CN110133285B

CN110133285B - 一种检测抗肝癌天然抗体的检测试剂、试剂盒和方法

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Publication number: CN110133285B
Application number: CN201910384809.1A
Authority: CN
Inventors: 韩传伟; 王明民
Original assignee: Qingdao Hailanshen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Hailanshen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110133285A

Abstract

本发明涉及用于检测VEGFR1和FGFR2天然抗体的抗原多肽检测试剂、包含该检测试剂的试剂盒、使用该检测试剂或该试剂盒检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体浓度的方法、以及该检测试剂或该试剂盒在样品VEGFR1和FGFR2天然抗体检测中的应用。本发明利用与VEGFR1和FGFR2天然抗体完全互补的两种线性抗原多肽,实现对样品中抗肝癌天然抗体的定性、定量检测，可用于区分富含VEGFR1和FGFR2天然抗体的血浆和不含VEGFR1和FGFR2天然抗体的血浆。

Description

一种检测抗肝癌天然抗体的检测试剂、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及两种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测试剂盒，用于检测人血浆中抗肝癌天然抗体浓度。

背景技术

原发性肝癌(主要是肝细胞肝癌，Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球第5大常见的恶性肿瘤，居全部肿瘤死因的第3位，其5年存活率不足10％。据报道，全球每年有近80万新发肝癌病例，其中40万以上在中国。多数病人的发病因素与感染乙型或丙型肝炎有密切关系。原发性肝癌在中国癌症患者中的死亡率，男性占第二位，女性占第三位。尽管针对肝癌的治疗手段很多，但肝切除术仍然是治疗早中期肝癌的最主要手段。由于肝癌发病隐匿，发现症状时绝大多数病例已进入中晚期，仅有20％左右的病人具备根治性切除术的指征。然而，即便这些病人实施了所谓的根治性切除术，仍有50％以上的病人迅速出现复发和转移。目前已知，影响肝癌术后复发的主要因素包括三个方面：(1)来自病人的肿瘤方面因素。包括肿瘤大小、肿瘤数量、有无完整包膜、肿瘤病理分级、有无门静脉癌栓、有无远处转移等。针对这些因素的具体干预措施主要是早期诊断、早期治疗，降低术后复发率；(2)来自外科手术方面的因素。临床实践证明，提高外科医生个人和总体手术水平是力争降低肝癌术后复发率的有效方式；(3)术后预防复发的干预措施。通过生物学研究，寻找有效预防复发的手段或药物，是降低肝癌术后复发率最重要、也是最根本的解决途径。

近年来有关天然抗体研究报道显示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由B1淋巴细胞自动分泌产生,不需要特异性抗原刺激。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,并且充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏或阴性者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。建立检测天然抗癌抗体方法有助于研发肿瘤发生发展规律，找到有效治疗肿瘤的方法。

发明内容

本发明人经过近期的临床研究发现，健康人血浆中的抗血管内皮细胞生长因子1型受体(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)和抗成纤维细胞生长因子2型受体(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)天然抗体能够明显延长HCC病人的存活时间。本发明的主要目的是提供一组用于检测人血浆中抗VEGFR1和FGFR2天然抗体浓度的线性抗原多肽组合物，由此组合物制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽组合物或该试剂盒检测人血浆中抗肝癌天然抗体的方法。所述抗原多肽衍生自人VEGFR1和FGFR2蛋白序列。这些抗原多肽能够与人血浆中VEGFR1和FGFR2天然抗体发生特异性结合。

本发明所定义的“抗肝癌天然抗体”和“VEGFR1和FGFR2天然抗体”可以互换使用，指自然存在于健康人体内的VEGFR1和FGFR2天然抗体，它由人体自发产生，可能参与肝癌的发生。检测抗肝癌天然抗体具有提示肝癌发病风险价值，有利于进一步开发早期诊断和治疗肝癌的技术手段。在本发明的特定实施方案中，所述抗肝癌天然抗体是指能识别SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2中的一个或多个抗原多肽序列的天然抗体或天然抗体混合物。

已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。抗原与抗体在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高。因此，目标抗体(待检测样品中的抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇可代表整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。

本发明人利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析VEGFR1和FGFR2蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位和B细胞表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。所设计的两种抗原多肽在空间结构和构型上与目标抗体完全互补，它们在相应蛋白序列上的位置分别列于表1和表2中，其中所示的斜体和下划线区域代表抗原多肽氨基酸序列。

表1.人VEGFR1蛋白序列

表2.人FGFR2蛋白序列

这两种线性抗原多肽的氨基酸序列见表3。

表3.检测人血浆中VEGFR1和FGFR2天然抗体的线性抗原多肽序列

经固相化学法合成上述两抗原多肽，并用于制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测健康个体血浆中VEGFR1和FGFR2天然抗体浓度。上述两种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，在4℃环境下可保存6个月以上。简言之，可将这两种抗原多肽包被在马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板上，在40-45℃烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选两种多肽抗原均为纯度>90％的制品。

因此，根据本发明之一，提供一种用于检测VEGFR1和FGFR2天然抗体的检测试剂，其包括下述两种抗原多肽：

H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDK-OH(SEQ ID NO:1)；和

H-KMEKRLHAVPAANTVEFVCKVYSDAQPHI-OH(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方案中，所述检测试剂由所述两种抗原多肽组成。

在一些实施方案中，所述两种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>90％的化学合成制品。

在一些实施方案中，所述两种抗原多肽可以混合使用。在混合使用时，所述两种抗原多肽可以相等的重量比例混合。

根据本发明的另一个方面，提供一种包含上述检测试剂的试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括微量检测板，所述检测试剂被包被在微量检测板的孔内。

在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将包被有上述检测试剂的微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。在一些实施方案中，所述微量检测板是马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板。

在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。

在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。在一些实施方案中，阳性对照和/或阴性对照被包被在微量检测板上。

根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述检测试剂或上述试剂盒检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体的方法，优选该方法为体外的、非诊断目的的检测技术。

在一些实施方案中，所述方法包括使用上述检测试剂通过抗原抗体结合反应检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体浓度。

在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。

在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。

在一些实施方案中，所述方法的实施步骤包括：(1)使用包被有上述检测试剂的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板进行分步加样分析并用酶标仪检测每孔中的光密度值(OD)；(2)并用阳性样品比值(PSR)表示抗体水平。

在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将样品稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl 10-12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。

在更优选的实施方案中，上述步骤(1)包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl 10-12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。

其中，硫酸溶液的浓度是体积/体积比。

在更优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为单一个体血浆。

在一些实施方案中，个体血浆为来自单一健康个体的血浆。

在更优选的实施方案中，上述步骤(1)的具体操作步骤为：

1.操作前，将所使用的每种抗原多肽用67％乙酸溶解为5mg/ml储存液,然后放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。

2.操作开始时，首先将所使用的抗原多肽用包被液稀释为10～30μg/ml的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

3.用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(ThermoScientific,美国)，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

4.然后按以下步骤分步加样和分析：

a)待测样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为不含抗VEGFR1抗体和抗FGFR2抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映所使用的抗原多肽在VEGFR1和FGFR2天然抗体阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人VEGFR1和FGFR2抗体的等比混合物)，藉此可反映所使用的抗原多肽在VEGFR1和FGFR2天然抗体阳性反应体系中的实验指标值。

b)用分析液将待测样品1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍。

c)用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证样品中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:10000～1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时。

d)用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。

e)每孔加50μl 10-12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中VEGFR1和FGFR2天然抗体水平。

在一些实施方案中，在进行群体随机抽样分析时，可针对每一个体检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中VEGFR1和FGFR2天然抗体的相对水平。PSR计算方法如下：

PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。

在本发明的另一个方面，提供上述检测试剂或试剂盒在检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体中的应用。在一些实施方案中，所述应用是体外的、非诊断目的。

在本发明的另一个方面，还提供上述检测试剂在制备用于检测样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体的试剂中的应用。

在优选的实施方案中，所述样品为人血浆，更优选为单一个体血浆。

在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。

基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的VEGFR1和FGFR2天然抗体检测技术，并在此基础上，进一步提供了对样品中VEGFR1和FGFR2天然抗体的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为发展基于健康人血浆VEGFR1和FGFR2天然抗体的全新早期诊断肝癌和早期实施治疗策略奠定重要基础。

本发明提供了一种简便的VEGFR1和FGFR2天然抗体检测手段，可用于辅助定性、定量检测VEGFR1和FGFR2天然抗体水平，辅助量化测定不同个体的血浆VEGFR1和FGFR2天然抗体水平。区分富含VEGFR1和FGFR2天然抗体和不含VEGFR1和FGFR2天然抗体的血浆，富含VEGFR1和FGFR2天然抗体的血浆对肝癌具有治疗作用。因此，本发明为血浆生物制品公司研发新产品和临床医学发展防治肝癌的新措施提供了重要工具。由于本发明的抗原多肽合成手段相对简单而成本适中，为下一步应用富含VEGFR1和FGFR2天然抗体血浆防治肝癌和评估不含血浆VEGFR1和FGFR2天然抗体个体的肝癌发病风险的临床实践奠定了重要基础。血浆生物制品公司可利用本发明技术辅助筛选血浆，制备富含VEGFR1和FGFR2天然抗体的丙种球蛋白，用于临床防治肝癌；临床也可以直接给接受局部治疗后(如手术或放疗后)的早期肝癌病人输入利用本发明技术筛选的富含VEGFR1和FGFR2天然抗体的健康人血浆，提高其免疫监视功能，预防肝癌的复发和转移。

此外，VEGFR1和FGFR2天然抗体水平较低或者阴性个体可能具有较高的肝癌发病风险，具有预测肝癌发病风险和早期诊断VEGFR1和FGFR2肝癌的重要价值。用本发明产品检测出的血浆VEGFR1和FGFR2天然抗体阴性个体，可能具有较高的肝癌发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，达到早期发现肝癌和早期实施治疗的目的。本发明的VEGFR1和FGFR2天然抗体检测方法可用于肝癌生物学研究，探讨肝癌发生机制、瘤细胞免疫“逃逸”机制及免疫监视机制等。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

实施例

1、筛查富含抗肝癌天然抗体的健康人血浆

依据《中华人民共和国献血法》及国家卫生行政部门的相关规定，每个献血者每次可自愿献血300毫升左右，在无菌条件下处理可获得150-200毫升血浆。在山东省某血站提供的健康献血者血浆样品中检测富含抗肝癌天然抗体水平。本实验所采用的两条多肽抗原(见表3)系应用化学固相合成，纯度为95％。具体进行如下操作步骤：

(1)操作前，将表3所示的VEGFR1和FGFR2衍生的两种抗原多肽用67％乙酸分别溶解为5.7mg/ml储存液,然后等质量体积混合，并放置-20℃冰箱中保存。

(2)操作开始时，首先用包被液将两种抗原混合体稀释为20μg/ml，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2。

(3)然后将两种抗原多肽包被在马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔检测板(Thermo Scientific,美国)上，每孔加100μl，在4℃过夜孵育15小时后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2。

(4)然后分步加样分析如下：

a)用每种抗原检测待测血浆样本时均设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为牛血清白蛋白，由Sigma-Aldrich公司提供)和2个阳性对照(PC)孔，参照物为抗人VEGFR1抗体和抗人FGFR2抗体的等比混合物(由Sigma-Aldrich公司提供)。

b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。

c)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体工作浓度为1:30000，每孔加100μl，室温孵育1.5小时。

d)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度PH值为7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室温避光孵育25分钟。

e)每孔加50μl 12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行VEGFR1和FGFR2天然IgG抗体的定量对比分析。

3.定义富含抗肝癌天然抗体血浆IgG水平阳性阈值

针对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(Positive sampleratio，PSR)判定血浆中富含VEGFR1和FGFR2天然IgG水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。用PSR平均值和标准差表示血浆中的抗体浓度。本方法判定血浆中VEGFR1和FGFR2天然IgG水平阳性样品的阈值定义为PSR平均值加两个标准差，高于该阈值的血浆IgG抗体水平定义为富含抗肝癌天然抗体血浆的阳性样品。将获得的富含抗肝癌天然抗体血浆用标准储存袋(每袋150-200毫升血浆)包装，在负80度(-80℃)冰箱中保存不超过6个月。

4.临床应用实例

在获得某医院医学研究伦理委员会批准后，共招募40例临床诊断为B期原发性肝癌患者作为研究对象，随机分为治疗和对照两组，每组20例。治疗组病人按临床输血浆规则，每次输注上述步骤3中获得的富含抗肝癌天然抗体血浆700-900毫升(4-5袋)，每三个月重复治疗一次，同时进行疗效评估。对照组仅给于常规介入和射频消融术治疗。整个研究时间为3年。如表4所示，Kaplan-Meier生存曲线分析表明，对照组的中位数生存为20个月，而治疗组为32个月。经COX回归分析及卡方(X²)检验，两组之间差别高度显著(X²＝11.9，P＝0.008)。

表4..Kaplan-Meier生存曲线分析

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛海兰深生物科技有限公司

<120> 一种检测抗肝癌天然抗体的检测试剂、试剂盒和方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 1

Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val

1 5 10 15

Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys

20 25 30

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 2

Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Glu

1 5 10 15

Phe Val Cys Lys Val Tyr Ser Asp Ala Gln Pro His Ile

20 25

Claims

1.用于检测抗肝癌天然抗体的检测试剂，包括下述两种抗原多肽:

H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDK-OH；和

H-KMEKRLHAVPAANTVEFVCKVYSDAQPHI-OH。

2.根据权利要求1的检测试剂，其中，两种抗原多肽被混合在一起。

3.根据权利要求2的检测试剂，其中两种抗原多肽混合的质量体积浓度比为1:1。

4.包含权利要求1-3任一项的检测试剂的试剂盒。

5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述试剂盒包括微量检测板，所述检测试剂被包被在微量检测板的孔内。

6.一种体外的非诊断目的的抗肝癌天然抗体检测方法，包括使用权利要求1或2所述的检测试剂或权利要求4或5所述的试剂盒检测样品中的抗肝癌天然抗体。

7.根据权利要求6的方法，包括以下步骤：

(1)使用包被有权利要求1的检测试剂的马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板进行分步加样分析；

(2)用酶标仪检测每孔中的光密度值(OD)，并用阳性样品比值(PSR)表示抗体水平。

8.权利要求1-3任一项所述的检测试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在体外非诊断目的检测样品中抗肝癌天然抗体中的应用。

9.权利要求1-3任一项所述的检测试剂在制备用于检测样品中抗肝癌天然抗体的试剂中的应用。

10.权利要求1-3任一项所述的检测试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在筛选富含抗肝癌天然抗体的人血浆中的应用。