ES2351938T3

ES2351938T3 - Reactivos y métodos para su uso en el diagnóstico, clasificación y terapia del cáncer .

Info

Publication number: ES2351938T3
Application number: ES06784318T
Authority: ES
Inventors: Douglas T. Ross; Brian Z. Ring; Robert S. Seitz
Original assignee: Applied Genomics Inc
Current assignee: Applied Genomics Inc
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2011-02-14
Anticipated expiration: 2026-02-17
Also published as: EP1856535A2; US20060003391A1; AU2006255766A1; CA2598170C; EP1856535B1; WO2006132683A3; ATE479898T1; AU2006255766B2; WO2006132683A2; CA2598170A1; DE602006016567D1

Abstract

Método de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama ER+/nódulo- con un pronóstico desconocido, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto una muestra de tumor de mama obtenida del paciente con un panel de anticuerpos cuya unión se ha correlacionado con un pronóstico particular; y valorar el pronóstico probable del paciente en base a la unión del panel con la muestra del tumor, donde el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos TP53, NDRG1, HTF9C y CEACAM5.

Description

Antecedentes de la invención [0001] Un reto destacado del tratamiento del cáncer es la selección de las pautas terapéuticas que maximizan la eficacia y minimizan la toxicidad de un paciente determinado. Un reto relacionado se refiere al intento de proporcionar una información

5 precisa de predicción, de pronóstico y diagnóstico. Actualmente, los tumores se clasifican generalmente mediante el sistema de tumor-nódulo-metástasis (TNM). Este sistema, que usa el tamaño del tumor, la presencia o la ausencia de tumor en nódulos linfáticos regionales y la presencia o la ausencia de metástasis distante, para asignar una etapa al tumor se describe en el AJCC Cancer Staging Manual, Lippincott, 5th ed.,

10 pp. 171-180 (1997). La etapa asignada se usa como una base para la selección de terapia apropiada y para fines de pronóstico. Además de los parámetros de TNM, se usa la apariencia morfológica para clasificar adicionalmente los tumores en tipos de tumores y, de ese modo, ayudar en la selección de la terapia apropiada. Sin embargo, esta estrategia tiene serias limitaciones. Los tumores con una apariencia

15 histopatológica similar pueden mostrar una variabilidad significativa en términos de evolución clínica y respuesta a la terapia. Por ejemplo, algunos tumores progresan rápidamente, mientras que otros no. Algunos tumores responden fácilmente a la terapia hormonal o quimioterapia mientras otros son resistentes. [0002] Los ensayos de marcadores de superficie celular, por ejemplo, usando

20 inmunohistoquímica, han proporcionado medios para dividir ciertos tipos de tumores en subclases. Por ejemplo, un factor considerado en las decisiones sobre el pronóstico y tratamiento del cáncer de mama es la presencia o ausencia del receptor de estrógeno (ER) en muestras de tumor. Los cánceres de mama positivos en ER responden habitualmente mucho más fácilmente a terapias hormonales, tales como tamoxifeno,

25 que actúa como un antiestrógeno en tejidos de mama, que tumores negativos en ER. Aunque útiles, estos análisis predicen sólo en parte el comportamiento clínico de los tumores de mama. Existe diversidad de fenotipo presente en cánceres que los métodos de diagnóstico actuales no son capaces de detectar. Como consecuencia, aun existe mucha controversia sobre como estratificar los pacientes entre tratamientos potenciales

30 para optimizar el resultado (por ejemplo, para cáncer de mama, véase “NIH Consensus Development Conference Statement: Adjuvant Therapy for Breast Cancer, November 1-3, 2000”, J.Nat. Cancer Inst. Monographs, 30:5-15, 2001 y Di Leo et al., Int. J.Clin. Oncol. 7:245-253, 2002). [0003] Existe claramente una necesidad de métodos y reactivos mejorados para

35 clasificar tumores. Una vez estos métodos y reactivos están disponibles, se pueden

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realizar estudios clínicos que permitirán la identificación de clases y subclases de pacientes que tienen diferentes pronósticos y/o respuestas a la terapia. Dichos métodos de pronóstico permitirán elecciones de base más racional gobernando la agresividad de intervenciones terapéuticas; dichos métodos predicativos también serán útiles para dirigir pacientes en protocolos de tratamiento apropiado. WO2005/008213 proporciona un test cuantitativo no invasivo para la determinación del pronóstico en pacientes con cáncer. El test depende de las medidas de los niveles en el tumor de ciertos ARN mensajero (ARNm). Estos niveles de ARNm se insertan en una fórmula polinomial (algoritmo) que produce una puntuación numérica de la reaparición, lo que indica el riesgo de reaparición. Descripción resumida de la invención [0004] La presente invención abarca la realización de que se pueden usar paneles particulares de agentes de unión (“parejas de interacción”) a muestras de tumor para proporcionar nuevas visiones en la biología del cáncer. Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y reactivos para tumores, tal como se definen en las reivindicaciones, para predecir el resultado final en base a la clase o subclase. [0005] Se describen métodos para identificar paneles adecuados de parejas de interacción (por ejemplo, sin limitación de anticuerpos), cuya unión se correlaciona con cualquiera de una variedad de aspectos deseados, tales como la clase o subclase del tumor, el origen del tumor (por ejemplo., tumor primario versus metástasis), pronóstico probable, respuesta a la terapia, etc. Especialmente, se seleccionan colecciones de parejas de interacción y se valora su actividad en la unión a una variedad de tumores diferentes, tejidos normales y/o líneas celulares. Se recogen datos para múltiples parejas de interacción para múltiples muestras y se valoran las correlaciones con características interesantes o deseables. Tal como se describe aquí, la detección de parejas de interacción individuales o paneles de las mismas que se unen diferencialmente con tumores diferentes proporciona nuevos métodos, tal como se define en las reivindicaciones, de uso en el pronóstico y selección de tratamiento del cáncer y selección de tratamiento. [0006] Tal como se describe en detalle más adelante, la presente invención emplea métodos para agrupar las parejas de interacción dentro de un panel en subconjuntos determinando sus patrones de unión a lo largo de una colección de muestras obtenidas de tejidos tumorales, tejidos normales y/o líneas celulares diferentes. La presente invención agrupa también las muestras de tumor en clases o subclases basándose en similitudes en su unión a un panel de parejas de interacción. Esta estrategia de

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agrupación bidimensional permite la asociación de clases particulares de tumores con subconjuntos particulares de parejas de interacción que, por ejemplo, muestran una unión relativamente alta con tumores de la misma clase. La correlación con la información clínica indica que las clases de tumor tienen una significancia clínica en términos de pronóstico o respuesta a quimioterapia. Breve descripción de los apéndices A-F [0007] Esta solicitud de patente se refiere a un material que comprende tablas y datos presentados como apéndices. [0008] El Apéndice A es una tabla que indica los anticuerpos incluidos en los paneles de mama, pulmón y/o colon que se discuten en los Ejemplos. La tabla incluye la ID del anticuerpo, nombre del gen parental, ID del LocusLink NCBI, ID del UniGene, alias conocidos para el gen parental, péptidos que se usaron en la preparación de anticuerpos, título de anticuerpo y una conexión con cualquiera imagen IHC relevante del Apéndice B. Usando el nombre de gen parental, la ID del LocusLink NCBI, la ID UniGene, y/o alias conocidos para el gen parental, un experto en la materia puede obtener fácilmente las secuencias de nucleótidos (y correspondientes aminoácidos) para todas y cada uno de los genes parentales que se indican en el Apéndice A de una base de datos pública (por ejemplo, GenBank, Swiss-Prot o cualquiera derivada de ellas). Los anticuerpos con ID AGI que empiezan con s5 o s6 se obtuvieron de fuentes comerciales indicadas. La tercera y la cuarta columnas del Apéndice A indican si los anticuerpos del panel de clasificación de cáncer de mama se identificaron mediante tinción con la cohorte de mama rusa (ejemplo 2) y/o la cohorte de mama HH (Ejemplo 3). La quinta y la sexta columnas indican si los anticuerpos del panel de clasificación de cáncer de pulmón se identificaron mediante tinción con la cohorte de pulmón rusa (Ejemplo 4) y/o con la cohorte de pulmón HH (Ejemplo 5). La séptima columna indica los anticuerpos del panel de clasificación de cáncer de colon. Todos se identificaron mediante tinción con la cohorte de colon rusa (Ejemplo 6). [0009] El Apéndice B incluye imágenes IHC de mama, imágenes IHC de colon e imágenes IHC de pulmón. Las imágenes IHC del Apéndice B se refieren a la columna derecha del Apéndice A. La copia auténtica del Apéndice B no está incluida en esta continuation-in-part, pero puede encontrarse en el caso parental U.S. No. de Serie 10/915.059, presentada el 10 de Agosto de 2004 (publicada como US 2005/0112622 el 26 de Mayo de 2005). [0010] El Apéndice C es una tabla que indica los anticuerpos de ejemplo cuyos patrones de unión se ha observado que se correlacionan con el pronóstico de tumor en

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pacientes con cáncer de mama. Los resultados están agrupados en cuatro categorías que se han reconocido clínicamente por tener importancia: todos los pacientes, pacientes ER+, pacientes ER-y pacientes negativos de metástasis de ER+/nódulo linfático (ER+/nódulo-). Los métodos de puntuación 1-3 utilizan los esquemas siguientes: método 1 (0 = negativo; 1 = débil; 2 = intenso); método 2 (0 = negativo; 1 = débil o intenso); y método 3 (0 = negativo o débil; 1 = intenso). Esta tabla se preparó usando muestras de la cohorte de mama HH tal como se describe en el Ejemplo 10. [0011] El Apéndice D es una tabla que indica los anticuerpos de ejemplo cuyos patrones de unión se ha observado que se correlacionan con el pronóstico de tumor en pacientes con cáncer de pulmón. Los resultados están agrupados en tres categorías que se han reconocido clínicamente por tener importancia: todos los pacientes, pacientes con adenocarcinoma y pacientes con carcinoma de célula escamosa. Los métodos de puntuación 1-3 utilizan los esquemas siguientes: método 1 (0 = negativo; 1 = débil; 2 = intenso); método 2 (0 = negativo; 1 = débil o intenso); y método 3 (0 = negativo o débil; 1 = intenso). [0012] El Apéndice E es una tabla que indica los anticuerpos de ejemplo cuyos patrones de unión se ha observado que se correlacionan con el pronóstico de tumor en pacientes con cáncer de mama. Los resultados están agrupados en cuatro categorías que se han reconocido clínicamente por tener importancia: todos los pacientes, pacientes ER+, pacientes ER-, y pacientes negativos de metástasis de ER+/nódulo linfático (ER+/nódulo-). Los métodos de puntuación 1-3 utilizan los esquemas siguientes: método 1 (0 = negativo; 1 = débil; 2 = intenso); método 2 (0 = negativo; 1 = débil o intenso); y método 3 (0 = negativo o débil; 1 = intenso). Esta tabla se preparó usando muestras de la cohorte de mama HH tal como se describe en el Ejemplo 12. El Apéndice E se diferencia del Apéndice C en análisis adicionales. [0013] El Apéndice F es una tabla que indica los anticuerpos de ejemplo cuyos patrones de unión se ha observado que se correlacionan con el pronóstico de tumor en pacientes con cáncer de pulmón. Los resultados están agrupados en dos categorías que se han reconocido clínicamente por tener importancia: todos los pacientes y pacientes con adenocarcinoma. Los métodos de puntuación 1-3 utilizan los esquemas siguientes: método 1 (0 = negativo; 1 = débil; 2 = intenso); método 2 (0 = negativo; 1 = débil o intenso); y método 3 (0 = negativo o débil; 1 = intenso). Esta tabla se preparó usando muestras de las cohortes de pulmón UAB y HH tal como se describe en el Ejemplo 13. Se muestran los valores p y las proporciones de riesgo que se obtuvieron con cada cohorte. Los anticuerpos incluidos tienen un valor p pronóstico de menos de 0,2 en

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ambas cohortes. Descripción breve de los Dibujos [0014] La Figura 1 muestra la valoración por inmunohistoquímica semicuantitativa (IHC) de un cohorte de 298 pacientes con cáncer de mama con un panel de clasificación de cáncer de mama de la invención. El panel se preparó tal como se describe en el Ejemplo 2 – los anticuerpos se usaron como parejas de interacción. Los pacientes (filas) se clasificaron usando la agrupación de k-medias, mientras que los anticuerpos (columnas) se organizaron usando la agrupación jerárquica. Gris oscuro representa tinción positiva intensa, negro representa tinción positiva leve, mientras gris claro representa la ausencia de tinción y gris normal representa una falta de información. Tal como se muestra en la Figura, nueve grupos de pacientes se identificaron mediante su patrón de consenso de tinción con el panel de anticuerpos. [0015] La Figura 2 muestra la valoración por inmunohistoquímica semicuantitativa (IHC) de un cohorte de 387 pacientes con cáncer de pulmón con un panel de clasificación de cáncer de pulmón de la invención. El panel se preparó tal como se describe en el Ejemplo 4 – los anticuerpos se usaron como parejas de interacción. Los pacientes (filas) se clasificaron usando la agrupación de k-medias, mientras que los anticuerpos (columnas) se organizaron usando la agrupación jerárquica. Gris oscuro representa tinción positiva intensa, negro representa tinción positiva leve, mientras gris claro representa la ausencia de tinción y gris normal representa una falta de información. Tal como se muestra en la Figura, ocho grupos de pacientes se identificaron mediante su patrón de consenso de tinción con el panel de anticuerpos. [0016] La Figura 3 muestra la valoración por inmunohistoquímica semicuantitativa (IHC) de un cohorte de 359 pacientes con cáncer de colon con un panel de clasificación de cáncer de colon de la invención. El panel se preparó tal como se describe en el Ejemplo 6 – los anticuerpos se usaron como parejas de interacción. Los pacientes (filas) se clasificaron usando la agrupación de k-medias, mientras que los anticuerpos (columnas) se organizaron usando la agrupación jerárquica. Gris oscuro representa tinción positiva intensa, negro representa tinción positiva leve, mientras gris claro representa la ausencia de tinción y gris normal representa una falta de información. Tal como se muestra en la Figura, siete grupos de pacientes se identificaron mediante su patrón de consenso de tinción con el panel de anticuerpos. [0017] La Figura 4 muestra curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER+ después de la clasificación de pronóstico en base a (A) tinción con un panel de anticuerpos de pronóstico del Apéndice C y (B) el Nottingham Prognostic Index (NPI).

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En cada caso los pacientes se colocaron en uno de tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “bueno” (curva superior). [0018] La Figura 5 muestra curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER+/nódulo-después de la clasificación de pronóstico en base a (A) tinción con un panel de anticuerpos de pronóstico del Apéndice C y (B) el Nottingham Prognostic Index (NPI). En cada caso los pacientes se colocaron en uno de tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “bueno” (curva superior). Cabe indicar que bajo el esquema de NPI, los pacientes nunca se clasifican con un pronóstico “malo”. Por esta razón, la Figura 5B solo incluye curvas para los pacientes con un pronóstico “bueno” o “moderado”. [0019] La figura 6 muestra las curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER+/nódulo -después de la clasificación del pronóstico en base a la tinción con el panel de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 5. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0020] La figura 7 muestra las curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER-después de la clasificación del pronóstico en base a la tinción con el panel de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 6. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0021] La figura 8 muestra las curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER-después de la clasificación del pronóstico en base a la tinción con el panel de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 7. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0022] La figura 9 muestra un dendrograma para los tres paneles de la Tabla 8 que se pueden utilizar para la clasificación del pronóstico de pacientes ER+/nódulo-. Si un paciente da positivo para la tinción en un nódulo determinado, su árbol de decisión de pronóstico sigue la rama marcada con un “+”. En cambio, si un paciente es negativo para la tinción en un nódulo determinado, su árbol de decisión de pronóstico sigue la rama marcada con un “-”. Esto se realiza hasta que se alcanza un extremo. [0023]La figura 10 muestra las curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes ER+/nódulo-después de la clasificación del pronóstico en base a la tinción con el panel de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 8. En cada caso, los

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pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0024] La figura 11 muestra un dendrograma para los tres paneles de la Tabla 9 que se pueden utilizar para la clasificación del pronóstico de pacientes ER+ y ER-. Si un paciente da positivo para la tinción en un nódulo determinado, su árbol de decisión de pronóstico sigue la rama marcada con un “+”. En cambio, si un paciente es negativo para la tinción en un nódulo determinado, su árbol de decisión de pronóstico sigue la rama marcada con un “-”. Esto se realiza hasta que se alcanza un extremo. [0025] La figura 12 muestra las curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes combinados de cáncer de pulmón (cohorte HH) después de la clasificación del pronóstico con los paneles de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de las Tablas 10 y

11. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0026] La figura 13 muestra las curvas que se obtuvieron cuando los pacientes en los grupos “moderado” y malo” de la figura 12 se combinaron en un único grupo de pronóstico “malo”. [0027] La figura 14 muestra curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes combinados de cáncer de pulmón (cohorte UAB) después de la clasificación del pronóstico con los paneles de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de las Tablas 10 y

11. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0028] La figura 15 muestra las curvas que se obtuvieron cuando los pacientes en los grupos “moderado” y malo” de la figura 14 se combinaron en un único grupo de pronóstico “malo”. [0029] La figura 16 muestra curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes de adenocarcinoma (cohorte UAB) después de la clasificación del pronóstico con los paneles de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 10. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico, concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0030] La figura 17 muestra curvas Kaplan-Meier que se generaron para pacientes de carcinoma de células escamosas (cohorte UAB) después de la clasificación del pronóstico con los paneles de anticuerpos de pronóstico de ejemplo de la Tabla 11. En cada caso, los pacientes se colocaron en uno de los tres grupos de pronóstico,

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concretamente “malo” (curva inferior), “moderado” (curva central) y “buena” (curva superior). [0031] La figura 18 muestra las proporciones relativas de diferentes morfologías de cáncer de pulmón diferentes que se identificaron en siete subclases de pacientes en la cohorte de pulmón HH. Definiciones [0032] Asociado – cuando un pareja de interacción y un marcador tumoral están físicamente “asociados” con otro tal como se describe aquí, están unidos mediante interacciones no covalentes directas. Entre las interacciones no covalentes deseables se incluyen las del tipo que aparecen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica, por ejemplo, interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbicas, etc. La fuerza o afinidad de la asociación física se puede expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de asociación de las parejas de interacción seleccionados y marcadores tumorales se pueden cuantificar utilizando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, véase, Davies et al., Annual Rev. Biochem. 59:439, 1990). [0033] Panel de clasificación – Un “panel de clasificación” de parejas de interacción es un conjunto de parejas de interacción cuyo patrón colectivo de unión o falta de unión a una muestra de tumor, cuando se toman juntos, es suficiente para clasificar la muestra de tumor como un miembro de una clase particular o subclase de tumor, o no como un miembro de una clase particular o subclase de tumor. [0034] Correlación -"Correlación" se refiere al grado en el que se puede predecir una variable a partir de otra variable, por ejemplo, el grado en el que se puede predecir una respuesta terapéutica del paciente a partir del patrón de unión entre un grupo de parejas de interacción y una muestra de tumor tomada del paciente. Se pueden utilizar una serie de métodos estadísticos para medir la correlación entre dos variables, por ejemplo, sin limitación, el test t de Student, el test exacto de Fisher, el coeficiente de correlación de Pearson, el coeficiente de correlación se Spearman, el test de Chi cuadrado, etc. Los resultados se proporcionan normalmente como un coeficiente de correlación medido con un valor p que proporciona una medida de la probabilidad de que la correlación se incrementara por casualidad. Una correlación con un valor p que es inferior a 0,05 se considera en general que es estadísticamente significativa. Las correlaciones preferidas tienen unos valores p que son inferiores a 0,01, especialmente

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inferiores a 0,001. [0035] Pareja de interacción – Un “pareja de interacción” es una entidad que se asocia físicamente con un marcador tumoral. Por ejemplo, y sin limitación, un pareja de interacción puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo que se asocia físicamente con un marcador tumoral. En general, se dice que un pareja de interacción se “asocia específicamente” con un marcador tumoral si se asocia en un nivel detectable con el marcador tumoral y no se asocia de manera detectable con entidades moleculares no relacionadas (por ejemplo, otros marcadores tumorales) bajo condiciones similares. La asociación específica entre un marcador tumoral y un pareja de interacción dependerá habitualmente de la presencia de una característica estructural particular del marcador tumoral diana, tal como un determinante antigénico

o epítopo reconocido por la parejas de interacción. En general, si la parejas de interacción es específico para el epítopo A, la presencia de una entidad molecular (por ejemplo, una proteína) que contiene el epítopo A o la presencia de A no marcado libre en una reacción que contiene tanto A marcado libre como la parejas de interacción para el mismo, reducirá la cantidad de A marcado que se une al pareja de interacción. En general, debe entenderse que la especificidad no necesita ser absoluta. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que los anticuerpos reaccionan a menudo de forma cruzada con otros epítopos además del epítopo diana. Dicha reactividad cruzada puede ser aceptable dependiendo de la aplicación para la que se utiliza la parejas de interacción. De este modo, el grado de especificidad de un pareja de interacción dependerá del contexto en el que se utiliza. En general, un pareja de interacción muestra especificidad por un marcador tumoral particular si favorece la unión con el compañero anterior que se une con otros compañeros potenciales, por ejemplo, otros marcadores tumorales. Un experto en la materia será capaz de seleccionar parejas de interacción que tienen un grado suficiente de especificidad para actuar de manera apropiada en cualquier aplicación determinada (por ejemplo, para la detección de un marcador tumoral diana, para fines terapéuticos, etc.). También debe entenderse que la especificidad puede evaluarse en el contexto de factores adicionales, tales como la afinidad de parejas de interacción para el marcador tumoral diana frente a la afinidad de parejas de interacción para otros potenciales compañeros, por ejemplo, otros marcadores tumorales. Si un pareja de interacción muestra una afinidad elevada por un marcador tumoral diana y una afinidad baja por moléculas no diana, la parejas de interacción será probablemente un reactivo aceptable para fines de diagnóstico incluso si carece de especificidad. Se entenderá que una vez se establece la especificidad de un

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pareja de interacción en uno o más contextos, se puede utilizar en otros contextos, preferiblemente similares, sin necesidad de reevaluar su especificidad. [0036] Panel predictivo – Un “panel predictivo” de parejas de interacción es un grupo de parejas de interacción cuyo patrón colectivo de unión o falta de unión con una muestra de tumor, cuando se toman juntos, tiene suficiente correlación para clasificar la muestra del tumor por ser de un paciente que probablemente (o no) responderá a una pauta terapéutica determinada. [0037] Panel de pronóstico – Un “panel de pronóstico” de parejas de interacción es un grupo de parejas de interacción cuyo patrón colectivo de unión o falta de unión con una muestra de tumor, cuando se toman juntos, tiene suficiente correlación para clasificar la muestra del tumor por ser de un paciente que probablemente tendrá un resultado determinado. En general, el “resultado” puede incluir, pero sin limitación, la esperanza de vida media del paciente, la probabilidad de que el paciente sobrevivirá durante un tiempo determinado (por ejemplo, 6 meses, 1 año, 5 años, etc.), la probabilidad de reaparición, la probabilidad de que el paciente estará libre de la enfermedad durante un periodo de tiempo prolongado específico, o la probabilidad de que el paciente se curará de la enfermedad. [0038] Respuesta -La "respuesta" de un tumor o un cáncer a la terapia puede representar cualquier cambio detectable, por ejemplo, a nivel molecular, celular, organular o de organismo. Por ejemplo, son respuestas el tamaño tumoral, la esperanza de vida media, la reaparición o la cantidad de tiempo que el paciente sobrevive, etc. Las respuestas se pueden medir de varias maneras, incluyendo, por ejemplo, la medición no invasiva del tamaño del tumor (por ejemplo, rastreo CT, visualización aumentada de la imagen, etc.), la medición invasiva del tamaño del tumor (por ejemplo, resección tumoral residual, etc.), medición de un marcador sucedáneo (por ejemplo, PSA de suero, etc.), variaciones de la evolución clínica (por ejemplo, medición de la calidad de vida del paciente, tiempo hasta recaída, tiempo de supervivencia, etc.) [0039] Molécula pequeña – Una “molécula pequeña” es una molécula no polimérica. Una molécula pequeña se puede sintetizar en un laboratorio (por ejemplo, mediante síntesis combinatoria) o se halla en la naturaleza (por ejemplo, un producto natural). Una molécula pequeña se caracteriza habitualmente porque contiene varios enlaces carbono-carbono y tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1500 Da, aunque esta caracterización no pretende ser limitante para los fines de la presente invención.

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[0040] Marcadores tumorales – Los “marcadores tumorales” son grupos moleculares que son detectables en muestras de tumores. En general, los marcadores tumorales serán proteínas que están presentes en la muestra del tumor, por ejemplo, en el citoplasma o membranas de las células tumorales y/o secretadas de dichas células. Según la presente invención, se identifican grupos de marcadores tumorales que se correlacionan con la clase o subclase del tumor. De este modo, las posteriores muestras tumorales se pueden clasificar o subclasificar en base a la presencia de estos grupos de marcadores tumorales. [0041] Muestra de tumor – Tal como se utiliza aquí el término “muestra de tumor” se entiende de forma amplia para incluir muestras celulares o tisulares extraídos de un tumor, células (o su progenie) derivadas de un tumor que puede localizarse en cualquier punto del cuerpo (por ejemplo, células en el torrente sanguíneo o en un punto de la metástasis), o cualquier material derivado por el procesamiento de dicha muestra. Las muestras de tumor derivadas pueden incluir, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas extraídos de la muestra. Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas de la invención [0042] Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona técnicas y reactivos para la clasificación y subclasificación de tumores. Dicha clasificación (o subclasificación) presenta muchas aplicaciones beneficiosas. Por ejemplo, una clase o subclase de tumor particular puede correlacionarse con el pronóstico y/o susceptibilidad para una pauta terapéutica particular. Por tanto, la clasificación o subclasificación se puede utilizar como base para un kit de pronóstico o predictivo y también se puede utilizar como base para identificar terapias previamente no apreciadas. Las terapias que son eficaces contra únicamente una clase o subclase particular de tumor pueden perderse en estudios cuyos datos no se estratificaron en subclases; la presente invención permite que dichos datos se vuelvan a estratificar y permite que se realicen estudios adicionales, de manera que se puedan identificar y/o implementar terapias específicas de clase o subclase. Alternativa o adicionalmente, la presente invención permite la identificación y/o implementación de terapias que están dirigidas a genes identificados como específicos de una clase o subclase. Clasificación y subclasificación de tumores [0043] En general, según la presente invención, los tumores se clasifican o subclasifican en base a los marcadores tumorales cuya presencia se correlaciona con una clase o subclase particular. En realizaciones preferidas, los marcadores tumorales se detectan a través de su asociación física con un pareja de interacción. En la presente

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invención se incluyen kits que comprenden grupos de parejas de interacción que juntos se pueden utilizar para identificar o clasificar una muestra de tumor particular; dichos grupos se refieren en general como “paneles de clasificación”. [0044] La presente invención proporciona sistemas de identificación de paneles de clasificación. En general, las muestras de tumor se ponen en contacto con parejas de interacción individuales y se detecta la unión entre las parejas de interacción y sus marcadores tumorales afines. Por ejemplo, los paneles de parejas de interacción que identifican una clase o subclase particular de tumor en las muestras de tumor de un tejido de origen seleccionado se pueden definir mediante el contacto de las parejas de interacción individuales con un conjunto de muestras diferentes de tumor (por ejemplo, de pacientes diferentes) todas del mismo tejido de origen. Las parejas de interacción individuales se pueden seleccionar para la inclusión en el panel de clasificación final en base a su unión a sólo un subgrupo de las muestras de tumor (por ejemplo, véase los ejemplos 1-4). Sin embargo, los expertos en la materia entenderán que todo lo que se requiere para la recogida de parejas de interacción para actuar de manera eficaz como un panel de clasificación es que las características de unión combinadas de los miembros parejas de interacción juntos son suficientes para clasificar una muestra de tumor particular. [0045] El proceso de la invención de identificación de paneles de parejas de interacción útiles tal como se describe en la presente invención puede en por sí mismo dar lugar a la identificación de nuevas clases o subclases de tumores. Es decir, a través del proceso de análisis de los patrones de unión a parejas de interacción, los investigadores a menudo descubrirán nuevas clases o subclases de tumores a las que se unen grupos de parejas de interacción. De este modo, los procesos (a) de definición de paneles de clasificación de parejas de interacción para clases o subclases de tumores determinados; y (b) identificación de nuevas clases o subclases de tumores pueden estar experimentalmente bien interrelacionados. En general, cuanto mayor es el número de muestras de tumor analizadas, mayor es la probabilidad de definir nuevas clases o subclases. [0046] A menudo, cuando se identifican grupos de parejas de interacción que pueden actuar como un panel de clasificación (o subclasificación), será deseable obtener el grupo más amplio de muestras de tumores posibles, y también recoger la mayor cantidad de información posible sobre las muestras individuales. Por ejemplo, se pueden registrar el origen del tumor, el género del paciente, la edad del paciente, el estadio del tumor (por ejemplo, según el sistema TNM), cualquier característica

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microscópica o submicroscópica del tumor que se pueden haber determinado. Los expertos en la materia entenderán que cuanto más información se sepa sobre una muestra de tumor, habrá más aspectos de la muestra disponibles para la correlación con la unión a un pareja de interacción. [0047] los sistemas de la presente invención son particularmente útiles en la clasificación o subclasificación de muestras de tumores que no son distinguibles entre sí de otro modo. De este modo, en algunas realizaciones, será deseable analizar la colección más amplia de muestras de tumores que son más similares entre sí.

[0048] Cuando se obtienen muestras de tumor para analizar según la presente invención, se prefiere en general que las muestras representen o reflejen características de una población de pacientes o muestras. También puede ser útil para manejar y procesar las muestras bajo condiciones y según las técnicas habituales para los laboratorios clínicos. Aunque la presente invención no pretende limitarse a las estrategias utilizadas para procesar muestras de tumor, cabe indicar que, en el campo de la patología, a menudo es habitual fijar las muestras en formalina tamponada y, a continuación, deshidratarlas mediante la inmersión en concentraciones crecientes de etanol, seguido de xileno. A continuación, las muestras se embeben en parafina que, a continuación, se moldea en un “bloque de parafina” que es un intermedio estándar en el procesamiento histológico de muestras de tejido. Los presentes inventores han encontrado que muchos parejas de interacción útiles muestran una unión comparable independientemente del método de preparación de las muestras de tumor; los expertos en la materia pueden ajustar fácilmente observaciones para justificar las diferencias en el procedimiento de preparación. [0049] En realizaciones preferidas de la invención, se analizan simultáneamente grandes cantidades de muestras de tejido. En algunas realizaciones, se prepara un “array” de tejidos. Los “arrays” (grupos) de tejidos se pueden construir según un conjunto de técnicas. Según un procedimiento, se utiliza un dispositivo mecánico disponible comercialmente (por ejemplo, el dispositivo de “arrays” de tejidos manual MTA1 de Beecher Instruments of Sun Prairie, WI) para extraer de un bloque de parafina (el bloque dador) preparado de cada paciente un “núcleo” de grosor completo de un diámetro de 0,6 micras, y para insertar el núcleo en un bloque de parafina separado (el bloque receptor) en una localización designada en una rejilla. En realizaciones preferidas, los núcleos de tantos como aproximadamente 400 pacientes se pueden insertar en un único bloque receptor; preferiblemente, el espaciado entre núcleos es de aproximadamente 1 mm. El “array” de tejidos resultante se puede

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procesar en secciones delgadas para la tinción con parejas de interacción según métodos estándar aplicables a material embebido en parafina. Dependiendo del grosor de los bloques dadores, así como las dimensiones del material clínico, un único “array” de tejido puede producir aproximadamente 50-150 muestras que contienen > 75% de material relevante de tumor para la valoración con las parejas de interacción. La construcción de dos o más “arrays” de tejido paralelos de núcleos del mismo cohorte de muestras de paciente puede proporcionar material relevante de tumor del mismo grupo de pacientes por duplicado o más. Naturalmente, en algunos casos, estarán presentes muestras adicionales en un “array” y no en otro. [0050] Los presentes inventores han observado que a menudo es deseable evaluar algunos aspectos de las características de unión de potenciales parejas de interacción antes o durante la evaluación de la conveniencia de incluirlos en un panel de interacción. Por ejemplo, los inventores han encontrado a menudo es deseable realización un estudio de titulación en el que se ponen en contacto diferentes concentraciones dla parejas de interacción con un grupo diverso de muestras de tejido derivadas de una serie de tejidos diferentes (por ejemplo, normal y/o tumoral) a efectos de identificar una concentración o título en la que se observa una unión diferencial. A este título se refiere en la presente invención como un “título discriminante”. Dicha tinción diferencial se puede observar entre muestras de tejido diferentes y/o entre tipos de células diferentes en una muestra de tejido determinada.

[0051] En general, se puede utilizar cualquier muestra de tejido para este objetivo (por ejemplo, muestras obtenidas de la epidimis, esófago, vesícula biliar, riñones, hígado, pulmones, nódulos linfáticos, músculos, ovarios, páncreas, glándulas paratiroides, placenta, próstata, saliva, piel, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, amígdalas, útero, etc.). Para dichos estudios de titulación, a menudo se prefiere una mayor diversidad entre muestras. Sin pretender limitar la presente invención, los inventores observan que los títulos útiles para parejas de interacción particulares se pueden definir habitualmente en un estudio de aproximadamente 40-70 muestras de tejido diferentes de aproximadamente 20-40 tejidos diferentes. [0052] Se pueden realizar estudios de unión (para titulación, para la valoración de la inclusión en un panel, o durante el uso de un panel) en cualquier formato que permite la detección de la interacción específica. Cuando se manipulan grandes cantidades de muestras, puede ser deseable utilizar formatos en “arrays” y/o automatizados. Los formatos particularmente preferidos incluyen “arrays” de tejidos tal como se han descrito anteriormente. La tinción de grandes cantidades de muestras derivadas de un

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conjunto de tumores en un formato de “array” de tejidos permite una valoración comparativa excelente de la tinción diferencial entre muestras bajo condiciones idénticas. Según la presente invención, los patrones de tinción que identifican por lo menos aproximadamente un 10% de las muestras que se unen con un pareja de interacción particular, o por lo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50% o más de las muestras, probablemente representan los patrones de tinción diferencial “reales” (es decir, variaciones reales en la unión con un pareja de interacción y no variaciones experimentales, por ejemplo, debido al procesado de la muestra o la variación día a día en técnicas de tinción. [0053] Se puede utilizar cualquier técnica disponible para detectar la unión entre un pareja de interacción y una muestra de tumor. Una técnica potente y utilizada habitualmente es tener un marcador detectable asociado (directa o indirectamente) con la parejas de interacción. Por ejemplo, los marcadores utilizados habitualmente que a menudo se asocian con anticuerpos utilizados en estudios de unión incluyen fluorocromos, enzimas, oro, yodo, etc. A continuación, se valora la tinción de tejido mediante parejas de interacción unidos, preferiblemente por un patólogo o citotecnólogo entrenado. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema de puntuación para designar si la parejas de interacción se une o no (por ejemplo, tiñe) la muestra, si tiñe la muestra de manera intensa o débilmente y/o si no se podía obtener información útil (por ejemplo, porque se perdió la muestra, no había tumor en la muestra o el resultado era en cualquier caso ambiguo). Los expertos en la materia reconocerán que las características exactas del sistema de puntuación no son críticas para la invención. Por ejemplo, la tinción se puede valorar cualitativa o cuantitativamente; se pueden definir gradaciones más o menos sutiles; etc.

[0054] Cualquiera que sea el formato, y cualquiera que sea la estrategia de detección, la identificación de un título discriminante puede simplificar los estudios de unión para valorar la conveniencia de incluir un pareja de interacción determinado en un panel. En dichos estudios, la parejas de interacción se pone en contacto con un conjunto de muestras de tumor diferentes que tienen preferiblemente por lo menos una característica en común (por ejemplo, tejido de origen) y a menudo presentan múltiples características en común (por ejemplo, tejido de origen, estadio, características microscópicas, etc.). En algunos casos, será deseable seleccionar un grupo de muestras con por lo menos una característica en común y por lo menso una característica diferente, de manera que se define un panel de parejas de interacción que diferencia la característica diferente. En otros casos, será deseable seleccionar un grupo

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de muestras con características diferentes no detectables, de manera que se define un panel de parejas de interacción que diferencia entre muestras previamente no diferenciables. Los expertos en la materia entenderán, sin embargo, que la presente invención a menudo permitirá que se cumplan ambos objetivos, incluso en estudios de recogidas de muestras con grados variantes de similitud y diferencia. [0055] Según la presente invención, las parejas de interacción que se unen a muestras de tumor se pueden caracterizar por su capacidad de discriminar entre muestras de tumor. Se puede utilizar cualquier grupo de técnicas para identificar parejas de interacción discriminantes. Para proporcionar un ejemplo, los presentes inventores han encontrado útil definir un “panel de consenso” de muestras de tejido para tumores de un tejido de origen particular (véase los ejemplos 2-6). Los expertos en la materia entenderán de nuevo que los parámetros exactos utilizados para designar una muestra particular como interpretable y reproducible no son críticos para la invención. A continuación, las parejas de interacción se puede clasificar en base a su capacidad de discriminar entre muestras de tejido en el panel de consenso (véase los ejemplos 2-6). Valoración del pronóstico o pauta terapéutica

[0056] La presente invención proporciona además sistemas para identificar paneles de parejas de interacción cuya unión se correlaciona con factores más allá de la clase o subclase del tumor, tal como la probabilidad de un resultado favorable o desfavorable particular, la susceptibilidad (o falta de la misma) a una pauta terapéutica particular, etc. [0057] Tal como se menciona en los antecedentes, las estrategias actuales para asignar las probabilidades de pronóstico y7o seleccionar las pautas terapéuticas apropiadas para tumores particulares utilizan en general el sistema de metástasis de nódulos tumorales (TNM). Este sistema utiliza el tamaño del tumor, la presencia o ausencia del tumor en los nódulos linfáticos regionales y la presencia o ausencia de metástasis distante, para asignar una etapa al tumor. La etapa asignada se utiliza como base para la selección de la terapia apropiada y con fines de pronóstico. [0058] La presente invención proporciona nuevos métodos y sistemas para evaluar el pronóstico tumoral y/o las estrategias terapéuticas recomendadas. En particular, la presente invención proporciona sistemas para identificar paneles de parejas de interacción, cuya unión se correlaciona con el pronóstico de tumores o resultado terapéutico. [0059] Por ejemplo, las parejas de interacción cuya unión se correlaciona con el pronóstico se pueden identificar mediante la evaluación de su unión a un conjunto de

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muestras de tumores para los cuales el pronóstico es conocido o se puede conocer. Es decir, se pueden utilizar las estrategias de la invención para identificar grupos de parejas de interacción cuya unión se correlaciona con un resultado conocido, o se pueden utilizar para identificar un patrón de tinción diferencial que a continuación se correlaciona con el resultado (el cual puede ser conocido por avanzado o determinado con el tiempo). [0060] En general, se prefiere que los análisis de unión de la invención se realicen sobre muestras de tumor humanas. Sin embargo, no es necesario que los tumores humanos crezcan en un huésped humano. Particularmente, para los estudios en los que los datos de los resultados a largo plazo son de interés (especialmente estudios de pronóstico o predictivos), puede ser particularmente útil analizar muestras desarrolladas in vitro (por ejemplo, líneas celulares) o, más preferiblemente, en un huésped no humano (por ejemplo, un roedor, un perro, una oveja, un cerdo, u otro animal). Por ejemplo, el ejemplo 9 proporciona una descripción de un ensayo en el que se utilizan técnicas de la invención que emplean células tumorales humanas que crecen en un huésped no humano para definir y/o utilizar un panel de parejas de interacción, cuya unión a muestras de tumor se correlaciona con el pronóstico y/o respuesta a la terapia. [0061] A menudo será deseable, cuando se identifican parejas de interacción, cuya unión se correlaciona con el pronóstico, recopilar información sobre las pautas de tratamiento que se pueden haber aplicado al tumor, cuya muestra se esta valorando, a efectos de controlar los efectos atribuibles a la terapia tumoral. La unión del panel de pronóstico se puede correlacionar con el resultado independientemente del tratamiento (Hayes et al., J. Mamm. Gland Bio. Neo. 6:375, 2001). Sin embargo, muchos marcadores de pronóstico presentan tanto carácter de pronóstico como predictivo (por ejemplo, status Her2/Neu). Muchos de las parejas de interacción individuales que comprenden un panel de pronóstico pueden asimismo tener una capacidad predictiva y/o ser miembros de un panel predictivo. [0062] Los expertos en la material entenderán que los paneles de pronóstico (o parejas de interacción individuales) presentan una utilidad clínica superior si su unión/falta de la misma se correlaciona con resultados positivos/negativos que están estadísticamente bien separados. [0063] Las estrategias de la invención también se pueden aplicar a la identificación de paneles predictivos de parejas de interacción (es decir, paneles cuya unión se correlaciona con la susceptibilidad a una terapia particular). Tal como se ha indicado

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anteriormente, algunos paneles de pronóstico pueden tener también capacidades predictivas.

[0064] Las parejas de interacción a incluir en paneles predictivos se identifican en estudios de unión realizados sobre muestras de tumor que responden o no a una terapia particular. En cuanto a los paneles de pronóstico, los paneles predictivos se pueden ensamblar en base a pruebas de muestras de tumor cuya respuesta ya es conocida o sobre muestras cuya respuesta no se conoce por avanzado. En cuanto a los estudios de pronóstico descritos anteriormente, la fuente de las muestras tumorales no es esencial y puede incluir, por ejemplo, líneas de células tumorales cuya respuesta a agentes químicos particulares se ha determinado, muestras de tumor de modelos de animales en las que se han introducido artificialmente tumores y se ha determinado la respuesta terapéutica y/o muestras de tumores naturales (humanas o de otro animal) para los que están disponibles los datos de los resultados (por ejemplo, el tiempo de supervivencia, respuesta a la terapia, etc.). Los paneles de las parejas de interacción cuya unión a muestras de tumor se correlaciona con cualquier tendencia de pronóstico o terapéutica se pueden definir y utilizar tal como se describe en la presente invención. [0065] Una vez se han establecido las correlaciones entre la unión de las parejas de interacción y el comportamiento del tumor, se pueden utilizar los paneles de pronóstico

o predictivos definidos para evaluar y clasificar muestras de tumores de pacientes y se pueden apoyar en estos para, por ejemplo, dirigir la selección de una pauta terapéutica eficaz. En cuanto a los estudios de clasificación de tumores descritos anteriormente, el proceso de identificar paneles de parejas de interacción cuya unión se correlaciona con el resultado puede identificar por sí mismo resultados particulares no apreciados previamente como diferentes. [0066] Los expertos en la material entenderán que es probable que, en por lo menos algunos ejemplos, la identidad de la clase o subclase del tumor se correlacionará por sí misma con el pronóstico o la respuesta. En dichas circunstancias, es posible que el mismo grupo de parejas de interacción pueda actuar tanto como panel de clasificación como panel de pronóstico o predictivo. Elementos del tumor unidos mediante parejas de interacción [0067] Las estrategias de la invención para identificar y utilizar paneles de parejas de interacción en la clasificación o análisis de muestras de tumor no dependen de las suposiciones sobre la identidad o características de los componentes tumorales unidos por las parejas de interacción. Siempre y cuando la unión dla parejas de interacción en el panel relevante se correlacione con alguna característica de interés, se aplican las

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enseñanzas de la invención. En muchos de los casos, si no la mayoría, se espera, sin embargo, que la unión será con una proteína expresada por células tumorales. [0068] En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, las parejas de interacción se unen a marcadores tumorales que (a) se expresan diferencialmente en células tumorales; (b) son miembros de familias de proteínas, cuyas actividades contribuyen a sucesos biológicos relevantes (por ejemplo, familias de genes que están implicados en cáncer, tal como oncogenes, genes supresores de tumores y genes que regulan la apoptosis; familias de genes que están implicados en la resistencia a fármacos; etc.); (c) están presentes en la membrana plasmática de las células tumorales; y/o (d) son los productos de degradación de los componentes tumorales, cuyos productos de degradación podrían ser detectables en el suero de los pacientes. [0069] De hecho, según la presente invención, las parejas de interacción para el análisis y utilización en los paneles de la invención se pueden identificar a veces identificando en primer lugar una proteína de interés asociada a un tumor y a continuación, buscando el potencial pareja de interacción que se une con la proteína. La unión por este potencial pareja de interacción a muestras de tumor se puede valorar y utilizar a continuación tal como se describe en la presente invención. [0070] Por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos, los presentes inventores han ensamblado de manera satisfactoria paneles de clasificación comprendidos de anticuerpos que se unen a antígenos de proteínas tumorales. Los antígenos candidatos se identificaron tanto a través de revisiones en la literatura de proteínas que juegan un papel biológico en el inicio o progresión del tumor o que se conocen por expresarse de diferencialmente en tumores como a través de estudios de expresión génica que identificaron proteínas adicionales expresadas diferencialmente. [0071] El trabajo de los presentes inventores, así como de otros, ya ha demostrado que los estudios de patrones de expresión génica en amplios cohortes de tumores pueden identificar nuevas clases de tumores (véase, por ejemplo, Perou et al., Nature 406:747, 2000; Sorlie et al., Proc Natl Acad. Sci. USA 98:10869, 2001; van’t Veer et al., Nature 415:530, 2002; West et al., Proc Natl. Acad Sci. USA 98:11462, 2001; Hedenfalk et al., N. Engl. J. Med. 344:539, 2001; Gruvberger et al., Cancer Res. 61: 5979, 2001; MacDonald et al., Nature Genet. 29:143, 2001; Pomeroy et al., Nature 415:436, 2002; Jazaeri et al., J. Natl Cancer Inst 94:990, 2002; Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1176, 2001; Wang et al., Gene 229:101,1999; Beer et al., Nature Med. 8:816. 2002; Garber et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:13784, 2001; Bhattacharjee et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:13790,2001; Zou et al., Oncogene 21:4855, 2002; Lin et

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al., Oncogene 21:4120, 2002; Alon et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:6745, 1999; Takahashi et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:9754, 2001; Singh et al., Cancer Cell 1:203, 2002; LaTulippe et al., Cancer Res. 62:4499, 2002; Welsh et al., Cancer Res. 61:5974, 2001; Dhanasekaran et al., Nature 412:822, 2001; Hippo et al., Cancer Res. 62:233, 2002; Yeoh et al., Cancer Cell 1:133, 2662; Hofmann et al., Lancet 359:481, 2002; Ferrando et al., Cancer Cell 1:75, 2002; Shipp et al., Nature Med 8:68, 2002; Rosenwald et al., N. Engl. J. Med. 346:1937, 2002; y Alizadeh et al., Nature 403:503, 2000). [0072] Los grupos de genes descritos en estas publicaciones son candidatos prometedores para genes que probablemente codifican marcadores tumorales, cuyos parejas de interacción son útiles en la clasificación y subclasificación de tumores según la presente invención. De particular interés son los grupos de genes expresados diferencialmente en tumores sólidos. [0073] Además, en general, dado que los genes expresados diferencialmente son probablemente responsables de las diferentes características fenotípicas de los tumores, la presente invención reconoce que dichos genes codificarán a menudo marcadores tumorales para los que se puede preparar probablemente un pareja de interacción útil que discrimina entre clases o subclases de tumores. Un gen expresado diferencialmente es un gen cuya abundancia de transcritos varía entre muestras diferentes, por ejemplo, entre muestras de tumor diferentes, entre muestras normales frente a muestras de tumor, etc. En general, la cantidad por la que varía la expresión y el número de muestras en las que varía la expresión en esa cantidad dependerán del número de muestras y las características particulares de las muestras. Un experto en la materia será capaz de determinar, en base al conocimiento de las muestras, lo que constituye un grado significativo de expresión diferencial. Dichos genes se pueden identificar mediante cualquier técnica, incluyendo, por ejemplo, la hibridación in situ, la transferencia Northern, las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, PCR cuantitativa, la reacción en cadena por ligasa, etc.) y, más habitualmente, análisis con microarrays. [0074] Además, los expertos en la material entenderán fácilmente, leyendo la presente memoria, que los procesos de la invención aquí descritos de identificación y/o utilización de grupos de parejas de interacción, cuya unión (o falta de la misma) se correlaciona con una característica interesante del tumor (por ejemplo, tipo o subtipo de tumor, resultado del paciente, respuesta del tumor o el paciente a la terapia, etc.), identifican inherentemente tanto las parejas de interacción de interés como los

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marcadores tumorales a los que se unen. De este modo, un aspecto importante de la presente invención es la identificación de marcadores tumorales, cuya capacidad (o falta de la misma) de asociarse con un pareja de interacción se correlaciona con una característica de interés del tumor. Dichos marcadores tumorales son útiles como dianas para la identificación de nuevos reactivos terapéuticos, así como de parejas de interacción adicionales útiles en la práctica de la presente invención. De este modo, debe entenderse que las discusiones de parejas de interacción presentados en la presente invención no se limitan habitualmente a un compuesto o entidad de pareja de interacción particular, sino que se puede generalizar para incluir cualquier compuesto o entidad que se una al marcador o marcadores tumorales relevantes con la especificidad y afinidad requeridas. Preparación de parejas de interacción [0075] en general, las parejas de interacción son entidades que se asocian físicamente con marcadores tumorales seleccionados. De este modo, cualquier entidad que se una de forma detectable a un marcador tumoral se puede utilizar como pareja de interacción según la presente invención, siempre y cuando se una con una combinación apropiada de afinidad y especificidad. [0076] Las parejas de interacción particularmente preferidos son anticuerpos, o fragmentos (por ejemplo, fragmentos F(ab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fv, o fragmentos sFv, etc.; véase, por ejemplo, Inbar et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659, 1972; Hochman et al., Biochem. 15:2706, 1976; y Ehrlich et al., Biochem. 19:4091, 1980; Huston et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879, 1998; las Patentes

U.S. Nos. 5,091,513 y 5,132,405 de Huston et al.; y la Patente U.S. No. 4,946,778 de Ladner et al.). En ciertas realizaciones, las parejas de interacción se pueden seleccionar entre bibliotecas de anticuerpos mutantes (o fragmentos de los mismos). Por ejemplo, los grupos de anticuerpos que incluyen cada uno diferentes mutaciones puntuales se pueden cribar por su asociación con un marcador tumoral de interés. Además, se pueden utilizar anticuerpos quiméricos como parejas de interacción, por ejemplo, anticuerpos “humanizados o “chapados” (“veneered”), tal como se describe con más detalle a continuación. [0077] Debe entenderse que la presente invención no se limita a la utilización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos como parejas de interacción de marcadores tumorales de la invención. En particular, la presente invención también abarca la utilización de parejas de interacción sintéticos que mimetizan las funciones de los anticuerpos. Se han propuesto y demostrado diversas estrategias para diseñar y/o

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identificar miméticos de anticuerpos (por ejemplo, véase las revisiones Hsieh-Wilson et al., Acc. Chem. Res. 29:164, 2000 y Peczuh and Hamilton, Chem. Rev. 100:2479, 2000). Por ejemplo, se han identificado mediante cribado de bibliotecas sintéticas de moléculas pequeñas o aislados de productos naturales, moléculas pequeñas que se unen a las superficies de proteínas de una manera similar a la de las proteínas naturales (por ejemplo, véase Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994; Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385, 1994; DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:4708, 1994; Virgilio and Ellman, J. Am. Chem. Soc. 116:11580, 1994; Wang et al., J. Med. Chem. 38:2995, 1995; y Kick y Ellman, J. Med. Chem. 38:1427, 1995). De manera similar, se han aplicado de manera satisfactoria estrategias combinatorias al cribado de bibliotecas de péptidos y polipéptidos por su capacidad de unirse a un conjunto de proteínas (por ejemplo, véase, Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1865, 1992; Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9022, 1994; Scott y Smith, Science 249:386, 1990; Devlin et al., Science 249:404, 1990; Corey et al., Gene 128:129, 1993; Bray et al., Tetrahedron Lett. 31:5811, 1990; Fodor et al., Science 251:767, 1991; Houghten et al., Nature 354:84, 1991; Lam et al., Nature 354:82, 1991; Blake y Litzi-Davis, Bioconjugate Chem. 3:510, 1992; Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10700, 1993; y Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10922, 1993). También se han utilizado estrategias similares para estudiar las interacciones carbohidrato-proteína (por ejemplo, véase Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5393, 1992) e interacciones polinucleótido-proteína (por ejemplo, véase Ellington y Szostak, Nature 346:818, 1990 y Tuerk y Gold, Science 249:505, 1990). Estas estrategias también se han ampliado al estudio de interacciones entre proteínas y biopolímeros no naturales, tales como oligocarbamatos, oligoureas, oligosulfonas, etc. (por ejemplo, véase Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc. 114:10646, 1992; Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9367, 1992; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Burgess et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 34:907, 1995; y Cho et al., Science 261:1303, 1993). Además, se han sugerido los andamios de proteínas alternativas que se basan aproximadamente alrededor del plegamiento básico de moléculas de anticuerpo y se pueden utilizar en la preparación de parejas de interacción de la invención (por ejemplo, véase Ku y Schultz Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6552, 1995). También se han construido miméticos de anticuerpos que comprenden un andamio de una molécula pequeña, tal como el ácido 3-aminometilbenzoico, y un sustituyente que consiste en un único bucle de péptido. El bucle de péptido realiza la

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función de unión en estos miméticos (por ejemplo, véase Smythe et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2725, 1994). También se ha descrito un mimético de anticuerpo sintético que comprende múltiples bucles de péptidos construido alrededor de la unidad de calixareno (por ejemplo, véase la Patente U.S. No. 5,770,380 de Hamilton et al.). Detección de la asociación de parejas de interacción y marcadores tumorales [0078] Se puede utilizar cualquier estrategia o sistema disponible para detector la asociación entre un pareja de interacción y su marcador tumoral afín. En ciertas realizaciones, se puede detectar la asociación mediante la adición de un marcador detectable al pareja de interacción. En otras realizaciones, la asociación se puede detectar utilizando un pareja de interacción secundario marcado que se asocia específicamente con la parejas de interacción primario, por ejemplo, tal como se conoce en sector de la detección de antígeno/anticuerpo. El marcador detectable puede ser directamente detectable o indirectamente detectable, por ejemplo, a través de la acción combinada con uno o más miembros adicionales de un sistema productor de señales. Entre los ejemplos de marcadores directamente detectables se incluyen marcadores radioactivos, paramagnéticos, fluorescentes, dispersores de la luz, absortivos y colorimétricos. Entre los ejemplos de marcadores indirectamente detectables se incluyen marcadores quimioluminiscentes, por ejemplo, enzimas que son capaces de convertir un sustrato en un producto cromogénico, tal como fosfatasa alcalina, peroxidada de rábano picante, y similares. [0079] Una vez un pareja de interacción marcado se ha unido a un marcador tumoral, el complejo se puede visualizar o detectar de diversas maneras, eligiéndose la manera particular de detección basada en el marcador particular detectable, en el que medios de detección representativos incluyen, por ejemplo, conteo por centelleo, autorradiografía, medición del paramagnetismo, medición de la fluorescencia, medición de la absorción de luz, medición de la dispersión de luz, y similares. [0080] En general, la asociación entre un pareja de interacción y su marcador tumoral afín se puede analizar mediante el contacto dla parejas de interacción con una muestra de tumor que incluye el marcador. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, los métodos apropiados incluyen, pero sin limitación, inmunohistoquímica (IHC), radioinmunoensayo, ELISA, inmunotransferencia y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En el caso en el que se detecta el polipéptido en una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de biopsia, la IHC es un método de detección particularmente apropiado. Las técnicas para obtener muestras de tejido y células y la realización de IHC y FACS son conocidas en el sector.

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[0081] Las estrategias de la invención para clasificar y/o subclasificar muestras de tumores se pueden aplicar a muestras de cualquier tipo y de cualquier tejido de origen. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, las estrategias se aplican a tumores sólidos. Históricamente, los investigadores han encontrado dificultades en la definición de subtipos de tumores sólidos dadas las dificultadas asociadas con la definición de sus características moleculares. Tal como se ha demostrado en los ejemplos, la presente invención es particularmente beneficiosa en esta área. Los tumores sólidos particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, tumores de mama, pulmón, colon y ovario. La presente invención también abarca el reconocimiento de que los marcadores tumorales que se secretan de las células en las que se producen pueden estar presentes en suero, permitiendo su detección a través de un análisis de sangre, en lugar de requerir una muestra de biopsia. Un pareja de interacción que se une a dichos marcadores tumorales representa una realización particularmente preferida de la presente invención. [0082] En general, los resultados de dicho análisis se pueden presentar en diversos formatos. Los resultados se pueden presentar de manera cualitativa. Por ejemplo, el informe del análisis puede indicar únicamente si se detectó o no el marcador tumoral particular, quizás también con una indicación de los límites de detección. Adicionalmente, el informe del análisis puede indicar la localización subcelular de unión, por ejemplo, nuclear frente a citoplásmico y/o los niveles relativos de unión en estas localizaciones subcelulares diferentes. Los resultados se pueden presentar de una manera semi-cuantitativa. Por ejemplo, se pueden definir varios intervalos y a los intervalos se les puede asignar una puntuación (por ejemplo, 0 a 5) que proporciona un cierto grado de información cuantitativa, Dicha puntuación puede reflejar varios factores, por ejemplo, el número de células en las que se detecta le marcador tumoral, la intensidad de la señal (que puede indicar el nivel de expresión del marcador tumoral), etc. Los resultados se pueden presentar de manera cuantitativa, por ejemplo, como el porcentaje de células en las que se detecta el marcador tumoral, como una concentración, etc. Tal como se entenderá por un experto en la materia, el tipo de resultado proporcionado por un análisis variará dependiendo de las limitaciones técnicas del análisis y de la importancia biológica asociada con la detección del marcador tumoral. Por ejemplo, en el caso de ciertos marcadores tumorales, un resultado puramente cualitativo (por ejemplo, si se detecta o no el marcador tumoral en un cierto nivel de detección) proporciona una información significativa. En otros casos, es necesario un resultado más cuantitativo (por ejemplo, una proporción del

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nivel de expresión del marcador tumoral en dos muestras). Identificación de nuevas terapias [0083] Los paneles predictivos de agentes de interacción son útiles según la presente invención no sólo para clasificar muestras de tumores obtenidas de pacientes de cáncer con respecto a su probable respuesta a terapias conocidas, sino también para identificar nuevas terapias potenciales o agentes terapéuticos que podrían ser útiles en el tratamiento del cáncer. [0084] Por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente, el proceso de identificación o utilización de paneles inventivos según la presente invención identifica y/o caracteriza simultáneamente marcadores tumorales en o sobre las células tumorales que se correlacionan con una o más características seleccionadas del tumor (por ejemplo, tipo o subtipo de tumor, pronóstico del paciente, y/o respuesta del tumor o el paciente a la terapia). Dichos marcadores tumorales son candidatos atractivos para la identificación de nuevos agentes terapéuticos (por ejemplo, a través de cribados para detectar compuestos o grupos que se unen a los marcadores tumorales, preferiblemente con, por lo menos, una afinidad y/o especificidad específicas y/o a través de cribados para detectar compuestos o grupos que modulan (es decir, aumentan o disminuyen) la expresión, localización, modificación, o actividad de los marcadores tumorales. En muchos casos, puede demostrarse que los propios parejas de interacción son agentes terapéuticos útiles. [0085] De este modo, la presente invención proporciona parejas de interacción que en sí mismos son agentes terapéuticos útiles. Por ejemplo, la unión de un pareja de interacción, o un conjunto de parejas de interacción, a una célula cancerosa, podría inhibir el crecimiento de esa célula. Alternativamente o adicionalmente, las parejas de interacción definidos o preparados según la presente invención se podrían utilizar para liberar un agente terapéutico a una célula cancerosa. En particular, las parejas de interacción se pueden acoplar a uno o más agentes terapéuticos. Entre los agentes adecuados se incluyen radionucleidos y fármacos. Los radionucleidos preferidos incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi. Los fármacos preferidos incluyen clorambucil, ifosfamida, mecloretamina, ciclofosfamida, carboplatino, cisplatino, procarbacina, decarbacina, carmustina, citarabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, 5-fluorouracilo, actinomicina, D-bleomicina, daunorubicina, doxorubicina, etopósido, vinblastina, vincristina, L-asparaginasa, adrenocorticosteroides, trifosfato de canciclovir, adenina arabinonucleósido trifosfato, 5-aziridinil-4-hidroxilamino-2-nitrobenzamida, acroleína, mostaza de fosforamida, 6

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metilpurina, etopósido, metotrexato, mostaza de ácido benzoico, cianuro y mostaza de nitrógeno. [0086] Según dichas realizaciones, el agente terapéutico se puede acoplar con un pareja de interacción mediante interacciones covalentes o no covalentes directas o indirectas. Una interacción directa entre un agente terapéutico y un pareja de interacción es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro. Las interacciones indirectas podrían implicar un grupo enlazador que se asocial por sí mismo con el agente terapéutico y la parejas de interacción. Un grupo enlazador puede actuar como un espaciador para separar un pareja de interacción de un agente con el fin de evitar la interferencia con las capacidades de asociación. Un grupo enlazador puede servir también para incrementar la reactividad química de un sustituyente sobre un agente o un pareja de interacción y, de este modo, incrementar la eficacia de acoplamiento. Un aumento en la reactividad química puede facilitar también la utilización de agentes, o grupos funcionales sobre agentes, que, de otro modo, no sería posible. [0087] Será evidente para los expertos en la material que se pueden utilizar como grupo enlazador un conjunto de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homofuncionales como heterofuncionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). El acoplamiento se puede realizar, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la Patente US No. 4,671,958, de Rodwell et al. Se entenderá además que un agente terapéutico y un pareja de interacción se pueden acoplar a través de interacciones no covalentes, por ejemplo, interacciones de tipo ligando/receptor. Para acoplar un agente terapéutico y un pareja de interacción se puede utilizar cualquier pareja ligando/receptor con una estabilidad y especificidad suficiente para actuar en el contexto de la invención. Para proporcionar un ejemplo, un agente terapéutico pueden estar unido covalentemente con biotina y un pareja de interacción con avidita. La unión no covalente fuerte de biotina a avidita permitiría entonces el acoplamiento del agente terapéutico y e pareja de interacción. Las parejas ligando/receptor típicas incluyen las parejas proteína/co-factor y enzima/sustrato. Además de la pareja biotina/avidita utilizada habitualmente, éstas incluyen, sin limitación, las parejas

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biotina/estreptavidina, digoxigenina/anti-digoxigenina, FK506/proteína de unión a FK506 (FKBP), rapamicina/FKBP, ciclofilina/ciclosporina y glutatión/glutatión transferasa. Los expertos en la materia reconocerán otras parejas de ligando/receptor adecuadas por ejemplo, anticuerpos monoclonales emparejados con un epítopo etiqueta, tal como, sin limitación, glutatión-S-transferasa (GSI), c-myc, FLAG® y proteína de unión a maltosa y además las descritas en Kessler pág. 105-152 de Advances in Mutagenesis" Ed. de Kessler, Springer-Verlag, 1990; "Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)" Ed. de Pascal Baillon, Humana Press, 2000; y "Immobilized Affinity Ligand Techniques" de Hermanson et al., Academic Press, 1992. [0088] Cuando un agente terapéutico es más potente cuando está libre dla parejas de interacción, puede ser deseable utilizar un grupo enlazador que es divisible durante o después de la internalización en una célula. Se han descrito un conjunto de diferentes grupos enlazadores divisibles. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de los grupos enlazadores incluyen la división durante la reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,489,710 de Spitler), mediante radiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,625,014 de Senter et al.), mediante la hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivados (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,638,045 de Kohn et al.), mediante hidrólisis mediada por complemento de suero (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,671,958 de Rodwell et al.) y mediante hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,569,789 de Blattler et al.). [0089] En ciertas realizaciones, puede ser deseable acoplar más de un agente terapéutico a un pareja de interacción. En una realización, múltiples moléculas de un agente se acoplan a una molécula de pareja de interacción. En otra realización, más de un tipo de agente terapéutico se puede acoplar a una molécula de pareja de interacción. Independientemente de la realización particular, las preparaciones con más de un agente se pueden preparar de varias maneras. Por ejemplo, se pueden acoplar directamente más de un agente a una molécula de pareja de interacción, o se pueden utilizar enlazadores que proporcionan múltiples sitios para la unión. [0090] Alternativamente, se puede utilizar un portador. Un portador puede transportar los agentes de varias maneras, incluyendo la unión covalente ya sea directamente o a través de un grupo enlazador. Los portadores adecuados incluyen proteínas, tales como albúminas (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,507,234 de Kato et al.), péptidos, y polisacáridos, tales como aminodextrano (por ejemplo, Patente U.S. No. 4,699,784 de Shih et al.). Un portador puede transportar también un agente mediante unión no

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covalente o mediante encapsulación, tal como en una vesícula liposoma (por ejemplo, Patente U.S. Nos. 4,429,008 de Martin et al. y 4,873,088 de Mayhew et al.). Los portadores específicos para agentes radionucleidos incluyen moléculas pequeñas halogenadas radioactivas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,735,792 de Srivastava describe moléculas pequeñas halogenadas radioactivas y su síntesis. Se puede formar un quelato con raidonucleido a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azyfre como átomos dadores para la unión radionucleido de metal, u óxido metálico. Por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,673,562 de Davison et al. describe compuestos quelantes representativos y su síntesis. [0091] Cuando las parejas de interacción son en sí mismos agentes terapéuticos, se entenderá que, en muchos casos, se puede utilizar cualquier pareja de interacción que se une al mismo marcador tumoral [0092] En una realización preferida de la invención, los agentes terapéuticos (tanto si son parejas de interacción u otros) son anticuerpos. Tal como se conoce en la técnica, cuando se utiliza un anticuerpo o fragmento del mismo para fines terapéuticos, puede resultar ventajoso utilizar una versión “humanizada” o “chapado” (“veneered”) de un anticuerpo de interés para reducir cualquier reacción inmunogénica potencial. En general, las moléculas de anticuerpo “humanizado” o "chapado" y fragmentos de las mismas minimizan las respuestas inmunológicas indeseadas hacia moléculas de anticuerpo antihumano que pueden limitar la duración y eficacia de aplicaciones terapéuticas de estos grupos en receptores humanos. [0093] En la técnica se ha descrito un conjunto de moléculas de anticuerpo “humanizado” que comprenden una parte de unión a antígeno derivada de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones variables de roedor y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a dominios constantes humanos (por ejemplo, see Winter et al., Nature 349:293, 1991; Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220, 1989; Shaw et al., J. Immunol. 138:4534, 1987; and Brown et al., Cancer Res. 47:3577, 1987), CDR de roedor injertadas en una region armazón (FR) de soporte humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (por ejemplo, véase Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; y Jones et al. Nature 321:522, 1986) y CDR de roedor soportadas por FR de roedor recombinantemente chapado (por ejemplo, véase la Publicación de Patente Europea No. 519,596, published Dec. 23, 1992). Debe entenderse que la invención

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también comprende anticuerpos “totalmente humanos” producidos utilizando la tecnología de XenoMouse™ (AbGenix Corp., Fremont, CA) según las técnicas descritas en la Patente U.S. No. 6,075,181. [0094] Además, se pueden utilizar los denominados anticuerpos “chapados” que incluyen “FR chapado”. El proceso de chapado implica la sustitución selectiva de residuos de FR de, por ejemplo, una región variable de cadena pesada o ligera murina, con residuos FR humanos, con el fin de proporcionar una molécula xenogeneica que comprende una parte de unión a antígeno que mantiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento de FR nativa. Las técnicas de chapado se basan en el entendimiento de que las características de unión a antígeno de una parte de unión a antígeno se determinan principalmente mediante la estructura y la disposición relativa de los grupos de CDR de cadena pesada y ligera en la superficie de asociación a antígeno (por ejemplo, véase Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439, 1990). De este modo, la especificidad de asociación a antígeno se puede conservar en un anticuerpo humanizado sólo cuando las estructuras de CDR, su interacción entre sí y su interacción con el resto de dominios de región variable se mantienen meticulosamente. Mediante la utilización de técnicas de chapado, los residuos FR exteriores (por, ejemplo, accesible al disolvente) que son fácilmente accesibles por el sistema inmune se sustituyen selectivamente con residuos humanos para proporciona una molécula híbrida que comprende una superficie chapada débilmente inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. [0095] Preferiblemente, las parejas de interacción adecuados para su uso como agentes terapéuticos (o portadores de agentes terapéuticos) muestran una especificidad elevada por el marcador tumoral diana y una unión de base baja con otros marcadores tumorales. En ciertas realizaciones, se prefieren anticuerpos monoclonales para fines terapéuticos. [0096] Los marcadores tumorales que se expresan en la superficie cellular representan dianas preferidas para el desarrollo de agentes terapéuticos, particularmente anticuerpos terapéuticos. Por ejemplo, las proteínas de la superficie celular se pueden identificar provisionalmente utilizando un análisis de secuencia basado en la presencia de un dominio transmembrana previsto. Su presencia en la superficie celular se puede confirmar por último utilizando HC. Kits

[0097] Los grupos o paneles útiles de parejas de interacción según la presente invención se pueden preparar y envasar juntos en kits para su uso en la clasificación,

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diagnóstico o, de otro modo, la caracterización de las muestras tumorales, o para la inhibición del crecimiento de células tumorales o , de otro modo, el tratamiento del cáncer. [0098] Se puede utilizar cualquier técnica disponible en la preparación de parejas de interacción individuales para la inclusión en kits. Por ejemplo, las parejas de interacción proteínas o polipéptidos se pueden producir por las células (por ejemplo, recombinantemente o de otro modo), se pueden sintetizar químicamente, o, de otro modo, se pueden generar in vitro (por ejemplo, a través de la transcripción y/o traducción in vitro). Las parejas de interacción que no son proteínas o polipéptidos (por ejemplo, moléculas pequeñas, etc.) se pueden sintetizar, se pueden aislar de las células que las producen o alrededor de éstas, o, en cualquier caso, se pueden generar.

[0099] Cuando los anticuerpos se utilizan como parejas de interacción, éstos se pueden preparar mediante cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales, o a través de la transfección de genes de anticuerpos en huéspedes de células bacterianas o de mamífero adecuadas, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un “inmunógeno” que comprende una parte antigénica de un marcador tumoral de interés (o el propio marcador tumoral) se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, un marcador tumoral (o una parte antigénica del mismo) puede servir como inmunógeno sin modificación. Alternativamente, particularmente para marcadores tumorales relativamente cortos, se puede obtener una respuesta inmune superior si el marcador tumoral se une a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de la lapa californiana (KLH). El inmunógeno se inyecta en el huésped animal, preferiblemente según una pauta predeterminada que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo y los animales se hacen sangrar periódicamente. A continuación, los anticuerpos policlonales específicos para el marcador tumoral se pueden purificar de dicho antisuero, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad utilizando el marcador tumoral (o una parte antigénica del mismo) acoplado a un soporte sólido adecuado. Un método de ejemplo se describe en el ejemplo 7.

[0100] Si se desean para kits de diagnóstico o terapéutico, se pueden preparar anticuerpos monoclonales específicos para un marcador tumoral de interés, por

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ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511, 1976 y las mejoras a la misma. Brevemente, estos métodos implican a preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen una especificidad deseada (es decir, una reactividad con el marcador tumoral de interés). Se pueden producir dichas líneas celulares, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado tal como se ha descrito anteriormente. Las células de bazo a continuación se inmortalizan mediante, por ejemplo, fusión con un compañero de fusión de la célula de mieloma, preferiblemente aquel que es singeneico con el animal inmunizado. Se pueden utilizar un conjunto de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante unos minutos y, a continuación, se emplacan a densidad baja en un medio selectivo que soporta el crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza la selección de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, normalmente aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan las colonias individuales y se analizan los sobrenadantes de cultivo por la actividad de unión contra el marcador tumoral. Se prefieren los hibridomas que tienen una reactividad y especificidad elevadas

[0101] Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, se pueden utilizar varias técnicas para aumentar el rendimiento, tal como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón. A continuación, los anticuerpos monoclonales se pueden recoger del fluido ascítico o sangre o de la sangre. Se pueden eliminar contaminantes de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. El marcador tumoral de interés se puede utilizar en el proceso de purificación en, por ejemplo, una etapa de cromatografía de afinidad. [0102] Además de las parejas de interacción de la invención, los kits preferidos para su uso según la presente invención pueden incluir, una muestra de referencia, instrucciones para procesar muestras, realizar la prueba, instrucciones para interpretar los resultados, tampones y/u otros reactivos necesarios para realizar la prueba. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender un panel de anticuerpos. Composiciones farmacéuticas [0103] Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona nuevas terapias y métodos para identificar a éstas. En ciertas realizaciones, un pareja

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de interacción puede ser útil como agente terapéutico. Alternativamente o adicionalmente, las parejas de interacción definidos o preparados según la presente invención se unen a marcadores tumorales que actúan como dianas para agentes terapéuticos. Además, las parejas de interacción de la invención se pueden utilizar para liberar un agente terapéutico a una célula cancerosa. Por ejemplo, las parejas de interacción proporcionados según la presente invención se pueden acoplar a uno o más agentes terapéuticos. [0104] Además, tal como se ha mencionado anteriormente, en tanto en cuanto una panel predictivo particular se correlacione con una respuesta a una terapia concreta porque detecta cambios que reflejan la inhibición (o la capacidad de inhibición) del crecimiento de células cancerosas, se podría utilizar ese panel para evaluar los candidatos terapéuticos (por ejemplo, fármacos de molécula pequeña) por su capacidad de inducir el mismo o cambios similares en células diferentes. En particular, la unión mediante el panel se podía evaluar en células cancerosas antes y después de la exposición a agentes terapéuticos candidatos; a continuación se identifican los candidatos que inducen la expresión de los marcadores tumorales a los que se une el panel. [0105] La presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden estos agentes terapéuticos de la invención. En general, una composición farmacéutica incluirá un agente terapéutico además de uno o más agentes inactivos, tales como un portador biocompatible estéril que incluyen, sin limitación, agua estéril, solución salina, solución salina tamponada o solución de dextrosa. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes terapéuticos, que incluyen otros agentes quimioterapéuticos, hormonas, vacunas y/o terapia por radiación. Por “en combinación con” no pretende entenderse que los agentes deben administrarse a la vez o formularse para una liberación conjunta, aunque estos métodos se encuentran en el alcance de la invención. En general, cada agente se administrará en una dosis y en una pauta de tiempo determinada para cada agente. Adicionalmente, la presente invención comprende la liberación de las composiciones farmacéuticas de la invención en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir o modificar su metabolismo, inhibir su excreción, o modificar su distribución en el cuerpo. La invención comprende el tratamiento del cáncer mediante la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención. Aunque las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento de cualquier sujeto (por ejemplo, cualquier animal) con necesidad

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del mismo, se utilizan más preferiblemente en el tratamiento de humanos. [0106] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a humanos y otros animales mediante un conjunto de rutas que incluyen las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, subcutánea, intraventricular, transdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como en polco, pomadas o gotas), bucal, o como un pulverizador oral o nasal o aerosol. En general, la ruta de de administración más apropiada dependerá de un conjunto de factores que incluyen, la naturaleza del agente (por ejemplo, si el paciente es capaz de tolerar la administración oral), etc. En la actualidad, la ruta intravenosa es la más utilizada habitualmente para liberar anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, la presente invención comprende la liberación de la composición farmacéutica de la invención mediante cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta probable avances en la ciencia de la liberación de fármacos. [0107] Las consideraciones generales en la formulación y fabricación de agentes farmacéuticos se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. [0108] Según los métodos de tratamiento de la presente invención, el cáncer se trata o previene en un paciente, tal como un ser humano u otro mamífero mediante la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de la invención en dichas cantidades y durante dicho tiempo según sea necesario para conseguir el resultado deseado. Por una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente terapéutico de la presente invención se entiende una cantidad suficiente del agente terapéutico a tratar (por ejemplo, para mejorar los síntomas, retrasar la progresión, evitar la reaparición, curar, etc..) un cáncer en una relación beneficio/riesgo razonable, que implica un equilibrio de la eficacia y la toxicidad del agente terapéutico. En general, la eficacia terapéutica y la toxicidad se pueden determinar mediante procedimientos farmacológicos estándar en cultivos celulares o con animales experimentales, por ejemplo, calculando la ED50 (la dosis que es terapéuticamente eficaz en un 50% de los sujetos tratados) y la LD50 (la dosis que es letal para el 505 de los sujetos tratados). La ED50/LD50 representa el índice terapéutico del agente. Aunque, en general, se prefieren los agentes terapéuticos que tienen un índice terapéutico grande, tal como se conoce en la técnica, un índice terapéutico menor puede ser aceptable en el caso de una enfermedad seria, particularmente en ausencia de opciones terapéutica alternativas. La selección final de un intervalo apropiado de las dosis para la administración a humanos se determina en

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la evolución de las pruebas clínicas. [0109] Se entenderá que la utilización diaria total de los agentes terapéuticos y las composiciones de la presente invención para cualquier paciente determinado se decidirá por el médico a cargo según el criterio médico sensato. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno en tratamiento y la gravedad del trastorno, la actividad del agente terapéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración y la velocidad de excreción del agente terapéutico específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o casualmente con el agente terapéutico específico empleado; y factores similares conocidos en el sector médico..

[0110] La dosis diaria total de los agentes terapéuticos de la presente invención administrada a un humano u otro mamífero en dosis individuales o divididas puede ser en cantidades, por ejemplo, desde 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal o más, normalmente desde 0,1 a 25 mg/kg de peso corporal. Las composiciones de dosis individual pueden contener dichas cantidades o submúltiplos de las mismas formando la dosis diaria. En general, las pautas de tratamiento según la presente invención comprenden la administración a un paciente con necesidad de dicho tratamiento de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 2000 mg del agente o agentes terapéuticos de la invención por día en dosis individuales o múltiples. Ejemplos Ejemplo 1: Selección de genes candidatos e identificación de potenciales parejas de interacción para paneles de clasificación de tumores [0111] Los presentes inventores identificaron una colección de genes candidatos que

(a): se expresaban diferencialmente a lo largo de un conjunto de muestras de tumor de un modo que sugería que diferenciaban biológicamente clases de tumores diferentes;

(b): eran miembros de una clase de gen funcional que se había unido a mecanismos celulares implicados en el pronóstico de tumores o resistencia a fármacos; (c) se sabía

o pensaba que mostraban una expresión, localización, modificación, o patrón de actividad que se correlacionaba con una característica relevante del tumor; etc. [0112] Por ejemplo, se identificaron genes expresados diferencialmente utilizando microarrays tal y como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite nº de serie 09/916,722, presentada el 26 de julio, 2001 titulada "REAGENTS AND METHODS FOR USE IN MANAGING BREAST CANCER". Se seleccionaron

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habitualmente otros genes en base a los datos publicados sugiriendo su posible implicación en la resistencia a fármacos, pronóstico del cáncer, etc. Se identificaron un total de 730 genes candidatos como proteínas codificantes contra los que deberían desarrollarse anticuerpos. [0113] A continuación, se desarrollaron anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad contra 661 de estas proteínas tal y como se describe en el Ejemplo 7. Cada anticuerpo se evaluó inicialmente sobre un rango de diluciones en grupos de tejidos que incluían un conjunto de tejidos normales, tejidos tumorales y líneas celulares, de modo que, para cada anticuerpo, se estableció un título discriminatorio cuya tinción diferencial se observó a través de un grupo diverso. Se describe la preparación y la tinción de los grupos de tejido en mayor detalle en el Ejemplo 8. De los 661 anticuerpos sujetos a este análisis, 460 mostraron una tinción diferencial y se consideraron de interés suficiente para análisis adicionales. Ejemplo 2: Panel de clasificación del cáncer de mama (cohorte de mama rusa) [0114] Los presentes inventores prepararon un panel de ejemplo de anticuerpos para utilizar en la clasificación de tumores de mama. 272 de los 460 anticuerpos de tinción diferencial del Ejemplo 1 mostraron un patrón de tinción reproduciblemente robusto en tejidos relevantes para esta aplicación. Por lo tanto, estos anticuerpos se aplicaron (en títulos apropiados) a un grupo de tejidos compuesto de aproximadamente 400 muestras de tumor de mama independientes de un cohorte de pacientes de cáncer de mama (la cohorte de mama ruso). Se puntuaron las muestras de tejido teñidas por un citotecnólogo o patólogo en una escala semi-cuantitativa en la que 0 = sin teñir en las células tumorales; 1 = sin información; 2 = tinción débil de células tumorales; y 3 = tinción fuerte de células tumorales. Se incluyeron anticuerpos en un panel de clasificación de cáncer de mama si se tiñeron más del 10% y menos del 90% de un "panel de consenso" definido de las muestras de tejido de tumor de mama en por lo menos dos grupos de tejido independientes. [0115] Se incluyó una muestra de tejido determinado en este "panel de consenso" si por lo menos el 80% de los anticuerpos evaluados daban puntuaciones interpretables (es decir, un resultado no cero) con esa muestra. De las 400 muestras de tumor de mama en el grupo de tejidos se incluyeron aproximadamente 320 en el panel de consenso. También, al valorar la unión de anticuerpo al panel de consenso, todas las puntuaciones representaban una puntuación de consenso de grupos de tejido replicados compuesto por muestras independientes de las mismas fuentes. Se determinó la puntuación de consenso mediante el cálculo de la mediana (redondeada hacia abajo

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hasta un número entero, si es aplicable) de todas las puntuaciones asociadas con un anticuerpo determinado aplicadas bajo condiciones idénticas a la muestra del paciente particular. En los casos en que la variancia de las puntuaciones era mayor que 2, se cambiaba la puntuación a 1 (es decir, sin información). Se guardaron los datos para cada anticuerpo en una base de datos basada en Oracle que contenía las puntuaciones semi-cuantitativas de tinción de tejido de tumor y también contenía enlaces con la información clínica del paciente y con las imágenes guardadas de las muestras de pacientes teñidas. [0116] A través de este análisis se seleccionaron 90 de los 272 anticuerpos evaluados para su inclusión en un panel de clasificación de cáncer de mama de ejemplo (ver Apéndice A, por ejemplo, S0021, S0022, S0039, etc.). Se sobreentiende que cualquier sub-combinación de estos 90 anticuerpos puede utilizarse en la construcción de un panel de clasificación de cáncer de mama de la invención. También se entenderá que pueden añadirse o eliminarse anticuerpos adicionales de un panel de clasificación de cáncer de mama de la invención a medida que se identifican más marcadores tumorales y/o se evalúan más muestras (por ejemplo, ver Ejemplo 3). [0117] La Figura 1 muestra el patrón de reactividad observada con ciertos miembros de este panel de anticuerpos a través de muestras de la cohorte de mama rusa. El gris oscuro representa un tinción positiva intensa, el negro representa una tinción positiva débil, mientras que el gris claro representa la ausencia de tinción y el gris medio representa falta de información. Pueden encontrarse en el Apéndice B imágenes de muestras teñidas (ver columna de la derecha del Apéndice A para referencias cruzadas con los anticuerpos correspondientes). [0118] Se clasificaron los pacientes (filas) utilizando agrupaciones de k-medias (tal y como se describe, por ejemplo, en MacQueen en Proceedings of the Fifth Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability (Le Cam et al., Eds.; University of California Press, Berkeley, CA) 1:281, 1967; Heyer et al., Genome Res. 9:1106, 1999), mientras que los anticuerpos (columnas) se organizaban utilizando una agrupación jerárquica (tal y como se describe en, por ejemplo, Sokal et al., Principles of Numerical Tazonomy (Freeman & Co., San Francisco, CA), 1963; Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14863, 1998). Tal y como se muestra en la Figura 1, se identificaron nueve sub-clases de pacientes de cáncer de mama mediante su patrón de consenso de tinción con este panel de clasificación de cáncer de mama. Ejemplo 3: Panel de clasificación de cáncer de mama (cohorte de mama HH)

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[0119] Con el objetivo de refinar y expandir el panel de clasificación de cáncer de mama del Ejemplo 2, los presentes inventores evaluaron 109 de los 460 anticuerpos de tinción diferencial del Ejemplo 1 en muestras de un nuevo cohorte de 550 pacientes de cáncer de mama (la cohorte de mama del Huntsville Hospital o cohorte de "mama HH", las características del cual están descritas en el Ejemplo 10). [0120] Se incluyeron anticuerpos en un panel de clasificación de cáncer de mama actualizado si se teñían más del 10% y menos del 90% del panel de consenso particular de muestras de tejido evaluadas. A través de este análisis se seleccionaron 87 de los 109 anticuerpos evaluados (ver Apéndice A, por ejemplo, S0011, S0018, S0020, etc.). Ejemplo 4: Panel de clasificación de cáncer de pulmón (cohorte de pulmón ruso) [0121] Los presentes inventores también prepararon un panel de ejemplo de anticuerpos para utilizar en la clasificación de tumores de pulmón. 417 de los 460 anticuerpos de tinción diferencial del Ejemplo 1 mostraron un patrón de tinción reproduciblemente robusto en tejidos relevantes para esta aplicación. Por lo tanto se aplicaron estos anticuerpos (en los títulos determinados en el Ejemplo 1) a un grupo de tejidos compuesto de aproximadamente 400 tejidos de tumor de pulmón independientes de un cohorte de pacientes de cáncer de pulmón (la cohorte de pulmón ruso). Se puntuaron las muestras de tejido teñido por un citotecnólogo o patólogo como antes y se incluyeron de nuevo anticuerpos en el panel de clasificación si se teñía más del 10% y menos del 90% de un "panel de consenso" definido de muestras de tejido en por lo menos dos grupos de tejido independientes. [0122] A través de este análisis se generó un panel de clasificación de cáncer de pulmón de ejemplo que estaba formado de 106 de los 417 anticuerpos evaluados (ver Apéndice A, por ejemplo, s0021, s0022, s0024, etc.). Se sobreentiende que cualquier subcombinación de esos 106 anticuerpos puede utilizarse en la construcción de un panel de clasificación de cáncer de pulmón de la invención. También se entenderá que pueden añadirse o eliminarse anticuerpos adicionales de un panel de clasificación de cáncer de pulmón de la invención a medida que se identifican más marcadores tumorales y/o se evalúan más muestras (por ejemplo, ver Ejemplo 5). [0123] La Figura 2 muestra el patrón de reactividad observado con ciertos miembros de este panel de anticuerpos a través de muestras de la cohorte de pulmón ruso. El gris oscuro representa una tinción positiva intensa, el negro representa una tinción positiva débil, mientras que el gris claro representa la ausencia de tinción y el gris medio representa falta de información. Pueden encontrarse en el Apéndice B imágenes de

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muestras teñidas (ver columna de la derecha del Apéndice A para referencias cruzadas con los anticuerpos correspondientes). [0124] Se clasificaron de nuevo los pacientes (filas) utilizando agrupaciones de k-medias mientras los anticuerpos (columnas) se organizaron utilizando una agrupación jerárquica. Tal y como se muestra en la Figura 2, se identificaron ocho sub-clases de pacientes de cáncer de pulmón mediante su patrón de consenso de tinción con este panel de clasificación de cáncer de pulmón. Ejemplo 5: Panel de clasificación del cáncer de pulmón (cohorte de pulmón HH)

[0125] Con el fin de refinar y ampliar el panel de clasificación del cáncer de pulmón del ejemplo 4, los presentes inventores analizaron 54 de los 460 anticuerpos diferenciados por tinción del Ejemplo 1 en muestras de un nuevo cohorte de 379 pacientes de cáncer de pulmón (la cohorte de pulmón del Hospital Huntsville o cohorte de “pulmón HH”, las características del cual se describen en el ejemplo 11). [0126] Los anticuerpos se incluyeron en un panel de clasificación de cáncer de colon actualizado si se teñían en más de un 10% y menos de un 90% del panel de consenso particular de las muestras de tejido analizadas. A través de este análisis se seleccionaron 39 de los 54 anticuerpos analizados (véase el Apéndice A, por ejemplo, S0021, S0022, S0046, etc.). Ejemplo 6: Panel de clasificación del cáncer de colon (cohorte de colon ruso) [0127] Los presentes inventores también prepararon un panel de anticuerpos de ejemplo para su uso en la clasificación de tumores de colon. 382 de los 460 anticuerpos diferenciados por tinción del Ejemplo 1 mostraron un patrón de tinción robusto de forma reproducible para esta aplicación. Por tanto, se aplicaron estos anticuerpos (en los títulos determinados en ele ejemplo 1) a un conjunto de tejidos comprendidos de aproximadamente 400 tejidos de tumor de colon independientes de un cohorte de pacientes de cáncer de colon (la cohorte de colon ruso). Las muestras de tejido teñidas se puntuaron por un citotecnólogo o patólogo cualificado como antes y se incluyeron de nuevo los anticuerpos en el panel de clasificación si teñían más de un 10% y menos de un 90% de un “panel de consenso” definido de muestras de tejido en por lo menos dos grupos de tejido independientes. [0128] A través de este análisis, se generó un panel de clasificación de anticuerpos de colon que estaba formado de 86 de los 382 anticuerpos analizados (véase el Apéndice A, por ejemplo, S0022, S0036, S0039, etc.). Se entenderá que se puede utilizar cualquier subcombinación de estos 86 anticuerpos en la construcción de un panel de clasificación del cáncer de colon de la invención. También se entenderá que se pueden

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añadir o eliminar anticuerpos adicionales de un panel de clasificación de cáncer de colon de la invención a medida que se identifican más marcadores tumorales y/o se analizan más muestras. [0129] La figura 3 muestra el patrón de reactividad observado con ciertos miembros de este panel de anticuerpos a través de muestras de la cohorte de colon ruso. El gris oscuro representa la tinción positiva intensa, negro representa una tinción positiva débil, mientras que el gris claro representa la ausencia de tinción y el gris normal representa falta de información. Las imágenes de las muestras teñidas se pueden hallar en el Apéndice B (véase la columna de la derecha del Apéndice A para las referencias cruzadas a los anticuerpos correspondientes). [0130] Los pacientes (filas) se clasificaron de nuevo utilizando la agrupación de k-medias, mientras que los anticuerpos (columnas) se organizaron utilizando una agrupación jerárquica. Tal como se muestra en la figura 3, se identificaron siete subclases de pacientes mediante su patrón de consenso de tinción con este panel de clasificación de cáncer de colon de ejemplo. Ejemplo 7: Desarrollo de anticuerpos [0131] Este ejemplo describe un método que se utilizó para generar la mayoría de los anticuerpos que se utilizaron en los ejemplos 1-6. Se pueden utilizar métodos similares para generar un anticuerpo que se une a cualquier polipéptido de interés (por ejemplo, a polipéptidos que son o derivan de otros marcadores tumorales). En algunos casos, los anticuerpos se pueden obtener de fuentes comerciales (por ejemplo, Chemicon, Dako, Oncogene Research Products, NeoMarkers, etc.) u otras fuentes públicamente disponibles (por ejemplo, Imperial Cancer Research Technology, etc.). Materiales y soluciones [0132]

•: Anisol (Cat. No. A4405, Sigma, St. Louis, MO)

•: 2,2’-azino-di-(3-etil-benztiazolin-ácido sulfónico) (ABTS) (Cat. No. A6499, Molecular Probes, Eugene, OR)

•: Hemocianina de lapa californiana con maleimida activada (Cat. No. 77106, Pierce, Rockford, IL)

•: Hemocianina de lapa californina (Cat. No. 77600, Pierce, Rockford, IL)

•: Ácido fosfórico (H3PO4) (Cat. No. P6560, Sigma)

•: Ácido acético glacial (Cat No. BP 1185-500, Fisher)

•: EDC (EDAC) (Cat No. 341006, Calbiochem)

•: 25% Glutaraldehido (Cat No. G-5882, Sigma)

•: Glicina (Cat No. G-8898, Sigma)

•: Biotina (Cat. No. B2643, Sigma)

•: Ácido bórico (Cat. No. B0252, Sigma)

•: Sefarosa 4B (Cat. No. 17-0120-01, LKB/Pharmacia, Uppsala, Suecia)

•: Albúmina de suero bovino (LP) (Cat. No. 100 350, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)

•: Bromuro de cianógeno (Cat. No. C6388, Sigma)

•: MWCO por Espectro/Membrana para tubos de diálisis 6-8,000 (Cat. No. 132 665, Spectrum Industries, Laguna Hills, CA)

•: Dimetil formamida (DMF) (Cat. No. 22705-6, Aldrich, Milwaukee, WI)

•: DIC (Cat. No. BP 592-500, Fisher)

•: Etanoditiol (Cat. No. 39,802-0, Aldrich)

•: Éter (Cat. No. TX 1275-3, EM Sciences)

•: Ácido Etilendiaminotetraacético acid (EDTA) (Cat. No. BP 120-1, Fisher, Springfield, NJ)

•: 1-etil-3-(3’dimetilaminopropil)-carbodiimida, HCL (EDC) (Cat. no. 341-006, Calbiochem, San Diego, CA)

•: Adyuvante Completo de Freund (Cat. No. M-0638-50B, Lee Laboratories, Grayson, GA)

•: Adyuvante Incompleto de Freund (Cat. No. M-0639-50B, Lee Laboratories)

•: Columnas de cromatografía Fritted (Parte de la Columna No. 12131011; Parte de poro No. 12131029, Varian Sample Preparation Products, Harbor City, CA)

•: Gelatina de Piel Bovina (Cat. No. G9382, Sigma)

•: IgG anti-conejo de cabra, biotinilada (Cat. No. A 0418, Sigma)

•: HOBt (Cat. No. 01-62-0008, Calbiochem)

•: Peroxidasa de rábano picante (HRP) (Cat. No. 814 393, Boehringer Mannheim)

•: HRP-Estreptavidina (Cat. No. S 5512, Sigma)

•: Ácido clorhídrico (Cat. No. 71445-500, Fisher)

•: Peróxido de hidrógeno al 30% p/p (Cat. No. H1009, Sigma)

•: Metanol (Cat. No. A412-20, Fisher)

•: Placas de microtitulación, 96 pocillos (Cat. No. 2595, Corning-Costar, Pleasanton, CA)

•: Aminoácidos protegidos con N-α-Fmoc de Calbiochem. See ’97-’98 Catalog pp. 1

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45.

• N Aminoácidos protegidos con N-α-Fmoc unidos a Resina Wang de Calbiochem.

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Véase ’97-’98 Catalog pp. 161-164.

•: NMP (Cat. No. CAS 872-50-4, Burdick and Jackson, Muskegon, MI)

•: Péptido (sintetizado por Research Genetics. Detalles indicados a continuación)

•: Piperidina (Cat. No. 80640, Fluka, disponibles a través Sigma)

•: Bicarbonato sódico (Cat. No. BP328-1, Fisher)

•: Borato sódico (Cat. No. B9876, Sigma)

•: Carbonato sódico (Cat. No. BP357-1, Fisher)

•: Cloruro sódico (Cat. No. BP 358-10, Fisher)

•: Hidróxido sódico (Cat. No. SS 255-1, Fisher)

•: Estreptavidina (Cat. No. 1 520, Boehringer Mannheim)

•: Tioanisol (Cat. No. T-2765, Sigma)

•: Ácido trifluoroacético (Cat. No. TX 1275-3, EM Sciences)

•: Tween-20 (Cat. No. BP 337-500, Fisher)

•: Wetbox (Rectangular Servin’ Saver™ Part No. 3862, Rubbermaid, Wooster, OH)

•: BBS – Solución salina tamponada con borato con EDTA disuelto en agua destilada (pH 8,2 a 8,4 con HCl o NaOH), borato sódico 25 mM (Borax), ácido bórico 100 mM, NaCl 75 mM y EDTA 5 mM.

•: HCl 0,1 N en solución salina tal como se indica: HCl concentrado (8,3 ml/0,917 litros de agua destilada) y NaCl 0,154 M

•: Glicina (pH 2,0 y pH 3,0) disuelta en agua destilada y ajustada al pH deseado, glicina 0,1 M y NaCl 0,154 M.

•: 5X Borato 1X cloruro sódico disuelto en agua destilada, NaCl 0,11 M, borato de sodio 60 mM y ácido bórico 250 mM.

•: Tampón sustrato en agua destilada ajustada a pH 4,0 con hidróxido sódico, ácido cítrico 50 a 100 mM.

•: Solución AA: HOBt se disuelve en NMP (8,8 gramos de HOBt hasta 1 litro NMP). Aminoácido con Fmoc-N a una concentración de 0,53 M.

•: solución DIC: 1 parte DIC a 3 partes NMP.

•: solución desprotectora: 1 parte Piperidina a 3 partes DMF.

•: Reactivo R: 2 partes anisol, 3 partes etanoditiol, 5 partes tioanisol y 90 partes ácido trifluoroacético. Equipamiento [0133]

•: Lector de placas MRX (Dynatech, Chantilly, VA)

•: Hamilton Eclipse (Hamilton Instruments, Reno, NV)

•: Centrífuga Beckman TJ-6 (Modelo No. TJ-6, Beckman Instruments, Fullerton, CA)

•: Registrador de gráficos (Registrador 1 Parte No. 18-1001-40, Pharmacia LKB Biotechnology)

•: Monitor UV (Uvicord SII Part No. 18-1004-50, Pharmacia LKB Biotechnology)

•: Concentrador de Células Agitadas Amicon (Modelo 8400, Amicon, Beverly, MA)

•: Filtro de corte de PM 30 kD (Cat. No. YM-30 Membranes Cat. No. 13742, Amicon)

•: Pipeteador Automático Multi-canal (Cat. No. 4880, Coming Costar, Cambridge, MA)

•: pH Metro Coming 240 (Coming Science Products, Coming Glassworks, Coming, NY)

•: Sintetizador de péptidos ACT396 (Advanced ChemTech, Louisville, KY)

•: Secador al vacío (Box de Labconco, Kansas City, MO y bomba de Alcatel, Laurel, MD).

•: Liofilizador (Unitop 600sl en tandem con Freezemobile 12, ambos de Virtis, Gardiner, NY)

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Selección de péptidos

[0134] Los péptidos contra anticuerpos a desarrollar se seleccionaron de la secuencia de polipéptido de interés utilizando un programa que utiliza el método Hopp/Woods (descrito en Hopp y Woods, Mol. Immunol. 20:483, 1983 y Hopp y Woods, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824, 1981). El programa utiliza una ventana de rastreo que identifica las secuencias de péptidos de 15-20 aminoácidos que contienen varios epítopos antigénicos posibles tal como se predice por la baja accesibilidad al disolvente. Esto contrasta con la mayoría de implementaciones del método Hopp/Woods, que identifican supuestos epítopos antigénicos únicos cortos (≈ 6 aminoácidos). Ocasionalmente, la accesibilidad al disolvente prevista se valoró adicionalmente mediante la predicción PHD de estructuras en bucle (descrito en Rost y Sander, Proteins 20:216, 1994). Las secuencias de proteínas preferidas muestran una mínima similitud con proteínas humanas conocidas adicionales. La similitud se determinó realizando alineaciones BLASTP, utilizando un tamaño de palabra de 2 (descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990). Se examinaron todas las alineaciones indicadas que daban un valor ESPERADO inferior a 1000 y las alineaciones con similitudes superiores al 60% o más o más de cuatro residuos en una alineación contigua sin espacios forzaron el rechazo de los péptidos. Cuando se deseaba reconocer regiones de proteínas expuestas al exterior de la membrana celular, se determinaron las regiones extracelulares de la proteína de interés a partir de la literatura o tal como se define mediante dominios transmembrana previstos utilizando

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un modelo Markov escondido (descrito en Krogh et al., J. Mol. Biol. 305:567, 2001). Cuando la secuencia del péptido estaba en un dominio extracelular, se rechazaron los péptidos si contenían sitios de glicosilación unidos a N. Tal como se muestra en el Apéndice A, se seleccionaron de una a tres secuencias de péptidos para cada polipéptido utilizando este procedimiento.

Síntesis de péptidos

[0135] La secuencia del péptido deseado se dispuso en un sintetizador de péptidos. Se determinó el residuo C-terminal y se unió la Resina Wang adecuada al recipiente de reacción. Los péptidos se sintetizaron del extremo C al extremo N terminal mediante la adición de un aminoácido cada vez utilizando un ciclo de síntesis. El aminoácido que se añadía estaba controlado por el sintetizador de péptidos, el cual mira a la secuencia del péptido que se entró en su base de datos. Las etapas de síntesis se realizaron la siguiente manera: Etapa 1 – Hinchamiento de la resina-Se añaden 2 ml de DMF, se incuban durante 30 minutos, se drena en DMF. Etapa 2 – Ciclo de síntesis (repetido sobre la longitud del péptido) 2a -Desprotección: se añadió 1 ml de solución de desprotección al recipiente de reacción y se incubó durante 20 minutos. 2b – Ciclo de lavado 2c – Acoplamiento: se añadieron al recipiente de reacción 750 ml de la solución de aminoácidos (cambia a medida que la secuencia avanza según lo dictado por el sintetizador de péptidos) y 250 ml de una solución DIC. El recipiente de reacción se incubó durante 40 minutos y se lavó una vez. La etapa de acoplamiento se repitió una vez. 2d – Ciclo de lavado Etapa 3 – Desprotección final: Se realzaron las Etapas 2a y 2b una última vez. [0136] Las resinas se deshincharon en metanol (enjuagado dos veces en 5 ml de metanol, incubado 5 minutos en 5ml de metanol, enjuagado en 5 ml de metanol, y a continuación se secaron al vacío.

[0137] El péptido se extrajo de la resina mediante la incubación durante 2 horas en reactivo R y, a continuación, se precipitó en éter. El péptido se lavó en éter y, a continuación, se secó al vacío. El péptido se resolubilizó en diH2O, se congeló y se liofilizó durante la noche.

Conjugación del péptido con la hemocianina de lapa californiana

[0138] El péptido (6 mg) se conjugó con hemocianina de lapa California (KLH).

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Cuando el péptido seleccionado incluía por lo menos una cisteína, se disolvieron tes alícuotas (2 mg) en PBS (2 ml) y se acoplaron a KLH a través de KLH activado por glutaraldehído, EDC o maleimida (2 mg) en 2 ml de PBS para un volumen total de 4 ml. Cuando el péptido carecía de cisteína, se acoplaron dos alícuotas ( 3mg) a través de los métodos de glutaraldehido y EDC.

[0139] El acoplamiento de la maleimida se realiza mezclando 2mg del péptido con 2 mg de la KLH activada por maleimida disuelta en PBS (4 ml) e incubando 4 horas.

[0140] El acoplamiento con EDC se realiza mezclando 2 mg de péptido, 2 mg de KLH no modificada y 20 mg de EDC en 4 ml de PBS (disminuido a pH 5 mediante la adición de ácido fosfórico) e incubando durante 4 horas. La reacción se detiene mediante la adición lenta de 1,33 ml de ácido acético (pH 4,2(). Cuando se utiliza EDC para acoplar 3 mg de péptido, las cantidades indicadas anteriormente se incrementan en un factor de 1,5. [0141] El acoplamiento con glutaraldehído tiene lugar cuando se mezclan 2 mg de péptido con 2 mg de KLH en 0,9 ml de PBS. Se añaden 0,9 ml de glutaraldehído al 0,2% en PBS y se mezclan durante una hora. Se añaden 0,46 ml de glicina 1 M en PBS y se mezclan durante una hora. Cuando se utiliza glutaraldehído para acoplar 3 mg de péptido, las cantidades indicadas anteriormente se incrementan en un factor de 1,5. [0142] Las alícuotas conjugadas se reagruparon posteriormente, se mezclaron durante dos horas y se dializaron en 1 litro de PBS y se liofilizó. Inmunización de conejos [0143] Se inyectaron dos Conejos Blancos de Nueva Zelanda con 250 μg (total) de péptido conjugado a KLH en un volumen igual de adyuvante completo de Freund y solución salina en un volumen total de 1 ml. A continuación, se inyectaron 100 μg de péptido conjugado a KLH en un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund y solución salina en tres a cuatro sitios dorsales subcutáneos para un volumen total d 1 ml, dos, seis, ocho y doce semanas después de la primera inmunización. La pauta de inmunización fue la siguiente: Día 0 Inmunización primaria, sangrado preinmune Día 15 Primer refuerzo Día 27 Primer sangrado Día 44 Segundo refuerzo Día 57 Segundo sangrado y tercer refuerzo Día 69 Tercer sangrado Día 84 Cuarto refuerzo

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Día 98 Cuarto sangrado

Recogida de suero de conejo

[0144] Se hicieron sangrar conejos (30 a 50 ml) de la arteria auricular. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente durante 15 minutos y se separó el suero de la coagulación utilizando una centrífuga IEC DPR-6000 a 5000g. El suero libre de células se decantó suavemente en un tubo de ensayo limpio y se almacenó a -20°C para la purificación por afinidad.

Determinación de título de anticuerpos

[0145] Todas las soluciones a excepción de la solución de lavado se añadieron mediante el Hamilton Eclipse, un dispensador manual de líquido. El título de anticuerpo se determinó en los conejos utilizando un ensayo ELISA con péptido en fase sólida. Se recubrieron pasivamente placas ELISA de unión elevada flexible con péptido diluido en BBS (100 μl, 1 μg/pocillo) y la placa se incubó a 4°C en un “wetbox” durante la noche (recipiente hermético con bolas de algodón humedecidas). Las placas se vaciaron y, a continuación, se lavaron tres veces con BBS que contenía Tween-20 al 0,1% (BBS-TW) mediante el llenado y vaciado repetido utilizando un lavador de placas semiautomático. Las placas se bloquearon mediante el llenado completo de cada pocillo con BBS-TW que contenía BSA al 1% y gelatina al 0,1% (BBS-TW-BG) y la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se vaciaron y se añadieron los sueros del suero post-inmune y pre-inmune a los pocillos. El primer pocillo contenía suero a 1:50 en BBS. A continuación, los sueros se titularon en serie once veces más a lo largo de la placa en una proporción de 1:1 para una dilución final (doceava) de 1:204,800. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se vaciaron y se lavaron tes veces tal como se ha descrito. [0146] Se añadió IgG anti-conejo de cabra biotinilada (100 μg) a cada pocillo de ensayo de la placa de microtitulación y se incubó durante cuatro horas a temperatura ambiente. Las placas se vaciaron y lavaron tres veces. Se añadió estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante (100 μl diluida 1:10.000 en BBS-TW-BG) a Cada pocillo y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se vaciaron y lavaron tres veces Se preparó ABTS nueva a partir de la solución madre combinando 10 ml de tampón citrato (0,1 M a pH 4,0), 0,2 ml de la solución madre (15 mg/ml en agua) y 10 μl de peróxido de hidrógeno al 30%. Se añadió solución ABTS (100 μl) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente. Las placas se leyeron a 414 nm, 20 minutos después de la adición de sustrato.

Preparación de Columna de Purificación por Afinidad de Péptido:

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[0147] La columna de afinidad se preparó conjugando 5 mg de péptido a 10 ml de Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno y 5 mg de péptido a hidrazina-Sefarosa 4B. Brevemente, se añadieron 100 μl de DMF a péptido (5 mg) y la mezcla se agitó hasta que se humedecieron completamente los componentes. A continuación, se añadió agua (900 μl) y los componentes se agitaron hasta disolver el péptido. La mitad del péptido disuelto (500 μl)) se añadió a tubos separados que contenían 10 ml de Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno en 0,1 ml de solución salinatamponada con borato a pH 8,4 (BBS) y 10 ml de hidrazina-Sefarosa 4B en tampón carbonato 0,1 M ajustado a pH 4,5 utilizando EDC en exceso en tampón citrato a pH 6,0. Se dejaron proceder las reacciones de conjugación durante la noche a temperatura ambiente. La Sefarosa conjugada se agrupó y cargó sobre columnas porosas, se lavó con 10 ml de BBS, se bloqueó con 10 ml de glicina 1 M y se lavó con 10 ml de glicina 0,1 M ajustada a pH 2,4 con HCl y se reneutralizó en BBS. La columna se lavó con volumen suficiente para que la densidad óptica a 280 nm alcance la línea base.

Purificación de anticuerpos por afinidad

[0148] La columna de afinidad de péptido se unión a un monitor UV y un registrador de gráficos. El antisuero de conejo titulado se descongeló y se agrupó. El suero se diluyó con un volumen de BBS y se dejó fluir a través de las columnas a 10 ml por minuto. Las inmunoglobulinas no peptídicas y otras proteínas se lavaron de la columna con BBS en exceso hasta que la densidad óptica a 280 nm alcanzó la línea base. Las columnas se desconectaron y la columna purificada por afinidad se eluyó utilizando un gradiente de pH desde pH 7,0 a 1,0. La elución se monitorizó a 280 nm y se recogieron fracciones que contenían anticuerpo (pH 3,0 a 1,0) directamente en BBS 0,5 M en exceso. El tampón en exceso (BBS 0,5 M) en los tubos de recogida sirvió para neutralizar los anticuerpos recogidos en las fracciones ácidas del gradiente de pH. [0149] Se repitió el procedimiento complete con suero “agotado” para asegurar la máxima recuperación de anticuerpos. El material eluido se concentró utilizando un aparato para células agitado y una membrana con un corte de peso molecular de 30 kD. La concentración de la preparación final se determinó utilizando una lectura de densidad óptica a 280 nm. La concentración se determinó utilizando la siguiente fórmula: mg/ml = DO280/1,4. [0150] Se entenderá que en ciertas realizaciones, se pueden utilizar etapas adicionales para purificar anticuerpos de la invención. En particular, puede resultar ventajoso repurificar anticuerpos, por ejemplo, contra uno de los péptidos que se utilizó en la

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generación de anticuerpos. Debe entenderse que la presente invención comprende anticuerpos que se han preparado con dichas etapas de purificación o repurificación adicionales. También se entenderá que el proceso de purificación puede afectar a la unión ente muestras y los anticuerpos de la invención. Ejemplo 8: Preparación y tinción de grupos de tejido [0151] Este ejemplo describe un método que se utilizó para preparar los grupos de tejidos que se utilizaron en los ejemplos 1-6. Este ejemplo también describe cómo se realizó la tinción del anticuerpo [0152] Los grupos de tejido se prepararon mediante la inserción de núcleos de grosor completo de un amplio número de bloques de parafina (bloques dadores) que contiene fragmentos de tejido derivados de muchos pacientes diferentes y/o tejidos o fragmentos de tejidos diferentes de un único paciente, en un bloque de parafina virgen (bloque receptor) en una parrilla. A continuación, se produjo un portaobjeto estándar del tejido embebido en parafina (bloque dador) que contenía una sección delgada de la muestra susceptible de tinción con H & E. Un patólogo cualificado o el equivalente versado en la evaluación de tejido tumoral y normal, designó la región de interés para el muestreo en el grupo de tejidos (por ejemplo, un área tumoral en oposición al estroma). A continuación, se utilizó un dispositivo de grupos de tejidos disponible comercialmente de Beecher Instruments para eliminar el núcleo del bloque dador que a continuación se insertó en el bloque receptor en una localización designada. El proceso se repitió hasta que todos los bloqueadores dadores se habían insertado en el bloque receptor. A continuación, el bloque receptor se seccionó de forma delgada para producir 50-300 portaobjetos que contenían los núcleos de todos los casos insertados en el bloque. [0153] A continuación, se utilizaron los anticuerpos seleccionados para realizar la tinción inmunohistoquímica utilizando el kit IHC peroxidasa, DAKO Envision+, (DAKO Corp., Carpenteria, CA) con sustrato DAB según las instrucciones del fabricante. Ejemplo 9: Correlación de la unión de la pareja de interacción con el resultado/respuesta de tumores de xenoinjerto [0154] Según la presente invención, pueden definirse paneles de parejas de interacción útiles a través del análisis de células tumorales humanas desarrolladas en un huésped no humano. En particular, tales análisis pueden definir paneles de parejas de interacción cuya unión se correlaciona con el pronóstico y/o con la respuesta a la terapia.

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[0155] Pueden transplantarse células derivadas de tumores humanos en un animal huésped (por ejemplo, un ratón), preferiblemente en un animal huésped inmunodeprimido. En realizaciones preferentes de la invención, se transplantan células (por ejemplo, líneas celulares, muestras de tumor obtenidas de pacientes humanos, etc.) de una serie de tumores humanos diferentes (por ejemplo, por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más tumores diferentes) en animales huésped. A continuación, se tratan los animales con diferentes concentraciones (por ejemplo, crecientes) de un compuesto químico conocido o que se piensa que es selectivamente tóxico para tumores con una característica común predeterminada (por ejemplo, clase o subclase). A continuación, se pueden evaluar el crecimiento o la regresión relativos de los tumores utilizando técnicas estándar. [0156] En ciertas realizaciones de la invención, opcionalmente puede crearse un conjunto de datos de sensibilidad de las células transplantadas a un compuesto o conjunto de compuestos determinados. Por ejemplo, un conjunto de datos podría consistir en la concentración de un compuesto administrado al animal huésped que inhibía el 50% de crecimiento tumoral a las 96 horas (es decir, la LD50) para cada una de las muestras celulares o líneas celulares evaluadas. Dicho conjunto de datos, por ejemplo para por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 o más líneas celulares, podría correlacionarse entonces con la tinción relativa de las parejas de unión a lo largo de las mismas líneas celulares. Estas parejas de unión cuya interacción (o ausencia de la misma) con células se correlacionaba de forma elevada con la sensibilidad o la resistencia a un compuesto dado serían miembros útiles de un panel predictivo. Ejemplo 10: Correlación de la unión de parejas de interacción con datos de pronóstico clínico en cáncer de mama [0157] Según la presente invención, pueden definirse paneles de parejas de interacción útiles a través de análisis de correlaciones entre patrones de unión y datos de pronóstico clínico. En concreto, tales análisis pueden definir paneles de parejas de interacción cuya unión se correlaciona con el pronóstico. [0158] A continuación, se describe la identificación de paneles de ejemplo de anticuerpos cuya unión se ha observado que se correlaciona con el pronóstico de pacientes de cáncer de mama. Se obtuvieron datos utilizando muestras de la cohorte de mama del Hunstville Hospital (la cohorte de "mama HH") a la que se hizo referencia en el Ejemplo 3. [0159] Se generó la cohorte de mama HH de 1082 pacientes de cáncer de mama que fueron tratados por el Comprehensive Cancer Institute (Huntsville, AL) entre 1990 y

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2000. Se filtró este grupo más grande hasta un grupo de estudio de 550 pacientes mediante la eliminación de pacientes de acuerdo con los siguientes criterios: 249 de los que no se pudo encontrar el historial clínico; 103 que no tenían seguimiento clínico; y 180 que no tenían suficiente material clínico en el bloque de parafina para muestra. 5 Para los 550 pacientes restantes, había datos clínicos disponibles hasta el 31 de diciembre de 2002. Por tanto, cada paciente de la cohorte tenía entre 2 y 13 años de seguimiento. El tiempo medio de seguimiento entre pacientes que no recaían era de 5,6 años. De los 550 pacientes, 140 tuvieron una recidiva de cáncer dentro del periodo de estudio; 353 pacientes eran receptores de estrógeno positivos (ER+); 154 pacientes

10 eran receptores de estrógeno negativos (ER-); y 43 eran indeterminados. Algunos pacientes dentro de estos grupos recibieron terapia de hormona adyuvante tal y como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Total: Hormona Sin hormona Desconocido

ER+: 353 278 68 7

ER: 154 70 83 1

Indeterminado: 43 28 15 0

15 [0160] Además, 263 pacientes recibieron quimioterapia. Se utilizaron hasta 16 pautas diferentes, no obstante, la mayoría eran variantes de ciclofosfamida, doxorubicina (con

o sin 5-fluorouracilo y/o ciclofosfamida), metotrexato y 5-fluoruracilo. Finalmente, 333 de los pacientes recibieron radiación. Se obtuvo información clínica con respecto a 20 la edad, estadio, estado del nódulo, tamaño del tumor, y grado.

[0161] La información clínica para los pacientes en la cohorte se resume en la Tabla 2. Tabla 2

Todos (550): ER+(353) ER-(154)

Estadio = 1: 236 162 49

Estadio = 2: 269 167 87

Estadio = 3: 44 23 18

Indeterminado: 1 0 0

Edad promedio @ Dx: 58 59 55

Estado del tumor = 0: 1 0 1

50

Estado del tumor = 1: 295 203 63

Estado del tumor = 2: 195 122 62

Estado del tumor = 3: 26 14 11

Estado del tumor = 4: 14 6 8

Indeterminado: 21 8 9

Estado de nódulo = 0: 326 215 76

Estado de nódulo = 1: 205 127 71

Estado de nódulo = 2: 10 6 3

Indeterminado: 10 5 4

Metástasis = 0: 527 338 147

Metástasis = 1: 5 4 1

Indeterminado: 19 11 6

[0162] Cada categoría está definida en la Tabla 3. Estas normas no están fijadas y el establecimiento del estadio es realizado por un oncólogo en base al estado de TNM y otros factores. Estas definiciones para el establecimiento del estadio no necesariamente

5 encajarán con el estadio que se le dio realmente a cada paciente. El estado del nódulo es la herramienta principal para los propósitos de establecimiento del estadio.

Tabla 3

Estado del tumor = 0 Estado del tumor = 1 Estado del tumor = 2 Estado del tumor = 3 Estado del tumor = 4: Sin evidencia de tumor < 2 cm 2 -5 cm > 5 cm Cualquier tamaño pero se extiende a la pared torácica

Estado del nódulo = 0 Estado del nódulo = 1 Estado del nódulo = 2: Sin metástasis LN regional Metástasis LN auxiliar pero nódulos aún movibles Metástasis LN auxiliar con nódulos fijados unos a otros O metástasis de nódulo mamario interno

Metástasis = 0 Metástasis = 1: Sin metástasis distante Metástasis distante

Estadio = 1: T1, N0, M0

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Estadio = 2 T0, N1, M0 T1, N1, M0 T2, N0, M0 T2, N1, M0 T3, N0, M0

Estadio = 3 T(0-3), N2, M0 T3, N1, M0 T4, NX, M0

Estadio = 4 TX, NX, M1

[0163] Se tiñeron las muestras de pacientes en la cohorte con anticuerpos del panel de clasificación de cáncer de mama identificados en el Apéndice A (tal y como se describieron previamente en los ejemplos 2 y 3). A continuación, se puntuaron las 5 muestras teñida de una forma semicuantitativa, con 0 = negativa, 1 = tinción débil, 2 = tinción intensa. Si era preciso, se utilizaron sistemas de puntuación alternativos (es decir, 0 = negativo, 1 = débil o intenso; ó 0 = negativo o débil y 1 = tinción intensa). Para cada anticuerpo, se seleccionó el sistema de puntuación utilizado para producir el pronóstico más significativo de los pacientes, tal y como se determinó mediante una 10 prueba con rango logarítmico (por ejemplo, ver Mantel y Haenszel, Journal of the National Cancer Institute 22:719-748, 1959). Los resultados se presentan en el Apéndice C y están agrupados en cuatro categorías que se han reconocido clínicamente por ser de importancia: todos los pacientes, los pacientes ER+, los pacientes ER-, y los pacientes ER+/nódulo-. Tal y como se muestra, se descubrió que los anticuerpos

15 presentaban una importancia distinta para cada una de estas categorías de pacientes de cáncer de mama. [0164] Se entiende que la exclusión de un anticuerpo concreto de cualquier panel de pronóstico basado en estos experimentos no es determinativa. De hecho, se prevé que datos adicionales con otras muestras pueden conducir a la identificación de otros

20 anticuerpos (del Apéndice A en adelante) que pueden tener un valor de pronóstico para estas y otras clases de pacientes. [0165] La relación esperada entre la tinción de muestras de pacientes con cada anticuerpo y la reaparición de tumores se midió utilizando el cálculo de Kaplan-Meier de reaparición esperada (por ejemplo, ver Kaplan y Meier, J. Am. Stat. Assn. 53:457

25 81, 1958). Se utilizó el test de rango logarítmico para determinar la importancia de diferentes recurrencias esperadas para cada anticuerpo (por ejemplo, ver Mantel y Haenszel, Journal of the National Cancer Institute, 22:719-748, 1959). Esto produce el valor de p que está indicado para cada anticuerpo en el Apéndice C. Los anticuerpos preferentes son aquellos que producen un valor de p de menos de 0,10.

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[0166] Se determinó el grado en el cual estos anticuerpos predecían la reaparición utilizando un modelo de riesgo proporcional univariado de Cox (por ejemplo, ver Cox y Oakes, "Analysis of Survival Data", Chapman & Hall, 1984). La "proporción de riesgo" indicado en el Apéndice C para cada anticuerpo refleja el incremento previsto en el riesgo de reaparición (recurrencia) para cada incremento en la puntuación de tinción. Las puntuaciones superiores a 1,0 indican que la tinción predice un mayor riesgo de reaparición en comparación con el promedio individual, puntuaciones menores a 1,0 indican que la tinción predice un riesgo menor. [0167] Se entenderá que estos anticuerpos pueden utilizarse solos o en combinaciones para predecir la reaparición (por ejemplo, en combinaciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

o más anticuerpos). También se entenderá que mientras un anticuerpo dado puede no predecir la recurrencia cuando se utiliza solo, el mismo anticuerpo puede predecir la recurrencia cuando se utiliza en combinación con otros. También se entenderá que mientras un anticuerpo dado o una combinación de anticuerpos pueden no predecir la recurrencia en un conjunto de pacientes determinados (por ejemplo, pacientes ER+), el mismo anticuerpo o combinación de anticuerpos pueden predecir la recurrencia en un conjunto de pacientes diferentes (por ejemplo, pacientes ER-). De un modo similar, se entiende que mientras un anticuerpo dado o una combinación de anticuerpos pueden no predecir la recurrencia en un conjunto de pacientes determinados (por ejemplo, pacientes ER+), el mismo anticuerpo o combinación de anticuerpos puede predecir la recurrencia en un subconjunto de estos pacientes (por ejemplo, pacientes ER+/nódulo negativo). [0168] Estos paneles de pronóstico podrían construirse utilizando cualquier método. Sin limitación, éstos incluyen normas simples derivadas empíricamente, modelos de riesgo proporcional multivariado Cox (por ejemplo, ver Cox y Oakes, "Analysis of Survival Data", Chapman & Hall, 1984), árboles de regresión (por ejemplo, ver Segal y Bloch, Stat. Med. 8:539-50, 1989), y/o redes neuronales (por ejemplo, ver Ravdin et al., Breast Cancer Res. Treat. 21:47-53, 1992). En ciertas realizaciones, un panel de pronóstico podría incluir entre 2-10 anticuerpos, por ejemplo 3-9 o 5-7 anticuerpos. Se entenderá que esos rangos son de ejemplo y no limitantes. [0169] El valor de pronóstico de paneles de ejemplo de anticuerpos también se calculó mediante la generación de curvas de reaparición de Kaplan-Meier para pacientes ER+ y ER+/nódulo-y la comparación a continuación de esas curvas producidas por estos mismos pacientes con el Índice de Pronóstico Nottingham (NPI) estándar.

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[0170] Con el objetivo de generar curvas Kaplan-Meier basadas en paneles de anticuerpos, primero se procesaron modelos de regresión de riesgo proporcional univariado Cox con todos los anticuerpos del Apéndice C utilizando los tres procedimientos de puntuación. A continuación, se utilizaron los anticuerpos y los sistemas de puntuación mejor capacitados para predecir la recurrencia en un modelo de árboles de regresión y se redujo para mantener el poder predictivo mientras se reducía la complejidad. Se colocaron los pacientes a los que el panel predijo como muy probable que recayeran en el grupo de pronóstico "malo". A los pacientes a los que el panel predijo como nada probable que recayeran se les dio la predicción de "bueno". Se colocaron los pacientes a los que el panel predijo como altamente probable que ni recayeran ni no recayeran en el grupo de pronóstico "moderado". A continuación, se calcularon curvas de Kaplan-Meier basadas en datos de recurrencia para pacientes dentro de cada grupo. La Figura 4A muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+ en cada uno de estos grupos de pronóstico. La Figura 5A muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+/nódulo-en cada uno de estos grupos de pronóstico. [0171] Los anticuerpos del Apéndice C que se utilizaron para predecir la recurrencia para pacientes ER+ (Figura 4A) fueron: s0296P1 (dilución 1:225, procedimiento de puntuación 3), s6006 (dilución 1:1, procedimiento de puntuación 2), s0545 (dilución 1:900, procedimiento de puntuación 2), s0063 (dilución 1:300, procedimiento de puntuación 2), s6002 (dilución 1:1, procedimiento de puntuación 3), s0081 (dilución 1:20, procedimiento de puntuación 2), s0255 (dilución 1:1000, procedimiento de puntuación 3), y s0039 (dilución 1:100, procedimiento de puntuación 2). [0172] Los anticuerpos del Apéndice C que se utilizaron para predecir la recurrencia para pacientes ER+/nódulo-(Figura 5A) fueron: s0143P3 (dilución 1:630, procedimiento de puntuación 1), s0137 (dilución 1:2500, procedimiento de puntuación 2), s0260 (dilución 1:5400, procedimiento de puntuación 2), s0702 (dilución 1:178200, procedimiento de puntuación 2), s0545 (dilución 1:900, procedimiento de puntuación 2), s6002 (dilución 1:1, procedimiento de puntuación 1), s6007 (dilución 1:1, procedimiento de puntuación 1). [0173] A continuación, se generaron curvas de recurrencia de Kaplan-Meier para los mismos pacientes basadas en sus puntuaciones NPI estándar. Se calcularon las puntuaciones NPI para pacientes según la fórmula estándar NPI = (0,2 x diámetro del tumor en cm) + estadio del nódulo linfático + grado del tumor. Tal y como se conoce bien en la técnica, el estadio del nódulo linfático es 1 (si no hay nódulos afectados), 2

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(si están afectadas 1-3 glándulas) o 3 (si está afectadas más de 3 glándulas). Se puntuó el grado de tumor según el sistema Bloom-Richardson Grade (Bloom y Richardson, Br. J. Cancer 11:359-377, 1957). Según este sistema, se examinaron histológicamente los tumores y se les dio una puntuación por la frecuencia de mitosis celular (índice de 5 división celular), formación tubular (porcentaje de cáncer compuesto de estructuras tubulares), y pleomorfismo nuclear (cambio en el tamaño y la uniformidad celular). A cada una de estas características se le asignó una puntuación que variaba del 1 al 3 tal y como se muestra en la Tabla 4. A continuación, se sumaron juntas las puntuaciones de cada característica para una suma final que variaba entre 3 y 9. Un tumor con una suma

10 de 3, 4 ó 5 se consideró tumor de Grado 1 (de aparición menos agresiva); una suma de 6 ó 7 un tumor de Grado 2 (aparición intermedia); y una suma de 8 ó 9 un tumor de Grado 3 (aparición más agresiva).

Tabla 4

Formación tubular (% de carcinoma compuesto de estructuras tubulares): Puntuación

> 75% 10 -75% < 10%: 1 2 3

Pleomorfismo nuclear (Cambio en células): Puntuación

Células pequeñas y uniformes Incremento moderado en tamaño y variación Variación marcada: 1 2 3

Recuento de mitosis (división celular): Puntuación

Hasta 7 De 8 a 14 15 o más: 1 2 3

15

[0174] Se colocaron los pacientes con tumores que tenían una puntuación NPI global de menos de 3,4 en el grupo de pronóstico “bueno”. Aquellos con una puntuación de NPI de entre 3,4 y 5,4 se colocaron en el grupo de pronóstico "moderado" y los pacientes con una puntuación de NPI de más de 5,4 se colocaron en el grupo de 20 pronóstico "malo". A continuación, se calcularon las curvas Kaplan-Meier basadas en datos de recurrencia para pacientes dentro de cada grupo. La Figura 4B muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+ en cada uno de estos grupos de

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pronóstico NPI. La Figura 5B muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+/nódulo-en cada uno de estos grupos de pronóstico NPI. Por definición, los pacientes ER+/nódulo-tienen una puntuación NPI que es menor que 5,4. Esto explica porqué no hay curva de pronóstico "malo" en la Figura 5B. El ejemplo 12 describe otros paneles de pronóstico de ejemplo para pacientes de cáncer de mama. Ejemplo 11: Correlación de la unión de parejas de interacción con datos de pronóstico clínico en cáncer de pulmón [0175] Este ejemplo describe la identificación de paneles de ejemplo de anticuerpos cuya unión se ha observado que se correlaciona con el pronóstico de pacientes de cáncer de pulmón. Se obtuvieron los datos utilizando muestras de la cohorte de pulmón del Huntsville Hospital (la cohorte "pulmón de HH") que se hizo referencia en el Ejemplo 5. [0176] Se generó la cohorte HH pulmón a partir de 544 pacientes de cáncer de pulmón que fueron tratados por el Comprehensive Cancer Institute (Huntsville, AL) entre 1987 y 2002. Se filtró este grupo más grande hasta un grupo de estudio de 379 pacientes mediante la eliminación de pacientes que tenían un seguimiento clínico insuficiente o que no tenían suficiente material clínico en el bloque de parafina para muestra. Para los pacientes restantes, los datos clínicos estuvieron disponibles hasta el 30 de septiembre de 2003. Este conjunto de pacientes consistía en 232 varones y 147 hembras. El tiempo promedio de seguimiento entre pacientes que no recaían fue de 3,5 años. De los 379 pacientes, 103 tuvieron una recurrencia de cáncer dentro del periodo de estudio. En este estudio se diagnosticaron todos los pacientes en un estadio patológico de 1 ó 2, con 305 pacientes en el estadio 1, 1A, o 1B, y 74 pacientes en el estadio 2, 2A, o 2B. [0177] Se tiñeron las muestras de pacientes en la cohorte con anticuerpos del panel de clasificación de cáncer de pulmón identificado en el Apéndice A (tal y como se describe previamente en los Ejemplos 4 y 5). A continuación, se puntuaron las muestras teñidas de un modo semi-cuantitativo; los procedimientos de puntuación 1-3 utilizan los siguientes esquemas: procedimiento 1 (0 = negativo; 1 = débil; 2 = intenso); procedimiento 2 (0 = negativo; 1 = débil o intenso); y procedimiento 3 (0 = negativo o débil; 1 = intenso). Para cada anticuerpo, se seleccionó el sistema de puntuación utilizado para producir el pronóstico más importante de los pacientes, tal y como se determina mediante la prueba de rango logarítmico (por ejemplo, ver Mantel y Haenszel, Journal of the National Cancer Institute 22:719-748, 1959). Los resultados están presentados en el Apéndice D y están agrupados en tres categorías que se ha reconocido clínicamente por ser de importancia: todos los pacientes, pacientes de

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adenocarcinoma, y pacientes de carcinoma de células escamosas. Tal y como se muestra, se descubrió que los anticuerpos tienen importancia diferente para cada una de estas categorías de pacientes de cáncer de pulmón. [0178] Se entiende que la exclusión de un anticuerpo concreto de cualquier panel de pronóstico basado en estos experimentos no es determinativa. De hecho, se prevé que datos adicionales con otras muestras pueden conducir a la identificación de otros anticuerpos (del Apéndice A en adelante) que pueden tener valor de pronóstico para estas y otras clases de pacientes. [0179] Respecto al estudio de mama del Ejemplo 10, se midió la relación esperada entre la tinción de muestras de paciente con cada anticuerpo y la recurrencia de tumores utilizando la estimación Kaplan-Meier de recurrencia esperada y se utilizó una prueba de rango logarítmico para determinar la importancia de diferentes recurrencias esperadas. Esto produce el valor p que se indica para cada anticuerpo en el Apéndice

D. Los anticuerpos preferentes son los que producen un valor p de menos de 0,10. [0180] Se determinó el grado en el cual esos anticuerpos predecían la recurrencia utilizando un modelo de riesgo proporcional univariado de Cox. La “proporción de riesgo" indicada en el Apéndice D para cada anticuerpo refleja el incremento previsto en el riesgo de recurrencia para cada incremento en la puntuación de tinción. Puntuaciones superiores a 1,0 indican que la tinción predice un mayor riesgo de recurrencia en comparación con un promedio individual, puntuaciones menores de 1,0 indican que la tinción predice un menor riesgo. [0181] Dado que varios pacientes tenían información con respecto a si el cáncer recaía

o no, pero carecían de información sobre el tiempo para la recaída, también se realizó una prueba ji-cuadrado. Esta prueba estadística estándar muestra el grado de divergencia entre frecuencias observadas y esperadas y no utiliza tiempo hasta la recaída, tal como hace la prueba de rango logarítmico. Los anticuerpos preferentes son aquellos que producen un valor p de menos de 0,10. [0182] Se entenderá que estos anticuerpos de pronóstico pueden utilizarse solos o en combinaciones para predecir la recurrencia (por ejemplo, en combinaciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más anticuerpos). También se entenderá que mientras un anticuerpo dado puede no predecir la recurrencia cuando se utiliza solo, el mismo anticuerpo puede predecir la recurrencia cuando se utiliza en combinación con otros. También se entenderá que mientras un anticuerpo dado o combinación de anticuerpos pueden no predecir la recurrencia en un conjunto de pacientes determinados (por ejemplo, pacientes de adenocarcinoma), el mismo anticuerpo o combinación de anticuerpos

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pueden predecir la recurrencia en un conjunto diferente de pacientes (por ejemplo, pacientes de carcinoma de célula escamosa). [0183] Con respecto al estudio de mama del Ejemplo 10, estos paneles de pronóstico podrían construirse utilizando cualquier procedimiento. Sin limitación, estos incluyen normas simples derivadas empíricamente, modelos de riesgo proporcional multivariado de Cox, y/o redes neuronales. En ciertas realizaciones, un panel de pronóstico podría incluir entre 2-10 anticuerpos, por ejemplo 3-9 ó 5-7 anticuerpos. Se entenderá que estos rangos son de ejemplo y no limitantes. En el Ejemplo 13 se describe la construcción de paneles de pronóstico de ejemplo para pacientes de cáncer de pulmón. Ejemplo 12: Paneles de pronóstico de cáncer de mama [0184] Este ejemplo se basa en los resultados del ejemplo 10 y describe la identificación de paneles de ejemplo adicionales de anticuerpos, cuya unión se ha observado que se correlaciona con el pronóstico de pacientes de cáncer de mama. [0185] En primer lugar, la capacidad de pronóstico individual de los anticuerpos del Apéndice C se refinó utilizando ejemplos de la cohorte de mama HH que se describió en el ejemplo 2. En particular, se excluyeron ciertos anticuerpos en base a la valoración sujetiva de especificidad y puntuabilidad. La metodología paralela que se utilizó en el ejemplo 10 y los datos actualizados de los anticuerpos se presentan en el Apéndice E. [0186] En segundo lugar, se generaron los paneles de pronóstico de dos subclases clínicamente importantes actualmente identificadas de los pacientes de cáncer de mama, concretamente pacientes ER+/nódulo – y pacientes ER-. Para minimizar las probabilidades de identificar asociaciones falsas, sólo se utilizaron los anticuerpos del Apéndice E que mostraron una significancia suficiente (valor de p inferior a 0,10) en las clases de pacientes ER+ o ER+/nódulo-en la creación de paneles de pronóstico para los pacientes de ER+/nódulo-, y sólo los marcadores igualmente significativos del grupo de pacientes ER-para crear un panel de pronóstico para pacientes ER-. Utilizando el análisis de riesgo proporcional Cox y el análisis de árboles de regresión (tal como se describe en el ejemplo 10), se derivaron paneles candidatos (y dendrogramas para análisis de árbol de regresión) para la predicción de reaparición temprana. Tanto para pacientes ER+/nódulo-como pacientes ER-, se eligieron paneles y dendrogramas que identifican pacientes con un riesgo de reaparición significativamente mayor

Paneles de pronóstico generadas por análisis Cox

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[0187] El análisis de riesgo proporcional Cox trata el componente anticuerpos de un panel como factores de riesgo adicionales. Los paneles para las clases de pacientes especificadas se crearon mediante la utilización inicial de todos los anticuerpos aplicables y, a continuación, la eliminación iterativa de los anticuerpos del panel. Si la

5 eliminación de un anticuerpo incrementaba o no afectaba a la significancia y capacidad de pronóstico del panel de forma global, se eliminaba, de lo contrario se mantenía. De esta manera, se crearon paneles preferidos con cantidades mínimas de anticuerpos. Los paneles preferidos para pacientes ER+/nódulo-y ER-se presentan en las tablas 5 y 6, respectivamente. Los anticuerpos en los paneles preferidos se clasifican en base a sus

10 contribuciones relativas con respecto a la función de predicción global. Tabla 5

Panel: Análisis Valor p1 Proporción de

riesgo2

Mama ER+/nódulo-: Cox 8.17E-05 5.68

AGI ID: Rango Valor p3 Términos4

S0702/s0296P1: 1 0,00015 -0,213,1,330

s6006: 2 0,00660 -0,325,0,799

s0404: 3 0,06200 -0,099,0,958

s0545: 4 0,10000 -0,112,0,604

s0235: 5 0,25000 -0,114,0,390

1Valor p del panel global 2Proporción de riesgo del panel global 3Valor p de la contribución de un anticuerpo determinado al panel global 4Contribución de un anticuerpo determinado a la función de predicción del panel global que depende de la puntuación de IHC (por ejemplo, puntuaciones de 0 ó 1 para s6006 que utiliza el método de puntuación 2 [véase el Apéndice E] dan lugar en su término en el modelo que es igual a -0,325 o 0,799, respectivamente).

Tabla 6

Panel: Análisis Valor p1 Proporción de riesgo2

Mama ER-: Cox 3,10E-03 2,25

AGI ID: Rango Valor p3 Términos4

s0691: 1 0,04700 -0,163,0,436,0,640

s0545: 2 0,08900 -0.339,0,259

s0330x1: 3 0,57000 -5.560,0,510

59

1,2,3,4Véase la Tabla 5

[0188] El valor de pronóstico de estos paneles de ejemplo se valoró mediante la generación de curvas de reaparición Kaplan-Meier para los pacientes ER+/nódulo-y ER-. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente recaerían 5 se colocaron en el grupo de pronóstico “malo”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente no recaerían se les dio la predicción de “bueno”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que ni muy probablemente recaerían ni no recaerían se colocaron en grupo de pronóstico “moderado”. A continuación, se calcularon las curvas Kaplan-Meier en base a los datos de reaparición para pacientes

10 en cada grupo. La figura 6 muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+/nódulo-en cada uno de los grupos de pronóstico. La figura 7 muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER-en cada uno de estos grupos de pronóstico. [0189] Cuando es estado del nódulo linfático se incluyó como variable adicional para el grupo de pacientes ER-, el panel preferido fue el que se muestra en la Tabla 7.

15 Tabla 7

Panel: Análisis Valor p1 Proporción de riesgo2

Mama ER-: Cox 3,70E-05 3,93

AGI ID: Rango Valor p3 Términos4

s6007: 1 0.05000 -0.460,0.280

s0545: 2 0.06400 -0.400,0.290

s0068: 3 0.18000 -0.350,0.160

1,2,3,4Véase la Tabla 5

[0190] El valor de pronóstico de este panel de ejemplo se valoró mediante la generación de curvas de reaparición Kaplan-Meier para los pacientes ER-. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente recaerían se

20 colocaron en el grupo de pronóstico “malo”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente no recaerían se les dio la predicción de “bueno”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que ni muy probablemente recaerían ni no recaerían se colocaron en grupo de pronóstico “moderado”. A continuación, se calcularon las curvas Kaplan-Meier en base a los datos de reaparición para pacientes

25 en cada grupo. La figura 8 muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER-en cada uno de los grupos de pronóstico.

60

[0191] Aunque los paneles Cox preferidos de la presente invención para pacientes ER+/nódulo-y ER-incluyen cada uno de los anticuerpos indicados, debe entenderse que otros paneles relacionados están comprendidos por la presente invención. En particular, se entenderá que la presente invención no se limita de ningún modo a los anticuerpos específicos indicados. Por ejemplo, se pueden utilizar otros anticuerpos dirigidos al mismo o mismos biomarcadores (por ejemplo, tomando el panel ER+/nódulo-COX, se puede observar fácilmente a partir del Apéndice A que los anticuerpos s0702 o s0296P1 se pueden sustituir por otros anticuerpos dirigidos al biomarcador Hs. 184601; el anticuerpo s6006 se puede sustituir por otros anticuerpos dirigidos al biomarcador Hs.1846, etc.). Tal como se indica, la adición de ciertos anticuerpos del Apéndice E no tenía efecto en la significancia y capacidad de pronóstico del panel de forma global. De este modo, se pueden añadir anticuerpos a cualquier panel determinado sin disminuir necesariamente la utilidad del panel para el pronóstico de un paciente. La inclusión de los anticuerpos más allá de los indicados en el Apéndice E también se encuentra en el alcance de la presente invención. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar menos de todos los anticuerpos indicados en un panel de pronóstico.

[0192] En general, un panel Cox para pacientes ER+/nódulo-incluirá por lo menos dos anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos a biomarcadores Hs.184601, Hs.1846, Hs.75789, Hs.63609 y Hs.220529 (por ejemplo, s0702 y/o s0296P1, s6006, s0404, s0545 y s0235, véase la Tabla 5 y el Apéndice A). Preferiblemente, el panel incluirá un anticuerpo dirigido al biomarcador Hs.184601 y por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en Hs.1846, Hs.75789, Hs.63609 y Hs.220529. Todas las permutaciones de estos anticuerpos están comprendidas. En una realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 (por ejemplo, s0702 y/o s0296P1) con un anticuerpo para el biomarcador Hs.1846 (por ejemplo, s6006). En otra realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.846 y Hs.75789 (por ejemplo, s6006 y s0404). En otras realizaciones, se utilize un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.1846, Hs.75789, Hs.63609 y opcionalmente Hs.220529 (por ejemplo, s6006, s0404, s0545 y opcionalmente s0235). En realizaciones preferidas, se utiliza un anticuerpo para Hs.184601 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.1846, Hs. 75789, Hs.63609 y Hs.220529. [0193] De manera similar, un panel Cox para pacienets ER-incluirá por lo menos dos

61

anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos a los biomarcadores Hs.6682, Hs.63609 y Hs.306098 (por ejemplo, s0691, s0545 y s0330x1, véase la Tabla 6 y el Apéndice A). Preferiblemente, el panel incluirá un anticuerpo dirigido al biomarcador Hs.6682 y anticuerpos para uno o ambos biomarcadores Hs.63609 y Hs.306098. En realizaciones preferidas, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.6682 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.63609 y Hs.306098. [0194] Cuando se utiliza el estado de los nódulos linfáticos como variable adicional, un panel Cox pronóstico de la invención para pacientes ER-incluirá por lo menos dos anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos a los biomarcadores Hs.80976, Hs.63609, Hs.416854 y Hs.306098 (por ejemplo, s6007, s0545, s0068 y s0330x1, véase la Tabla 7 y el Apéndice A). Preferiblemente, el panel incluirá un anticuerpo dirigido al biomarcados Hs.80976 y anticuerpos para uno o más de los biomarcadores Hs. 63609, Hs.416854 y Hs.306098. Todas las permutaciones de estos anticuerpos están comprendidos. En una realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.80976 con un anticuerpo para el biomarcador Hs.63609. En otra realización, se utiliza un anticuerpos para el biomarcador Hs.80976 con los anticuerpos para los biomarcadores Hs.63609 y Hs.416854 y opcionalmente con un biomarcador para Hs.306098. En realizaciones preferidas, se utiliza un anticuerpos para el biomarcador Hs.80976 con anticuerpos para los biomarcadores Hs. 63609, Hs.416854 y Hs.306098. [0195] La presente invención también comprende métodos para evaluar el pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama utilizando estos paneles de ejemplo. Después de obtener una muestra de tumor de un paciente con un pronóstico desconocido, la muestra se pone en contacto con dos o más anticuerpos de los paneles de las Tablas 5, 6 y/o 7. A continuación, se valora el pronóstico probable del paciente en base al patrón de unión positiva y negativa de los dos o más anticuerpos a la muestra de tumor.

Paneles de pronóstico generados por el análisis de árboles de regresión

[0196] Los árboles de regresión clasifican los pacientes en un conjunto de subclases, cada una definidas por su patrón de unión a un único grupo de anticuerpos de un panel. Un árbol de ejemplo (o “dendrograma”) para pacientes ER+/nódulo-se muestra en la figura 9 que se discute a continuación. Los árboles de regresión se crearon inicialmente con todos los anticuerpos aplicables, y a continuación, se “recortó” hasta una complejidad mínima (el menor número de nódulos terminales sin perder demasiada

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capacidad de pronóstico) utilizando un procedimiento de validación cruzada. Este procedimiento de validación cruzada implicaba construir paneles y dendrogramas utilizando una serie de grupos de pacientes que se escogieron del grupo total de pacientes utilizando una serie de árboles recortados de forma creciente. Los resultados 5 sobre los grupos analizados se sumaron y se eligieron el panel y dendrograma mínimamente complejos con menos tendencia al error. El dendrograma resultante se simplificó adicionalmente colocando nódulos con una gama de valores de respuestas en las clases “buena” o “mala” (o alternativamente, “buena”, moderada” o “mala”). La tabal 8 indica los anticuerpos de un panel de árbol de ejemplo ER+/nódulo-que se

10 construyó tal como se ha descrito anteriormente. Los dendrogramas para este panel se ilustran en la figura 9. Tabla 8

Panel: Análisis Valor p1 Proporción de riesgo2

Mama ER+/nódulo-: Árbol 2,82E-05 6,06

AGI ID: Rango

s0702/s0296P1: 1

s0081: 2

s6006: 2

s6007: 3

s0545: 4

s6002: 4

1Valor p de panel global 2Proporción de riesgo del panel global

[0197] Tal como se ilustra en la figura 9, si un paciente da positivo en la tinción para

15 un nódulo determinado, su árbol de decisión del pronóstico sigue la rama marcada con un “+”. En cambio, si un paciente da negativo en la tinción en un nódulo determinado, su árbol de decisión del pronóstico sigue la rama marcada con un “-” Esto se realiza hasta alcanzar un extremo. [0198] Por ejemplo, si un paciente A da positive para la tinción con s0702 y negativo

20 para la tinción con s0081 entonces, en base al dendrograma, su pronóstico es “malo”. En cambio, si el paciente B da negativo en la tinción con s0702, negativo en la tinción con s6006, positive en la tinción con s6007 y negativo en la tinción con s0545, entonces su pronóstico es “bueno”. Se entenderá a partir de lo anterior y de la figura 9

63

que el número de manchas requeridas con el fin de obtener un pronóstico variará de paciente a paciente. Sin embargo, desde un punto de vista práctico (y sin limitación), puede resultar ventajoso completar todas las manchas para un panel determinado en un punto, en lugar de adoptar una estrategia iterativa con cada anticuerpo individual.

5 [0199] El valor de pronóstico de este panel de ejemplo de la Tabla 8 también se valoró mediante la generación de las curvas de reaparición Kaplan-Meier para pacientes ER+/nódulo-. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente recaerían se colocaron en el grupo de pronóstico “malo”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente no recaerían se les dio la predicción de

10 “bueno”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que ni muy probablemente recaerían ni no recaerían se colocaron en grupo de pronóstico “moderado”. A continuación, se calcularon las curvas Kaplan-Meier en base a los datos de reaparición para pacientes en cada grupo. La figura 10 muestra las curvas que se obtuvieron para pacientes ER+/nódulo-en cada uno de los grupos de pronóstico

15 [0200] En general, un panel de árboles para pacientes de ER+/nódulo-incluirá un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 (por ejemplo, s0702 o s0296P1) con anticuerpos para uno o ambos biomarcadores Hs.155956 y Hs.1846 (por ejemplo, s0081 y s6006, véase la Tabal 8 y el Apéndice A). En ciertas realizaciones, se puede añadir un anticuerpo para el biomarcador Hs.80976 (por ejemplo, s6007),

20 opcionalmente con anticuerpos para uno o ambos biomarcadores Hs.63609 y Hs.2905 (por ejemplo, s0545 y s6002). En realizaciones preferidas, el panel de árboles incluye un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 y anticuerpos para los biomarcadores Hs.155956, Hs.1846, Hs. 80976, Hs.63609 y Hs.2905. [0201] La tabla 9 indica los anticuerpos de paneles de árboles de ER+ y ER-de

25 ejemplo que se construyeron tal como se ha descrito anteriormente para el panel de árboles de ER+/nódulo-de la Tabla 8. Los dendrogramas para estos paneles se ilustran en la figura 11. Tabla 9

Panel: Análisis Panel Análisis

Mama ER+: Árbol Mama ER- Árbol

AGI ID: Rango AGI ID Rango

s0702/s0296P1: 1 s6007 1

s0137: 2 s0303 2

s6007: 2 s0398 2

s5076: 3 s0063 3

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s0143: 3 s0545 4

s6007: 4 s0702/s0296P1 4

s0545: 4 s0068 5

[0202] La presente invención también comprende métodos de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama utilizando un panel de árboles de la invención. Por ejemplo, después de obtener una muestra de tumor de un paciente

5 con un pronóstico desconocido, la muestra se pone en contacto con dos o más anticuerpos del panel de la Tabla 8 ( o uno de los paneles en la Tabla 9). A continuación, se valora el pronóstico probable de paciente en base a la unión positiva o negativa de los dos o más anticuerpos a la muestra de tumor utilizando el dendrograma de la figura 9 (o la figura 11). Tomando el panel de ER+/nódulo-de la Tabla 8 como

10 ejemplo, el método incluye en general una etapa de poner en contacto la muestra de tumor con un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 (por ejemplo, s0702 o s0296P1) y anticuerpos para uno o ambos biomarcadores Hs.155956 y Hs.1846 (por ejemplo, s0081 y/o s6006). En otras realizaciones, la muestra de tumor se pone en contacto adicionalmente con un anticuerpo para el biomarcador Hs.80976 (por

15 ejemplo, s6007) y opcionalmente con anticuerpos para los biomarcadores Hs.63609 y/o Hs.2905 (por ejemplo, s0545 y/o s6002). Tal como se ha mencionado anteriormente, la muestra de tumor se puede poner en contacto con estos anticuerpos en un único punto o secuencialmente en base a los resultados de unión de una mancha previa. Obviamente, la muestra de tumor se puede dividir y diferentes anticuerpos

20 pueden contactar con diferentes fracciones. Alternativamente, se pueden poner en contacto diferentes muestras de tumor original con diferentes anticuerpos. [0203] Tanto si se crea mediante análisis Cox como por análisis de árboles de regresión, los paneles de pronóstico de ejemplo se determinaron que eran independientes de la edad, etapa y grado. Para asegurar que los paneles no

25 identificaban clases de pacientes que probablemente no se encontraban como significativos en una cohorte independiente, se utilizó la validación cruzada para estimar el error inherente en cada panel. Se realizó una validación cruzada de diez veces mediante la “separación” secuencial del 10% de pacientes y la construcción de paneles en los pacientes restantes diez veces, de manera que todos los pacientes eran

30 finalmente clasificados. Esto incluía la redeterminación del grupo de anticuerpos suficientemente significativos a utilizar en el proceso de construcción del panel (valor de p < 0,10). Los valores p de validación cruzada reflejan la confianza calculada para

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la suma de los diez paneles independientes y confirmaban la significancia estadística de estos paneles. Para el grupo de pacientes ER+/nódulo-, los paneles tanto Cox (tabla 5) como de árboles de regresión (Tabla 8) mostraron una significancia después de la validación cruzada (valor p/proporción de riesgo de 1,12E-02/2,36 y 3,40E-03/2,91, respectivamente). Para los grupos de pacientes ER, se observó que los paneles Cox (tablas 6 y 7) eran capaces de mantener la significancia (valor p/proporción de riesgo de 6,40E-02/1,37 y 1,80E-03/1,79 para los paneles de las tablas 6 y 7, respectivamente). [0204] Debe entenderse que cada uno de los paneles Cox y de árboles de ejemplo descritos aquí se pueden utilizar solos, en combinación con otro (por ejemplo, el panel Cox de la tabla 5 y el panel de árboles de la Tabla 8 para los pacientes ER+/nódulo-) o conjuntamente con otros paneles y/o factores de pronóstico independientes. Ejemplo 13: Paneles de pronóstico de cáncer de pulmón [0205] Este ejemplo se construye a partir de los resultados del Ejemplo 11 y describe la identificación de paneles de ejemplo de anticuerpos cuya unión se ha observado que se correlaciona con el pronóstico de pacientes de cáncer de pulmón. [0206] Se generaron paneles de pronóstico en dos subclases clínicamente importantes actualmente identificadas de pacientes con cáncer de pulmón, concretamente pacientes con adenocarcinoma y de carcinoma de células escamosas. De acuerdo con la significancia clínica conocida de los diagnósticos de estas dos subclases de pacientes de cáncer de pulmón, se observó que se derivaban los modelos más robustos cuando se clasificaron en primer lugar los pacientes de esta manera, y a continuación, se modelaron independientemente los grupos de pacientes separados. Se entenderá que esta estrategia no es limitante y que podrían generarse modelos utilizando todos los pacientes de cáncer de pulmón o utilizando otras subclases de pacientes. Para minimizar la posibilidad de identificación de asociaciones falsas, sólo se utilizaron aquellos anticuerpos del Apéndice D que mostraron una significancia suficiente (valor p inferior a 0,10) en la clase de paciente de adenocarcinoma en la creación de paneles de pronóstico para los pacientes de adenocarcinoma, y sólo los marcadores igualmente significativos de la clase de pacientes de carcinoma de células escamosas para la creación de un panel de pronóstico para los pacientes de carcinoma de células escamosas. Utilizando el análisis de riesgo proporcional Cox (tal y como se describe en el Ejemplo 10) se derivaron paneles candidatos para la predicción de reaparición temprana. Tanto para pacientes de adenocarcinoma como de carcinoma de células

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escamosas, se eligieron paneles que identificaron pacientes con riesgo de reaparición significativamente incrementados. [0207] Tal y como se indicó previamente, el análisis de riesgo proporcional Cox trata el componente anticuerpos de un panel como factores de riesgo adicionales. Los

5 paneles para las clases de pacientes especificadas se crearon mediante la utilización inicial de todos los anticuerpos aplicables y, a continuación, la eliminación iterativa de los anticuerpos del panel. Si la eliminación de un anticuerpo incrementaba o no afectaba a la significancia y capacidad de pronóstico del panel de forma global, se eliminaba, de lo contrario se mantenía. De esta manera, se crearon paneles preferidos

10 con cantidades mínimas de anticuerpos. Los paneles preferidos para pacientes con adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas se presentan en las tablas 10 y 11, respectivamente. Los anticuerpos en los paneles preferidos se clasifican en base a sus contribuciones relativas con respecto a la función de predicción global.

15 Tabla 10

Panel: Análisis Valor de P1 Proporción de

riesgo2

Adenocarcinoma de: Cox 1,30E-05 3,23

pulmón

AGI ID: Rango Valor de P3 términos4

s0022: 1 0,00620 -1,240, 0,880

s0702/s0296P1: 2 0,12000 -0,150, 0,980

s0330: 3 0,13000 -0,034, 0,870

s0586: 4 0,16000 -0,250, 0,680

1Valor p del panel global 2Proporción de riesgo del panel global 3Valor p de la contribución de un anticuerpo determinado al panel global 4Contribución de un anticuerpo determinado a la función de predicción del panel global que depende de la puntuación de IHC (por ejemplo, puntuaciones de 0 ó 1 para s0022 que utiliza el método de puntuación 2 [véase el Apéndice D] dan lugar en su término en el modelo que es igual a -1,240 o 0,880, respectivamente).

Tabla 11

Panel Análisis Valor de P1 Proporción de riesgo2

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Escamosa de pulmón: Cox 3,20E-05 6,88

AGI ID: Rango Valor de P3 Términos4

s6013: 1 0,02000 0,520,-0,430

s0545: 2 0,03500 1,150, -0,070

s0404: 3 0,04000 0,550,-0,270

s0702/s0296P1: 4 0,08800 0,450,-0,230

1,2,3,4 Ver Tabla 10

[0208] El valor de pronóstico de estos paneles de ejemplo se valoró mediante la generación de curvas de reaparición Kaplan-Meier para los pacientes combinados de cáncer de pulmón de la cohorte de pulmón HH. Los pacientes se clasificaron 5 inicialmente como pacientes con adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas. A continuación, se valoró para cada paciente el patrón de tinción de anticuerpos con el panel aplicable (es decir, la Tabla 10 u 11). Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente recaerían se colocaron en el grupo de pronóstico “malo”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que muy probablemente no 10 recaerían se les dio la predicción de “bueno”. Los pacientes a los que los paneles predijeron que ni muy probablemente recaerían ni no recaerían se colocaron en grupo de pronóstico “moderado”. A continuación, se calcularon las curvas Kaplan-Meier en base a los datos de reaparición en cinco años para pacientes en cada grupo. La figura 12 muestra las curvas que se obtuvieron cuando los pacientes combinados de cáncer de

15 pulmón se colocaron en grupos de pronóstico “bueno”, “moderado” o “malo”. La figura 13 muestra las curvas que se obtuvieron cuando los pacientes en los grupos “moderado” y “malo” se combinaron en un único grupo de pronóstico “malo”. [0209] Para asegurar que los paneles no identificaban clases de pacientes que probablemente no se encontraban como significativos en una cohorte independiente, se

20 utilizó la validación cruzada para estimar el error inherente en cada panel. Se realizó una validación cruzada de diez veces mediante la “separación” secuencial del 10% de pacientes y la construcción de paneles en los pacientes restantes diez veces, de manera que todos los pacientes eran finalmente clasificados. Esto incluía la redeterminación del grupo de anticuerpos suficientemente significativos a utilizar en el proceso de

25 construcción del panel (valor de p < 0,10). Los valores p de validación cruzada reflejan la confianza calculada para la suma de los diez paneles independientes y confirmaban la significancia estadística de estos paneles. Los paneles mostraron significancia

68

después de la validación cruzada con los pacientes de pulmón combinados (valor p/proporción de riesgo de 2,20E-02/1,48, cuando se utilizó un esquema de “bueno”, “moderado” y “malo” y 1,80E-02/2,07 cuando se utilizó un esquema de “bueno2 y “malo”). [0210] Aunque los paneles de Cox preferentes de la invención para pacientes de cáncer de pulmón incluyen cada uno de los anticuerpos indicados, se entiende que otros paneles relacionados están comprendidos por la presente invención. En concreto, se entenderá que la presente invención no está limitada en modo alguno a los anticuerpos específicos indicados. Por ejemplo, pueden utilizarse otros anticuerpos dirigidos al mismo biomarcador o biomarcadores (por ejemplo, tomando el panel de adenocarcinoma, puede verse fácilmente del Apéndice A que el anticuerpo s0022 puede reemplazarse con otros anticuerpos dirigidos al biomarcador Hs.176588; s0702

o s0296P1 pueden reemplazarse con otros anticuerpos dirigidos al biomarcador Hs.184601, etc.). Otros anticuerpos del Apéndice D pueden añadirse a cualquier panel determinado sin necesariamente disminuir la utilidad de un panel para el pronóstico del paciente. También se encuentra dentro del alcance de la invención la inclusión de anticuerpos más allá de aquellos indicados en el Apéndice D. En ciertas realizaciones, pueden utilizarse menos anticuerpos que todos los indicados en un panel pronóstico. [0211] Generalmente, un panel de Cox para pacientes de adenocarcinoma incluirá por lo menos dos anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos a los biomarcadores Hs.176588, Hs.184601, Hs.306098 y Hs.194720 (por ejemplo, s0022, s0702 o s0296P1, s0330 y s0586, ver Tabla 10 y Apéndice A). Preferiblemente el panel incluirá un anticuerpo dirigido al biomarcador Hs.176588 y por lo menos un anticuerpo dirigido al biomarcador seleccionado del grupo que consiste en Hs.184601, Hs.306098 y Hs.194720. Todas las permutaciones de estos anticuerpos están comprendidas. En una realización, se utilizó un anticuerpo para el biomarcador Hs.176588 (por ejemplo, s0022) con un anticuerpo para el biomarcador Hs.184601 (por ejemplo, s0702 y/o s0296P1). En otra realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.176588 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.184601 y Hs.306098 (por ejemplo, s0702 o s0296P1 y s0330). En realizaciones preferentes, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.176588 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.184601, Hs.306098 y Hs.194720. [0212] De un modo similar, un panel Cox para pacientes de carcinoma de célula escamosa incluirá por lo menos dos anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos dirigidos contra los biomarcadores Hs.323910, Hs.63609, Hs.75789 y

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Hs.184601 (por ejemplo, s6013, s0545, s0404 y s0702 o s0296P1, ver Tabla 11 y Apéndice A). Preferentemente, el panel incluirá un anticuerpo dirigido al biomarcador Hs.323910 y por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en Hs.63609, Hs.75789 y Hs.184601. Todas las permutaciones de estos anticuerpos están comprendidas. En una realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.323910 (por ejemplo, s6013) con un anticuerpo para el biomarcador Hs.63609 (por ejemplo, s0545). En otra realización, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.323910 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.63609 y Hs.75789 (por ejemplo, s0545 y s0404). En realizaciones preferentes, se utiliza un anticuerpo para el biomarcador Hs.323910 con anticuerpos para los biomarcadores Hs.63609, Hs.75789 y Hs.184601. [0213] Se entiende que estos paneles de Cox de ejemplo pueden utilizarse solos, en combinación con otro o en conjunción con otros paneles y/o factores de pronóstico independientes. [0214] La presente invención también métodos de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de pulmón utilizando estos paneles de ejemplo. Después de obtener una muestra de tumor de un paciente con pronóstico desconocido se pone en contacto la muestra con dos o más anticuerpos de los paneles de la Tabla 10 y/o 11. A continuación se valora el pronóstico probable del paciente en base a la unión positiva o negativa de dos o más anticuerpos a la muestra de tumor. Ejemplo 14: Uso de paneles de pronóstico de cáncer de pulmón con una cohorte independiente [0215] Este ejemplo se basa en los resultados del Ejemplo 13 mediante la descripción de cómo se utilizaron los paneles de pronóstico de cáncer de pulmón de ejemplo para predecir la recurrencia en una cohorte independiente de pacientes de cáncer de pulmón. [0216] Para este propósito se utilizó una cohorte de 119 pacientes de cáncer de pulmón de la the University of Alabama-Birmingham (UAB). Se disponía de datos clínicos relativamente limitados para estos pacientes, en la mayoría de los casos sólo se disponía del tiempo de supervivencia. El tiempo promedio de seguimiento entre pacientes que no murieron de la enfermedad fue de 28 meses. De los 119 pacientes, se observó que 54 había tenido una recaída del cáncer dentro del periodo de estudio, y 74 murieron de la enfermedad. Esta cohorte difería significativamente de la cohorte de pulmón HH (ver Ejemplo 11) en que no se limitaba a tumores en estadio temprano, y por lo tanto la cohorte tenía una mayor incidencia de muerte debido a la enfermedad. Dado que los datos de recurrencia para esta cohorte eran limitados, se utilizaron los

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paneles de pronóstico del ejemplo 13 (diseñado para predecir la recurrencia) para predecir la supervivencia en esta cohorte independiente. Específicamente, se calculó el valor de pronóstico de los paneles mediante la generación de curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para los pacientes de cáncer de pulmón combinados de la cohorte de UAB. Como en el Ejemplo 13, se clasificó inicialmente a los pacientes como pacientes de adenocarcinoma o de carcinoma de célula escamosa. A continuación, para cada paciente se calculó el patrón de tinción de anticuerpo con el panel aplicable (es decir, Tabla 10 o 11). Se colocaron los pacientes en los grupos de pronóstico "malo", "moderado" y "bueno" en base a sus patrones de unión con estos anticuerpos. A continuación, se calcularon curvas de Kaplan-Meier en base a los datos de supervivencia para los pacientes dentro de cada grupo. La Figura 14 muestra las curvas que se obtuvieron cuando se colocaron los pacientes de cáncer de pulmón combinados

en grupos de pronóstico "bueno", "moderado" o "malo" (valor de p/proporción de riesgo de 5,20E-02/1,98). La Figura 15 muestra las curvas que se obtuvieron cuando se combinaron los pacientes de los grupos "moderado" y "malo" en un único grupo de pronóstico "malo" (valor de p/proporción de riesgo de 2,50E-02/3,03). La Figura 16 muestra las curvas que se obtuvieron cuando se colocaron los pacientes de la subclase de adenocarcinoma en los grupos de pronóstico "bueno", "moderado" o "malo" (ningún paciente caía en el grupo "malo" por lo cual sólo hay dos curvas, valor de p/proporción de riesgo de 4,00E-02/2,19). La Figura 17 muestra las curvas que se obtuvieron cuando se colocaron los pacientes de la subclase de carcinoma de célula escamosa en los grupos de pronóstico "bueno", "moderado" o "malo" (valor de p/proporción de riesgo de 2,50E-02/3,03). [0217] También se valoró la significancia de pronóstico de anticuerpos individuales identificados en la cohorte de pulmón HH (es decir, los indicados en el Apéndice D) utilizando los datos de supervivencia de cinco años de la cohorte UAB. La metodología fue tal y como se describe en el Ejemplo 11. También se revaloró la significancia de pronóstico de estos mismos anticuerpos utilizando datos de recurrencia de cinco años de la cohorte de HH pulmón (en lugar del periodo de seguimiento completo como en el Ejemplo 11 en el que los pacientes que no murieron de la enfermedad fueron seguidos durante un periodo de hasta diez años). En base a estos cálculos, se descubrió que diversos anticuerpos del Apéndice D tenían un valor de pronóstico relativamente relevante (valor de p inferior a 0,2) tanto en la cohorte de pulmón HH como en la UAB. Estos anticuerpos se presentan en el Apéndice F.

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Ejemplo 15: Uso de un panel de clasificación de cáncer de pulmón con una cohorte independiente [0218] Se determinó el patrón de reactividad con el panel de clasificación de cáncer de pulmón del Ejemplo 5 (ver Apéndice A) utilizando muestras de la cohorte de pulmón HH (datos no mostrados). Como en el Ejemplo 4, se clasificó a los pacientes utilizando agrupamientos de k-medias. Se eligieron siete subclases de pacientes de cáncer de pulmón por su patrón de consenso de tinción. [0219] Se determinó la morfología de los cánceres de pulmón dentro de cada subclase y se muestra gráficamente en la Figura 18. De un modo destacado, se descubrió que las subclases comprendían pacientes con cánceres de pulmón que tenían características morfológicas similares (es decir, las subclases 1, 2, 3 y 7 se componían de una mayoría de pacientes con adenocarcinomas; las subclases 4 y 5 se componían de una mayoría de pacientes con carcinomas de célula escamosa y la subclase 6 se componía de una mayoría de pacientes con carcinomas de célula grande). Estos resultados sugieren que los anticuerpos en el panel de clasificación reconocen una diversidad biológica y clínica en cánceres de pulmón. [0220] Por curiosidad, también se calculó el valor de pronóstico de estas siete subclases. (Cabe indicar que estas subclases se construyeron en base a patrones de tinción de muestra a lo largo del panel de clasificación entero del Apéndice A. Esto difiere de la estrategia que se describió en el Ejemplo 14 en la que se combinaron anticuerpos específicos con valor de pronóstico predeterminado en paneles de pronóstico que a continuación se utilizaron para clasificar pacientes). Primero se calculó la probabilidad promedia de recurrencia para la cohorte HH global y se descubrió que se estabilizaba a aproximadamente el 38% después de seis años. A continuación, se calcularon las probabilidades promedias dentro de cada una de las siete subclases HH y se compararon con el promedio global. Se clasificaron como que tenían un pronóstico "malo" las subclases con una probabilidad promedia de recurrencia después de seis años superior al 48% (es decir, más del 10% peor que la población global). Se clasificaron como que tenían un pronóstico "bueno" las subclases con una probabilidad promedia de recurrencia después de seis años menor del 28% (es decir, más del 10% mejor que la población total). Se clasificaron como que tenían un pronóstico "moderado" las subclases con una probabilidad promedia de recurrencia después de seis años de 28 al 48%. En base a este análisis, las subclases HH 1, 6 y 7 se clasificaron como "mala"; las subclases HH 2 y 4 como "moderada"; y las subclases HH 3 y 5 como "buena". Cuando se combinaron los datos de recurrencia para

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pacientes en las clases "malo", "moderado" y "bueno" y representados como curvas Kaplan-Meier los diferentes resultados para los tres grupos de pronóstico fueron estadísticamente significativas (valor de p < 0,02, datos no mostrados). [0221] Con el objetivo de calcular si las subclases de la Figura 18 se correlacionaban a lo largo de los cánceres de pulmón en general, los criterios de agrupación de k-media que se utilizaron en la clasificación de la cohorte de HH pulmón se "forzaron" en las muestras de una cohorte de pulmón independiente (en concreto la cohorte de pulmón UAB que se describió en el Ejemplo 14). Cabe indicar que mientras la cohorte de HH pulmón estaba compuesta de pacientes en Estadio I/II, la cohorte de pulmón UAB estaba compuesta de pacientes en Estadio III/IV. De este modo, el pronóstico global de los pacientes de UAB era peor que el pronóstico de los pacientes de HH. Primero, se calcularon los valores promedio de los análisis k-medis de H para cada una de las siete subclases de HH de la Figura 18. A continuación, los resultados de tinción de anticuerpo de cada muestra de UAB se compararon con los siete promedios y se asignaron las muestras a una de las siete "subclases HH" en base a la coincidencia más cercana. A continuación, se clasificaron las siete agrupaciones de UAB como un pronóstico "malo", "moderado" y "bueno" en base simplemente a los pronósticos que se habían determinado previamente para las siete subclases de HH correspondientes (ver anteriormente). Cuando se combinaron los datos de recurrencia de pacientes en las clases "malo", "moderado" y "bueno" y se representaron con curvas Kaplan-Meire, los diferentes resultados de los tres grupos de pronóstico fueron de nuevo estadísticamente relevantes (valor de p < 0,02, datos no mostrados). El examen de las curvas y el posterior análisis demostraron que "bueno" y "moderado" dieron resultados similares el uno en relación con el otro mientras que "malo" fue claramente divergente de estos dos. Otras realizaciones [0222] Serán evidentes otras realizaciones de la invención para los expertos en la materia a partir de la consideración de la memoria o práctica de la invención descrita aquí. Se pretende que la memoria y los ejemplos se consideren sólo como ejemplos, indicando el alcance verdadero de la invención en las siguientes reivindicaciones. APÉNDICE A

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APENDICE C

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APENDICE D

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APÉNDICE E

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APÉNDICE F REIVINDICACIONES

PRONÓSTICO DE PULMÓN (COHORTE HH & UAB): reaparición 5 años HH supervivencia UAB 5 años

AGI ID: Dilución (1:X) Método de puntuación Valor P Proporción de riesgo Valor P Proporción de riesgo

s0073P2: 50 2 0,129 0,497 0,192 0,660 TODOS

s0074P3: 810 3 0,091 0,002 0,096 0,002

s0586: 400 2 0,007 0,385 0,148 0,619

s6007: 1 2 0,081 2,420 0,112 2,099

s0074P3: 810 3 0,166 0,002 0,076 0,002 Adenocarcinoma

s0143P3: 300 3 0,001 4,521 0,023 4,450

s0296P1: 1350 2 0,024 2,185 0,021 2,214

s0303: 300 2 0,047 2,049 0,007 3,358

s6006: 1 2 0,126 1,772 0,164 1,650

s6007: 1 2 0,032 3,427 0,033 2,734

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

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•: US 4429008 A, Martin [0090]

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•: US 4735792 A, Srivastava [0090]

•: US 4673562 A, Davison [0090]

•: EP 519596 A [0093]

•: US 6075181 A [0093]

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Claims

1. Método de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama ER+/nódulo-con un pronóstico desconocido, comprendiendo el método las etapas de:

poner en contacto una muestra de tumor de mama obtenida del paciente con un panel de anticuerpos cuya unión se ha correlacionado con un pronóstico particular; y

valorar el pronóstico probable del paciente en base a la unión del panel con la muestra del tumor,

donde el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos TP53, NDRG1, HTF9C y CEACAM5.

2.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a TP53.

3.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53 y NDRG1.

4.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53, NDRG1 y HTF9C.

5.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53, NDRG1, HTF9C y CEACAM5.

6.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a NDRG 1.

7.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a HTF9C.

8.: Método según la reivindicación 1, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a CEACAM5.

9.: Método de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama ER+/nódulo-con un pronóstico desconocido, comprendiendo el método las etapas de:

valorar el pronóstico probable del paciente en base a la unión del panel con

la muestra del tumor,

donde el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos NAT1 y TP53.

10.: Método según la reivindicación 9, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a MKI67.

11.: Método según la reivindicación 10, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a HTF9C, un anticuerpo dirigido a PGR, o ambos.

12.: Método de valoración del pronóstico de un paciente que tiene un tumor de mama ER+ con un pronóstico desconocido, comprendiendo el método las etapas de:

donde el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos CELSR2 y MKI67.

13.: Método según la reivindicación 12, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a PGR, un anticuerpo dirigido a FASN, o ambos.

14.: Método según la reivindicación 13, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a MKI67, un anticuerpo dirigido a HTF9C, o ambos.

15.: Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el panel incluye entre 2 y 10 anticuerpos.

16.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye entre 3 y 9 anticuerpos.

17.: Método según la reivindicación 16, en el que el panel incluye entre 5 y 7 anticuerpos.

18.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 2 anticuerpos.

19.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 3 anticuerpos.

20. Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 4

anticuerpos.

21.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 5 anticuerpos.

22.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 6 anticuerpos.

23.: Método según la reivindicación 15, en el que el panel incluye 7 anticuerpos.

24.: Kit que comprende un panel de anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos TP53, NDRG1, HTF9C y CEACAM5.

25.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a TP53.

26.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53 y NDRG1.

27.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53, NDRG1 y HTF9C.

28.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y anticuerpos dirigidos a TP53, NDRG1, HTF9C y CEACAM5.

29.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a NDRG 1.

30.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a HTF9C.

31.: Kit según la reivindicación 24, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y un anticuerpo dirigido a CEACAM5.

32.: Kit que comprende un panel de anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos NAT1 y TP53.

33.: Kit según la reivindicación 32, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a MKI67.

34.: Kit según la reivindicación 33, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a HTF9C, un anticuerpo dirigido a PGR, o ambos.

35.: Kit que comprende un panel de anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido a SLC7A5 y por lo menos un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos CELSR2 y MKI67.

36.: Kit según la reivindicación 35, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a PGR, un anticuerpo dirigido a FASN, o ambos.

37.: Kit según la reivindicación 36, en el que el panel de anticuerpos incluye además un anticuerpo dirigido a MKI67, un anticuerpo dirigido a HTF9C, o ambos.

38.: Kit que comprende un panel de anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido al Citocromo P450 4Z1 y un anticuerpo dirigido a SLC7A5.

39.: Kit según la reivindicación 38, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido al Citocromo P450 4Z1 y anticuerpos dirigidos a SLC7A5 y AKR1C1.

40.: Kit según la reivindicación 38, en el que el panel de anticuerpos incluye un anticuerpo dirigido al Citocromo P450 4Z1 y anticuerpos dirigidos a SLC7A5, AKR1C1 y ABCG2.

41.: Kit que comprende un panel de anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido a ERBB2 y anticuerpos dirigidos a HTF9C, NDRG1 y SLC7A5.

42.: Kit según cualquiera de las reivindicaciones 24-41, en el que el panel incluye entre 2 y 10 anticuerpos.

43.: Kit que comprende un panel que consiste entre 2 y 10 anticuerpos que incluye un anticuerpo dirigido a ERBB2 y un anticuerpo dirigido a SLC7A5.

44.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye entre 3 y 9 anticuerpos.

45.: Kit según la reivindicación 44, en el que el panel incluye entre 5 y 7 anticuerpos.

46.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 2 anticuerpos.

47.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 3 anticuerpos.

48.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 4 anticuerpos.

49.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 5 anticuerpos.

50.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 6 anticuerpos.

51.: Kit según la reivindicación 42 o la reivindicación 43, en el que el panel incluye 7 anticuerpos.