JP6423092B2 - 血漿免疫標識物−vegfr1自己抗体の検出に用いる抗原ポリペプチド及び応用 - Google Patents
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Description
1、操作する前に、各抗原ポリペプチドを65%〜70%の酢酸で5mg/mlの貯蔵液に溶解し、次いで等体積で混合して−20℃(誤差は2℃以内)の冷蔵庫に入れて保存する;
2、操作する際に、まず表1に示される3つの抗原ポリペプチドの等比混合液を被覆液で10〜50マイクログラム/mlに希釈し、該被覆液は塩化ナトリウム0.15MとEDTA10Mを含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、pHは7.0〜7.4である;
3、次いでマレイミド(Maleimide)で活性化される96ウエルプレート(Thermo Scientific、アメリカ)をコーティングし、4℃で一晩インビトロ培養した後に、洗浄液でプレートを3回洗浄し、前記洗浄液は0.15Mの塩化ナトリウムと0.1%TWEEN−20を含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、pHは7.0〜7.4である;
4、次いで複数回に分けてサンプルを添加し、次のとおり分析を行う:
a、検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、他に2つの陰性対照ウェル(NC、参照物は血漿VEFGR1抗体を含まない陰性対照液であり、それによりVEFGR1自己抗体を含まない陰性環境における表1に記載の本発明の3つの抗原ポリペプチドの指標値を得ることができ、目的は、本発明の組成物はVEFGR1自己抗体を含まない場合に、陽性結果を示さないことを証明することである)及び2つの陽性対照ウェル(PC、参照物はVEFGR1抗体標準品を含んだ陽性対照液であり、それによりVEFGR1抗体標準品の基準含有量レベルの場合の、表1に記載の本発明の3つの抗原ポリペプチドの指標値を得ることができ、目的は本発明の組成物はVEFGR1自己抗体を含んだ環境において陽性結果を示せることを証明し、さらに基準値として検出される血漿サンプルの指標値の比較に用いることである)を設置する;
b、分析液を用いて検出対象の血漿サンプルを1:200で希釈し、前記分析液は抗原コーティング液と同じであり、即ち塩化ナトリウム0.15MとEDTA10mMを含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、pHは7.0〜7.4であり、ウェルごとに100μl添加し、25℃で1−2時間インビトロ培養し、次いでプレートを3回洗浄する;
c、前記分析液を用いて上記bステップ(塩化ナトリウム0.15MとEDTA10mMを含んだリン酸塩緩衝液0.1M、pHは7.0〜7.4)に従って操作した後に、ペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトIgG(血漿中の検出対象物質は特異性抗体であるか否かを検出するために使用する)を希釈し、抗体の機能保証範囲は1:10000〜1:50000であり、ウェルごとに100μl添加し、25℃で1−2時間インビトロ培養する;
d、前記洗浄液(0.15Mの塩化ナトリウムと0.1%のTWEEN−20を含んだリン酸塩緩衝液0.1M、pHは7.0〜7.4)を用いてプレートを3回洗浄した後に、ウェルごとに100μlの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)及びペルオキシダーゼからなる混合液を添加し、室温避光20〜30分とする;
e、ウェルごとに反応停止液の10%硫酸溶液(10%H2SO4 )を50μl添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値(OD値)を検出し、検出波長は450nmであり、参照波長は630nmである。検出プロセスは反応停止液添加後の10分以内に終了させなければならない。これに基づき個体の血漿VEGFR1自己抗体レベルを定量的に分析することができる。
5、母集団からの無作為抽出を行う際に、各個体の検出データについて分析して、サンプル陽性率(Positive sample ratio、PSR)で血漿中のVEGFR1自己抗体の相対的レベルを確定することができる。PSRの算出方法は次のとおりである:PSR=[VEGFR1 OD値−NC OD値]/[PC OD値−NC OD値]。次いで正規化四分法(Q−Q)を用いてグラフを作成する。
1.サンプルの収集:健常成人121例(男性65例、女性56例)の血漿サンプルを収集する。前記血漿サンプルの提供者はいずれも臨床健診にていかなる腫瘍もかからないと確定した個体である。操作する前にすべての血漿サンプルをともに−80℃の条件下で保存し、確認したところ、保存期間は2年を超えておらず、繰り返し凍結融解された血漿サンプルがなかった(凍結融解回数は3回以下)ことが判明した。
(1)操作する前に、各抗原ポリペプチドを67%の酢酸で5.7mg/mlの貯蔵液に溶解し、次いで等体積で混合して−20℃の冷蔵庫に入れて保存する;
(2)操作する際に、まず3つの抗原ポリペプチドの混合液を被覆液で28.5マイクログラム/mlに希釈し、該被覆液は塩化ナトリウム0.15MとEDTA10Mを含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、測定したところ、pHは7.2である;
(3)次いでマレイミド(Maleimide)で活性化される96ウエルプレート(Thermo Scientific、アメリカ)をコーティングし、4℃で一晩16.5時間インビトロ培養した後に、洗浄液でプレートを3回洗浄し、前記洗浄液は0.15Mの塩化ナトリウムと0.1%TWEEN−20を含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、測定したところ、pHは7.3である;
(4)次いで複数回に分けてサンプルを添加し、次のとおり分析を行う:
a、検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、他に2つの陰性対照ウェル(NC、参照物はSigma−Aldrich社の提供するVEFGR1抗体を含まないヒト血漿陰性対照液)及び2つの陽性対照ウェル(PC、参照物は同じく、Sigma−Aldrich社の提供するヒト血漿VEFGR1抗体標準品の陽性対照液)を設置する;
b、分析液を用いて血漿を1:200で希釈し、前記分析液は抗原コーティング液と同じであり、塩化ナトリウム0.15MとEDTA10mMを含んだリン酸塩緩衝液0.1Mであり、測定したところ、pHは7.2である。ウェルごとに100μl添加し、25℃で1.5時間インビトロ培養する;
c、前記洗浄液(0.15Mの塩化ナトリウムと0.1%TWEEN−20を含んだリン酸塩緩衝液0.1M、測定したところ、pHは7.2)を用いてプレートを3回洗浄した後に、分析液を用いてペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトIgG(Sigma−Aldrich社提供)を希釈し、抗体の機能保証範囲は1:285000であり、ウェルごとに100μl添加し、25℃で1.5時間インビトロ培養する;
d、前記洗浄液(0.15Mの塩化ナトリウムと0.1%のTWEEN−20を含んだリン酸塩緩衝液0.1M、測定したところ、pHは7.2程度)を用いてプレートを3回洗浄した後に、ウェルごとに100μlの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)及びペルオキシダーゼからなる混合液(Life Technologies社提供)を添加し、室温避光25分とする;
e、ウェルごとに反応停止液の10%硫酸溶液(10%H2SO4 )を50μl添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値(OD値)を検出し、検出波長は450nmであり、参照波長は630nmである。反応停止液添加後の10分以内に検出を終了させる。
Claims (6)
- VEGFR1自己抗体の検出に用いる組成物であって、それは次の3つの抗原ポリペプチドを含む:
H−DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLE−OH;
H−DLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI−OH;
H−ESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAEL−OH。 - 請求項1に記載の組成物であって、その特徴は、組成物における各抗原ポリペプチドの比率は1:1:1であることにある。
- 個体におけるVEGFR1自己抗体を検出する方法であって、それは以下のことを含む:請求項1に記載の3つの抗原ポリペプチドを等比率で混合し、次いでマレイミド(Maleimide)で活性化される96ウエルプレートをコーティングし、4℃で一晩インビトロ培養し、プレートを洗浄し、次いで複数回に分けてサンプルを添加して分析を行う。
- 請求項3に記載の方法であって、それにおいて、複数回に分けてサンプルを添加して分析するプロセスは以下のことを含む:検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、また2つの陰性対照ウェルと2つの陽性対照ウェルを設置し、分析液を用いて血漿を希釈し、またペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトIgGを希釈し、プレートを洗浄し、ウェルごとに100μlの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)及びペルオキシダーゼからなる混合液を添加し、室温避光20〜30分とし、ウェルごとに反応停止液の10%硫酸溶液(10%H2SO4)を50μl添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値(OD値)を検出し、検出波長は450nmであり、参照波長は630nmである。
- VEGFR1自己抗体の検出における請求項1又は2に記載の組成物の使用。
- 請求項1又は2に記載の組成物で生産される検出キットのセットであって、その特徴は、3つの抗原ポリペプチドを医療用非金属包装材で真空個別包装した後に、1例ずつ取って検出キットのセットに組み合わせて使用に備える。
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