JP2005503145A - 非小細胞肺癌の分子特性 - Google Patents
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Abstract
本発明者らは、階層型クラスタリングを使用して、全部で9個の正常肺上皮細胞と非小細胞肺癌（NSCLC）における遺伝子発現の連続解析（Serial Analysis of Gene Expression：SAGE）によって生成された遺伝子発現プロファイルを試験した。正常試料と腫瘍試料の分離および組織病理学的サブタイプは、3,921個の大量の転写産物タグを使用して明らかであった。この区分は、ちょうど115個の非常に示差的に発現される転写産物タグを用いた場合と変わらなかった。さらに、これらの115個の転写産物タグは、試験された異なる組織の特有の生物学的特性および病理学的特性を示唆する群にクラスター化された。腺癌は、小気道関連または免疫関連タンパク質の高レベルの発現によって特徴付けられ、扁平上皮癌は、細胞内の解毒または抗酸化に関与する遺伝子を過剰発現した。2つのp53調節遺伝子、p21waf1/CIP1および14-3-3σの情報は腺癌において構成的に低発現され、p53経路自体がこの癌の型を損ないうることを示唆した。SAGEによって観察された遺伝子発現は、43個のさらに別の肺腫瘍および正常試料を使用した定量リアル-タイムPCRまたはcDNAアレイ解析によって得られた結果と一致した。従って、たった数個の組織ライブラリーからではあるが、SAGEに由来する非小細胞肺腫瘍の分子シグニチャは、ヒト肺癌のための不偏で今のところ特殊な分子シグニチャを示す可能性が非常に高い。
Description
【技術分野】
【０００１】
本出願書は、2001年8月16日に出願された米国仮特許出願第60/312,400号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は癌の技術分野に関する。特に、肺癌の診断領域に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は世界中で癌による死の原因となっており、NSCLCはこの疾患の80％近くになると考えられる（1）。細胞形態学に基づき、腺癌および扁平上皮癌はNSCLCの最も一般的な型である（2）。これらの腫瘍の臨床経過は同様であるが、腺癌は肺の末梢局在により特徴付けられ、K-ras癌遺伝子において活性化された変異をしばしば有する（3、4）。対照的に、扁平上皮癌は、通常中枢に局在し、非常に頻繁にp53遺伝子の変異を有している（5）。さらに、扁平上皮癌の病因は喫煙に密接に関連しているが、腺癌の原因は不明なままである（6、7）。NSCLCに関する多くの分子変化が報告されており（8、9）、肺癌の最も一般的な2つの型に関連する包括的な遺伝子発現パターンは記載されていない。これらの主要な腫瘍型の遺伝子発現パターンを理解することは、疾患検出のための新規のマーカー、および肺癌の合理的治療のための潜在的な標的を明らかにすると思われる。
【０００４】
いくつかの技術は、ヒト癌において遺伝子発現をプロファイリングするために現在利用されている（10）。SAGE（11）は対象となる組織において、同定されていない転写産物を含む発現された任意の転写産物を、迅速に同定する開放系である。高度な定量方法は、各々の転写産物の発現の程度を正確に同定することができる。腫瘍と対応する正常組織の間でSAGEプロファイルを比較することにより、2集団において差異を持って発現する遺伝子が容易に同定され得る。この方法を使用して、新規の転写産物および分子経路が明らかにされている（12-14）。対照的に、cDNAアレイは、既知の遺伝子または転写産物の相対的な発現レベルを解析する閉鎖系を示す（15、16）。迅速スクリーニングのために、何千個もの多くの遺伝子を単一の膜またはスライド上に置くため、研究では最近、いくつかのヒト癌の分子プロファイルが明らかにされている（17-20）。
【０００５】
階層型クラスタリングは、cDNAアレイデータ解析において広く使用される系統的な方法であり、多くの遺伝子の発現パターンにおける差異は一般的に数倍以内である（21）。本発明者らは、SAGEは高度に定量性があるので、階層型クラスタリングは、たった数個の組織ライブラリーからのSAGEによって生成された遺伝子発現データを組織化するために使用することができると考えた。これを試験するために、原発性腺癌、原発性扁平上皮癌、正常肺小気管上皮細胞（SAEC）、または正常気管支／気管上皮（NHBE）細胞、および肺腺癌細胞系に由来するそれぞれのライブラリーの2つからのSAGEタグを使用した。最も量が多いSAGEタグをクラスタリング解析にかけた。それぞれのライブラリーは、2つの別々の分枝でクラスター化された異なる別々の正常および腫瘍試料に由来したが、一方、異なる細胞型の組織は一緒にクラスター化された。さらに、SAGEタグは最も一般的な2つのNSCLCサブタイプの重要な分子特性を示す生物学的に有意義な群にクラスター化した。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、肺癌を扁平上皮癌として同定する方法を提供する。本方法に従って、肺癌試料における遺伝子の遺伝子産物量が測定される。遺伝子は、グルタチオンパーオキシダーゼ（GPX；NM_002083）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM3（GSTM3；NM_000849）、アルドケトレダクダーゼファミリー1、メンバーB 10（NM_020299）、パーオキレドキシン（peroxiredoxin）1（PRDX1；NM_002574）、スモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）、およびTNF受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；NM004195）からなる群より選択される。肺癌試料の遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が増加していることにより、肺癌が扁平上皮癌として同定される。
【０００７】
本発明は、肺癌を腺癌として同定する方法を提供する。本方法に従って、肺癌試料におけるスモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）遺伝子の遺伝子産物量が測定される。肺癌試料の遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が減少していることにより、肺癌が腺癌として同定される。
【０００８】
したがって本発明は、組織学的特性および／または臨床行為を補助または置換する分子診断技術を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ある特定の分子マーカーを最も一般的な2つの肺癌の型である、腺癌と扁平上皮癌を識別するために使用できることを見出した。正常の非病原性肺組織と比較して、試料腫瘍組織におけるある特定の遺伝子の発現レベルを評価することにより、癌が示すこれらの型を決定することができる。
【００１０】
1つまたは複数の癌の型でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることが見出されている任意の遺伝子発現を測定することができる。1つの好ましい態様において、1つまたは複数の癌マーカーの発現パターンを確かめることによって、肺組織を、診断し、予後し、または治療の決定をすることができる。そのようなマーカーには、グルタチオンパーオキシダーゼ（GPX；NM_002083）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM3（GSTM3；NM_000849）、アルドケトレダクダーゼファミリー1、メンバーB 10（NM_020299）、パーオキレドキシン（peroxiredoxin）1（PRDX1；NM_002574）、スモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）、およびTNF受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；NM004195）が含まれるが、これらに限定されることはない。癌が疑われる組織において測定された遺伝子産物の量を、非病原性の肺組織試料における同じ遺伝子産物の量と比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が増加または減少することにより、その型によって肺癌を同定する。そのようなマーカーを使用して、例えば肺の扁平上皮癌と腺癌を識別することができる。
【００１１】
mRNAまたはタンパク質のいずれかを、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを測定する手段として測定することができる。そのような遺伝子産物を測定するための当技術分野に周知の任意の技術を使用することができる。定量技術が好まれるが、半定量技術または定性技術も使用することができる。遺伝子産物を測定するための適当な技術には、SAGE解析、DNAマイクロアレイ解析、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫細胞化学的解析、およびELISAが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１２】
本発明に従って使用することのできる対照試料には、肺組織の任意の非病原性試料が含まれる。これらは、疑われる肺試料として同一個体から、または異なる個体（関連があろうとなかろうと）から、単離されうる。適当な細胞型には、肺小気道上皮細胞、および気管支／気管上皮細胞が含まれる。
【００１３】
実施例
実施例1. 腫瘍および細胞系
SAGEのために使用する原発性肺腫瘍組織を、癌のために肺切除の手術の後に、以前に記載されたように、ジョーンズ-ポプキンス-ホスピタル（Johns Hopkins Hospital）から得た（9）。組織学的に、2つの扁平上皮腫瘍は穏やかに扁平上皮癌に分化し、一方、2つの腺癌は、隣接した肺胞中隔でリンパ形質細胞性浸潤の一般的特徴を共有する、十分に分化した腫瘍およびほとんど分化していない腫瘍からなる。SAECおよびNHBE細胞をClonetics/BioWhittaker, Inc.（Walkersville, MD）から購入し、製造者の指示に従って増殖させた。本発明者らは、これらの2つの始原細胞培養物が、小気道および大気道のそれぞれから、肺上皮細胞の純粋な集団を示したことから、これらを正常対照として選択した。腫瘍RNA試料は、BioChain Inc.（Hayward, CA）から購入するか、またはSAGEのために使用する試料と同じ方法で得られた。A549細胞は、James Herman博士（Johns Hopkins Oncology Center）からの寄贈品として得られた。
【００１４】
実施例2. SAGEライブラリーおよびSAGE解析
総RNA試料をRNazol（Tel-Test Inc., Friendswood, Texas）によって、製造者の指示に従って単離した。ポリ(A)+RNAをOligotex mRNA Miniキット（Qiagen Inc, Valencia, California）Dynabeads mRNA DIRECTキット（Dynal A. S., Oslo, Norway）を使用して抽出した。SAGEライブラリーを作製し、タグを記載のようにシークエンスした(11)(22)。SAGE 300ソフトウエア（URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名sagenet.org、ディレクトリsage_protocol、サブディレクトリhtm）を使用して、タグ配列を同定し、各タグの量を定量した。遺伝子の同定および各SAGEタグのUniGeneクラスターアサインメントは、URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名ncbi.nlm.nih.gov、ディレクトリpub、サブディレクトリSAGE、サブサブディレクトリmapからのタグ-遺伝子の「信頼できる」マップ（2001年4月23日アップデート）、ならびにURLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名ncbi.nlm.nih.gov、ディレクトリUniGeneからのUniGeneクラスター表（2001年5月23日アップデート）を使用することによって得られた。
【００１５】
実施例3. 正規化および階層型クラスタリング解析
「Cluster 2.11」プログラム（URLアドレス：httpファイルタイプ、ドメイン名rana.lbl.gov）を、SAGEデータの正規化およびクラスタリングに使用した。簡単に言うと、正規化はデータの対数変換を含み、試料による、その後遺伝子による、中間値でデータを10サイクルセンタリングした後、各時間は各試料および各遺伝子における二乗和を1にスケーリングした。非センタリングピアソン相関は距離計算のために使用され、加重平均連鎖は記載されたようにクラスタリングに使用された（21）。
【００１６】
実施例4. 正常肺および腫瘍試料の多次元スケーリング
古典的な多次元スケーリング法を、SAGEにより解析される各ライブラリーの相関性を決定するために使用した（23）。各試料を使用して、特有のライブラリーが生成された。ライブラリー毎で各遺伝子について正規化された発現レベルの表は、相違する行列として使用された。正規化は、上記のように「Cluster 2.11」プログラムを使用して行われた。多次元スケーリングにより、対象物の間の距離が既知ならば、対象物の座標が計算される。試料間の距離は、1-Cnmとして計算され、式中、Cnmはライブラリーnとmの間の相関計数であった。距離行列は、N次元空間に渡り、式中、Nは試験におけるライブラリー数である。主成分解析（23）を使用して、ライブラリーを提示のための3次元範囲中で最良適合した。
【００１７】
実施例5. 統計解析
p確率解析（SAGE 300ソフトウエアで入手可能であり、(21)に記載される）を使用して、各腫瘍とその対応する正常対照の間で最も差異を持って発現する遺伝子を選択した。p確率はモンテ-カルロ（Monte-Carlo）法（24）を使用して、確率のみにより2つの試料間の観察される発現の差と、同一またはそれより大きい発現の差を検出する相対的確率を計算した。第一に、各腫瘍型に対して、2つの腫瘍ライブラリーのうち1つが2つの対応する正常ライブラリーに比較され、p確率値が0.001未満である遺伝子が選択された。このp確率において、選択された全ての遺伝子の擬陽性率は、0.015未満であった。次に、本発明者らは、同一細胞型の両方の腫瘍ライブラリーにおいて一貫した発現パターンを有する遺伝子のみを選択し、それらを、同一の方法を使用することによって他の腫瘍型から選択された遺伝子と組み合わせた。
【００１８】
実施例6. リアルタイム定量PCR解析
腺癌または扁平上皮癌のいずれかにおいて高レベルに発現するものとしてSAGEによって同定された5つの遺伝子を、肺腫瘍および対照に由来する14個のRNA試料を用いて、リアルタイム逆転写（RT)-PCRによって解析した（25)。リアルタイムRT-PCRプローブおよびプライマーは、Primer Expressソフトウエアを用いて設計された（PE Biosystems, Foster City, California）。プライマー配列および反応条件は補足試料において記載されている。各遺伝子の相対発現は、対応する正常細胞型と比較して、同一細胞型の腫瘍のための平均遺伝子発現レベルの割合として計算された。
【００１９】
実施例7. GeneChip（商標）を使用した遺伝子発現解析
GeneChip（商標）U95AプローブアレイをAffimetrix Inc.（Santa Clara, CA）から得た。32個のRNA試料の全てを個々に調製し、GeneChip（商標）とハイブリダイズし、製造者により推奨されたHewlett-Packard（HP）GeneArray（商標）スキャナーでスキャンした。6個のGeneChip（商標）内部標準、β-アクチン、18S rRNA、28S rRNA、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、トランスフェリン受容体、および転写因子ISGF-3は、試験された全ての試料の品質を確認するために対照として使用された。
【００２０】
実施例8. NSCLCのSAGE
9個の別々のSAGEライブラリーの全てを、異なる5つの正常組織および腫瘍組織から生成した。18,300個の別々のクローンの全てがシークエンスされ、66,501個の別個の転写産物を示す374,643個のタグが生成された（表1）。組み合わされた9個全てのライブラリーにおいて1回より多く現れた23,056個の別個のタグのうち、18,595個のタグはUniGeneクラスターと少なくとも1回一致し、4,907個のタグは多数回一致し、4,319個のタグは一致がなく、142個のタグはミトコンドリアDNAまたはリボソームRNA配列と一致した。9個全てのライブラリーにおいて1回のみ現れたタグで、潜在的なシークエンスエラーの7％を占めており（21）、同定された別個の転写産物タグの総数は約59,000である。この数は、ヒトゲノムにおいて予測される遺伝子の現在の推定値の30,000個〜40,000個（26、27）を超えることから、この不一致は、結果として同一遺伝子に対して複数のSAGEタグを生じうる、オルタナティブスプライシングされた転写産物およびポリアデニル化使用部位によるものとして計算することができる（28、29）。または、本発明者らの転写産物解析が、制限された数の組織で行われたため、現在の遺伝子推定値が低くなっている可能性がある。
【００２１】
（表１）NSCLCおよび正常肺気管支上皮細胞におけるSAGE
要約：
特有のライブラリー数＝9
特有のタグ数＝66,502
＞1で現れた特有のタグの数＝23,056
特有のUniGeneクラスターと一致した数＝18,652
【００２２】
実施例9. SAGEに基づく腫瘍および正常肺組織の階層型クラスタリング
腫瘍試料と正常試料の間、および、異なる腫瘍型の間で、差異を持って発現する遺伝子を同定するために、本発明者らは、階層型クラスタリングを使用して各組織に由来するライブラリーの全体の類似性を調べた（22）。より一般的に発現する遺伝子に対する発現の差異は、偶然に観察された可能性は低いため、9個全てのライブラリーにおいて少なくとも10回現れた3,921個のSAGEタグの集団をクラスタリング解析にかけた。各試料は異なる個体に由来し、特有の発現パターンを有したが（図1A）、正常組織は互いに同様であり、腫瘍組織は群としてより類似していた。さらに、SAECおよびNHBE試料の各々は正常分枝下で共に対になり、腺癌およ扁平上皮腫瘍の各々は腫瘍分枝下で共にクラスター化された（図1B）。腺癌由来のA549細胞系はNSCLC腫瘍と枝分かれし、多次元スケーリングにおける2つの腺癌の相関性を証明した。これは、互いに関連する9個全ての試料の空間的関連を示すものである（図1C）。
【００２３】
遺伝子発現レベルが、SAGEライブラリーで検出される各転写産物に対するタグ数によって示されたことから、本発明者らは、モンテ-カルロシミュレーション（24）を使用し、腫瘍ライブラリーと対応する2つの正常上皮細胞対照との遺伝子発現の差異の有意性を定量した。p＜0.001で、2つの腺癌とSAEC試料を比較した場合に、58個の遺伝子が選択され、扁平上皮癌とNHBE細胞の比較によって、71個の遺伝子が得られた。14個の遺伝子が両方の比較に対して共通であるため、従って、本発明者らは、両方の腫瘍型に対して転写産物を高レベルで差異を持って発現した115個の転写産物を同定した（表1、補足材料（Supplemental Material）における遺伝子の表）。予想されたように、階層型クラスタリングにかけた場合、これらの115個の遺伝子は、9個のライブラリーを、上記の約4,000個の遺伝子を伴って正確に同一の分枝パターンに再び分離した（図2A）。再び、A549細胞系を腫瘍組織で分けたところ、多次元スケーリングによって2つの腺癌の最も近くに局在した（図2B）。
【００２４】
実施例10. 異なるNSCLCサブタイプにおける遺伝子の生物学的に別個のクラスター
115個の統計学的に有意な遺伝子のクラスタリングにより、解析され高度に特徴付けられた腫瘍組織である、少なくとも3つの別個の遺伝子クラスターが明らかにされた（図2C）。肺の扁平上皮癌において最も高レベルで発現した遺伝子（図2C、上パネル）は、解毒特性および抗酸化特性を有するタンパク質をコードする転写産物によって特徴付けられた。これらの遺伝子には、グルタチオンパーオキシダーゼ2（GPX2）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM1（GSTM1）、カルボキシエステラーゼ、アルド-ケトレダクターゼ、およびパーオキレドキシン1（PRDX1）が含まれる。これらが扁平細胞肺癌において存在することは、環境的発癌性傷害に対する気管支による細胞内反応が示された可能性が高い（30、31）。過剰発現した遺伝子のクラスタリングは、集団におけるこれらのタンパク質の機能的変種が数人の患者において肺癌感受性に寄与しうるという考えを強調する。加えて、GSTM1は、肺および口腔癌に対して感受性の既知のマーカーである（32）。それは、乳房（33）および卵巣癌（34）にも関連している。インターフェロンα誘導性タンパク質27はまた、乳癌の50％で過剰発現されることが示されている（35）。
【００２５】
対照的に、遺伝子クラスターは肺腺癌で発現し（図2C、中央パネル）、そのほとんどが小気道に関連するタンパク質および免疫学的に関連するタンパク質をコードしていた。クラスターにおける、界面活性剤A2およびB、プロナプシンA（pronapsin A）、およびムチン1の存在は、小気道上皮細胞（例えば2型肺細胞およびクララ細胞）に由来する腫瘍の起源を表している（36、37）。しかし、これらの遺伝子の高レベルの発現により、これらのタンパク質が肺腺癌の腫瘍形成に関与する可能性を有することも示唆された。実際、ムチン1は乳癌で過剰発現し、MUC1ムチンのCTドメインのチロシンリン酸化により、Ras-MEK-ERK2経路を介したマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路が活性化される（38、39）。さらに、試験された腺癌におけるイムノグロブリン遺伝子の過剰発現は、B細胞の浸潤の範囲、およびSAGE解析に使用された腺癌における抗原提示細胞（APC）の存在により説明できると考えられる。しかし、SAGEタグのクラスタリング解析は、異なる腫瘍型が細胞表面マーカーの異なるセットを優先的に発現することを示した。扁平上皮癌はMHCクラスIおよびCD71タンパク質を過剰発現すると思われ（図2C、上パネル）、一方、腺癌はMHCクラスIIおよびCD74抗原の比較的高レベルの発現を有していた。腫瘍におけるこの遺伝子発現の差異は、免疫ベースの癌治療が異なる腫瘍表面マーカーの発現に基づき増強されうることを示した。
【００２６】
予期しないこともなかったが、原発性腺癌およびA549腺癌細胞系（図2C、下パネル）で低発現した多くの遺伝子は、扁平上皮細胞分化に関連するものであった。これらのタンパク質には、S100タンパク質、ケラチン、およびスモールプロリン-リッチタンパク質1B（コーニフィン（Cornifin））が含まれる。興味深いことに、2つのp53誘導性遺伝子、14-3-3σ（ストラティフィン（Stratifin））（40）およびp21waf1/CIP1（41、42）はこの群の遺伝子とクラスター化し、腺癌における発現の有意な減少を示した。p21waf1/CIP1および14-3-3σの両方は、電離放射線およびp53に依存的な方法で他のDNA傷害剤を処理した細胞で高レベルに誘導される（43、44）。p53によるこれらの遺伝子の誘導により、細胞周期の停止が引き起こされる（45）。p53遺伝子は肺の扁平上皮癌ではしばしば変異しており、これは、p53における変異が、肺上皮細胞が発癌性物質に誘導性の傷害を修復することを不能にすることに寄与している可能性が考えられた（46）。対照的に、p53変異は、肺腺癌で頻繁に観察されることはほとんどない（5）。腺癌でp21waf1/CIP1および14-3-3σ遺伝子転写産物の発現が減少していることは、p53経路における遺伝子の不活性化が肺腫瘍型で非常に重要な役割を担っていることを示唆している。しかし、mRNAの発現が減少していることが、遺伝子産物の減少といつも関連しているというわけではないと考えられる。コードされたタンパク質の発現を伴うp53の分子の役割に関するさらなる研究が、p53および肺腺癌の発症におけるその下流の遺伝子の関与を評価するために必要とされる。
【００２７】
実施例11. NSCLCにおいて差異を持って発現する他の遺伝子
本発明者らが同定した115個の高レベルに差異を持って発現した遺伝子は、差異を持った発現が、各細胞型の分子特性および肺の新生物性状態を識別可能な遺伝子セットを示したのみであったことに気づくことが重要である。また、明らかに、NSCLCに生物学的有意性を有する付加的な遺伝子を、選択された統計学的方法および有意性のレベルにより同定することができた。例えば、同一細胞型のライブラリー内で構成性発現を示した全てのタグが、99％の信頼水準で差異を持って発現する遺伝子を単離するために比較された場合、多くの候補遺伝子が単離された。具体的には、827個のタグが、扁平上皮癌とNHBEの間で統計学的に有意な差異を持った発現を示し、少なくとも10倍の過剰発現を示す71個のタグが存在した。2つの腺癌腫瘍ライブラリーとSAECでの同様の比較により、差異を持った発現を示した298個のタグが同定され、腫瘍において少なくとも10倍で過剰発現した20タグが存在した。共同で、45個のタグが両方の比較で差異を持って発現し、これらの遺伝子は、115個の遺伝子によって明らかにされた観察の一部またはさらに拡大されたものであった。例えば、スモールプロリンリッチタンパク質3（SPRR3）は扁平上皮腫瘍では上昇したが、腺癌では事実上存在しなかった。SPRR3は、SPRR1（コーニフィン）を含むタンパク質のスモールプロリンリッチファミリーのメンバーであり、遺伝子は扁平上皮癌に対するマーカーとして単離され（47）、腺癌で発現しない遺伝子のための同一クラスター内にある（図2C、下パネル）。SPRR3は、細胞の表皮層に防護壁提供する助けとなる角化膜におけるタンパク質のメンバーである（48）。腺癌におけるこのファミリーのタンパク質発現の減少は、この癌の侵襲特性に寄与する可能性がある。さらに、タンパク質の腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：TNF）のいくつかのメンバーおよびそれらの受容体は、NSCLCを含む様々な癌において発現を増加することを明らかにした（49）。SAGEデータの本発明者らによる統計学的解析により、TNF受容体スーパーファミリーメンバー18の発現が解毒および抗酸化遺伝子に加えて、扁平上皮腫瘍で増加することが明らかになった。TNFは、T細胞を介するアポトーシスを促進し（50）、この経路での遺伝子の発現の増加により、腫瘍細胞の抗増殖機構が提供されると考えられる。
【００２８】
実施例12. 付加的なNSCLC腫瘍の定量PCRおよびGeneChip（商標）cDNAオリゴアレイ解析
SAGEライブラリーは、選択された腫瘍組織のみに由来することから、SAGEに由来する遺伝子発現パターンが独立したアッセイ法を使用することにより大パネルの肺組織で再現可能かどうかを決定することは不可欠であった。全部で43個の付加的な腫瘍および正常試料を、定量リアルタイムPCRまたはcDNAアレイ法のいずれかを使用することによって試験した。肺の扁平上皮または腺癌のいずれかで高レベルの過剰発現するとSAGEにより観察された5つの遺伝子は（図2Cに列挙される）、10個の異なるNSCLC腫瘍および4個の正常対照を使用したリアルタイムRT-PCRにより試験された。表2に示されるように、2個の扁平上皮腫瘍に特異的な遺伝子が、腺癌の発現と比較して、この腫瘍型で高レベルの発現割合を構成的に有することが、リアルタイムRT-PCRによって明らかにされた。同様に、3つの腺癌に特異的な遺伝子は、この腫瘍型に高レベルの発現割合を構成的に有し、正常組織と比較して、扁平上皮癌でより減少した。
【００２９】
（表２）SAGEにより同定された遺伝子のリアルタイム定量PCR解析
列挙された遺伝子の発現を、14試料（5個の扁平上皮細胞腫瘍、4個の腺癌、1個の腺癌形態を有する腫瘍、2個のNHBE培養物、および2個のSAEC培養物）で試験した。*示されたSAGEライブラリーでタグの出現した実際の数を提供する。†各遺伝子の平均発現を、4つの異なる細胞型に対して計算し、差異を持った発現の割合を示す。Ad＝腺癌、Sq＝扁平上皮癌、N＝NHBE、S＝SAEC、Spec.＝SAEGに基づく腫瘍特異性。
【００３０】
肺のSAGEライブラリーから得られた分子クラスタリングの総合的な信頼性を調べるため、GeneChip（商標）cDNAオリゴアレイ（15, 16）を用いて、32個の腫瘍および正常組織（リアルタイムPCRで使用された3個の試料を含む）を相対的遺伝子発現について調査した。高レベルで差異を持って発現する115個の転写産物タグのうち51個のみが、12,000エレメントGeneChip（商標）（U95A）に存在し、3つの主要クラスター由来の35個の遺伝子のうち20個（図2Cに示される）が、SAGEとcDNAアレイの両方で比較可能であった。これらの20個の遺伝子に対する遺伝子発現レベルは、同一細胞型の全ての腫瘍間で平均化され、対応する正常試料のレベルと比較された。20個の遺伝子のうち19個が、SAGEによって得られた発現パターンと同様の発現パターンを示した。腺癌でダウンレギュレーションされた遺伝子クラスターに対する発現パターンを示す（図3Aおよび図3B）。これらの結果から、SAGEライブラリーの階層型クラスタリングによって、強い生物学的有意性を有する遺伝子クラスターが明らかにされうることが示され、高度に定量的で再現性のあるSAGEの性質が、数個の組織試料を使用するのみで、高度に正確な組織分類および信頼性のある遺伝子クラスタリングを可能にするという見解が支持される。さらに、SAGE法は遺伝子配列情報またはプローブのハイブリダーゼーション条件と独立しているため、対象となる組織における遺伝子発現パターンの公平な同定および定量化を可能にする。SAGEの使用により、新規遺伝子および分子マーカーを同定する機会が提供される。
【００３１】
要約すると、本発明者らは、SAGEおよび階層型クラスタリング解析を使用して、ヒト肺癌の最も共通している2つ型に特異的に関連する分子プロファイルおよび遺伝子クラスターを同定した。生物学的有意性および高度の再現性にもかかわらず、本明細書に記載した遺伝子発現プロファイルは、肺の腺癌および扁平上皮癌に由来する基本的な分子特性を識別できる可能性を有することを示すのみである可能性がある。腫瘍の階層型特性および臨床行為は、様々な遺伝子および経路のための発現レベルの著しい変化によってほとんど決定されていない。それにもかかわらず、証拠を蓄積することにより、遺伝子発現パターンは、癌の臨床行為および治療的反応をより決定することができる可能性を示唆している（19、51）。本発明者らが記載した高度に差異を持って発現する遺伝子の表は、改良した診断、予後、および合理療法のための新規の分子標的を提供する可能性を有すると考えられる。記載した臨床的情報および結論を有する数の多い肺腫瘍におけるこれらの発現解析は、本目的を達成することを助けると思われる。
【００３２】
本発明は、本発明を実施する現在の好ましい方法を含む、特定の実施例に関して記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲内で、上記の技術の様々な変形および置換を認識すると思われる。
【００３３】
参考文献
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ−１Ｃ】SAGEライブラリーのクラスタリングおよび多次元スケーリングを示す。少なくとも10個の総タグ数を有する遺伝子のみを含む。（図1A）9個全てのSAGEライブラリーのクラスター。遺伝子を水平面に配列し、ライブラリーを垂直方向に示す。示したライブラリーにおいて、赤色、緑色、および黒色はそれぞれ、高レベル、低レベル、および中レベルを示す。（図1B）クラスター化されたライブラリーの系統樹。（図1C）9個のライブラリーの関連性を示す多次元スケーリング。
【図２Ａ−２Ｃ】9個のSAGEライブラリーにおいて差異を持って発現した（p＜0.001）115個の遺伝子のクラスタリングおよび多次元スケーリング。（図2A）扁平上皮癌で過剰発現した遺伝子（上）、腺癌で過剰発現した遺伝子（中央）、および腺癌を低発現した遺伝子（下パネル）からなる3つの主要なクラスター（右パネル）を有する、115個の遺伝子クラスター（左パネル）。†このタグが同一ファミリーの1つより多い遺伝子に対応することを示す。*このタグが1つより多い異なる遺伝子に対応することを示す。（図2B）115個の差異を持って発現した遺伝子の使用による、9個のクラスター化されたライブラリーの系統樹。（図2C）115個の差異を持って発現した遺伝子の使用による、ライブラリーの多次元スケーリング。
【図３Ａ−３Ｂ】Affimetrix GeneChips（商標）およびSAGEライブラリーの使用による腺癌で低発現した遺伝子の比較を示す。（図3A）正規化したSAGEデータのヒストグラムは、腺癌で低発現した7個の遺伝子の平均相対発現レベルを示す（図2Cの右下パネルに示す）。（図3B）GeneChip（商標）データのヒストグラムは、図3Aのように同一遺伝子の正規化された平均相対発現レベルを示す。GeneChip（商標）発現値が1未満である場合、正規化前にそれを1にセットした。正規化はクラスタリング解析と同様の方法で行った。
【０００１】
本出願書は、2001年8月16日に出願された米国仮特許出願第60/312,400号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は癌の技術分野に関する。特に、肺癌の診断領域に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は世界中で癌による死の原因となっており、NSCLCはこの疾患の80％近くになると考えられる（1）。細胞形態学に基づき、腺癌および扁平上皮癌はNSCLCの最も一般的な型である（2）。これらの腫瘍の臨床経過は同様であるが、腺癌は肺の末梢局在により特徴付けられ、K-ras癌遺伝子において活性化された変異をしばしば有する（3、4）。対照的に、扁平上皮癌は、通常中枢に局在し、非常に頻繁にp53遺伝子の変異を有している（5）。さらに、扁平上皮癌の病因は喫煙に密接に関連しているが、腺癌の原因は不明なままである（6、7）。NSCLCに関する多くの分子変化が報告されており（8、9）、肺癌の最も一般的な2つの型に関連する包括的な遺伝子発現パターンは記載されていない。これらの主要な腫瘍型の遺伝子発現パターンを理解することは、疾患検出のための新規のマーカー、および肺癌の合理的治療のための潜在的な標的を明らかにすると思われる。
【０００４】
いくつかの技術は、ヒト癌において遺伝子発現をプロファイリングするために現在利用されている（10）。SAGE（11）は対象となる組織において、同定されていない転写産物を含む発現された任意の転写産物を、迅速に同定する開放系である。高度な定量方法は、各々の転写産物の発現の程度を正確に同定することができる。腫瘍と対応する正常組織の間でSAGEプロファイルを比較することにより、2集団において差異を持って発現する遺伝子が容易に同定され得る。この方法を使用して、新規の転写産物および分子経路が明らかにされている（12-14）。対照的に、cDNAアレイは、既知の遺伝子または転写産物の相対的な発現レベルを解析する閉鎖系を示す（15、16）。迅速スクリーニングのために、何千個もの多くの遺伝子を単一の膜またはスライド上に置くため、研究では最近、いくつかのヒト癌の分子プロファイルが明らかにされている（17-20）。
【０００５】
階層型クラスタリングは、cDNAアレイデータ解析において広く使用される系統的な方法であり、多くの遺伝子の発現パターンにおける差異は一般的に数倍以内である（21）。本発明者らは、SAGEは高度に定量性があるので、階層型クラスタリングは、たった数個の組織ライブラリーからのSAGEによって生成された遺伝子発現データを組織化するために使用することができると考えた。これを試験するために、原発性腺癌、原発性扁平上皮癌、正常肺小気管上皮細胞（SAEC）、または正常気管支／気管上皮（NHBE）細胞、および肺腺癌細胞系に由来するそれぞれのライブラリーの2つからのSAGEタグを使用した。最も量が多いSAGEタグをクラスタリング解析にかけた。それぞれのライブラリーは、2つの別々の分枝でクラスター化された異なる別々の正常および腫瘍試料に由来したが、一方、異なる細胞型の組織は一緒にクラスター化された。さらに、SAGEタグは最も一般的な2つのNSCLCサブタイプの重要な分子特性を示す生物学的に有意義な群にクラスター化した。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、肺癌を扁平上皮癌として同定する方法を提供する。本方法に従って、肺癌試料における遺伝子の遺伝子産物量が測定される。遺伝子は、グルタチオンパーオキシダーゼ（GPX；NM_002083）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM3（GSTM3；NM_000849）、アルドケトレダクダーゼファミリー1、メンバーB 10（NM_020299）、パーオキレドキシン（peroxiredoxin）1（PRDX1；NM_002574）、スモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）、およびTNF受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；NM004195）からなる群より選択される。肺癌試料の遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が増加していることにより、肺癌が扁平上皮癌として同定される。
【０００７】
本発明は、肺癌を腺癌として同定する方法を提供する。本方法に従って、肺癌試料におけるスモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）遺伝子の遺伝子産物量が測定される。肺癌試料の遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が減少していることにより、肺癌が腺癌として同定される。
【０００８】
したがって本発明は、組織学的特性および／または臨床行為を補助または置換する分子診断技術を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ある特定の分子マーカーを最も一般的な2つの肺癌の型である、腺癌と扁平上皮癌を識別するために使用できることを見出した。正常の非病原性肺組織と比較して、試料腫瘍組織におけるある特定の遺伝子の発現レベルを評価することにより、癌が示すこれらの型を決定することができる。
【００１０】
1つまたは複数の癌の型でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることが見出されている任意の遺伝子発現を測定することができる。1つの好ましい態様において、1つまたは複数の癌マーカーの発現パターンを確かめることによって、肺組織を、診断し、予後し、または治療の決定をすることができる。そのようなマーカーには、グルタチオンパーオキシダーゼ（GPX；NM_002083）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM3（GSTM3；NM_000849）、アルドケトレダクダーゼファミリー1、メンバーB 10（NM_020299）、パーオキレドキシン（peroxiredoxin）1（PRDX1；NM_002574）、スモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）、およびTNF受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；NM004195）が含まれるが、これらに限定されることはない。癌が疑われる組織において測定された遺伝子産物の量を、非病原性の肺組織試料における同じ遺伝子産物の量と比較する。非病原性の肺組織試料と比較して肺癌試料における遺伝子産物量が増加または減少することにより、その型によって肺癌を同定する。そのようなマーカーを使用して、例えば肺の扁平上皮癌と腺癌を識別することができる。
【００１１】
mRNAまたはタンパク質のいずれかを、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを測定する手段として測定することができる。そのような遺伝子産物を測定するための当技術分野に周知の任意の技術を使用することができる。定量技術が好まれるが、半定量技術または定性技術も使用することができる。遺伝子産物を測定するための適当な技術には、SAGE解析、DNAマイクロアレイ解析、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫細胞化学的解析、およびELISAが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００１２】
本発明に従って使用することのできる対照試料には、肺組織の任意の非病原性試料が含まれる。これらは、疑われる肺試料として同一個体から、または異なる個体（関連があろうとなかろうと）から、単離されうる。適当な細胞型には、肺小気道上皮細胞、および気管支／気管上皮細胞が含まれる。
【００１３】
実施例
実施例1. 腫瘍および細胞系
SAGEのために使用する原発性肺腫瘍組織を、癌のために肺切除の手術の後に、以前に記載されたように、ジョーンズ-ポプキンス-ホスピタル（Johns Hopkins Hospital）から得た（9）。組織学的に、2つの扁平上皮腫瘍は穏やかに扁平上皮癌に分化し、一方、2つの腺癌は、隣接した肺胞中隔でリンパ形質細胞性浸潤の一般的特徴を共有する、十分に分化した腫瘍およびほとんど分化していない腫瘍からなる。SAECおよびNHBE細胞をClonetics/BioWhittaker, Inc.（Walkersville, MD）から購入し、製造者の指示に従って増殖させた。本発明者らは、これらの2つの始原細胞培養物が、小気道および大気道のそれぞれから、肺上皮細胞の純粋な集団を示したことから、これらを正常対照として選択した。腫瘍RNA試料は、BioChain Inc.（Hayward, CA）から購入するか、またはSAGEのために使用する試料と同じ方法で得られた。A549細胞は、James Herman博士（Johns Hopkins Oncology Center）からの寄贈品として得られた。
【００１４】
実施例2. SAGEライブラリーおよびSAGE解析
総RNA試料をRNazol（Tel-Test Inc., Friendswood, Texas）によって、製造者の指示に従って単離した。ポリ(A)+RNAをOligotex mRNA Miniキット（Qiagen Inc, Valencia, California）Dynabeads mRNA DIRECTキット（Dynal A. S., Oslo, Norway）を使用して抽出した。SAGEライブラリーを作製し、タグを記載のようにシークエンスした(11)(22)。SAGE 300ソフトウエア（URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名sagenet.org、ディレクトリsage_protocol、サブディレクトリhtm）を使用して、タグ配列を同定し、各タグの量を定量した。遺伝子の同定および各SAGEタグのUniGeneクラスターアサインメントは、URLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名ncbi.nlm.nih.gov、ディレクトリpub、サブディレクトリSAGE、サブサブディレクトリmapからのタグ-遺伝子の「信頼できる」マップ（2001年4月23日アップデート）、ならびにURLアドレス：httpファイルタイプ、wwwホストサーバー、ドメイン名ncbi.nlm.nih.gov、ディレクトリUniGeneからのUniGeneクラスター表（2001年5月23日アップデート）を使用することによって得られた。
【００１５】
実施例3. 正規化および階層型クラスタリング解析
「Cluster 2.11」プログラム（URLアドレス：httpファイルタイプ、ドメイン名rana.lbl.gov）を、SAGEデータの正規化およびクラスタリングに使用した。簡単に言うと、正規化はデータの対数変換を含み、試料による、その後遺伝子による、中間値でデータを10サイクルセンタリングした後、各時間は各試料および各遺伝子における二乗和を1にスケーリングした。非センタリングピアソン相関は距離計算のために使用され、加重平均連鎖は記載されたようにクラスタリングに使用された（21）。
【００１６】
実施例4. 正常肺および腫瘍試料の多次元スケーリング
古典的な多次元スケーリング法を、SAGEにより解析される各ライブラリーの相関性を決定するために使用した（23）。各試料を使用して、特有のライブラリーが生成された。ライブラリー毎で各遺伝子について正規化された発現レベルの表は、相違する行列として使用された。正規化は、上記のように「Cluster 2.11」プログラムを使用して行われた。多次元スケーリングにより、対象物の間の距離が既知ならば、対象物の座標が計算される。試料間の距離は、1-Cnmとして計算され、式中、Cnmはライブラリーnとmの間の相関計数であった。距離行列は、N次元空間に渡り、式中、Nは試験におけるライブラリー数である。主成分解析（23）を使用して、ライブラリーを提示のための3次元範囲中で最良適合した。
【００１７】
実施例5. 統計解析
p確率解析（SAGE 300ソフトウエアで入手可能であり、(21)に記載される）を使用して、各腫瘍とその対応する正常対照の間で最も差異を持って発現する遺伝子を選択した。p確率はモンテ-カルロ（Monte-Carlo）法（24）を使用して、確率のみにより2つの試料間の観察される発現の差と、同一またはそれより大きい発現の差を検出する相対的確率を計算した。第一に、各腫瘍型に対して、2つの腫瘍ライブラリーのうち1つが2つの対応する正常ライブラリーに比較され、p確率値が0.001未満である遺伝子が選択された。このp確率において、選択された全ての遺伝子の擬陽性率は、0.015未満であった。次に、本発明者らは、同一細胞型の両方の腫瘍ライブラリーにおいて一貫した発現パターンを有する遺伝子のみを選択し、それらを、同一の方法を使用することによって他の腫瘍型から選択された遺伝子と組み合わせた。
【００１８】
実施例6. リアルタイム定量PCR解析
腺癌または扁平上皮癌のいずれかにおいて高レベルに発現するものとしてSAGEによって同定された5つの遺伝子を、肺腫瘍および対照に由来する14個のRNA試料を用いて、リアルタイム逆転写（RT)-PCRによって解析した（25)。リアルタイムRT-PCRプローブおよびプライマーは、Primer Expressソフトウエアを用いて設計された（PE Biosystems, Foster City, California）。プライマー配列および反応条件は補足試料において記載されている。各遺伝子の相対発現は、対応する正常細胞型と比較して、同一細胞型の腫瘍のための平均遺伝子発現レベルの割合として計算された。
【００１９】
実施例7. GeneChip（商標）を使用した遺伝子発現解析
GeneChip（商標）U95AプローブアレイをAffimetrix Inc.（Santa Clara, CA）から得た。32個のRNA試料の全てを個々に調製し、GeneChip（商標）とハイブリダイズし、製造者により推奨されたHewlett-Packard（HP）GeneArray（商標）スキャナーでスキャンした。6個のGeneChip（商標）内部標準、β-アクチン、18S rRNA、28S rRNA、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、トランスフェリン受容体、および転写因子ISGF-3は、試験された全ての試料の品質を確認するために対照として使用された。
【００２０】
実施例8. NSCLCのSAGE
9個の別々のSAGEライブラリーの全てを、異なる5つの正常組織および腫瘍組織から生成した。18,300個の別々のクローンの全てがシークエンスされ、66,501個の別個の転写産物を示す374,643個のタグが生成された（表1）。組み合わされた9個全てのライブラリーにおいて1回より多く現れた23,056個の別個のタグのうち、18,595個のタグはUniGeneクラスターと少なくとも1回一致し、4,907個のタグは多数回一致し、4,319個のタグは一致がなく、142個のタグはミトコンドリアDNAまたはリボソームRNA配列と一致した。9個全てのライブラリーにおいて1回のみ現れたタグで、潜在的なシークエンスエラーの7％を占めており（21）、同定された別個の転写産物タグの総数は約59,000である。この数は、ヒトゲノムにおいて予測される遺伝子の現在の推定値の30,000個〜40,000個（26、27）を超えることから、この不一致は、結果として同一遺伝子に対して複数のSAGEタグを生じうる、オルタナティブスプライシングされた転写産物およびポリアデニル化使用部位によるものとして計算することができる（28、29）。または、本発明者らの転写産物解析が、制限された数の組織で行われたため、現在の遺伝子推定値が低くなっている可能性がある。
【００２１】
（表１）NSCLCおよび正常肺気管支上皮細胞におけるSAGE
特有のライブラリー数＝9
特有のタグ数＝66,502
＞1で現れた特有のタグの数＝23,056
特有のUniGeneクラスターと一致した数＝18,652
【００２２】
実施例9. SAGEに基づく腫瘍および正常肺組織の階層型クラスタリング
腫瘍試料と正常試料の間、および、異なる腫瘍型の間で、差異を持って発現する遺伝子を同定するために、本発明者らは、階層型クラスタリングを使用して各組織に由来するライブラリーの全体の類似性を調べた（22）。より一般的に発現する遺伝子に対する発現の差異は、偶然に観察された可能性は低いため、9個全てのライブラリーにおいて少なくとも10回現れた3,921個のSAGEタグの集団をクラスタリング解析にかけた。各試料は異なる個体に由来し、特有の発現パターンを有したが（図1A）、正常組織は互いに同様であり、腫瘍組織は群としてより類似していた。さらに、SAECおよびNHBE試料の各々は正常分枝下で共に対になり、腺癌およ扁平上皮腫瘍の各々は腫瘍分枝下で共にクラスター化された（図1B）。腺癌由来のA549細胞系はNSCLC腫瘍と枝分かれし、多次元スケーリングにおける2つの腺癌の相関性を証明した。これは、互いに関連する9個全ての試料の空間的関連を示すものである（図1C）。
【００２３】
遺伝子発現レベルが、SAGEライブラリーで検出される各転写産物に対するタグ数によって示されたことから、本発明者らは、モンテ-カルロシミュレーション（24）を使用し、腫瘍ライブラリーと対応する2つの正常上皮細胞対照との遺伝子発現の差異の有意性を定量した。p＜0.001で、2つの腺癌とSAEC試料を比較した場合に、58個の遺伝子が選択され、扁平上皮癌とNHBE細胞の比較によって、71個の遺伝子が得られた。14個の遺伝子が両方の比較に対して共通であるため、従って、本発明者らは、両方の腫瘍型に対して転写産物を高レベルで差異を持って発現した115個の転写産物を同定した（表1、補足材料（Supplemental Material）における遺伝子の表）。予想されたように、階層型クラスタリングにかけた場合、これらの115個の遺伝子は、9個のライブラリーを、上記の約4,000個の遺伝子を伴って正確に同一の分枝パターンに再び分離した（図2A）。再び、A549細胞系を腫瘍組織で分けたところ、多次元スケーリングによって2つの腺癌の最も近くに局在した（図2B）。
【００２４】
実施例10. 異なるNSCLCサブタイプにおける遺伝子の生物学的に別個のクラスター
115個の統計学的に有意な遺伝子のクラスタリングにより、解析され高度に特徴付けられた腫瘍組織である、少なくとも3つの別個の遺伝子クラスターが明らかにされた（図2C）。肺の扁平上皮癌において最も高レベルで発現した遺伝子（図2C、上パネル）は、解毒特性および抗酸化特性を有するタンパク質をコードする転写産物によって特徴付けられた。これらの遺伝子には、グルタチオンパーオキシダーゼ2（GPX2）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM1（GSTM1）、カルボキシエステラーゼ、アルド-ケトレダクターゼ、およびパーオキレドキシン1（PRDX1）が含まれる。これらが扁平細胞肺癌において存在することは、環境的発癌性傷害に対する気管支による細胞内反応が示された可能性が高い（30、31）。過剰発現した遺伝子のクラスタリングは、集団におけるこれらのタンパク質の機能的変種が数人の患者において肺癌感受性に寄与しうるという考えを強調する。加えて、GSTM1は、肺および口腔癌に対して感受性の既知のマーカーである（32）。それは、乳房（33）および卵巣癌（34）にも関連している。インターフェロンα誘導性タンパク質27はまた、乳癌の50％で過剰発現されることが示されている（35）。
【００２５】
対照的に、遺伝子クラスターは肺腺癌で発現し（図2C、中央パネル）、そのほとんどが小気道に関連するタンパク質および免疫学的に関連するタンパク質をコードしていた。クラスターにおける、界面活性剤A2およびB、プロナプシンA（pronapsin A）、およびムチン1の存在は、小気道上皮細胞（例えば2型肺細胞およびクララ細胞）に由来する腫瘍の起源を表している（36、37）。しかし、これらの遺伝子の高レベルの発現により、これらのタンパク質が肺腺癌の腫瘍形成に関与する可能性を有することも示唆された。実際、ムチン1は乳癌で過剰発現し、MUC1ムチンのCTドメインのチロシンリン酸化により、Ras-MEK-ERK2経路を介したマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路が活性化される（38、39）。さらに、試験された腺癌におけるイムノグロブリン遺伝子の過剰発現は、B細胞の浸潤の範囲、およびSAGE解析に使用された腺癌における抗原提示細胞（APC）の存在により説明できると考えられる。しかし、SAGEタグのクラスタリング解析は、異なる腫瘍型が細胞表面マーカーの異なるセットを優先的に発現することを示した。扁平上皮癌はMHCクラスIおよびCD71タンパク質を過剰発現すると思われ（図2C、上パネル）、一方、腺癌はMHCクラスIIおよびCD74抗原の比較的高レベルの発現を有していた。腫瘍におけるこの遺伝子発現の差異は、免疫ベースの癌治療が異なる腫瘍表面マーカーの発現に基づき増強されうることを示した。
【００２６】
予期しないこともなかったが、原発性腺癌およびA549腺癌細胞系（図2C、下パネル）で低発現した多くの遺伝子は、扁平上皮細胞分化に関連するものであった。これらのタンパク質には、S100タンパク質、ケラチン、およびスモールプロリン-リッチタンパク質1B（コーニフィン（Cornifin））が含まれる。興味深いことに、2つのp53誘導性遺伝子、14-3-3σ（ストラティフィン（Stratifin））（40）およびp21waf1/CIP1（41、42）はこの群の遺伝子とクラスター化し、腺癌における発現の有意な減少を示した。p21waf1/CIP1および14-3-3σの両方は、電離放射線およびp53に依存的な方法で他のDNA傷害剤を処理した細胞で高レベルに誘導される（43、44）。p53によるこれらの遺伝子の誘導により、細胞周期の停止が引き起こされる（45）。p53遺伝子は肺の扁平上皮癌ではしばしば変異しており、これは、p53における変異が、肺上皮細胞が発癌性物質に誘導性の傷害を修復することを不能にすることに寄与している可能性が考えられた（46）。対照的に、p53変異は、肺腺癌で頻繁に観察されることはほとんどない（5）。腺癌でp21waf1/CIP1および14-3-3σ遺伝子転写産物の発現が減少していることは、p53経路における遺伝子の不活性化が肺腫瘍型で非常に重要な役割を担っていることを示唆している。しかし、mRNAの発現が減少していることが、遺伝子産物の減少といつも関連しているというわけではないと考えられる。コードされたタンパク質の発現を伴うp53の分子の役割に関するさらなる研究が、p53および肺腺癌の発症におけるその下流の遺伝子の関与を評価するために必要とされる。
【００２７】
実施例11. NSCLCにおいて差異を持って発現する他の遺伝子
本発明者らが同定した115個の高レベルに差異を持って発現した遺伝子は、差異を持った発現が、各細胞型の分子特性および肺の新生物性状態を識別可能な遺伝子セットを示したのみであったことに気づくことが重要である。また、明らかに、NSCLCに生物学的有意性を有する付加的な遺伝子を、選択された統計学的方法および有意性のレベルにより同定することができた。例えば、同一細胞型のライブラリー内で構成性発現を示した全てのタグが、99％の信頼水準で差異を持って発現する遺伝子を単離するために比較された場合、多くの候補遺伝子が単離された。具体的には、827個のタグが、扁平上皮癌とNHBEの間で統計学的に有意な差異を持った発現を示し、少なくとも10倍の過剰発現を示す71個のタグが存在した。2つの腺癌腫瘍ライブラリーとSAECでの同様の比較により、差異を持った発現を示した298個のタグが同定され、腫瘍において少なくとも10倍で過剰発現した20タグが存在した。共同で、45個のタグが両方の比較で差異を持って発現し、これらの遺伝子は、115個の遺伝子によって明らかにされた観察の一部またはさらに拡大されたものであった。例えば、スモールプロリンリッチタンパク質3（SPRR3）は扁平上皮腫瘍では上昇したが、腺癌では事実上存在しなかった。SPRR3は、SPRR1（コーニフィン）を含むタンパク質のスモールプロリンリッチファミリーのメンバーであり、遺伝子は扁平上皮癌に対するマーカーとして単離され（47）、腺癌で発現しない遺伝子のための同一クラスター内にある（図2C、下パネル）。SPRR3は、細胞の表皮層に防護壁提供する助けとなる角化膜におけるタンパク質のメンバーである（48）。腺癌におけるこのファミリーのタンパク質発現の減少は、この癌の侵襲特性に寄与する可能性がある。さらに、タンパク質の腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：TNF）のいくつかのメンバーおよびそれらの受容体は、NSCLCを含む様々な癌において発現を増加することを明らかにした（49）。SAGEデータの本発明者らによる統計学的解析により、TNF受容体スーパーファミリーメンバー18の発現が解毒および抗酸化遺伝子に加えて、扁平上皮腫瘍で増加することが明らかになった。TNFは、T細胞を介するアポトーシスを促進し（50）、この経路での遺伝子の発現の増加により、腫瘍細胞の抗増殖機構が提供されると考えられる。
【００２８】
実施例12. 付加的なNSCLC腫瘍の定量PCRおよびGeneChip（商標）cDNAオリゴアレイ解析
SAGEライブラリーは、選択された腫瘍組織のみに由来することから、SAGEに由来する遺伝子発現パターンが独立したアッセイ法を使用することにより大パネルの肺組織で再現可能かどうかを決定することは不可欠であった。全部で43個の付加的な腫瘍および正常試料を、定量リアルタイムPCRまたはcDNAアレイ法のいずれかを使用することによって試験した。肺の扁平上皮または腺癌のいずれかで高レベルの過剰発現するとSAGEにより観察された5つの遺伝子は（図2Cに列挙される）、10個の異なるNSCLC腫瘍および4個の正常対照を使用したリアルタイムRT-PCRにより試験された。表2に示されるように、2個の扁平上皮腫瘍に特異的な遺伝子が、腺癌の発現と比較して、この腫瘍型で高レベルの発現割合を構成的に有することが、リアルタイムRT-PCRによって明らかにされた。同様に、3つの腺癌に特異的な遺伝子は、この腫瘍型に高レベルの発現割合を構成的に有し、正常組織と比較して、扁平上皮癌でより減少した。
【００２９】
（表２）SAGEにより同定された遺伝子のリアルタイム定量PCR解析
【００３０】
肺のSAGEライブラリーから得られた分子クラスタリングの総合的な信頼性を調べるため、GeneChip（商標）cDNAオリゴアレイ（15, 16）を用いて、32個の腫瘍および正常組織（リアルタイムPCRで使用された3個の試料を含む）を相対的遺伝子発現について調査した。高レベルで差異を持って発現する115個の転写産物タグのうち51個のみが、12,000エレメントGeneChip（商標）（U95A）に存在し、3つの主要クラスター由来の35個の遺伝子のうち20個（図2Cに示される）が、SAGEとcDNAアレイの両方で比較可能であった。これらの20個の遺伝子に対する遺伝子発現レベルは、同一細胞型の全ての腫瘍間で平均化され、対応する正常試料のレベルと比較された。20個の遺伝子のうち19個が、SAGEによって得られた発現パターンと同様の発現パターンを示した。腺癌でダウンレギュレーションされた遺伝子クラスターに対する発現パターンを示す（図3Aおよび図3B）。これらの結果から、SAGEライブラリーの階層型クラスタリングによって、強い生物学的有意性を有する遺伝子クラスターが明らかにされうることが示され、高度に定量的で再現性のあるSAGEの性質が、数個の組織試料を使用するのみで、高度に正確な組織分類および信頼性のある遺伝子クラスタリングを可能にするという見解が支持される。さらに、SAGE法は遺伝子配列情報またはプローブのハイブリダーゼーション条件と独立しているため、対象となる組織における遺伝子発現パターンの公平な同定および定量化を可能にする。SAGEの使用により、新規遺伝子および分子マーカーを同定する機会が提供される。
【００３１】
要約すると、本発明者らは、SAGEおよび階層型クラスタリング解析を使用して、ヒト肺癌の最も共通している2つ型に特異的に関連する分子プロファイルおよび遺伝子クラスターを同定した。生物学的有意性および高度の再現性にもかかわらず、本明細書に記載した遺伝子発現プロファイルは、肺の腺癌および扁平上皮癌に由来する基本的な分子特性を識別できる可能性を有することを示すのみである可能性がある。腫瘍の階層型特性および臨床行為は、様々な遺伝子および経路のための発現レベルの著しい変化によってほとんど決定されていない。それにもかかわらず、証拠を蓄積することにより、遺伝子発現パターンは、癌の臨床行為および治療的反応をより決定することができる可能性を示唆している（19、51）。本発明者らが記載した高度に差異を持って発現する遺伝子の表は、改良した診断、予後、および合理療法のための新規の分子標的を提供する可能性を有すると考えられる。記載した臨床的情報および結論を有する数の多い肺腫瘍におけるこれらの発現解析は、本目的を達成することを助けると思われる。
【００３２】
本発明は、本発明を実施する現在の好ましい方法を含む、特定の実施例に関して記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲内で、上記の技術の様々な変形および置換を認識すると思われる。
【００３３】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ−１Ｃ】SAGEライブラリーのクラスタリングおよび多次元スケーリングを示す。少なくとも10個の総タグ数を有する遺伝子のみを含む。（図1A）9個全てのSAGEライブラリーのクラスター。遺伝子を水平面に配列し、ライブラリーを垂直方向に示す。示したライブラリーにおいて、赤色、緑色、および黒色はそれぞれ、高レベル、低レベル、および中レベルを示す。（図1B）クラスター化されたライブラリーの系統樹。（図1C）9個のライブラリーの関連性を示す多次元スケーリング。
【図２Ａ−２Ｃ】9個のSAGEライブラリーにおいて差異を持って発現した（p＜0.001）115個の遺伝子のクラスタリングおよび多次元スケーリング。（図2A）扁平上皮癌で過剰発現した遺伝子（上）、腺癌で過剰発現した遺伝子（中央）、および腺癌を低発現した遺伝子（下パネル）からなる3つの主要なクラスター（右パネル）を有する、115個の遺伝子クラスター（左パネル）。†このタグが同一ファミリーの1つより多い遺伝子に対応することを示す。*このタグが1つより多い異なる遺伝子に対応することを示す。（図2B）115個の差異を持って発現した遺伝子の使用による、9個のクラスター化されたライブラリーの系統樹。（図2C）115個の差異を持って発現した遺伝子の使用による、ライブラリーの多次元スケーリング。
【図３Ａ−３Ｂ】Affimetrix GeneChips（商標）およびSAGEライブラリーの使用による腺癌で低発現した遺伝子の比較を示す。（図3A）正規化したSAGEデータのヒストグラムは、腺癌で低発現した7個の遺伝子の平均相対発現レベルを示す（図2Cの右下パネルに示す）。（図3B）GeneChip（商標）データのヒストグラムは、図3Aのように同一遺伝子の正規化された平均相対発現レベルを示す。GeneChip（商標）発現値が1未満である場合、正規化前にそれを1にセットした。正規化はクラスタリング解析と同様の方法で行った。
Claims (26)
- 以下の段階を含む、肺癌を扁平上皮癌として同定する方法：
肺癌試料における遺伝子の遺伝子産物量を測定する段階であって、該遺伝子が、グルタチオンパーオキシダーゼ（GPX；NM_002083）、グルタチオンS-トランスフェラーゼM3（GSTM3；NM_000849）、アルドケトレダクダーゼファミリー1、メンバーB 10（NM_020299）、パーオキレドキシン1（PRDX1；NM_002574）、スモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）、およびTNF受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；NM004195）からなる群より選択される段階；
遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する段階であって、非病原性の肺組織試料と比較した肺癌試料における遺伝子産物量の増加により、肺癌が扁平上皮癌として同定される段階。 - 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、診断を計画する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、予後を計画する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、治療を計画する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- GPXの遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- GSTM3の遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- アルドケトレダクダーゼの遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- PRDX1の遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- SPRR3の遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- TNF受容体18の遺伝子産物を測定する、請求項1記載の方法。
- 遺伝子産物がmRNAである、請求項1記載の方法。
- 遺伝子産物がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 非病原性の肺組織試料が正常肺小気道上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 非病原性の肺組織試料が正常気管支／気管上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 遺伝子産物量をマイクロアレイを使用して測定する、請求項1記載の方法。
- cRNAをプローブとマイクロアレイ上でハイブリダイズして、遺伝子産物量を測定する、請求項15記載の方法。
- 以下の段階を含む、肺癌を腺癌として同定する方法：
肺癌試料におけるスモールプロリン-リッチタンパク質3（SPRR3；NM_005416）遺伝子の遺伝子産物量を測定する段階；および
遺伝子産物量と、非病原性の肺組織試料において測定された量とを比較する段階であって、非病原性の肺組織試料と比較した肺癌試料における遺伝子産物量の減少により、肺癌が腺癌として同定される段階。 - 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、診断を計画する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、予後を計画する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 測定された比較による遺伝子産物情報を使用して、治療を計画する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 遺伝子産物がmRNAである、請求項17記載の方法。
- 遺伝子産物がタンパク質である、請求項17記載の方法。
- 非病原性の肺組織試料が正常肺小気道上皮細胞を含む、請求項17記載の方法。
- 非病原性の肺組織試料が正常気管支／気管上皮細胞を含む、請求項17記載の方法。
- 遺伝子産物量をマイクロアレイを使用して測定する、請求項17記載の方法。
- cRNAをプローブとマイクロアレイ上でハイブリダイズして、遺伝子産物量を測定する、請求項25記載の方法。
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