ES2305866T3 - Uso de la proteina spee (espemidina sintasa) como marcador en el cancer de mama. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico del cáncer de mama que comprende las etapas de (a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo, (b) puesta en contacto de dicha muestra con un agente de fijación específico para la espermidina sintasa (=SPEE) en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho aglutinante y la SPEE, y (c) correlacionar la cantidad de complejo formada en (b) respecto al diagnóstico de cáncer de mama.
Description
Uso de la proteína spee (espermidina sintasa)
como marcador en el cáncer de mama.
La presente invención se refiere al diagnóstico
del cáncer de mama. Revela el uso de la espermidina sintasa (=SPEE)
en el diagnóstico del cáncer de mama. Además, se refiere
especialmente a un método para el diagnóstico del cáncer de mama a
partir de una muestra líquida, procedente de un individuo midiendo
la SPEE en dicha muestra. La medición de la SPEE puede ser
utilizada, por ejemplo, en la detección prematura o el diagnóstico
del cáncer de mama.
El cáncer sigue siendo un reto importante en la
salud pública en cuanto a la detección y la terapia. Entre los
diversos tipos de cáncer, el cáncer de mama es uno de los cánceres
más frecuentes en el mundo occidental.
El cáncer prematuro puede ser
detectado/diagnosticado, lo mejor es el índice de supervivencia
global. Esto es especialmente cierto para el cáncer de mama. El
pronóstico en estados avanzados del tumor es pobre. Más de una
tercera parte de los pacientes morirá de una enfermedad progresiva
en los cinco años posteriores al diagnóstico, lo que corresponde a
un índice de supervivencia del 40% para cinco años. El tratamiento
habitual solamente cura una parte de los pacientes y tiene
claramente el mejor efecto en aquellos pacientes diagnosticados en
un estado prematuro de la enfermedad.
Con respecto al cáncer de mama como problema de
salud pública, resulta esencial que se desarrollen unas medidas más
eficaces de exploración y de prevención.
Los procedimientos de detección prematura
disponibles en la actualidad para el cáncer de mama implican el uso
de un examen clínico de la mama y de una mamografía. Sin embargo,
debe existir un tamaño significativo de tumor para que un tumor sea
palpable o detectable por mamografía. La densidad del tejido de la
mama y la edad son factores de predicción importantes en la
exactitud de la mamografía de detección. La sensibilidad varía del
63% en las mujeres con mamas extremadamente densas a un 87% en las
mujeres con mamas casi íntegramente grasas. La sensibilidad aumenta
con la edad desde un 69% en las mujeres de 40 años de edad a un 83%
en las mujeres de 80 años o de una edad superior (Carney, P.A., y
cols.,Ann.Intern.Med.138(3)(2003)168-175).
Solamente el 20-25% de las anomalías detectadas
mediante mamografía en las que se ha realizado una biopsia
resultaron ser malignas. La visualización de lesiones cancerosas y
precancerosas representa el mejor método para una detección precoz,
pero la mamografía es una prueba cara que requiere muchos cuidados y
experiencia tanto en su realización como en la interpretación de
resultados
(OMS; Screening for Breast Cancer, May 10, 2002; Esserman, L., y cols., J.Natl. Cancer Inst.94 (2002)369-375).
(OMS; Screening for Breast Cancer, May 10, 2002; Esserman, L., y cols., J.Natl. Cancer Inst.94 (2002)369-375).
Recientemente se tiene información sobre una
cantidad tremenda de genes específicos del cáncer de mama. La gran
mayoría de los informes de investigación correspondientes o de las
solicitudes de patentes se basan en datos obtenidos por análisis de
los modelos de expresión del ARN en el tejido (cáncer) de mama
frente a un tejido diferente o bien un tejido normal adyacente,
respectivamente. Dichos métodos pueden resumirse como técnicas
diferenciales de visualización del ARNm.
Como un ejemplo de los datos disponibles de las
técnicas de visualización del ARNm, se menciona y comenta la
solicitud WO 00/60076. Esta solicitud describe y reivindica más de
doscientos polinucleótidos aislados y los polipéptidos
correspondientes como tal, así como su uso en la detección del
cáncer de mama. Sin embargo, se sabe en general que las diferencias
en el nivel del ARNm no son reflejadas por el nivel de las
correspondientes proteínas. Una proteína codificada por un ARNm
raro se puede hallar en cantidades muy elevadas y una proteína
codificada por un ARNm abundante puede ser difícil de detectar y de
hallar (Chen, G., y cols., Molecular and Cellular Proteomics, 1.4
(2002)304-313). Esta falta de correlación
entre el nivel de ARNm y de proteínas se debe a motivos como la
estabilidad del ARNm, la eficacia de la transferencia, la
estabilidad de la proteína, etc.
Existen también métodos recientes que investigan
las diferencias en los modelos de proteínas entre los diferentes
tejidos o entre el tejido sano y el tejido enfermo con el fin de
identificar las moléculas del marcador apropiado que se podría
utilizar en el diagnóstico del cáncer de mama. Wulfkuhle y cols.
Cancer Research 62(2002)6740-6749 han
identificado cincuenta y siete proteínas que se expresaban de forma
diferente entre el tejido del cáncer de mama y el tejido normal
adyacente. No se tienen datos de muestras líquidas de un
individuo.
La WO 02/23200 informa sobre doce manchas
asociadas al cáncer de mama como resultado de la deserción e
ionización (SELDI) por láser. Estas manchas se pueden ver más
frecuentemente en los sueros obtenidos de los pacientes con cáncer
de mama en comparación con los sueros obtenidos de controles sanos.
Sin embargo, se desconoce la identidad de la(s)
molécula(s) comprendida(s) en dicha mancha, por
ejemplo, su secuencia.
El líquido procedente de los pezones se ha
utilizado durante muchos años como un método potencial no traumático
para identificar los marcadores específicos del cáncer de mama.
Kuerer y cols. comparaban los fluidos de aspiración de ambos
pezones de mujeres con carcinoma de mama traumático unilateral
mediante electroforesis de gel 2D (Querer, H.M., y cols., Cancer
95(2002)2276-2282). Se detectaban
entre 30 y 202 diferentes manchas de proteínas en el fluido o
líquido procedente de los pezones que padecen un carcinoma de mama y
no en el líquido del aspirado de pezón de las mamamas sanas. Estas
manchas se detectaban mediante un análisis de la imagen del gel.
Pero la identidad de las manchas de proteínas se desconoce.
A pesar de la lista cada vez mayor de marcadores
de proteínas en el campo del cáncer de mama, se desconoce hasta la
fecha la utilidad clínico/diagnóstica de estas moléculas. Para ser
de utilidad clínica un nuevo marcador diagnóstico como marcador
individual debería ser al menos tan bueno como el mejor marcado
conocido hasta el momento. O bien un marcador nuevo debería
conducir a un avance en la sensibilidad diagnóstica y/o
especificidad tanto si se utilizara solo o en combinación con uno o
más marcadores, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad
diagnóstica de una prueba es valorada por sus características
receptoras/de funcionamiento, que se indicarán con detalle a
continuación.
En la actualidad, solamente se dispone de
pruebas diagnósticas en sangre sobre la detección del antígeno del
cáncer 15-3(CA 15-3), una
mucina asociada al tumor y un antígeno carcinoembriónico (CEA), una
glucoproteína asociada a un tumor, que ayuden al diagnóstico en el
campo del cáncer de mama. La CA 15-3 generalmente
aumenta en los pacientes con cáncer de mama avanzado. Los niveles
de CA 15-3 son raramente elevados en las mujeres
con un cáncer de mama en estado prematuro (Duffy, M.J., Critical
Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)
225-262). Los cánceres de ovarios, pulmón y próstata
pueden elevar también los niveles de CA 15-3.
Niveles elevados de CA 15-3 se pueden asociar a
unas condiciones no cancerosas, como una enfermedad benigna de
ovarios o mama. Niveles elevados de CA 15-3 se
pueden asociar a unas condiciones no cancerosas, como una enfermedad
benigna de cáncer o de ovarios, la endometriosis, la enfermedad
inflamatoria pélvica y la hepatitis. El embarazo y la lactancia
pueden hacer que los niveles de CA 15-3 aumenten
(National Cancer Institute, Cancer Facts, Fact Sheet 5.18
(1998)1-5). El uso básico de CEA reside en el
control del cáncer de colon, especialmente cuando la enfermedad
presenta metástasis. Sin embargo, una variedad de cánceres pueden
producir niveles elevados de CEA, incluyendo el cáncer de mama.
Debido a la falta de especificidad en órganos y
tumores, no se recomienda ni la medición de CA 15-3
ni la medición de CEA para la detección del cáncer de mama. Estos
marcadores tumorales son herramientas diagnósticas útiles en el
seguimiento de los pacientes con cáncer de mama (Untch, M., y cols.,
J. Lab. Med. 25(2001)343-352).
La sangre entera, el suero, plasma o el líquido
aspirado de los pezones son las fuentes de muestras más ampliamente
utilizadas en la rutina clínica. La identificación de un marcador de
tumor de cáncer de mama prematuro que permita la detección fiable
de cáncer o aporte una información precoz podría llevar a una
valoración diagnóstica que ayudaría enormemente en el diagnóstico y
en el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, existe una
necesidad clínica urgente de mejorar el diagnóstico del cáncer de
mama a partir de la sangre. Es especialmente importante mejorar el
diagnóstico precoz del cáncer de mama, puesto que para los pacientes
diagnosticados a tiempo las posibilidades de supervivencia son
mucho mayores si se compara con los diagnosticas en una etapa
avanzada de la enfermedad.
La presente invención tenía el cometido de
investigar si se puede identificar un marcador nuevo que pueda
ayudar en el diagnóstico del cáncer de mama.
Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso
del marcador SPEE puede superar al menos parcialmente los problemas
ya conocidos de la situación actual.
La presente invención se refiere por tanto a un
método para el diagnóstico del cáncer de mama que comprende las
etapas de a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo,
b) puesta en contacto de dicha muestra con un aglutinante
específico para SPP en unas condiciones apropiadas para la formación
de un complejo entre dicho aglutinante y el SPEE, y c) correlación
de la cantidad de complejo formada en (b) para el diagnóstico del
cáncer de mama.
Otra configuración preferida de la invención es
un método para el diagnóstico del cáncer de mama que comprende las
etapas de a) puesta en contacto de una muestra líquida obtenida de
un individuo con un aglutinante específico para SPEE en unas
condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho
agente aglutinante y el SPEE, y b) correlación de la cantidad de
complejo formada en (a) para el diagnóstico del cáncer de mama.
Como apreciará el experto en el tema, cualquiera
de dichos diagnósticos se realiza in vitro. Luego se tira la
muestra del paciente. La muestra del paciente se utiliza meramente
para el método diagnóstico in vitro de la invención y el
material de la muestra del paciente no es transferida de vuelta al
cuerpo del paciente. Típicamente, la muestra suele ser líquida.
La espermidina sintasa (SPEE; conocida también
como putrescina aminopropiltransferasa;
Swiss-PROT:P19623) se caracteriza por la secuencia
dada en SEQ ID NO:1. Esta secuencia se traduce en un peso molecular
teórico de 33824 DA y un punto isoeléctrico a un pH de 5,26.
La biosíntesis de las poliaminas, que son
esenciales para las funciones celulares incluye cuatro enzimas
diferentes: ornitina decarboxilasa,
S-adenosil-L-metionina
decarboxilasa, espermita sintasa y espermidina sintasa. Wahlfors y
cols. clonaron un ADNc que codificaba la subunidad de espermidina
sintasa de longitud completa (Wahlfors, J., y cols., DNA Cell Biol.
9(1990)103-110).
La biosíntesis de la poliamina espermidina es
catalizada por la espermidina sintasa que transfiere una mitad
aminopropilo de la metionina S-adenosil
descarboxilada a la putrescina. La espermidina se une al ADN y se
encuentra implicada en una serie de procesos cruciales como la
división celular, diferenciación y función de la membrana. La
inhibición de la biosíntesis de la poliamina interrumpe el
crecimiento celular (Kaiser, A.E., y cols., Folia Parasitologica
50(2003)3-18).
La actividad catalítica de la espermidina
sintasa puede verse inhibida por la metiltiopropilamina (PTPA).
Hibasami y cols. demostraron que la inhibición de la espermidina
sintasa conduce a un crecimiento inhibido de las células de
leucemia linfoide humana Molt 4B (Hibasami, H., y cols., Anticancer
Research 7(1987)1213-1216).
Nishikawa y cols. descubrieron que la expresión
de mRNA de espermidina sintasa y su actividad enzimática disminuían
después del tratamiento de las líneas celulares de hematoma Hep 3B
con el factor de crecimiento transformador proteínico beta
(TGF-beta). Ellos sugerían que la regulación por
adelantado de la espermidina sintasa se puede asociar al mecanismo
de la supresión del crecimiento inducida por
TGF-beta (Nishikawa, Y., y cols., Biochem.J.321
(1997)537-543).
Nitta y cols. investigaron el efecto del
agotamiento intracelular de las poliaminas con la apoptosis.
Averiguaron que la inhibición de la espermidina sintasa y enzimas
similares y el descenso resultante de las poliaminas desencadena la
vía mediada por la mitocondria para la apoptosis, dando lugar a una
activación de la caspasa y a la muerte celular apoptótica (Nitta,
T., y cols.,Exp.Cell
Res.276(2002)120-128).
Se ha mencionado la espermidina sintasa en la
solicitud de patente WO 02/059377 además de un gran número de genes
y de sus proteínas para diagnosticar el cáncer de mama. Pero no se
ha descrito la aplicación diagnóstica.
La WO 02/046471 se refiere a la identificación
de marcadores que se pueden utilizar para determinar si las células
cancerígenas son sensibles a un agente terapéutico. Se ha mencionado
que el nivel de SPEE-ARNm a diferencia del nivel de
los ARNs de otros muchos genes puede ser modulado por un fármaco
anti-cancerígeno.
La presente invención no se desarrolla para
verse limitada a la proteína SPEE de la secuencia ID NO: 1 de
longitud completa. Los fragmentos artificiales o fisiológicos de la
SPEE, las modificaciones secundarias de la SPEE así como las
variantes alélicas de SPEE son asimismo abarcadas por la presente
invención. Los fragmentos artificiales abarcan preferiblemente un
péptido producido sintéticamente o siguiendo técnicas recombinantes,
que al menos comprenda un epítopo de interés diagnóstico formado
por al menos 6 aminoácidos contiguos derivados de la secuencia
revelada en SEQ ID NO:1. Dicho fragmento puede ser utilizado
ventajosamente para la generación de anticuerpos o como un estándar
en un inmunoanálisis. El fragmento artificial comprende al menos dos
epítopos de interés apropiados para llevar a cabo un inmunoanálisis
en sándwich.
En las configuraciones preferidas, el marcador
nuevo SPEE se puede usar para controlar así como para fines de
exploración.
Cuando se utiliza en el control de pacientes, el
método diagnóstico conforme a la presente invención puede ayudar a
evaluar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la
recurrencia del tumor en el seguimiento de los pacientes. Los
niveles elevados de SPEE se correlacionan directamente con la carga
tumoral. Después de la quimioterapia, un aumento a corto plazo
(pocas horas hasta 14 días) en el SPEE puede servir como un
indicador de la muerte de células tumorales. En el seguimiento de
los pacientes (de 3 meses a 10 años) se puede usar un aumento del
SPEE como indicador de la recurrencia del tumor.
En una configuración preferida el método
diagnóstico conforme a la presente invención se utiliza para fines
de exploración o detección. Se utiliza para evaluar los individuos
sin un diagnóstico previo del cáncer de mama midiendo el nivel de
SPEE y correlacionando el nivel medido respecto a la presencia o
ausencia del cáncer de mama.
La estadificación del cáncer es la clasificación
de la enfermedad en cuanto a su extensión, avance y gravedad.
Agrupa pacientes con cáncer de manera que se pueden hacer
generalizaciones acerca del pronóstico y la elección de la
terapia.
Actualmente, el sistema TNM es la clasificación
utilizada mayoritariamente de la extensión anatómica del cáncer.
Representa un sistema de estadificación uniforme, aceptado
internacionalmente. Existen tres variables básicas: T(la
extensión del tumor básico), N(el estado de los nódulos
linfáticos regionales) y M(la presencia o ausencia de
metástasis a distancia). Los criterios del TNM han sido publicados
por la UICC (Internacional Union Against Cancer) (Sobón, L.H.,
Wittekind, Ch.(eds): TNM Classification of Malignant Tumours, quinta
edición, 1997). El sistema de estadificación para el cáncer de mama
se ha revisado recientemente (Singletary, S.E., y cols.,Journal of
Clinical Oncology
20(2002)3628-3636).
Lo que es especialmente importante es que el
diagnóstico prematuro del cáncer de mama se traduzca en un
pronóstico más favorable. Por lo tanto, los mejores pronósticos se
producen en aquellos pacientes que están en una etapa precoz
T_{is}, NO, MO ó T1-3; NO; MO, si son tratados de
forma apropiada tienen una posibilidad superior al 90% de
supervivencia 5 años después del diagnóstico, si se compara con un
índice de supervivencia a los 5 años de solamente el 18% para los
pacientes que son diagnosticados cuando las metástasis a distancia
ya se encuentran presentes.
En el sentido de la presente invención, el
diagnóstico prematuro del cáncer de mama se refiere a un diagnóstico
en un estado pre-cancerígeno (DCIS) o en un estado
tumoral donde no existe metástasis (ni proximal ni distal), es
decir, T_{is}, NO, M0 ó T1-4;N0;M0 están
presentes. T_{is} indica un carcinoma in situ.
\newpage
En una configuración preferida la SPEE se
utiliza para diagnosticar el cáncer de mama en un estado no
metastásico, es decir, que el diagnóstico se realiza en la etapa
T_{is}, N0, M0 ó
T1-3;N0;M0(=T_{is}-3;N0;M0).
El método diagnóstico conforme a la presente
invención se basa en una muestra líquida que procede de un
individuo. A diferencia de los métodos conocidos la SPEE se mide de
forma específica en esta muestra líquida usando un aglutinante
específico.
Un aglutinante específico es, por ejemplo, un
receptor de SPEE, una lectina que se enlaza a la SPEE o un
anticuerpo a la SPEE. Un aglutinante específico tiene al menos una
afinidad de 10^{7} l/mol por su molécula de referencia
correspondiente. El aglutinante específico tiene preferiblemente una
afinidad de 10^{8} l/mol o incluso superior de 10^{9} l/mol por
su molécula de referencia. Como apreciará el experto en la materia
el término específico se utiliza para indicar que otras
biomoléculas presentes en la muestra no se enlazan de forma
significativa al aglutinante específico para la SPEE.
Preferiblemente, el nivel de enlace a una biomolécula diferente de
la molécula de referencia da lugar a una afinidad de enlace que es
meramente del 10%, más preferiblemente sólo del 5% de la afinidad
de la molécula de referencia o bien inferior. Un aglutinante
específico preferiblemente es un anticuerpo reactivo con la SPEE.
El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo policlonal, un
anticuerpo monoclonal, fragmentos de dichos anticuerpos, así como a
construcciones genéticas que comprenden el dominio aglutinante de
un anticuerpo. También se puede usar cualquier fragmento de
anticuerpo que tenga los criterios mencionados de un aglutinante
específico.
Los anticuerpos son generados mediante
procedimientos de vanguardia, por ejemplo, tal como se describen en
Tijssen (Tijssen,P.,Practice and theory of enzyme immnumoassays
11(1990) en todo el libro especialmente en las páginas
43-78;Elsevier, Ámsterdam). Además, el experto
conoce perfectamente los métodos basados en inmunoadsorbentes que
se pueden utilizar para el aislamiento específico de anticuerpos.
Con estos medios se puede incrementar la calidad de los anticuerpos
policlonales y de ahí su rendimiento en los inmunoanálisis (Tijssen,
P., supra, páginas 108-115).
Para los logros obtenidos en la actual invención
se han utilizado anticuerpos monoclonales y policlonales. Los
anticuerpos policlonales se han conseguido en conejos. Sin embargo,
también se han obtenido anticuerpos policlonales de diferentes
especies, por ejemplo, ratas o cobayas. Los anticuerpos monoclonales
se han fabricado usando células de bazo de ratones inmunizados.
Puesto que se pueden producir anticuerpos monoclonales en cualquier
cantidad con unas propiedades constantes, representan unas
herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina
clínica. El uso de anticuerpos monoclonales contra la SPEE en un
método conforme a la presente invención es otra de las
configuraciones preferidas.
Como apreciará el experto en la materia, se
pueden usar varias estrategias para generar anticuerpos frente a la
SPEE. Dichas estrategias comprenden entre otras cosas el uso de
péptidos sintéticos, lo que representa un epítopo de la SPEE para
la inmunización. Preferiblemente, un péptido sintético comprende una
subsecuencia de SEQ ID NO:1 que es específica de la SPEE, es decir,
que tiene una homología comparativamente baja frente a otros
polipéptidos. Es preferible que el péptido sintético conste de una
subsecuencia contigua formada por 5 a 25 residuos de aminoácidos de
la SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, el péptido comprende una
subsecuencia contigua formada por 10 a 15 residuos de aminoácidos
de la SEQ ID NO: 1.
Alternativamente, se puede utilizar la
inmunización del ADN conocida como vacunación del ADN.
Para la medición, la muestra líquida obtenida de
un individuo se incuba con el aglutinante específico para la SPEE
en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo de
SPEE aglutinante. No es preciso especificar dichas condiciones
puesto que el experto sin esfuerzo inventivo alguno puede
identificar fácilmente las propiedades de incubación
apropiadas.
Como una etapa final conforme al método
divulgado en la presente invención se mide la cantidad de complejo
y se correlaciona con el diagnóstico del cáncer de mama. Como
apreciará el especialista existen numerosos métodos para medir la
cantidad de complejo aglutinante específico SPEE, todos ellos
descritos con detalle en relevantes libros de texto (por ejemplo,
Tijssen P., supra, o Diamandis y cols.,eds.(1996) Immunoassay,
Academic Press, Boston).
Preferiblemente la SPEE se detecta en un formato
de análisis tipo sándwich. En dicho análisis se utiliza un primer
aglutinante específico para capturar la SPEE por un lado y se
utiliza un segundo aglutinante específico que se marca para ser
detectado directa o indirectamente por otro lado.
Tal como se ha mencionado antes, se ha
descubierto sorprendentemente que la SPEE se puede medir a partir de
una muestra líquida obtenida de una muestra individual. No se
requiere ninguna muestra tisular o de biopsia para aplicar la SPEE
en el diagnóstico del cáncer de mama.
En una configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se prueba con suero como material
de muestra líquido.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se prueba con plasma como material
de muestra líquido.
\newpage
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se prueba con sangre entera como
material de muestra líquido.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se prueba con fluido de aspirado
de pezones como material de muestra líquido.
Mientras que la aplicación de métodos rutinarios
proteinómicos a muestras tisulares, conduce a la identificación de
muchos candidatos marcadores potenciales para el tejido elegido,
sorprendentemente los inventores de la presente invención han sido
capaces de detectar la SPEE en una muestra de fluido corporal.
Todavía más sorprendentemente, han sido capaces de demostrar que la
presencia de la SPEE en dicha muestra líquida obtenida de un
individuo puede correlacionarse con el diagnóstico del cáncer de
mama.
Los anticuerpos contra la SPEE se pueden
utilizar con gran ventaja en procedimientos establecidos, por
ejemplo, para detectar células de cáncer de mama in situ, en
biopsias, o en procedimientos inmunohistológicos.
Preferiblemente, un anticuerpo contra la SPEE se
utiliza en un inmunoanálisis cualitativo (SPEE presente o ausente)
o cuantitativo (se determina la cantidad de SPEE).
El medir el nivel de SPEE proteínico ha
demostrado ser una gran ventaja en el campo del cáncer de mama. Por
lo tanto, en otra configuración preferida, la presente invención se
refiere al uso de SPEE proteínica como molécula marcador en el
diagnóstico del cáncer de mama de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
El término molécula marcador se utiliza para
indicar que un nivel elevado de la SPEE analito medido a partir de
un líquido corporal de un individuo indica la presencia de cáncer de
mama.
Se prefiere especialmente el uso de SPEE
marcador nuevo en el diagnóstico precoz del cáncer de mama.
El uso de la SPEE proteínica propiamente
representa un avance significativo hacia el campo desafiante del
diagnóstico del cáncer de mama. El combinar las mediciones de la
SPEE con otros marcadores conocidos, por ejemplo, CA
15-3 y CEA, o con otros marcadores del cáncer de
mama actualmente conocidos o bien todavía por descubrir, lleva a
mejoras adicionales. Por lo tanto en otra configuración preferida la
presente invención se refiere al uso de la SPEE como una molécula
marcador para el cáncer de mama en combinación con una o más
moléculas marcador para el cáncer de mama en el diagnóstico del
cáncer de mama de una muestra líquida obtenida de un individuo. A
este respecto, la expresión "uno o más" equivale a 1 a 10,
preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 3. Otros marcadores del
cáncer de mama preferidos con los cuales se puede combinar la
medición del SPEE son el CEA y CA 15-3. La SPEE más
preferida se utiliza como parte de un panel de marcadores que
comprende al menos la SPEE y la CA 15-3. Así pues,
otra configuración preferida de la presente invención es el uso de
la proteína SPEE como una molécula marcador para el cáncer de mama
en combinación con una o más moléculas marcador para el cáncer de
mama en el diagnóstico del cáncer de mama de una muestra líquida
obtenida de un individuo, en la que al menos una molécula marcador
es la CA 15-3.
Preferiblemente, el método de la invención se
utiliza con muestras de pacientes que se sospecha padecen un cáncer
de mama. Un individuo que probablemente padece cáncer de mama es un
individuo para el que se han excluido otros tipos de cánceres.
Otros cánceres incluyen pero no se limitan a cánceres de colon,
pulmón, estómago, ovarios y próstata. Una configuración preferida
de la invención es por lo tanto un método para el diagnóstico del
cáncer de mama que comprende las etapas de
- a)
- aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo del que se sospecha que padece cáncer de mama,
- b)
- puesta en contacto de dicha muestra con un aglutinante específico para SPEE en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho aglutinante y el SPEE, y
- c)
- correlación de la cantidad de complejo formado en b) respecto al diagnóstico del cáncer de mama.
Los reactivos diagnósticos en el campo de los
análisis de fijación a receptores específicos, como los
inmunoanálisis, normalmente se presentan en forma de un estuche o
equipo, que consta del aglutinante específico y de los reactivos
auxiliares requeridos para realizar el análisis.
La exactitud de una prueba se describe mejor por
medio de sus características operativas receptoras (ROC)(ver
especialmente Zweig, M...H., y Campbell, G.Clin.Chem.
39(1993)561-577). El gráfico ROC es
una línea de todos los pares de sensibilidad/especificidad
resultantes de modificar de forma continuada el umbral de decisión
en la gama completa de datos observados.
El rendimiento clínico de una prueba de
laboratorio depende de su exactitud diagnóstica, de la capacidad
para clasificar correctamente los individuos en subgrupos
relevantes desde el punto de vista clínico. La exactitud
diagnóstica mide la capacidad de la prueba para distinguir
correctamente dos condiciones distintas de los individuos
investigados. Dichas condiciones son por ejemplo la salud y la
enfermedad o bien la enfermedad benigna frente al cáncer.
En cada caso, la línea ROC representa el
solapamiento entre las dos distribuciones trazando la sensibilidad
frente a la especificidad 1 para la gama completa de umbrales de
decisión. En el eje y es la sensibilidad, o la fracción verdadera
positiva (definida como (número de resultados de de la prueba
verdaderos-positivos) (número de resultados de la
prueba verdaderos-positivos +
falsos-negativos)). A esto se le llama también
positividad en la presencia de una enfermedad o estado. Se calcula
meramente del subgrupo afectado. En el eje x está la fracción
falsa-positiva o bien la especificidad 1 (definida
como (el número de resultados
falsos-positivos)/(número de resultados
verdaderos-negativos + número de resultados
falsos-positivos)). Se trata de un índice de
especificidad y se calcula íntegramente del subgrupo no afectado.
Debido a que las fracciones de verdaderos y falsos positivos se
calculan totalmente por separado, al utilizar los resultados de la
prueba de dos subgrupos diferentes, la línea ROC resulta
independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada
punto en la línea ROC representa un par de
sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión
especial. Una prueba con discriminación perfecta (sin solapamiento
en las dos distribuciones de resultados) tiene una línea ROC que
atraviesa el extremo izquierdo superior, donde la fracción
verdadera-positiva es 1,0 o del 100% (sensibilidad
perfecta), y la fracción falsa-positiva es 0
(especificidad perfecta). La línea teórica para una prueba sin
discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos
grupos) es una línea diagonal de 45º desde el extremo izquierdo
inferior al extremo derecho superior. La mayoría de líneas caen
entre estos dos extremos. (Si la línea ROC cae completamente por
debajo de la diagonal de 45º, esto se soluciona fácilmente
invirtiendo el criterio para "positividad" de "más de" a
"menos de" o viceversa). Cualitativamente, cuanto más próxima
está la línea al extremo superior izquierdo, mayor es la exactitud
global de la prueba.
Un objetivo conveniente para cuantificar la
exactitud diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su
rendimiento con un solo número. La medida global más común es el
área bajo la línea ROC. La costumbre es que esta área sea siempre
\geq 0,5 (en caso de que no lo sea, uno puede invertir la decisión
para hacerlo así). Los valores oscilan entre 1,0 (separación
perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y 0,5(no
existe diferencia aparente en la distribución entre los dos grupos
de valores de prueba). El área no depende solamente de una parte
especial de la línea como el punto más próximo a la diagonal o bien
la sensibilidad para una especificidad del 90%, sino que de toda la
línea. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva de lo próxima
que se encuentra la línea ROC a la perfecta (área=1,0).
La utilidad clínica del marcador nuevo SPEE ha
sido evaluada en comparación con y en combinación con el marcador
establecido CA 15-3 usando un análisis de la curva
del operador receptor (ROC;Zweig, M.H., y Campbell, G.,
Clin.Chem.39(1993)561-557). Este
análisis se ha basado en grupos de pacientes bien definidos y consta
de 50 muestras de cada uno de los pacientes con carcinoma ductal o
lobular traumático en Y1-3; N0; M0, un tumor más
avanzado, es decir T4 y/o varios grados de metástasis (N+ y/o M+),
carcinoma medular, papilar, mucinoso y tubular, ductal in
situ, y controles de salud, respectivamente.
Los ejemplos, referencias siguientes, el listado
de secuencias y la figura podrán ayudar a comprender la presente
invención, el verdadero alcance de lo que se indica en las
reivindicaciones adjuntas.
Figura 1 La figura 1 muestra un ejemplo típico
de una muestra de gel 2D cargada con un tumor (lado izquierdo), y
un gel cargado con una muestra de control comparable (lado derecho).
El círculo en la sección alargada de estos geles indica la posición
de la proteína SPEE. Usando el mismo método esta proteína no ha sido
detectada en tejido sano. La SPEE que ha migrado en el gel 2D
corresponde a un punto isoeléctrico de pH 5,3 y un peso molecular
aparente entre 30 y 35 kDa.
- ABTS
- sal de diamonio de 2,2'-Azino-di-[3-etilbenzo-tiazolinsulfonato(6)]
- BSA
- albúmina de suero bovina
- cADN
- ADN complementario
- CHAPS
- (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano-sulfonato)
- DMSO
- sulfóxido de dimetilo
- DTT
- ditiotreitol
- EDTA
- ácido etilendiaminotetracético
- ELISA
- enzimoinmunoanálisis de adsorción
- HRP
- peroxidasa de rábano
- IAA
- acetamida de yodo
- IgG
- inmunoglobulina G
- IEF
- enfoque isoeléctrico
- IPG
- gradiente de pH inmovilizado
- LDS
- dodecilsulfato de litio
- MALDI-TOF
- tiempo de ionización/desorción asistido por láser de la espectrometría de masa
- MES
- mesitil, 2, 4,6-trimetilfenilo
- OD
- densidad óptica
- PAGE
- electroforesis de gel de poliacrilamida
- PBS
- solución salina tamponada de fosfato
- PI
- punto isoeléctrico
- RTS
- sistema de traducción rápido
- SDS
- dodecilsulfato sódico
- UICC
- UNION INTERNACIONAL CONTRA EL CÁNCER.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar las proteínas específicas de
los tumores como potenciales marcadores diagnósticos para el cáncer
de mama, se ha realizado el análisis de dos clases diferentes de
tejido usando métodos proteinómicos.
En total, se han analizado muestras de tejido de
14 pacientes que padecen cáncer de mama. De cada paciente se han
recogido dos tipos diferentes de tejido de las resecciones
terapéuticas: Tejido tumoral (>80% de tumor) (T), y tejido sano
adyacente (N). Este último tipo de tejido sirve de muestra de
control sana comparativa. Los tejidos son congelados a trozos
inmediatamente después de la resección y se almacenan a -80ºC antes
de su tratamiento. Se efectúa el diagnóstico de los tumores según
los criterios histopatológicos.
0,8-1,2 g de tejido congelado se
colocan en un mortero y se encuentran totalmente congelados por el
nitrógeno líquido. El tejido es pulverizado en el mortero, disuelto
en 10 veces el volumen (p/v) de tampón de lisis (citrato sódico 40
mM, MgCl_{2} 5 mM, 1% de Genapol X-080, 0,02%
azida sódica, Complete® libre de EDTA (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania, Nr. cat. 1873580) y posteriormente son
homogenizados en un homogenizador de vidrio Wheaton® (20xajuste
flojo, 20xajuste hermético). 3 ml del homogenizado se someten a una
centrifugación de densidad de la sacarosa (10-60%
de sacarosa) durante 1 h a 4500 x g. Tras esta etapa de
centrifugación, se obtienen tres fracciones. La fracción en la
parte superior del gradiente contiene las proteínas solubles y se
utiliza para un posterior análisis.
El gel Sepharose 4B activado con CNBr
liofilizado (Amersham Biosciences,
17-0430-01) se vuelve a inflar y a
lavar conforme a las instrucciones del fabricante. El anticuerpo
monoclonal dirigido contra la albúmina humana se disuelve en
NaHCO_{3} 0,1M, pH 8,3, NaCl 0,5M, 10 mg/ml. 1 ml de solución de
anticuerpo se mezcla con 1 ml de Sepharose 4B activado con CNBr
inflado. El tiempo de reacción es de 1 h. EL bloqueo de los grupos
activos restantes y el lavado del gel se realizan de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
7 ml de gel anti-albúmina se
equilibran en un tampón de lisis sin Genapol X-080.
7 ml de la fracción superior de la centrifugación por gradiente de
densidad de la sacarosa (ver antes, preparación del tejido) se
aplican en la columna y se lavan con tampón de lisis sin Genalpol
X-080. El combinado de efluentes se utiliza para
los experimentos de enfoque isoeléctrico.
Para IEF, se mezclan 3 ml de la preparación
tisular con poco HSA con 12 ml de tampón de muestra (urea 7M,
tiourea 2M, 2% CHAPS, 0,4% tampón de IPG pH 4-7,
0,5% DTT) y se incuban durante 1 hora. Las muestras se concentran
en un dispositivo Amicon® Ultra-15 (Millipore GmbH,
Schwalbach, Alemania) y la concentración proteínica se determina
usando la valoración proteínica Bio-Rad®
(nr.cat.500-0006; Bio-Rad
Laboratorios GmbH, München, Alemania) siguiendo las instrucciones
del manual del proveedor. A un volumen correspondiente a 1,5 mg de
proteína se añade tampón de muestra hasta un volumen final de 350
\mul. Esta solución se utiliza para volver a hidratar las tiras
de IPG a pH 4-7 (Amersham Biosciences, Freiburg,
Alemania) durante la noche. El EIF se lleva a cabo usando el
siguiente protocolo de gradientes: (1.) 1 minuto a 500 V;(2.) 2h a
3500 V; (3.) 22h a 3500 V constantes lo que da lugar a 82 kVh.
Después del IEF, las tiras se almacenan a -80ºC o se utilizan
directamente para SDS-PAGE.
Previamente al SDS-PAGE las
tiras se incuban en un tampón de equilibrio (urea 6M, Tris/HCl 50
mM, pH 8,8, 30% de glicerina 2% SDS), se añade DTT para la
reducción (15 min + 50 mg de DTT/10 ml), y se añade IAA para la
alquilación (15 min + 235 mg de acetamida de yodo/10 ml). Las tiras
se ponen en geles de poliacrilamida del 12,5% y se someten a una
electroforesis a 1 W/gel y luego 1 h a 17 W/gel. Posteriormente, se
fijan los geles (50% de metanol, 10% de acetato) y se tiñen durante
la noche con un equipo Novex^{TM} Colloidal Blue Staining Kit
(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Cat No.LC6025,
45-7101).
Cada paciente es analizado por separado mediante
el análisis de la imagen con el software ProteomeWeaver® (Definiens
AG, Alemania. Munich). Además, todas las manchas del gel se extirpan
mediante un robot de expulsión y las proteínas presentes en las
manchas son identificadas por espectrometría de masa
MALDI-TOF (Ultraflex^{TM} Tof/Tof, Bruker
Daltonick GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente se comparan 4
geles de la muestra tumoral con 4 geles de tejido adyacente y se
analizan en busca de manchas diferentes correspondientes a proteínas
expresadas de forma diferente. De esta forma, la SPEE proteínica se
expresa de forma específica o bien se sobreexpresa intensamente en
el tejido tumoral y no se puede detectar en el tejido de control
sano. Por lo tanto, entre otras muchas proteínas, se considera como
un marcador candidato para ser utilizado en el diagnóstico del
cáncer de mama.
El anticuerpo policlonal contra la SPEE
proteínica marcador del cáncer de mama se genera para su uso
posterior en la medición de los niveles de suero, plasma y sangre
por análisis de inmunodetección, por ejemplo, Western Blotting y
ELISA.
Para generar anticuerpos contra la SPEE, se
lleva a cabo la expresión recombinante de la proteína para obtener
los antígenos. La expresión se realiza aplicando una combinación del
sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En una primera
etapa, se analiza la secuencia de ADN y se obtienen recomendaciones
para las variantes silenciosas de mutación del cADN de alto
rendimiento y se obtienen las respectivas secuencias
RCP-cebador usando el sistema "ProteoExpert RTS
E. coli HY". Este es un servicio comercial basado en una
web (www.proteoexpert.com). Usando los pares recomendados
del cebador, se emplea el sistema "RTS 100 E. coli Linear
Template Generation Set, His-tag" (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat.nr.3186237) para generar
los patrones de RCP lineales del ADNc para la transcripción in
vitro y se utiliza la expresión de la secuencia de nucleótidos
que codifica la variante proteínica de SPEE. Para la detección por
inmunotransferencia y posterior purificación, la proteína expresada
contiene un His-tag. Se identifica la variante que
mejor se expresa. Todas las etapas desde la RCP hasta la expresión
y detección se llevan a cabo según las instrucciones del fabricante.
El producto respectivo de la RCP, que contiene todas las regiones
reguladoras necesarias T7 (promotor, lugar de fijación ribosómico y
finalizador T7) se clona en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen,
Karlsruhe, Germany, Cat.Nr.K 4300/01) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Para la expresión que utiliza las secuencias
reguladoras T7, la construcción se transforma en E. coli BL
21(DE 3)(Studier, F.W., y cols., Methods
Enzymol.185(1990)60-89) y las
bacterias transformadas son cultivadas en un lote 11 para la
expresión proteínica.
La purificación de la proteína de fusión
His-SPEE se realiza siguiendo los procedimientos
estándar en una columna de quelato de níquel. Brevemente, el lote
11 del cultivo bacteriano que contiene el vector de expresión para
la proteína de fusión His-SPEE se tritura por
centrifugación. Los gránulos celulares se vuelven a suspender en un
tampón de lisis, que contiene fosfato, cloruro de guanidio 7M a pH
8,0, imidazol y tiogliceroles, a lo que sigue una homogenización
usando un Ultra-Turrax®. El material insoluble se
granula mediante centrifugación a alta velocidad y el sobrenadante
se aplica a una columna cromatográfica de quelato de níquel. La
columna se lava con varios volúmenes de tampón de lisis seguidos de
lavados con tampón, que contienen fosfato, pH 8,0 y urea.
Finalmente, el antígeno fijado es eluido usando un tampón fosfato
que contiene SDS en condiciones ácidas.
La síntesis se realiza usando química
heterobifuncional (química de maleimida/SH). Las cisteinas
seleccionadas que contienen péptidos de SPEE se acoplan a la
hemocianina activada por el éster
3-maleimidohexanoil-N-hidroxisuccinimida
(MHS) de Concholepas concholepas (Sigma,
B-8556).
La hemocianina se lleva a 10 mg/ml en
NaH_{2}PO_{4}/NaOH 100 mM, pH 7,2. Por ml de hemocianina se
añaden 100 \mul de MHS (12,3 mg en DMSO) y se incuban durante 1
hora. La muestra es dializada durante la noche frente a
NaH_{2}PO_{4}/NaOH 100 mM, pH 6,5 y se ajusta a 6 mg/ml con
tampón de diálisis. Una cisteina seleccionada que contiene péptidos
de SPEE se disolvía en DMSO (5 mg/ml para un péptido de 1500
Dalton). Se añaden 20 \mul de EDTA 100 mM, pH 7,0 por ml de
hemocianina activada con MHS, pH 7,0 y 100 \mul de la cisteina
seleccionada que contiene péptidos de SPEE. Al cabo de 1 h los
grupos de maleimida restantes son bloqueados por la adición de 10
\mul de cisteina/HCl 0,5M por ml de mezcla de reacción. Esta
preparación se utiliza para la inmunización sin una
purificación
posterior.
posterior.
Ratones A/J de 12 semanas son inmunizados
inicialmente por vía intraperitoneal con 100 \mug de SPEE o bien
de conjugado de hemocianina-péptido (ver antes). Al
cabo de 6 semanas se realizan dos inmunizaciones intraperitoneales
con intervalos mensuales. En este proceso cada ratón recibe 100
\mug de SPEE o bien de conjugado de péptido de hemocianina
adsorbido al hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de
Bordetella pertussis. Posteriormente se llevan a cabo las
dos últimas inmunizaciones por vía intravenosa, el tercer y segundo
día previo a la fusión, usando 100 \mug de SPEE o bien de
conjugado de hemocianina-péptido en tampón de
PBS.
Las células del bazo de los ratones inmunizados
conforme a a) se amalgaman con células de mieloma conforme a
Galfre, G., y Milstein, C., Methods in Enzymology
73(1981)3-46. En este proceso, aprox.
1x10^{8} células del bazo del ratón inmunizado se mezclan con
2x10^{7} células de mieloma
(P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se
centrifugan (10 min a 300 xg y 4ºC). Luego las células se lavan una
vez con un medio RPMI 1640 sin suero bovino fetal (FCS) y se
centrifugan de nuevo a 400 xg en un tubo cónico de 50 ml. Se desecha
el sobrenadante, el sedimento celular se agita suavemente dando
unos golpecitos, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 4000, Merck,
Darmstadt) y se mezcla mediante pipeteo. Tras 1 minuto en un baño de
agua a 37ºC, se añaden 5 ml de RPMI 1640 sin FCS gota a gota a
temperatura ambiente durante un periodo de 4-5
minutos. Luego se añaden 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10% de
FCS, gota a gota, durante aproximadamente 1 minuto, se mezclan
intensamente, se enrasa hasta 50 ml con el medio (RPMI 1640 + 10%
FCS) y posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a 400 xg y
4ºC. Las células sedimentadas son absorbidas en un medio RPMI 1640
que contiene un 10% de FCS y son cultivadas en un medio de
selección de hipoxantina-azaserina (100 mmol/l de
hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% de FCS).
Se añaden 6 a 100 U/ml de interleucina al medio como un factor de
crecimiento.
Después de aproximadamente 10 días se analiza la
presencia de anticuerpos específicos en los cultivos primarios. Los
cultivos principales positivos de SPEE son clonados en placas de
cultivo celular de 96 pocillos por medio de un clasificador celular
activado por la fluorescencia. En este proceso de nuevo se añade
interleucina 6 a 100 U/ml al medio como un aditivo de
crecimiento.
Las células del hibridoma obtenidas son
cultivadas en una densidad de 1x10^{5} células por ml en un medio
de RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se multiplican o
reproducen durante 7 días en un fermentador (Thermodux
Co.,Wertheim/Main, Model MCS-104XL, pedido
nr.144-050). Se obtienen concentraciones medias de
100 \mug de anticuerpos monoclonales por ml de sobrenadante del
cultivo. La purificación de este anticuerpo del sobrenadante del
cultivo se realiza mediante métodos convencionales en la química
proteínica (por ejemplo, conforme a Bruck, C.,y cols.,Methods in
Enzymology 121 (1986)587-695).
Para la inmunización se prepara una emulsión
nueva de solución proteínica (100 \mug/ml de SPEE o de conjugado
de hemocianina-péptido) y el adyuvante completo de
Freund en una proporción 1:1. Cada conejo es inmunizado con 1 ml de
la emulsión los días 1, 7,14 y 30,60 y 90. Se extrae la sangre y el
suero anti-SPEE resultante es utilizado para
posteriormente experimentos tal como se ha descrito en los ejemplos
3 y 4.
\newpage
Un volumen de suero de conejo se diluye con 4
volúmenes de tampón de acetato (60 mM, pH 4,0). El pH se ajusta a
4,5 con Tris-base 2M. Se añade ácido caprílico (25
\mum/ml de muestra diluida) gota a gota agitando vigorosamente.
Al cabo de 30 minutos, se centrifuga la muestra (13.000 xg, 30 min,
4ºC), se desechan los gránulos y se recoge el sobrenadante. El pH
del sobrenadante se ajusta a 7,5 añadiendo Tris-base
2M y se filtra (0,2 \mum).
La inmunoglobulina en el sobrenadante se
precipita agitando vigorosamente mediante la adición gota a gota de
una solución de sulfato de amonio 4M hasta una concentración final
de 2M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogen por
centrifugación (8000 xg, 15 min., 4ºC).
Se desecha el sobrenadante. Los gránulos se
disuelven en NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM y se
dializan de forma exhaustiva. El dializado se centrifuga (13.000
xg, 15 min., 4ºC) y se filtra (0,2 \mum).
El IgG policlonal de conejo se prepara con 10
mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se
añaden 50 \mul de N-hidroxisuccinimida de biotina
(3,6 mg/ml en DMSO) por ml de solución de IgG. Después de 30
minutos a temperatura ambiente, la muestra es cromatografiada en
Superdex 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se
recoge la fracción que contiene IgG biotinilada. Los anticuerpos
monoclonales son biotinilados según el mismo procedimiento.
El IgG policlonal de conejo se prepara con 10
mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se
añaden 50 \mul de éster de N-hidroxisuccinimida de
ácido
digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico
(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Nr. cat. 1 333 054) (3,8
mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la
muestra es cromatografiada en Superdex 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH
10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recogen las fracciones que contienen
IgG digoxigenilada. Los anticuerpos monoclonales son marcados con
digoxigenina según el mismo procedimiento.
La SDS-PAGE y la
inmunotransferencia se realizan usando reactivos y equipo de
Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Las muestras de plasma humano se
diluyen 1:20 al reducir el tampón de la muestra LDS NuPAGE®
(Invitrogen) y se calientan durante 5 minutos a 95ºC. Partes
alícuotas de 10 \mul se añaden a geles NuPAGE®
4-12% (Bis-Tris) en el sistema
tampón MES. La mezcla proteínica separada del gel se transfiere a
las membranas de nitrocelulosa usando el sistema tampón de
transferencia Invitrogen XCell II^{TM}Blot Module (Invitrogen) y
NuPAGE®. Las membranas se lavan 3 veces en PBS/0,05% de
Tween-20 y se bloquean con tampón de bloqueo
SuperBlock (Pierce Biotechnology, Inc.,Rockford,IL,USA). El
anticuerpo primario biotinilado se diluye en tampón de bloqueo
SuperBlock (0,01-0,2 \mug/ml) y se incuba con la
membrana durante 1 hora. Las membranas se lavan tres veces en
PBS/Yween 20 0,05%. El anticuerpo primario biotinilado enlazado
específicamente se marca con un conjugado HRP de estreptavidina
(20 mU_{ABTS}/ml en tampón de bloqueo SuperBlock). Después de una
incubación durante 1 h, las membranas se lavarán 3 veces en
PBS/0,05% Tween-20. El conjugado de
estreptavidina-HRP se detecta usando un sustrato
quimioluminiscente (SuperSignal West Femto Substrate, Pierce
Biotechnology, Inc.,Rockford, IL, USA) y una película
autoradiográfica. Los tiempos de exposición varían de 10 minutos a
toda la noche.
Para la detección de la SPEE en suero o plasma
humano, se realiza un ELISA sándwich. Para la detección y captura
del antígeno, se conjugarán partes alícuotas del anticuerpo
policlonal anti-SPEE (ver ejemplo 2) con biotina y
digoxigenina, respectivamente.
Las placas de microvaloración de 96 pocillos
revestidas de estreptavidina son incubadas con 100 \mul de
anticuerpo policlonal anti-SPEE biotinilado durante
60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% de BSA, 0,9%
de NaCl y 0,1% de Tween-20. Tras la incubación, las
placas se lavan tres veces con 0,9% de NaCl, 0,1% de
Tween-20. Luego los pocillos in incubados durante 2
horas con una dilución en serie de proteína recombinante (ver
ejemplo 2) como antígeno estándar o con muestras de plasma diluidas
de los pacientes. Tras la fijación del SPEE, las placas se lavan
tres veces con NaCl 0,9%, Tween-20 0,1%. Para una
detección específica de la SPEE fijada, los pocillos se incuban con
100 \mul de anticuerpo policlonal anti-SPEE
digoxigenilado durante 60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM,
pH 7,4, 1% de BSA, NaCl 0,9% y Tween-20 0,1%. A
continuación, las placas se lavan tres veces para eliminar el
anticuerpo no fijado. En una siguiente etapa, los pocillos se
incuban con conjugados de
anti-digoxigenina-POD 20 mU/ml
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim. Alemania, nr. Catálogo 1633716)
durante 60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA al 1%, NaCl 0,9% y
Tween-20 0,1%. Las placas se lavan posteriormente
tres veces con el mismo tampón. Para la detección de los complejos
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incubarán con
100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, Nr. catálogo 11685767) y se mide el OD después de
30-60 minutos a 405 nm con un lector de ELISA.
La exactitud se valora analizando las muestras
líquidas individuales obtenidas de los grupos de pacientes
caracterizados en cada pocillo, por ejemplo, 50 pacientes a los que
se ha hecho una mamografía y que no presentan cáncer de mama, 50
pacientes diagnosticados y clasificados como NO, MO de cáncer de
mama, T1-3 lobular y ductal invasivo, 50 pacientes
diagnosticados con cáncer de mama en progreso, que tienen al menos
infiltración tumoral en como mínimo un nódulo linfático proximal o
bien formas severas de metástasis, 50 pacientes diagnosticados con
carcinoma de mama medular, mucinoso, tubular o papilar, y 50
pacientes diagnosticados con DCIS, respectivamente. El CA
15-3 medido como un análisis disponible en el
comercio (Roche Diagnostics, CA
15-3-análisis (nr. catálogo 0 304
5838 para el analizador Elecsys®Systems de inmunoanálisis) y la SPEE
medida tal como se ha descrito antes, han sido cuantificados en un
suero obtenido de cada uno de estos individuos. El análisis ROC se
realiza de acuerdo con Zweig, M.H., y Campbell, supra. El
poder discriminatorio para diferenciar los pacientes del grupo
T_{is}-3, NO, M0 de los individuos sanos para la
combinación de la SPEE con el marcador establecido CA
15-3 se ha calculado mediante un análisis
discriminante regularizado (Friedman, J.H., Regularized Discriminant
Analysis, Journal of the American Statistical Association
84(1989)165-175).
Los datos premilitares indican que la SPEE puede
ser también muy útil en el seguimiento de pacientes después de la
cirugía.
Bruck, C., Y Chen, G., et
al., Methods Enzymol. 121 (1986)
587-695
Carney, P.A., et al., Ann.
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<120> Uso de SPEE proteínica como marcador
del cáncer de mama
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<130> 22239
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<150> EP 03023508.9
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<151>
2003-10-15
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<160> 1
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<170> Versión de la paciente 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Espermidina sintasa (SPEE), conocida
también por putrescina aminopropiltransferasa
\newpage
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<400>1
Claims (10)
1. Un método para el diagnóstico del cáncer de
mama que comprende las etapas de
(a) aporte de una muestra líquida obtenida de un
individuo,
(b) puesta en contacto de dicha muestra con un
agente de fijación específico para la espermidina sintasa (=SPEE)
en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo
entre dicho aglutinante y la SPEE, y
(c) correlacionar la cantidad de complejo
formada en (b) respecto al diagnóstico de cáncer de mama.
2. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque dicha muestra es suero.
3. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque dicha muestra es plasma.
4. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque dicha muestra es sangre entera.
5. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque dicha muestra es un fluido de aspirado
de pezones.
6. Uso de la SPEE proteínica como una molécula
marcador en el diagnóstico del cáncer de mama de una muestra
líquida que se obtiene de un individuo.
7. Uso de la SPEE proteínica como una molécula
marcador en el diagnóstico precoz del cáncer de mama de una muestra
líquida que se obtiene de un individuo.
8. Uso conforme a la reivindicación 7, de manera
que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra derivada de
pacientes con cáncer de mama en
T_{is}-3;N0;M0.
9. Uso de la SPEE proteínica como una molécula
marcador en el cáncer de mama en combinación con una o más
moléculas marcador para el cáncer de mama en el diagnóstico del
cáncer de mama de una muestra líquida de un individuo.
10. Uso conforme a la reivindicación 9, donde al
menos una molécula marcador es CA 5-3.
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