性抗原多肽实现对血浆中ICA的定性、定量检测，可用于预测常见炎症相关疾病的风险。

Description

一种检测血浆炎性细胞因子自身抗体的组合物、试剂盒与方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及四种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测试剂盒，用以检测血浆中炎性细胞因子自身抗体(inflammatory cytokine autoantibodies,ICA)的浓度。
背景技术
炎症是人类及动物体内产生的一种防御性反应。其目的主要是清除侵入体内的各种病原微生物、非生物分子颗粒以及受到损伤和发生坏死的组织细胞。在临床上，炎症反应具有五大特点：红、肿、热、痛和机能障碍。然而，长期持续的慢性炎症反应会造成机体内组织和细胞损伤导致多种常见疾病的发生。例如，牙周炎、脉管炎、类风湿性关节炎、前列腺炎、动脉粥样硬化、炎性肠道疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、肥胖症、糖尿病、老年性痴呆及多种神经精神性疾病等。从免疫学角度来看，机体对炎症细胞因子的反应可能与相对应抗体的血浆水平相关。但现有技术中尚无可定量检测人血浆炎症细胞因子自然抗体的手段，因而开发一种测定特定炎症细胞因子相对应的多克隆自然抗体血浆浓度的检测手段意义重大。这既可利用流行病学统计方法确定人群中相应血浆抗体浓度的阳性或阴性阈值，也可以针对特定个体进行抗体血浆浓度水平变化的跟踪监测，进而对研究不同个体的抗体水平自然分布态势，或评估特定个体炎症相关疾病发生与发展都具有重要价值。相关检测结果有可能成为进一步研究如何有效地控制炎症反应相关疾病的一个基础参数，这将有利于预防各种炎症相关疾病的发生与发展。
刺激炎症反应的因素有多种，包括生物因素、物理因素和化学因素等。炎症反应的发生过程又涉及多种免疫细胞、细胞因子及微血管的参与。尽管炎症反应病理生理机制极为复杂，如能控制其中某些重要环节，就可有效地防止慢性炎症反应对机体造成的损伤。目前研究较多的领域是炎性细胞因子，主要包括白细胞介素1(interleukin 1α和β，IL1-α和IL1-β),白细胞介素6(interleukin 6，IL6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)。这些炎性细胞因子几乎参与所有炎症反应过程，且与多种疾病的发生密切相关。大量研究报道表明，炎性细胞因子可随年龄而持续性增高，参与某些老年性疾病的发生与发展，如老年性痴呆、骨质酥松及缺血性心脑血管疾病等，但导致炎性细胞因子随年龄增高的原因尚未完全阐明。
目前，临床已广泛应用抗炎性细胞因子的单克隆抗体药物治疗类风湿性关节炎。其中包括抗肿瘤坏死因子的单克隆抗体-阿达木单抗(Adalimumab或Humira)和英利昔单抗(Infliximab或Remicade)，抗白细胞介素-1β单克隆抗体-卡那单抗(Canakinumab或Ilaris)以及抗白细胞介素-6受体的单克隆抗体-托珠单抗(Actemra或Tocilizumab)。
发明内容
本发明人发现，炎性细胞因子水平与其自身抗体水平成负相关，这一发现说明，炎性细胞因子的自身抗体可能是机体内控制炎性细胞因子生理水平的重要因素。由于循环中抗体水平相对稳定，检测血浆中炎性细胞因子自身抗体水平可预测炎症相关疾病的发病风险。而且，血浆中炎性细胞因子自身抗体水平严重偏低或阴性者通过定期输入人丙种球蛋白或炎性细胞因子自身抗体富集血浆可能具有预防炎症相关疾病的作用。
根据上述发现，本发明的主要目的是提供一组用于检测人血浆中炎性细胞因子自身抗体(inflammatory cytokine autoantibodies,ICA)浓度的线性抗原多肽和由此制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血浆中ICA的方法。所述抗原多肽为IL1-α、IL1-β、IL6及TNF-α四种炎性细胞因子的抗原表位。这些抗原表位能够与人血浆中针对IL1-α、IL1-β、IL6及TNF-α的自身抗体发生特异性结合。
如本发明所定义的“炎性细胞因子自身抗体”或“ICA”是自然存在于人体内的，能识别一种或多种炎性细胞因子抗原表位的多克隆抗体混合物，在本发明中，“炎性细胞因子自身抗体”或“ICA”优选是能识别IL1-α、IL1-β、IL6及TNF-α四种炎性细胞因子抗原表位的多种抗体(单克隆抗体和/或多克隆抗体)的混合物。在本发明的特定实施方案中，所述“炎性细胞因子自身抗体”或“ICA”是指能识别选自SEQ ID NO:1-4的一个或多个多肽序列的抗体(单克隆抗体和/或多克隆抗体)的混合物。
本发明人利用免疫信息学方法和计算机软件，在IL1-α、IL1-β、IL6及TNF-α蛋白序列上进行人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位制图，甄别具有高度亲和力的序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。
已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇(即抗原表位)与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体(待检测抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇影响整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。
本发明根据IL1-α、IL1-β、IL6及TNF-α四种蛋白的生物学特性，针对这四种蛋白的多个抗原表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与 抗原性相关的各种参数，分别设计了四种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原表位多肽，其氨基酸序列见表1。
表1.检测人血浆中ICA的线性抗原表位多肽序列
IL1-α分子的全长氨基酸序列(271氨基酸)及线性抗原多肽区域
IL1-β分子的全长氨基酸序列(269氨基酸)及线性抗原多肽区域
IL6分子的全长氨基酸序列(212氨基酸)及线性抗原多肽区域
TNF-α分子的全长氨基酸序列(233氨基酸)及线性抗原多肽区域
经固相化学法合成上述4种抗原多肽，等比(重量体积浓度比)混合后制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测人血浆中ICA浓度。上述4种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4度(4℃)环境下可保存6个月以上。简言之，用4种抗原多肽的混合液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板,在45度(45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选地，4种合成抗原多肽均为纯度>95％的制品。
因此，根据本发明之一，提供了一种用于检测ICA的组合物，其中包含如下4种抗原多肽：
H-LLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGP-OH
H-LNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVF-OH
H-TCLVKIITGLL EFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQM-OH
H-LIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLS-OH。
在一些实施方案中，所述4种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>95％的化学合成制品。
在一些实施方案中，所述组合物中4种抗原多肽的比例为1:1:1:1(重量体积浓度比)。根据本发明的另一个方面，提供一种包含上述组合物的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒是用上述4种抗原多肽的混合液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板,干燥后用非金属医用包装材料真空密封包装而制得。
在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测待测样品中ICA浓度的方法，包括使所述组合物与待测样品中的ICA之间发生抗原抗体反应，并确定待测样品中的ICA水平。优选所述方法是在体外进行的，并且是非诊断目的的。
在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的4种抗原多肽等比混合，然后通过抗原抗体结合反应检测待测样品中的ICA水平。
利用抗原多肽通过抗原抗体结合反应检测或确定待测样品中的抗体水平的技术在本领域是众所周知的，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。在优选的实施方案中，在上述方法中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测或确定待测样品中的ICA水平。
在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。
在更优选的实施方案中，将上述组合物中的4种抗原多肽等浓度比混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4度过夜孵育，洗板，再对待测样品进行检测分析。
在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设4个阴性对照孔和4个阳性对照孔，用分析液将待测血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
在更优选的实施方案中，所述待测样品为个体血浆。
在更优选的实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：
1、操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5毫克/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。
2、操作开始时，首先将表1中所列4种抗原多肽的混合液用包被液稀释为10～50微克/ml的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间。
3、用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间。
4、然后按一下步骤分步加样和分析：
a、待测血浆样品设双复孔，另设4个阴性对照(NC)孔(参照物为不含抗IL1-α抗体、抗IL1-β抗体、抗IL6抗体和抗TNF-α抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映表1所述的4种多肽抗原在ICA阴性反应体系中的实验指标值)和4个阳性对照(PC)孔(参照物为人抗IL1-α抗体、人抗IL1-β抗体、人抗IL6抗体和人抗TNF-α抗体的混合物，藉此可反映表1所述的4种多肽抗原在ICA阳性反应体系中的实验指标值)。
b、用分析液将待测血浆样品1:100-200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间，每孔加100μl,20-25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍。
c、用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例 为1:10000～1:50000，每孔加100μl，20-25℃孵育1-2小时。
d、用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。
e、每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中ICA水平。
进行群体随机抽样分析时,可针对每一个体检测所得数据进行分析。在一些实施方案中，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中ICA的相对水平。PSR计算方法如下：
PSR＝[待测样品OD值–NC OD值]/[阳性标准品OD值–NC OD值]。
在本发明的另一个方面，提供上述组合物或试剂盒在体外地、非诊断目的地检测人血浆中ICA水平中的应用。
在优选的实施方案中，所检测的ICA是来自不同个体的人血浆。
基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的ICA检测技术，并在此基础上，进一步提供了对ICA半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为预测炎症相关疾病的发病风险和发展全新且副作用低的免疫治疗策略奠定重要基础。
本发明提供了一种简便的人血浆ICA检测手段，可用于辅助定性、定量检测ICA这类炎性细胞因子自身抗体，辅助量化测定不同个体血浆ICA水平，区分富含ICA(强阳性)和不含ICA(阴性)的血浆。富含ICA的血浆对炎症相关疾病具有防治作用。因此，本发明为血浆生物制品公司研发新产品和临床医学发展防治炎症相关疾病的新措施提供了重要工具。由于本发明的抗原多肽合成手段相对简单而成本适中，为下一步应 用富含ICA血浆防治炎症相关疾病和评估血浆ICA阴性个体的炎症相关疾病发病风险的临床实践奠定了重要基础。血浆生物制品公司可利用本发明技术辅助筛选血浆，制备富含ICA的丙种球蛋白，用于临床防治炎症相关疾病。此外，用本发明产品检测出的血浆ICA阴性个体，可能具有较高的炎症相关疾病发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，达到早期实施防治的目的。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。
具体实施方式
下面结合实施例:使用表1所述4种抗原多肽检测血浆中ICA水平,阐释本发明的原理。
1.样本收集：由广东省某血站提供132份正常成年人献血者的新鲜血浆样品。所述献血者均为临床体检确定的未曾患有严重炎症相关疾病的个体。操作前所有血浆样品均在4度(4℃)条件下保存，经核实保存时间未超过48小时。
2.样本检测：本实验所采用的表1中所列4种多肽抗原均由英国SEVERN BIOTECH有限公司合成，纯度为95％，具体操作步骤如下：
(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5.0mg/ml储存液,然后等体积混合、成为包被液并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。
(2)操作开始时，首先将4种抗原的混合液用包被液稀释为40微克/ml，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.3。
(3)然后用上述步骤(2)中获得的含4种抗原混合液的包被液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜(14-18小时)孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.3。
(4)然后分步加样分析如下：
a、待测血浆样品设双复孔，另设4个阴性对照(NC)孔(牛血清白蛋白,由Sigma-Aldrich公司提供)和4个阳性对照(PC)孔(人抗IL1-α抗体、人抗IL1-β抗体、人抗IL6抗体和人抗TNF-α抗体的混合物)。
b、用分析液将血浆1:150稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度pH值为7.3，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
c、以洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.3)洗板3遍后，用分析液(含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度pH值为7.3)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体稀释比例为1:25000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
d、以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度pH值为7.3)洗板3遍后，每孔加100μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室温避光25分钟。
e、每孔加50μl终止液12％硫酸溶液(12％H2SO4，)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤可以依据此结果针对每 一个体进行ICA的定量对比分析。
(5)针对前述检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中ICA水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–NC OD值]/[阳性标准品OD值–NC OD值]，应用百分位数法确定富含ICA(强阳性)血浆和不含ICA(阴性)血浆的阈值(cut-off)。
3.实验结果：本实施例随机抽取的132份正常成年人血浆样品中，其ICA浓度平均值为PSR＝0.78±0.42，变异系数为53.8％。应用百分位数法确定血浆ICA强阳性阈值为1.55，血浆ICA阴性阈值为0.25(表2所示)。
表2.某血站132份正常成年人血浆样品ICA浓度检测结果
由表2可知，在受检的132份正常成年人血浆样品中,ICA强阳性人数为6例(4.5％)，ICA阴性人数为4例(3％)。
4.结果评价：上述4种线性抗原多肽与血浆中ICA可发生特异性结合。即,这4种线性抗原多肽的氨基酸序列在空间结构和构型上与ICA蛋白是完全互补的。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测血浆ICA的组合物，其包含如下4种抗原多肽:
H-LLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGP-OH
H-LNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVF-OH
H-TCLVKIITGLL EFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQM-OH
H-LIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLS-OH。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中各抗原多肽的比例为1:1:1:1(重量体积浓度比)。
3.包含权利要求1或2的组合物的试剂盒。
4.根据权利要求3的试剂盒，其中将4种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装，制成试剂盒。
5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
6.一种体外的、非诊断目的的、使用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒检测待测样品中ICA浓度的方法，包括使所述组合物与待测样品中的ICA之间发生抗原抗体反应，并确定待测样品中的ICA水平。
7.根据权利要求6的方法，包括将所述4种抗原多肽等浓度比例混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，4度过夜孵育，洗板，再进行分步加样分析。
8.权利要求7所述的方法，其中所述分步加样分析包括将待测血浆样品双复孔检测，同时设4个阴性对照孔和4个阳性对照孔；用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液(12％硫酸溶液)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
9.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒在体外非诊断目的检测待测样品中ICA中的应用。
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