ES2347485T3 - Uso de la proteina s100a12, como marcador para el cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo, b) contactar la citada muestra, con un agente de unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12, c) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa b) y d) correlacionar la cantidad de complejo formado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

Description

Uso de la proteína S100A12, como marcador para el cáncer colorrectal.

La presente invención, se refiere al diagnóstico de cáncer colorrectal. Ésta da a conocer el uso de la proteína S100A12 (= Calgranulina C), como molécula marcadora en el diagnóstico del cáncer colorrectal. Adicionalmente, además, ésta se refiere, de una forma especial, a un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces, derivada de un individuo, procediendo a medir la S100A12, en la citada muestra. La medición de la S100A12, puede utilizarse en la detección temprana o diagnosis de cáncer colorrectal.

El cáncer, continúa siendo un desafío mayor en cuanto a lo referente a la salud pública, a pesar del progreso habido en la detección y la terapia. De entre varios tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (=CRC), es uno de los cánceres más frecuentes, en el mundo occidental.

Cuanto más tempranamente puede detectarse/diagnosticarse el cáncer, más alto es la tasa total de supervivencia. Esto es especialmente cierto, para el CRC. La prognosis, en estados avanzados del tumor, es pobre. Más de un tercio de los pacientes, morirán, a raíz de una enfermedad progresiva, dentro de los cinco años a partir de la diagnosis, correspondiendo a una tasa de supervivencia de aproximadamente el 40%, para cinco años. El tratamiento actual, cura únicamente a una fracción de los pacientes y, claramente, tiene los mejores efectos, en aquéllos pacientes diagnosticados en una etapa temprana de la enfermedad.

Con respecto a lo referente al CRC, como un problema de salud pública, es esencial que se desarrollen medidas de rastreo y preventivas más efectivas, para el cáncer colorrectal.

Los procedimientos de detección más temprana disponibles en el momento presente, para el cáncer colorrectal, involucran la utilización de procedimientos de tests de ensayo para la sangre fecal o de endoscopia. No obstante, debe existir un significativo tamaño del tumor, antes de que se detecte sangre fecal. Con respecto a la detección del CRC, a partir de una muestra de heces, el estado actual del arte correspondiente a la técnica especializada, es el test de ensayo de sangre oculta fecal, basados en el ensayo de guaiac.

En los años recientes, se ha reportada una tremenda cantidad de los denominados genes específicos del colon o genes específicos del cáncer colorrectal. La inmensa mayoría de los correspondientes documentos de investigación o de solicitudes de patente, se basan en datos obtenidos mediante análisis de modeles patrón de expresión de RNA, en el tejido de (cáncer de) colon, con respecto a un tejido diferente o un tejido normal contiguo, respectivamente. Tales tipos de enfoques o métodos para abordar el problema, pueden resumirse como técnicas de exhibición de mRNA diferencial.

Como ejemplo, para los datos disponibles para las técnicas de exhibición del mRNA, puede mencionarse y discutirse el documento de patente internacional WO 01/96 390. Esta solicitud, describe y reivindica más de doscientos polinucleótidos aislados y los correspondientes polipéptidos, como tales, así como su uso en la detección del CRC. No obstante, es de un conocimiento general, el hecho de que, las diferencias, en el nivel de mRNA, no se reflejan mediante el nivel de las correspondientes proteínas. Una proteína codificada por un mRNA raro, puede encontrarse en unas cantidades muy grandes, y una proteína codificada por un mRNA abundante, puede no obstante ser difícil de detectar y de encontrar. Esta falta de correlación entre el nivel de mRNA y el nivel de proteína, se debe a razones tales la estabilidad del mRNA, eficacia de traducción, estabilidad de la proteína, etc.

Existen, también, métodos recientes de enfoque del problema, que investigan las diferencias en los modelos patrón de las proteínas, entre diferentes tejidos o entre tejido sano y un tejido enfermo, con objeto de identificar las moléculas marcadores candidatas que puedan utilizarse en la diagnosis del CRC. Brünagel, G. et al., Cancer Research 62 (2002) 2437 - 2447, han identificado siete proteínas matrices nucleares, las cuales aparecen, de una forma abundante, en el tejido del CRC, si se compara con el tejido normal contiguo. No se reportan datos sobre muestras de líquidos o de heces, procedentes de un individuo.

El documento de patente internacional WO 02/078 636, reporta sobre nueve puntos o manchas asociados con el cáncer colorrectal, que se encuentran mediante desorción y ionización mejoradas por láser, de superficie (SELDI). Estos puntos o manchas, se ven, de una forma más frecuente, en el suero obtenido de pacientes con CRC, si se compara con suero obtenido de controles sanos. No obstante, la identidad de la(s) molécula(s), comprendidas en dichos puntos o manchas, no se conoce, por ejemplo, no se conoce su secuencia.

A pesar de amplia lista y siempre creciente de marcadores de proteínas candidatos, en el sector del CRC, hasta hoy, no se conoce la utilidad clínica/de diagnóstico de estas moléculas. Con objeto de ser de utilidad clínica, un nuevo marcador de diagnóstico, como marcador individual, debería ser por lo menos tan bueno como el mejor marcador individual conocido en el arte especializado de la técnica. Ahora bien, un nuevo marcador, debería conducir a un progreso en la sensibilidad y/o especificidad de diagnóstico, tanto si se utiliza individualmente como si se utiliza en combinación con uno o más marcadores distintos, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad del diagnóstico de un test de ensayo, se valora, a menudo, por sus características operativas para el destinatario, las cuales se describirán abajo, a continuación, en mayor detalle.

En el momento presente, por ejemplo, se encuentran disponibles los tests de ensayo de sangre, de diagnóstico, basados en la detección del antígeno carcinoembriónico (CEA), una glicoproteína asociada a tumores, para valorar la diagnosis en el sector del CRC. El CEA, se encuentra incrementado en un 95% de las muestras de tejido obtenidas de pacientes con Cáceres colorrectales, gástricos, y pancreáticos, en la mayoría de los carcinomas de pecho, de pulmón y de la cabeza y el cuello (Goldenberg, D.M. et al.,) Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22). Niveles elevados del CEA, han sido también detectados en pacientes con enfermedades no malignas, y muchos pacientes con cáncer colorrectal, tienen niveles normales de CEA, el suero, especialmente, durante la etapa temprana de la enfermedad (Carriquiry, L.A. y Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929; Herrera, M.A. et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J. et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451). La utilidad del CEA, medido a partir del suero o plasma, en detector las reapariciones o recidivas, se ha reportado como siendo contradictorio o discutible, y debe todavía aplicarse de una forma extensa (Martell, R.E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C.G. et al., JAMA 270 (1993) 943-947). A la luz de los datos disponibles, la determinación del CEA en suero, no posee ni la sensibilidad no la especificidad para capacitar su uso como un test de ensayo de rastreo para el cáncer colorrectal, en la población asintomática. (Reynoso, G. et al., JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon, C., Clin. Chem. 48 (2002) 1151-1159).

Muestras tomadas de heces, tienen la ventaja consistente en que, su muestreo, es fácilmente posible, mediante procedimientos no invasivos.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, arriba, el ensayo de guaiac, se utiliza, actualmente, de una forma más extensa, como ensayo de rastreo o diagnóstico, para CRC, a partir de las heces. El ensayo de guaiac, no obstante, tiene tanto una sensibilidad reducida así como también, una especificidad reducida. La sensibilidad de los test de ensayo de sangre oculta fecal, basados en el teste de ensayo de guaiac, es de -26%, lo cual significa el hecho de que, un 74% de los pacientes con lesiones malignas, permanecen indetectados. (Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55).

La visualización de lesiones precancerosas y cancerosas, representa el mejor método de abordar el problema de la detección temprana, pero, la colonoscopia, es invasiva, con unos significativos costes, riesgos y complicaciones (Silvis, S.E. et al., JAMA 235 (1976) 928-930; Geenen, J.E. et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235; Anderson, W.F. et al., J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133).

La sensibilidad y especificidad de alternativas de diagnóstico al test de ensayo de guaiac, han sido investigadas recientemente, por parte de Sieg, A. et al., Int. J. Colorectal Dis. 14 (1999). Especialmente, se ha procedido a comparar la medición de la hemoglobina y del complejo hemoglobina-haptoglobina, a partir de un espécimen de heces. Se ha notado el hecho de que, el ensayo de hemoglobina, tiene un sensibilidad insatisfactoria, para la detección de neoplasmas colorrectales. Mientras que, el cáncer, en su etapa de carcinoma progresado, se detecta con una sensibilidad de aproximadamente el 87%, las etapas de tumores tempranas, no se detectan con una sensibilidad suficiente. El ensayo del complejo hemoglobina - haptoglobina, fue más sensible, en la detección de etapas tempranas del CRC. Esta detección más sensible, iba acompañada de una reducida especificidad. Puesto que una reducida especificidad, se traduce en un gran número de investigaciones secundarias, como la colonoscopia, un ensayo con una reducida especificidad, no cumple, tampoco, con los requerimientos de un ensayo de rastreo aceptado de una forma general.

La calprotectina, ha sido descrita como un biomarcador alternativo para la detección del CRC, a partir de muestras de heces, en la patente estadounidense US 4.455.160 y, de una forma correspondiente, en la literatura científica, A.G. et al. (Scand. J. Gastroenterol. 27 (1972) 793 - 798; Scand. J. Gastroenterol. 28 (1993) 1073 - 1076). Si bien la calprotectina es un marcador de enfermedades inflamatorias, su potencial como un marcador para la detección del CRC, a partir de las heces, se encuentra documentado por varias publicaciones (Johne, B. et al., Scand. J. Gastroenterol. 36 (2001) 291 - 296); Limburg, P.J., et al., Am. J. Gastroenterol. 98 (2003) 2299 - 2305; Hoff, G., et al. Gut 53 (2004) 1329 - 1333). Mientras que, la sensibilidad y especificidad de la calprotectina son comparables a las del ensayo inmunológico de la hemoglobina, la calprotectina, parece tener ciertas características favorables para un biomarcador de diagnóstico, al compararse con la hemoglobina. Ésta se encuentra homogéneamente distribuida en los excrementos, es estable es estable a la temperatura ambiente, haciendo posible una envío por correo de la muestra al laboratorio, y éste no muestra interferencias con los componentes alimenticios o los compuestos farmacéuticos (Ton, H. et al., Clin. Chim. Acta 292 (2000) 41 - 54). No obstante, se encontraron elevadas concentraciones de calprotectina, el heterodímero de la S100A8 y de de la S100A9, en muestras de heces procedentes de pacientes que sufren de CRC, enfermedad de Crohn o enfermedad inflamatoria del intestino. Los resultados, están de acuerdo la función o rol general de la calprotectina en la inflamación (Rickman, C., et al., J. Immun. 170 (2003) 3233 - 3242). Así de este modo, el uso de la calprotectina en gastroenterología, no se limita a la detección del CRC, sino que se extiende a otras enfermedades, especialmente, la enfermedad inflamatoria del intestino, tal como se ha revisado por parte de Poullis. A., et al. (J. Gastroenterol. Heptol. 18 (2003) 756 - 762).

En la solicitud de patente internacional WO 2004/079 368, se menciona el hecho de que, la S100A8 ó la S100A9, respectivamente, se encuentran reguladas al alza, en parte de las muestras de tejidos de CRC investigados.

Sieg A., et al., Internacional Journal of Colorrectal Tissue Disease, 14 (6), 1999, páginas 267 - 271, reportan sobre la detección del cáncer colorrectal mediante la medición sensible de complejo hemoglobina/haptoglobina en muestras de excrementos.

En la patente estadounidense US 2004/157.278, se discute la regulación al alza del gen que codifica para la proteína 1 regeneradora de los islotes humanos (Reg1\alpha) y la regulación al alza de otros genes, tales como el que codifica para el inhibidor de tejido de las metaloproteasas 1 (TIMP 1), se encuentra asociada con el cáncer colorrectal.

Otro procedimiento alternativa adicional para el test de ensayo de guaiac, para la detección de CRC en las heces, es el que se ha publicado recientemente y que consiste en la detección del antígeno específico de cáncer colorrectal, "proteína 2 de mantenimiento de minicromosomas" (MCM2), mediante inmunohistoquímica en células del colon derramadas al interior de las heces. Debido a la reducida extensión del estudio, la conclusión del valor de diagnóstico, para la detección del cáncer colorrectal, es preliminar. No obstante, el test de ensayo, parece tener únicamente una sensibilidad limitada para detectar cáncer de colon con los correctos contornos (Davies, R.J. et al., Lancet 359 (2002) 1917 - 1919).

Recientemente, ha sido introducido, en el mercado, un ensayo para la detección de la isoenzima piruvato-quinasa M2 (M2-PK) (Schebo Biotech, Gießen, Alemania). Una comparación del test de ensayo de guaiac con respecto a los inmunoensayos para hemoglobina y M2-PK, se realizado, por ejemplo, por parte de Vogel, T. et. Al., Dtsch. Med. Wochenschr. 130 (2005) 872 - 877. Éstos muestran el hecho de que, los ensayos inmunológicos, son superiores a los del test de ensayo de guaiac y que, a una especificidad comparable, el ensayo de la M2-PK, es menos sensible en la detección del CRC, si se compara con el ensayo de la hemoglobina. No obstante, los autores concluyen que, la utilidad de ambos tipos ensayos basados en las heces, es todavía cuestionable.

La identificación de un marcador de tumor de CRC temprano, que pudiera permitir la detección fidedigna de cáncer, o proporcionar una información de pronóstico temprano, mediante medios no invasivos, a partir de un espécimen de heces, podría conducir a un ensayo de diagnóstico que ayudaría enormemente en la diagnosis y en control de esta enfermedad. Así, por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente de mejorar la diagnosis del CRC, especialmente, a partir de las heces. Es especialmente importante, el mejorar la diagnosis temprana del CRC, puesto que, para los pacientes diagnosticados tempranamente, las probabilidades de supervivencia, son mucho mayores, si se comparan con las de aquéllos diagnosticados en una etapa avanzada de la enfermedad.

Era una labor de la presente invención, el investigar si podía identificarse un nuevo marcador, el cual pudiera ayudar en la diagnosis del CRC. De una forma preferible, tal tipo de marcador, se encontraría presente en las heces, y permitiría para el lograr una diagnosis no invasiva.

De una forma sorprendente, se ha encontrado el hecho de que, el uso de la proteína S100A12, como marcador para el CRC, puede superar, por lo menos parcialmente, los problemas conocidos a partir del estado actual del arte especializado de la técnica.

La presente invención, se refiere, por lo tanto, al uso de un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo,

b) contactar la citada muestra, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

c) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa (b), y

d) correlacionar la cantidad de complejo determinado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

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Tal y como podrá apreciar el artesano experto en el arte especializado de la técnica, cualquiera de estas mediciones de la S100A12, se realiza in vitro. A continuación, se deshecha la muestra procedente del paciente. La muestra obtenida del paciente, se utiliza únicamente para el procedimiento in vitro de la invención y no se transfiere ningún material de la muestra procedente del paciente, de vuelta, al cuerpo del paciente. No se realizan ni mediciones de la S100A12, ni mediciones del CRC, en el cuerpo humano o de un animal.

El procedimiento de diagnóstico in vitro en concordancia con la presente invención, se utilizad para valorar la ausencia, la presencia o la concentración relativa de la S100A13, en una muestra de heces. El valor medido para la S100A12, ayudará al médico clínico, en la valoración del CRC, por ejemplo, en su establecimiento de una diagnosis clínica y/o en su decisión para un tratamiento apropiado.

En una forma preferida de presentación, la muestra de heces, se procesa para obtener un líquido de la muestra, el cual es más conveniente, para su manipulación, que un espécimen de heces. Tal tipo de muestra procesada, se incuba, a continuación, con el agente de unión específico, para la S100A12. La presente invención, se refiere, por lo tanto, también, a un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo,

b) procesar la citada muestra, para obtener una muestra de líquido procesada,

c) contactar la citada muestra líquida, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

d) correlacionar la cantidad de complejo formado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

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Otro procedimiento preferido de la invención, es un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de

a) procesar una muestra de heces obtenida de un individuo, para obtener una muestra líquida procesada,

b) contactar la citada muestra líquida, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

d) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa (b) y

e) correlacionar la cantidad de complejo formado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

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En una forma adicionalmente preferida de presentación, la presente invención, da a conocer un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de proporcionar una muestra obtenida de un individuo, contactar la citada muestra, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12, contactar la citada muestra, con un agente específico de enlace o unión, para un segundo marcador seleccionado de entre el grupo consistente en el complejo de hemoglobina/haptoglobina, hemoglobina, tejido inhibidor de metaloproteasas 1 (TIMP-1), y piruvato-quinasa M2 (M2-PK) tumoral, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace y el segundo marcador, la detección de la cantidad de complejo formado para la S100A12 y el por lo menos un segundo marcador, y correlacionar la cantidad de complejos determinada a la diagnosis del cáncer colorrectal. En formas adicionalmente preferidas de presentación, el procedimiento en concordancia con la presente invención, se basa en la determinación de la S100A12 y de hemoglobina, como segundo marcador, la determinación de la S100A12 y del complejo de hemoglobina/haptoglobina, como segundo marcador, la determinación de la S100A12 y del TIMP-1, como segundo marcador, y la determinación de la S100A12 y de la M2-PK, como segundo marcador, respectivamente. Tal y como resultará obvio, para el artesano experto en el arte especializado de la técnica, la medición de la S100A12 y las mediciones del por lo menos un segundo marcador, pueden realizarse a partir del mismo alícuoto de la muestra de heces de una muestra de heces procesada, respectivamente, o a partir de diferentes alícuotos de una muestra de heces de un paciente, o a partir de diferentes alícuotos de una muestra de heces procesada, de un paciente, respectivamente.

En otra forma preferida de presentación, la muestra de heces, se procesa para recuperar colonocitos, los cuales, a continuación, se aplican, a modo de manchas, en una platina deslizante de microscópico. Tale tipo de muestra procesada, se incuba, a continuación, con el agente de enlace o unión específico para la S100A12. La presente invención, por lo tanto, se refiere, también, a un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo,

b) procesar la citada muestra, para recuperar colonocitos,

c) contactar la citada muestra, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

d) correlacionar la cantidad de complejo formado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

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La proteína A100A12 (= Calgranulina C), se caracteriza por una secuencia dada SEQ ID NO:1.

La A100A12, se denomina, también CAAF1; CAGC; proteína de enlace o unión de calcio en fluido amniótico 1; Calgranulina CM ENRAGE (proteína de enlace o unión RAGE, extracelular, recientemente identificada); proteína S100 neutrofílica; proteína S100 del tipo A12, de enlace de calcio, la proteína codificada por este gen, es un miembro de la familia de proteínas que contiene formaciones de enlace o unión de calcio 2 EF-hand. Las proteínas S100, se encuentran localizadas en el citoplasma y/o núcleo de una amplio gama de células, y se encuentra involucrado en la regulación de una gran número de procesos celulares, tales como los consistentes en la progresión y la diferenciación de ciclo celular. Los genes S100, incluyen por lo menos 13 miembros, los cuales se encuentran localizados, como una agrupación, en el cromosoma 1q21. Esta proteína, se propone que está involucrada en las trayectorias de las señales de transducción dependientes del calcio y, su efecto regulador sobre los componentes de citosqueletal, pueden modular varias actividades neutrófilas.

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El documento de patente internacional 2005/05 4508, se refiere a procedimientos de perfilación de expresión de genes, utilizando reservas de series de polinucleótidos, y a la expresión de tales tipos de perfiles a las características histopatológicas del tejido de cáncer colorrectal. La S100, se encuentra comprendida entre los varios centenares de genes diferencialmente expresados mencionados en esta solicitud de patente. No se muestra la detección del S100A12 en el nivel de proteínas, en el tejido de CRC, en una muestra de fluido corporal o en una muestra de
heces.

La estructura fisiológicamente relevante de la S100A12, es un homodímero de unión al Ca^{2+}. Puesto que la S100A12, se libera, también, de las células, se han descrito las funciones extracelulares, por ejemplo, la regulación de procesos inflamatorios (Foell, D. et al. Clin. Chim. Acta 344 (2004) 37-51). Conjuntamente con la S100A8 (= calgranulina A) y la S100A9 (calgranulina B), la S100A12, se expresa en granulitos, a cuyo efecto, las proteínas de calgranulina, constituyen un porcentaje de hasta un o 50% del contenido de proteínas citosólicas solubles. En la inflamación aguda, se libera la A100A12 y se ha encontrado, en diferentes enfermedades que a las enfermedades del intestino irritable, la enfermedad mórbida de Crohn, la enfermedad de Kawasaki o la artritis reumatoidea (Burmeister, G. y Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230; Foell, D. et al., Rheumatology 42 (2003) 1383-1389). Cuando se investigó la cascada de respuestas de la S100A12, ésta se vinculó a un nuevo eje inflamatorio, vía el receptor para producto finales glicolados avanzados (=RAGE). Este receptor, puede encontrarse en varios tipos de tejidos, incluyendo, por ejemplo, al endotelio y células del sistema autoinmune (Hofmann, M.A. et al., Cell 97 (1999) 889 - 901; Schmidt, A. M. et al., J. Clin. Invest. 108 (2001) 949-955). Aparte de encontrarse involucrado en la respuesta inflamatoria, la trayectoria RAGE, se ha descrito, también, en el curado de heridas, en el crecimiento de tumores o amiloidosis sistemática (Hofmann, M.A. et al., véase anteriormente, arriba; Schmidt, A.M. et al., véase anteriormente, arriba; Yan, S.S. et al., Nat. Med. 9 (2003) 287-293; Hofmann, M.A. et al., Genes Immun. 3 (2002) 123-135). Así, de este modo, la S100A12, puede tener una amplia gama de efectos. No obstante, no se ha descrito, hasta la fecha, una relación con los procesos tumorales.

En una forma preferida de presentación, el nuevo marcador S100A12, se utiliza en la exploración de rastreo para la CRC. Cuando se utiliza en un paciente, el control y realización del procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, puede ayudar para valorar la carga del tumor, la eficacia del tratamiento y la recidiva del tumor, en el seguimiento de los pacientes. Los niveles incrementados de A100A12, se encuentran directamente correlacionados con la carga tumoral. Después de una quimioterapia a corto plazo (desde pocas horas hasta 14 días), el incremento en S100A12, puede servir como un indicador la muerte de las células tumorales. En el seguimiento a largo plazo de los pacientes, después de la cirugía y/o quimioterapia (desde 3 meses hasta 10 años), un incremento de la S100A12, puede ser utilizada como un indicador de recidiva del tumor en el colorrecto.

En una forma preferida de presentación, el procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, se utiliza para propósitos de exploración de rastreo. Es decir, éste se utiliza para valorar sujetos, sin una diagnosis previa de CRC, mediante la medición del nivel de S100A12, en una muestra de heces, y correlacionando el nivel medido a la presencia o ausencia de CRC.

Tal y como el artesano experto en el arte especializado de la técnica apreciará fácilmente, en tales tipos de rastreo exploratorio, debe prestarse un especial cuidado, en cuanto al hecho de que se utilice una cantidad apropiada de muestra de heces. De una forma preferible, para la medición de la S100A12, se utiliza una determinada cantidad de muestra de heces, en la que se encuentra comprendida la S100A12. De una forma preferible, la cantidad de S100A12, se expresa en términos de cantidad de S100A por cantidad de heces, es decir, se proporciona la concentración relativa de S100A12.

El procedimiento de diagnóstico, puede utilizarse no únicamente para el rastreo exploratorio de la población asintomática, sino también, como una forma preferida alternativa para la vigilancia de individuos de alto riesgo. Tales tipos de individuos de alto riesgo, de una forma preferible, se seleccionan de entre el grupo consistente en individuos con una anemia de deficiencia en hierro, relativos de primer grado de pacientes con CRC, pacientes con una historia de familia de CRC, y pacientes con pólipos nuevamente detectados o una historia de neoplasia gastrointestinal.

Para un ensayo de rastreo de exploración, no es únicamente relevante el valor de AUC. Un requerimiento bastante crítico en un escenario de rastreo de exploración, es el de una sensibilidad lo suficientemente buena a un nivel alto y clínicamente relevante de especificidad. Una alta especificidad, es crucial, debido al hecho de que, si este requerimiento no se cumpliera, ello daría como resultado un alto número de falsos positivos, acompañados de procedimientos innecesarios de seguimiento, y de angustia, para los pacientes. En otras formas preferidas de presentación, el nivel de especificidad, se ajusta a unos porcentaje del 96%, 97%, 98% ó 99%, respectivamente, si se compara con individuos CRC-negativos de la población de rastreo de exploración clínicamente relevante.

Tal y como apreciará el artesano experto en el arte especializado de la técnica, se ha establecido un valor de corte para la S100A12, basados en valores de S100A12 medidos en las muestras de heces derivadas de individuos de una población normal, sana. La población normal clínicamente relevante, en un establecimiento de rastreo exploratorio, consiste, de una forma preferible, en individuos clínicamente sanos, de una edad comprendida dentro de unos márgenes que van desde los 55 años hasta los 65 años. Un valor de S100A12, en una muestra de heces, por encima de un valor establecido de corte, puede considerarse indicativa para CRC, o puede por lo menos justificar un examen de diagnóstico adicional del respectivo individuo.

El cáncer colorrectal, de la forma más frecuente, progresa, a partir de adenomas (pólipos), a carcinomas malignos.

La clasificación por etapas del cáncer, es la clasificación en términos de extensión, progresión y gravedad. Esta clasificación, agrupa a pacientes de tal forma que puedan realizarse generalizaciones a propósito de la prognosis y la elección de la terapia.

Las diferentes etapas del CRC utilizadas para clasificarlo son las etapas A a D, según la clasificación de Duke. Hoy en día, el sistema TNM, es la clasificación más extensamente utilizada de la extensión anatómica del cáncer. Éste representa sistema de clasificación uniforme por fases o etapas, internacionalmente aceptado. Hay, en éste, tres variables básicas: T (la extensión del tumor primario), N (el estatus de los nódulos o ganglios linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de metástasis distante. Los criterios del sistema TNM, se encuentran publicados, por parte de la UICC (Internacional Union Against Cancer - [Unión internacional contra el cáncer] -), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, sexta edición, 2002). Una vez que se ha determinado el estatus según la clasificación TNM, los pacientes se agrupan en etapas de la enfermedad, las cuales se denominan mediante números romanos, en un rango que se extiende desde I a IV, siendo, la etapa IV, la etapa correspondiente a la enfermedad más avanzada. La clasificación según el sistema TNM y la clasificación por etapas de la enfermedad según la UICC, se corresponde, la una con la otra, de la forma que se muestra en la Tabla 1 que se facilita a continuación, tomada de Sobin L.H. y Wittekind (eds.), véase anteriormente, arriba.

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TABLA 1 Interrelación de la clasificación según el sistema TNM, y las etapas de la enfermedad según la UICC

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Lo que es especialmente importante, es que, la diagnosis temprana del CRC, se traduzca en un prognosis mucho mejor. Los tumores malignos del colorrecto, se producen a partir de tumores benignos, es decir, a partir de adenomas. Así, por lo tanto, la mejor prognosis, la tienen aquéllos pacientes diagnosticados en el estado de adenoma. Los pacientes diagnosticados tan tempranamente como en el estado T_{is}, N0, M0, ó T1-3; N0; M0, si se tratan apropiadamente, tienen más de un 90% de probabilidades de supervivencia a los 5 años después de la diagnosis, si se compara con los 5 años de tasa de supervivencia de únicamente un 10%, para pacientes diagnosticados cuando se encuentra ya presente una metástasis distante.

En el sentido de la presente invención, una diagnosis temprana o precoz del CRC, se refiere a una diagnosis en una etapa del tumor, en donde no se encuentra presente metástasis en absoluto (ni próxima = N0, ni distal = M0), es decir, las etapas correspondientes a T_{is}, N0, M0, ó T1-4; N0; T_{is}, significa un carcinoma in situ.

Es preferible, el hecho de que, el carcinoma, se diagnostique cuando éste no ha crecido todavía completamente a través de la pared del intestino, y así de este modo, que no se encuentre perforada ni el peritoneo visceral, ni que nos se hayan invadido otros órganos o estructuras, es decir, que la diagnosis de realice en cualquier etapa, desde la T_{is}; N0; M0 a la T3; N0; M0 (T_{is}-3; N0; M0).

El procedimiento de diagnóstico en concordancia con la presente invención, se base en una muestra de heces, la cual se deriva de un individuo. La muestra de heces, se extrae, y se mide específicamente la S100A12, a partir de esa muestra de heces procesada, mediante la utilización de un agente específico de enlace o unión.

Un agente específico de enlace o unión es, por ejemplo, un receptor para la S100A12, una lectina de enlace o unión a la S100A12, un aptámero de la S100A12, o un anticuerpo a la S100A12. Un agente específico de enlace o unión, tiene por lo menos una afinidad de 10^{7} l/mol, para su correspondiente molécula diana. El agente específico de enlace o unión, tiene preferiblemente una afinidad de 10^{7} l/mol, o de una forma incluso más preferible, tiene una afinidad de 10^{8} l/mol, para su molécula diana. Tal y como un artesano experto en el arte especializado de la técnica apreciará, el término específico, se utiliza para indicar el hecho de que, las otras biomoléculas presentes en la muestra, no enlazan o se unen, con el agente de enlace o unión específico para la A100A12. De una forma preferible, el nivel de enlace o unión a una biomolécula distinta que la molécula diana, tiene como resultado una afinidad de enlace o unión que es únicamente de un 10%, de una forma más preferible, de únicamente un 5% de la afinidad de de la molécula diana, o menos. Un agente de enlace o unión o unión mayormente preferido, cumplirá con ambos de los criterios mínimos anteriormente mencionados, arriba, para la afinidad, así como para la especificidad.

Un agente específico de enlace o unión, es preferiblemente un anticuerpo reactivo con la S100A12. El término anticuerpo, se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal fragmentos de tales tipos de tales tipos de anticuerpos, así como las construcciones genéticas que comprenden el dominio de enlace o unión de un anticuerpo. Puede utilizarse cualquier fragmento de anticuerpo que retenga los criterios anteriormente mencionados, arriba, de un agente de enlace o unión específico. Los anticuerpos, se generan mediante procedimientos correspondiente al estado actual de arte especializado de la técnica, como por ejemplo, tal y como se describe en Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11 (1990), en el libro en su totalidad, especialmente, en las páginas 43 - 78, Elsevier, Ámsterdam). Adicionalmente, además, el artesano experto en el arte especializado de la técnica, se encuentra bien asesorado sobre los procedimientos basados en inmunoabsorbentes que pueden utilizarse en el aislamiento específico de los anticuerpos. Mediante estos medios, puede mejorarse la calidad de los anticuerpos policlonales y, así, de este modo, su rendimiento en inmunoensayos (Tijssen, P., mencionado anteriormente, más arriba, páginas 108 - 115).

Para las realizaciones, tal y como se han dado a conocer en la presente invención, se han utilizado anticuerpos policlonales provocados en conejos. No obstante, pueden utilizase, naturalmente, también, anticuerpos policlonales procedentes de diferentes especies, como por ejemplo, ratas, conejillos de indias, así como anticuerpos monoclonales. Puesto que, los anticuerpos monoclonales, pueden producirse en cualquier cantidad requerida con unas propiedades constantes, éstos representan unas herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina clínica. La generación y el uso de anticuerpos monoclonales a la S100A12, en un procedimiento en concordancia con la presente invención, es todavía, también, otra forma de presentación preferida.

Tal y como apreciará el artesano experto en el arte especializado de la técnica ahora, que la S100A12 ha sido identificada mediante mediciones en un inmunonensayo, como un marcador que es de utilidad en la diagnosis del CRC, pueden utilizarse modos alternativos para alcanzar un resultado comparable al de los logros de la presente invención. La proteína marcadora A100A12, puede detectarse mediante medios apropiados y utilizarse como un marcador del CRC. Tales medios apropiados preferidos, comprenden la detección del polipéptido S100A12, mediante un procedimiento de inmunoensayo, mediante cromatografía líquida, especialmente, cromatografía líquida de alto rendimiento, mediante electroforesis, especialmente SDS-PAGE, combinado con una transferencia Western y mediante espectroscopia de masas.

Par las mediciones, se obtiene la muestra de heces, de un individuo. Puede utilizarse directamente un alícuoto de la muestra de heces. De una forma preferible, se procesa un alícuoto de la muestra de heces, para proporcionar una muestra líquida. Una muestra de heces procesada, es una muestra líquida obtenida en la extracción de una muestra de heces, con un tampón de extracción.

El procesado de la muestra de heces, se realiza mediante un tampón de extracción, el cual se optimiza para la tarea. Éste debería cumplir por lo menos con tres requerimientos básicos: Éste debería liberar el analito de interés, del la matriz de heces. Éste debería estabilizar el analito libre. Éste debería minimizar la interferencia de la matriz de heces en la subsiguiente detección del analito. Puesto que las combinaciones de marcadores pueden tener un potencial adicional de diagnóstico, un tampón optimizado, debería ser no únicamente aplicable para un biomarcador específico, sino para todos los biomarcadores de interés. El tampón de extracción, puede contener urea, para mejorar la homogeneización y la extracción de una muestra de heces. Puede incluirse el Ca^{2+}, para la estabilización de una proteína de enlace o unión al Ca^{2+}. Puesto que se conoce que las proteínas S100, son proteínas de enlace o unión al Ca^{2+}, el tampón de extracción, contendrá, de una forma preferible, iones Ca^{2+}, para estabilizar tales tipos de proteínas. Deberían utilizarse los agentes quelantes débiles, los cuales, por un lado, puedan romper los puentes iónicos entre las proteínas de enlace o unión al Ca^{2+ y} la matriz de las heces. No obstante, por otro lado, estos agentes complejantes de Ca^{2+}, tienen que unirse a los iones de Ca^{2+}, de una forma lo suficientemente débil, como para evitar el agotamiento de los iones de Ca^{2+} procedentes de la S100A12. De una forma preferible, el ácido o el citrato nitriloacético, se utilizan como quelantes en un tampón de extracción de heces. Un tampón de extracción optimizado y preferido, contiene urea, iones de Ca^{2\text{*}}, y un quelante. De una forma preferible, el quelante, se selecciona de entre el grupo consistente en ácido o citrato nitriloacético. Un tampón de extracción optimizado, se utiliza, por ejemplo, en el procesado de una muestra de heces, tal y como se muestra en el Ejemplo 4b.

Es más conveniente el utilizar un tampón de extracción optimizado, en combinación con un dispositivo de muestreo de heces, hecho a medida. De una forma mayormente conveniente, un individuo, recolecta una cantidad definida de muestra de heces, y la transfiere directamente a la colección, previamente llenada con el tampón estabilizante de extracción. Esta forma conveniente de muestreo y extracción, posibilita el transporte de los especimenes a un laboratorio de diagnóstico, sin la degradación del analito. Puesto que, la extracción de la muestra de heces, puede realizarse directamente en el dispositivo de muestreo, se reducen los procedimientos necesarios de manipulación y de transferencia.

Varios desarrollos recientes, se han centralizado en dispositivos que facilitan el muestreo y la manipulación de una muestra de heces. La patente europea EP 1 366 715, da a conocer un tubo de recolección especial, para la recolección de una muestra de heces. Este tubo de extracción, comprende, esencialmente, a) un cuerpo de recipiente contenedor que es hueco en el lado interior, abierto en la parte superior, y apto para recibir una solución de tampón, (b) un casquete superior, provisto de un pequeña varilla roscada, para la recolección de las muestras de excrementos, sobresaliendo, la citada pequeña varilla roscada, axialmente, hacia el interior del cuerpo del recipiente contenedor, cuando el casquete superior se aplica en el final superior del cuerpo del recipiente contenedor, y (c) una partición de división, provista en una posición intermedia, en el interior del citado cuerpo del recipiente contenedor, de tal forma que separa una cámara superior, desde una cámara del fondo, hacia el interior del citado cuerpo del recipiente contenedor, teniendo, la citada partición de división, un orificio axial, apropiado para permitir el paso de la citada pequeña varilla roscada, de tal forma que se retengan los excrementos en exceso en la citada cámara superior, y que permita el paso de la parte roscada de la pequeña varilla, al interior de la citada cámara del fondo. Este tubo de extracción, tiene adicionalmente un recipiente contenedor que está abierto en el fondo, y que se encuentra provisto de un casquete del fondo, el cual puede aplicarse, de una forma móvil, al extremo o final del fondo del cuerpo del recipiente contenedor, de tal forma que, el citado tubo de extracción, pueda utilizarse directamente como un tubo primario de muestreo, a ser insertado en el interior de una placa de soporte de muestras de analizadores automáticos, a continuación de la retirada del citado casquete del fondo y del giro del citado cuerpo del recipiente contenedor. El dispositivo dado a conocer en la patente europea EP 1 366 715, permite una manipulación conveniente de una cantidad definida de muestra de heces, y tiene la ventaja de que, después de una apropiada extracción, el tubo, puede emplazarse directamente en el soporte de muestras de un analizador automático.

Un segundo ejemplo de una dispositivo de muestreo de heces, sofisticado, el cual es apropiado para un muestreo manipulación convenientes de una muestra de heces, es el que describe en el documento de patente internacional WO 03/068 398.

La muestra de heces, se utiliza o se procesa, de una forma preferible, directamente después del muestreo, o bien se almacena enfriándola ó, de una forma preferible, ésta se almacena congelándola. Las muestras de heces congelada, puede procesarse mediante descongelación, seguido de la dilución en un tampón apropiado, procediendo a mezclar y a centrifugar. Los sobrenadantes, se utilizan como muestra líquida, para la medición subsiguiente en el marcador S100A12.

Un alícuoto de la muestra de heces procesada, se incuba con el agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo de agente de enlace o unión de S100A12. Tales tipos de condiciones, no necesitan ser especificadas, debido al hecho de que, el artesano experto en el arte especializado de la técnica, puede identificar fácilmente, sin ningún esfuerzo inventivo, tales tipos de condiciones apropiadas de incubación.

Como etapa final, en concordancia con el procedimiento dado a conocer en la presente invención, la cantidad de complejo, se mide y se correlaciona a la diagnosis del CRC. Tal y como apreciará el artesano experto en el arte especializado de la técnica, existen numerosos procedimientos para medir la cantidad de agente del complejo de enlace o unión específico de S100A12, todos ellos, descritos en detalle en libros de texto relevantes (compárese, por ejemplo, Tijssen P., citado anteriormente, arriba, o Diamandis et al. (eds.), Immunoassay, Academia Press, Boston (1966).

De una forma preferible, la S100A12, se detecta en un formato de ensayo del tipo "sándwich" o emparedado. En tal tipo de ensayo, se utiliza un primer agente de enlace o unión específico, para capturar la S100A12, por un lado, y un segundo agente de enlace o unión específico, el cual se encuentra marcado para detectarse directamente o indirectamente, por otro lado.

Los anticuerpos de la S100A12, pueden utilizarse para la valoración del CRC, en otros procedimientos, como por ejemplo, para detectar las células del cáncer colorrectal in situ, en biopsias, o procedimientos inmunohistológicos de tinción.

De una forma preferible, se utiliza un anticuerpo a la S100A12, en inmunoensayo cualitativo (S100A12 presente o ausente) o cuantitativo (se determina la cantidad de S100A12).

Tal y como se ha mencionado anteriormente, arriba, de una forma sorprendente, se ha encontrado el hecho de que, la S1210A12, puede medirse a partir de una muestra de heces, obtenida de una muestra procedente de un individuo. No ser requiere ninguna muestra de tejido ni ninguna biopsia para aplicar el marcador S100A12, en la diagnosis del CRC.

Mientras que la aplicación de procedimientos proteómicos de rutina a muestras de tejidos, como por ejemplo, al comparar tejido sano y tejido canceroso, conduce a la identificación de muchos candidatos marcadores potenciales, para el tejido/la enfermedad seleccionados, estos marcadores candidato, solamente se encuentran en la circulación, de una forma accidental y en raros casos. De una forma sorprendente, los inventores de la presente invención, han sido capaces de detectar la proteína A100A12, en una muestra de heces. Éstos han ha sido también capaces de demostrar el hecho de que, la presencia de la S100A12, en tal tipo de muestra de heces, obtenida de un individuo, puede correlacionarse a la diagnosis del cáncer colorrectal.

Se ha encontrado también el hecho de que, la presencia o la ausencia de la S100A12, en tales tipos de muestras, obtenidas de un individuo, pueden correlacionarse a la presencia o ausencia de cáncer colorrectal, en un paciente. La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para la exclusión del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo, b) procesar la citada muestra de heces, para obtener una muestra líquida, c) contactar la citada muestra líquida, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12, d) utilizar la ausencia de un complejo, en (c), como un indicador para la ausencia del cáncer colorrectal.

Tal y como apreciará un artesano experto en el arte especializado de la técnica, un resultado positivo par la S100A12, en una muestra de heces, no tiene porqué necesariamente significar que un paciente tiene CRC. No obstante, un valor positivo para la S100A12, en una muestra de heces, debería ser considerada con un claro indicador de corte, para garantizar diagnósticos adicionales y más sofisticados. En una forma preferida de presentación, un valor positivo para la S100A12, que ha sido medido a partir de una muestra de heces, se utiliza como un indicador de que, al paciente, debería ofrecérsele investigaciones adicionales, especialmente, un colonografía tomográfica virtual computerizada (VCTC - de sus iniciales en inglés -[virtual tomographic colonography]-). De una forma preferible, un valor positivo en una muestra de heces, se utiliza como un indicador de que, la colonoscopia, como la siguiente etapa en el examen (de diagnóstico) de un paciente, está justificada.

La medición del nivel de proteína S100A12, ha probado ser muy ventajosa en el sector del CRC. Así, por lo tanto, en una forma de presentación adicionalmente preferida, la presente invención, se refiere al uso de la proteína S100A12, como una molécula marcadora en la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces obtenida de un individuo.

El término molécula marcadora, se utiliza para indicar el hecho de que, la presencia de un analito de S100A12, ó un nivel incrementado de éste, que haya sido medido a partir de una muestra de heces procesada, obtenida de un individuo, marca la presencia de CRC. Obviamente, el marcador de S100A12, puede medirse mediante cualesquiera medios apropiados, y en presencia de un valor medido utilizado en la valoración del CRC.

Tal y como resultará obvio para el artesano experto en el arte especializado de la técnica, la presente invención, no debe interpretarse como limitándose a las mediciones de la proteína S100A12 de longitud total de la SEQ IND NO: 1. Los fragmentos fisiológicos de la S100A12, pueden también medirse y utilizarse como un marcador para CRC, mientras se practica la presente la invención. Los fragmentos inmunológicamente detectables, comprenden, de una forma preferible, por lo menos 6, 7, 9, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos contiguos del citado polipéptido marcador. Una persona experta en el arte especializado de la técnica, reconocería el hecho de que, las proteínas que se liberan mediante las células o que se encuentran presentes en la matriz extracelular, pueden dañarse, por ejemplo, durante la inflamación, y pueden degradarse o dividirse en tales tipos de fragmentos. Tal y como apreciará el artesano experto en el arte de la técnica, la S100A12 ó fragmentos de ésta, pueden también encontrarse presentes como parte de un complejo. Tal tipo de complejo, puede también utilizarse como un marcador, en el sentido de la presente la invención. Adicionalmente, o de una forma alternativa, el polipéptido S100A12, puede portar una modificación post-traducción, y tal S100A12 modificada, puede también servir como un marcador del CRC.

Los fragmentos artificiales de la S100A12, pueden utilizarse, por ejemplo, como un control positivo, en un inmunoensayo o como un inmunogen. Los fragmentos artificiales, abarcan, de una forma preferible, a un péptido sintéticamente producido o producido por técnicas recombinantes, consistente en por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 12 ó por lo menos 15 aminoácidos contiguos, que se derivan de la secuencia dada a conocer en la SEQ ID: NO:1. De una forma preferible, tal tipo de fragmento artificial, comprende por lo menos un epítope de interés para el diagnóstico. También, de una forma preferible, el fragmento artificial, comprende por lo menos dos epítopes de interés, y es apropiado para su uso como un control positivo en un inmunoensayo del tipo sándwich.

Es preferible, el utilizar el nuevo marcador de S100A12, en la diagnosis temprana del cáncer colorrectal. No obstante, tal y como apreciará el artesano experto en el arte especializado de la técnica, la S100A12, de forma distinta a otros marcadores, será también de una gran ventaja en el diagnóstico y seguimiento de pacientes que ya sufren de un CRC, en etapas más avanzadas de la progresión del tumor.

La concentración de S100A12, se correlaciona, de una forma íntima, con la carga tumoral, en el CRC. El marcador, es por lo tanto también apropiado para el seguimiento de pacientes con CRC, después del tratamiento. En una forma preferible de presentación, el nuevo marcador de S100A12, se utiliza en el seguimiento de pacientes que sufren de CRC. Mediante la medición del CRC, regularmente, por ejemplo, a intervalos de 3 meses, 6 meses o anualmente, puede medirse la progresión el tumor y/o si fuere el caso, la recidiva del tumor.

Un incremento o reaparición de la S100A12, por encima de un valor de corte normal, se consideran como indicativos para una progresión tumoral del CRC, o para una recidiva tumoral, respectivamente. Una forma adicionalmente preferida de presentación, se refiere, por lo tanto, a un procedimiento de valoración mediante una medición in vitro, de un paciente que sufre de cáncer colorrectal, después de la cirugía, para la eliminación de la lesión cancerosa, comprendiendo, el procedimiento, las etapas de a) proporcionar una muestra de heces, obtenida del citado paciente, b) contactar la citada muestra, con un agente de enlace o unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12, c) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa (b), y d) correlacionar la cantidad de complejo determinado en (c), a la recidiva o progresión de cáncer colorrectal. La medición de la S100A12, a partir de una muestra de heces, es especialmente de utilidad y, en una forma preferida de presentación, se utiliza en la detección temprana de una recidiva tumoral del CRC, en el tracto gastrointestinal.

El colon, así como el recto, son ambos parte del tracto gastrointestinal. Ahora que se ha mostrado el hecho de que, la S100A12, de la forma más probable, será de utilidad en el rastreo exploratorio de pacientes con cáncer colorrectal, es muy probable que, la presencia de la S100A12, en una muestra de heces, pueda también utilizarse como un auxiliar de diagnóstico, en la valoración de otros tipos de cáncer gastrointestinal. En una forma adicionalmente de presentación, la presente invención, se refiere al uso de la S100A12, medida a partir de una muestra de heces, en la valoración de un tumor gastrointestinal. De una forma preferible, la S100A12, medida a partir de una muestra de heces, se utiliza, también, en la valoración de un tumor en el estómago. Las mediciones de la S100A12, a partir de una muestra de heces, pueden ser de utilidad, y así, por lo tanto, representa una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, en la detección temprana de la recidiva de un tumor gastrointestinal, dentro del tracto gastrointestinal.

El uso de la proteína S100A12, en sí mismo, representa un significativo progreso en el desafiante sector de la diagnosis del CRC, a partir de las heces. La combinación de las mediciones de la S100A12, con otros marcadores conocidos, como la hemoglobina o el complejo hemoglobina/haptoglobina, o con otros marcadores del CRC, a ser todavía descubiertos, conduce y puede conducir, respectivamente, a otras mejoras adicionales en la valoración del CRC. Así, por lo tanto, en una forma adicional de presentación, la presente invención, se refiere al uso de la S100A12, como una molécula marcadora para el cáncer colorrectal, en combinación con una o más moléculas marcadoras, para el cáncer colorrectal, en la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces, obtenida de un individuo. Otros marcadores de CRC seleccionados de una forma preferida, con los cuales puede combinarse la medición de la S100A12, son los consistentes en la TIMP-1, la calprotectina, la piruvato-quinasa (M2-PK) tumoral, la hemoglobina y/o el complejo hemoglobina/haptoglobina.

Como una forma de presentación adicionalmente preferida, la presente invención, da a conocer el uso de la proteína S100A12, como una molécula marcadora, para el cáncer colorrectal, en combinación con una o más moléculas marcadoras para el cáncer colorrectal, seleccionadas de entre el grupo consistente en el complejo hemoglobina/haptoglobina, hemoglobina, tejido inhibidor de metalo-proteasas 1 (TIMP-1), calprotectina, y piruvato-quinasa M2 (M2-PK) tumoral.

En una forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12 y TIMP-1, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

En una forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12 y hemoglobina, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

En una forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12 y el complejo hemoglobina/haptoglobina, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

En una forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12 y piruvato-quinasa M2 (M2-K2) tumoral, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

En todavía otra forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12, TIMP-1 y hemoglobina, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

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En todavía otra forma preferida de presentación, la presente invención, se refiere al uso de una combinación de marcadores, que comprende los marcadores S100A12, TIMP-1 y complejo hemoglobina/haptoglobina, en la valoración del CRC, a cuyo efecto, ambos marcadores, se miden a partir de una muestra de heces.

TIMP-1 (= activador 1 plasminógeno de tejido)

Las metaloproteinasas matrices (MIMP's), juegan un rol interpretativo fundamental, en el crecimiento y extensión o propagación del cáncer, contribuyendo a la degradación enzimática de la matriz extracelular. Los inhibidores de origen natural de las MMP's, se denominan inhibidores de tejido de la MMP's ó TIMP's. Los TIMP's, forman apretados o íntimos complejos estequiométricos 1 : 1, con las formas activadas de los MMP's, inhibiendo, con ello, la actividad catalítica de estas enzimas.

Se han descrito un gran número de inmunoensayos unidos a enzimas, para la detección del TIMP-1 (Kodama, S., et al., Matrix 9 (1989) 1-6; Cooksley, S., et al., Matrix 10 (1990) 285-291; Clark, I.M., et al., Matrix 11 (1991) 76-85) y TIMP-2 (Fujimoto, N., et al., Clin. Chim. Acta 220 (1993) 31-45). Estos ensayos, se han aplicado a fluidos corporales, como por ejemplo, suero, plasma, fluido amnióatico, fluido cerebro-espinal y orina. No puede encontrarse ninguna fecha en el arte de la técnica especializada, que demuestre la presencia de TIMP-1, en una muestra de heces. No se encuentran fechas disponibles, en el arte de la técnica especializada, indicativas del hecho de que, la presencia de TIMP-1, en una muestra de heces, pudiera ser de utilidad clínica.

Los reactivos de diagnosis, en el sector de ensayos de unión específicos, como los inmunoensayos, usualmente, se proporcionan, del mejor modo, en forma de un equipo a modo de "kit", el cual comprende un agente de unión específico, y los reactivos auxiliares requeridos para realizar el ensayo. La presente invención, por lo tanto, se refiere, también, a un equipo, a modo de "kit", que comprende por lo menos un agente de unión específico para la S100A12, y reactivos auxiliares para la medición de la S100A12.

La precisión de un test de ensayo de diagnóstico, se describe, a menudo, por mediación de sus características operadoras del destinatario (ROC) (véase, especialmente, Zweig, M.H. y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). El gráfico ROC, es un trazado de la totalidad de los pares de sensibilidad/especificidad, resultantes de variar continuamente el umbral de decisión entre la gama correspondiente a los márgenes de los datos observa-
dos.

El rendimiento clínico de un test de laboratorio, depende de su precisión de diagnóstico, o de la capacidad de clasificar correctamente, sujetos, en subgrupos clínicamente relevantes.

La precisión del diagnóstico, mide la capacidad del test de ensayo, para distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados, tales tipos de condiciones son, por ejemplo, salud y enfermedad o benigno versus enfermedad maligna.

En cada caso, el gráfico ROC, representa el solapado de dos distribuciones, mediante el trazado de la sensibilidad con respecto a la especificidad para la gama completa de los umbrales de los márgenes de decisión. En el eje y, se encuentra la sensibilidad, o la fracción positiva cierta [definida como (número de resultados de tests de ensayo positivos ciertos)(número de tests de ensayo positivos ciertos + número de tests de ensayo falsos negativos)]. A esto se le ha hecho también referencia como positividad, en presencia de una enfermedad o trastorno. Ésta, se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x, se encuentra la fracción falso negativo, ó 1 - especificidad [definida como (número de resultados falsos positivos)/(número de resultados de negativos ciertos + número de resultados de falsos positivos)]. Éste, es un índice de especificidad y se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado. Puesto que, las fracciones de positivos ciertos y de falsos positivos, se calculan enteramente por separado, mediante la utilización de estos tests de ensayo, procedentes de dos subgrupos diferentes, el registro gráfico ROC, es independiente del predominio de la enfermedad en la muestra. Cada punto del registro gráfico ROC, representa un par sensibilidad/1-especificidad, correspondiente a un umbral de decisión particular. Un test de ensayo con una discriminación perfecta (sin solapado en las dos distribuciones de resultados), tiene un registro gráfico ROC, que pasa a través de la esquina superior izquierda, en donde, la fracción positivo cierto, es 1,0 ó 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción falso positivo, es 0 (especificidad perfecta). El registro gráfico perfecto para un test de ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados, para los dos grupos), es una línea diagonal de 45º, desde la esquina inferior izquierda a la esquina superior derecha. La mayoría de los registros gráficos, se encuentran entre estos dos extremos (si el registro gráfico ROC se encuentra completamente por debajo de la línea en diagonal de 45º, esto se remedia fácilmente mediante la inversión del criterio para "positividad", de "mayor de" a "menos de", o viceversa). De una forma cualitativa, cuanto más cercano se encuentra el registro gráfico, con respecto a la esquina superior izquierda, mayor es la exactitud o precisión total del test de ensayo.

Un objetivo conveniente para cuantificar la exactitud de diagnóstico, en un test de ensayo de laboratorio, es el consistente en expresar sus prestaciones técnicas, mediante un número individual. La medida global más usual, es la correspondiente al área que se encuentra bajo el registro gráfico ROC. Por convención, esta área, es siempre \geq 0,5 (si no lo es, pueden invertirse las reglas de decisión, para que así sea). Los valores, se encuentran comprendidos dentro de unos márgenes situados entre 1,0 (separación perfecta de los valores de test de ensayo de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia aparente de la distribución entre los dos grupos de valores de test de ensayo). Esta área, no depende únicamente de una porción particular del registro gráfico, tal como el punto más cercano a la diagonal, o la sensibilidad a un 90% de especificidad, sino del registro gráfico entero. Éste es una expresión descriptiva, cuantitativa, de cuan cercano es el AUC, con respecto al perfecto (área = 1,0).

Se ha procedido a valorar la utilidad clínica del nuevo marcador S10012, en comparación con el marcador establecido de hemoglobina, y en combinación con éste, utilizando un análisis de la curva operador destinatario (ROC); Zweig, M. H. y Campbell, G. Clin. Chem. 39 (1993) 561 - 577). Este análisis, se ha basado en muestras derivadas de cohortes de pacientes, bien conocidos, tal y como se proporcionan en la sección de los ejemplos.

Se ha encontrado que, el procedimiento de diagnóstico basado en la medición de la S100A12, sola, en comparación con el marcador hemoglobina solo, tiene por lo menos una precisión de diagnóstico (perfil de sensibilidad/especificidad), como el que se demuestra mediante el área que se encuentra por debajo de la curva.

El procedimiento de diagnóstico basado en la medición de la S100A2, sola, en comparación con el marcador establecido hemoglobina solos, según se ha encontrado, tiene por lo menos una precisión de diagnóstico (perfil de sensibilidad/especificidad), tan buena, como la que se demuestra mediante el área por debajo de la curva.

Los ejemplos, figuras y listados de secuencias que se listan, listados, se proporcionan para ayudar en la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance, se expone en las reivindicaciones adjuntas.

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Descripción de las figuras

Figura 1

Análisis de transferencia Western

Se procedió a analizar tejido normal, para cuatro pacientes con CRC, mediante transferencia Western, utilizando anticuerpo policlonal contra S100A12. La proteína recombinante expresada en E. coli, como proteína 6xHis-tagged, se utilizó como control positivo. La diferencia en el modelo patrón de migración de la proteína recombinante, viene causada por la 6xHis-tag comprendida aquí. Se procedió a recuperar tejido normal, de pacientes, cuando el tumor se había extirpado quirúrgicamente. M: peso molecular; r.p. proteína recombinante; N: tejido normal.

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Figura 2

Gráfico ROC

Se proporciona el gráfico de las características de operación del destinatario (ROC) para la valoración de 23 muestras obtenidas de un paciente con CRC, comparadas con 18 muestras obtenidas de individuos sanos.

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Figura 3

Gráficos de dispersión de las concentraciones de S100A12 en pacientes con CRC

Efecto de los iones Ca^{2+} en las S100A12 en muestras de heces. Los extractos de heces, se diluyeron en ausencia (figura 3a) o presencia (figura 3b) de iones Ca2+. Las concentraciones detectables, son más altas, en presencia de iones Ca^{2+}, y se encuentran distribuidas en una zona o rango dinámico incrementado.

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Abreviaciones

ABTS

Sal diamónica de 2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolinsulfonato (6)]

BSA

Albúmina de suero bovino

cDNA

DNA complementario

DMSO

Dimetilsulfóxido

DTT

Ditiotreitol

EDTA

Ácido etilen-diaminotetraacético

ELISA

Ensayo inmunosorbente ligado a una encima

ESI

Ionización por electroespray

FCS

suero de ternero fetal

IAA

Yodoacetamida

IgG

Inmunoglobulina G

LC

Cromatografía líquida

MS

Espectrografía de masas

MES

mesitil,2,4,6-trimetilfenilo

PAGE

electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS

Suero salino tamponado de fosfato.

IEF

Focalización isoeléctrica

PI

Punto isoléctrico

POD

Peroxidasa del rábano salvaje

RTS

Sistema de traducción rápida

SDS

Dodecilsulfato de sodio

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Ejemplo 1

Identificación de la S100A12, como marcador potencial de cáncer colorrectal Fuentes de tejido

Con objeto de identificar proteínas específicas de tumores, como marcadores potenciales de diagnóstico, para el cáncer colorrectal, se procede a realizar análisis de tres diferentes clases de tejido, utilizando procedimientos proteómicos.

En total, se procede a analizar espécimen de tejido procedente de 10 pacientes que sufren de cáncer colorrectal. Se procede a recolectar tres diferentes tipos de tejido, de cada paciente, procedente de resecciones terapéuticas: tejido tumoral (> 80% tumor) (T), tejido sano contiguo o adyacente (N), y mucosa retirada de la mucosa sana contigua (M). Los dos últimos tipos de tejidos, sirven como ejemplos de control, sanos, emparejados. Los tejidos, se congelan inmediatamente en breve tiempo, después de la resección, y se almacenan a una temperatura de -80ºC, antes de procesarlos. Los tumores, se diagnostican mediante criterios histopatológicos.

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Preparación del tejido

Se procede a colocar 0,8 - 1,2 g de tejido, en un mortero, y se congela completamente, mediante nitrógeno líquido. El tejido, se pulveriza en el mortero, se disuelve en el volumen 10 veces más grande (peso/volumen) de tampón de lisis (40 mM citrato de Na, 5 mM MgCl_{2}, 1% Genapol X-080, 0,02% Azida de Na, Complete® exento de EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. Nº 1 873 580] y, subsiguientemente, se homogeneiza en un homogeneizador de vidrio del tipo Wheaton® (20 x carga suelta, 20 x carga apretada). Se procede a someter 3 ml del homogeneizado, a centrifugación por densidad de sucrosa (10 - 60% de sucrosa), durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a 4.500 x g. Después de esta etapa de centrifugación, se obtienen tres fracciones. La fracción en la parte superior del gradiente, contiene las proteínas solubles, para análisis posterior.

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Preparación de muestras para análisis de LC-ESI-MSMS

La concentración de proteína de la fracción soluble de proteína se determina utilizando el ensayo de proteína consistente en el Bio-Rad® protein assay (Cat.No.500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany), siguiendo las instrucciones del manual de proveedor. A un volumen correspondiente a 200 \mug, se le añaden 4 ml de tampón de reducción (9 M urea, 2 mM DTT, 100 mM KH2PO4, pH 8,2 NaOH), y se procede a incubar durante un transcurso de tiempo de 1 hora. La solución, se concentra a 250 \mul, en un dispositivo del tipo Amicon® Ultra 10 kD device (Millipore GmbH, Schwalbach, Germany). Para la alquilación, se transfieren 250 \mul, a un ml de tampón de alquilación (9 M urea, 4 mM yodoacetamida, 100 mM KH_{2}PO_{4}, pH 8,2 NaOH), se procede a incubar durante un transcurso de tiempo de 6 horas y, a continuación, se concentra en un dispositivo del tipo Amicon® Ultra 10 kD, a un volumen de 250 \mul. Para el lavado, se procede a añadir 1 ml de urea 9 M, y de nuevo, se procede a concentrar en un dispositivo del tipo Amicon® Ultra 10 kD, a 250 \mul. Se procede a repetir el lavado, tres veces.

Para la digestión de proteasa, la solución concentrada, se diluyen a urea 2,5 M, y se incuba con 4 \mug de tripsina (Proteomics grade - grado proteómico -, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), durante el transcurso de toda la noche. La digestión, se para, mediante la adición de 1 ml de ácido fórmico al 1%, y se analiza.

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Análisis LC-ESI-MSMS

El digesto tríptico (500 \mul), se separa en un sistema de dos dimensiones del tipo Nano-HPLC-System (Ultimate, Famos, Switchos; LC Packings, Idstein, Germany), consistente en una SCX y una columna RP Pepmep C18 (LC Packings, Idstein, Germany). Las 11 fracciones de SCX (elución por etapas, con 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1.500 mM NH_{4}Ac), se separaron adicionalmente, sucesivamente, en la columna de RP, con un gradiente de de 90 minutos (5-95% acetonitrilo), y se analizaron en línea, utilizando exploraciones dependientes de los dato, con una trampa iónica de ESI-MS (LCQ deca XP; Thermo Electron, Massachusetts, USA; véase la Tabla 2, par los parámetros). Para cada muestra, se realizan tres pasadas. Los datos brutos, se procesan con un sistema de software informático del tipo Bioworks 3.1 (Thermo Electron, Massachusetts, USA), utilizando los parámetros listados en la Tabla 2. Se procedió a combinar las listas resultantes de los péptidos y proteínas identificados, a partir de pasadas de replicados.

La proteína S100A12, se identifica mediante la ayuda de las secuencias parciales proporcionadas en la Tabla 3.

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Detección de la S100A12, como un marcador potencial, para el cáncer colorrectal

Para cada paciente, las proteínas identificadas y número de los péptidos correspondientes procedentes de la muestra del tumor, se comparan, con los resultados correspondientes procedentes de tejido normal contiguo, y de tejido de mucosa normal, desnuda. Mediante estos medios, se encuentra que, la proteína S100A12, se encuentra específicamente expresada, o fuertemente sobreexpresada, en tejido tumoral, y no se encuentra expresada, o se encuentra expresada de una forma menos fuerte, en tejido de control sano. Ésta se califica, por lo tanto - entre otras muchas proteínas - como un marcador candidato, para uso en la diagnosis del cáncer colorrectal.

La proteína S100A12, se encontraba fuertemente sobre-expresada, en tejidos tumorales procedentes de pacientes que sufrían de un cáncer colorrectal. Las siguientes secuencias peptídicas, de la proteína S100A12, se identificaron con Bioworks 3.1, a partir de datos de LCQ-MS^{2}, en tejido tumoral.

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TABLA 2 Adquisición de datos de MS/MS y parámetros de búsqueda mediante Bioworks 3.1

2

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TABLA 3 Secuencias encontradas

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Las dos secuencias peptídicas anteriormente presentadas, arriba, han sido identificadas como secuencias parciales de la S100A12. La secuencia (i), representa las posiciones de aminoácidos desde el aminoácido 2 hasta el aminoácido 21 de la SEQ ID NO: 1, y la secuencia (ii), representa las posiciones de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 24 de la SEQ ID: 1, respectivamente.

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Ejemplo 2

Generación de anticuerpos a la proteína marcadora de cáncer colorrectal, A100A12

Se genera anticuerpo policlonal para la proteína marcadora S100A12 de cáncer colorrectal, para el uso adicional de la medición de la S100A12, en una muestra de suero, plasma, sangre y, especialmente, en una muestra de heces. Tales tipos de mediciones de la S100A12, se realizan, por ejemplo, mediante ensayos de inmunodetección, por ejemplo, de Transferencia Western y ELISA.

Expresión de proteína, recombinante, en E. coli

Con objeto de generar anticuerpos a la S100A12, se procede a realizar expresión recombinante de la proteína, para la obtención de inmunógenos. La expresión, se realiza aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En una primera etapa, la secuencia de DNA, se analiza, y se obtienen recomendaciones para un alto rendimiento productivo de variantes mutacionales silenciosas de cDNA, y las respectivas secuencias de cebadores de PCR, utilizando el sistema de "ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio comercial basado en una web informática de Internet (www.proteoexpert.com). Utilizando los pares de cebadores recomendados, se usa el sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Cat. nº 3186237), para generar moldes de PCR lineales, a partir de cDNA, y para la transcripción y expresión in-vitro de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína S100A12. Para la detección de Transferencia de Western, y purificación posterior, la proteína expresada, contiene un His-tag. La mejor variante expresante, se identifica. Todas las etapas, desde la PCR hasta la expresión y detección, se llevan a cabo en concordancia con las instrucciones del fabricante. El respectivo producto de PCR, que contiene todas las regiones reguladoras de T7 necesarias, (promotor, sitio de enlace ribosómico, y terminador de T7), se clonan en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, Cat. nº K 43001/01), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión, utilizando las secuencias reguladoras de T7, la construcción, se transforma en E. coli BL 21 (DE 3)(Studier, F.W., et al., Methods Ezymol. 185 (1990) 60 - 89) y, las bacterias transformadas, se cultivan en 1 l de batch (lote) para la expresión de proteínas.

La purificación de la proteína de fusión His- S100A12, se realiza siguiendo procedimientos Standard, en una columna de quelato de Ni. En resumen, se procede a granular, mediante centrifugación, 1 l de cultivo de bacterias que contiene el vector de expresión para la proteína de fusión His- S100A12. El gránulo celular, se suspende de nuevo en tampón de lisis, que contiene fosfato de Na 50 mM, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mg/ml de Lysozyme, 2 x Complete (exento de EDTA) y DNasa, seguido de disrupción celular, utilizando una prensa del tipo "Frech press" (modelo: IUL, Basic Z). Se procede a granular el material insoluble, mediante centrifugación a alta velocidad y, el sobrenadante, se aplica a una columna cromatográfica de quelato de Ni. La columna, se lava con varios volúmenes de lecho de tampón de lavado (50 mM fosfato de Na, pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol. Finalmente, el antígeno enlazado, se aísla, utilizando un tampón de elución, el cual contiene 10 mM fosfato de Na, pH 8,0, 300 mM NaCl, con un gradiente lineal de 20 a 500 mM imidazol.

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Producción de anticuerpos monoclonales contra la S100A12 a) Inmunización de ratones

Se procede, inicialmente, a inmunizar, intra-peritonealmente, ratones A/J de 12 semanas de edad, con 100 \mug de S100A12. Esto viene seguido, después de un transcurso de tiempo de 6 semanas, de dos inmunizaciones intraperitoneales, a intervalos mensuales. En este proceso, a cada ratón, se le administran 100 \mug de S100A12, adsorbidos en hidróxido de aluminio, y 10^{9} gramos de Bordetella pertussis. Subsiguientemente, las dos últimas inmunizaciones, se llevan a cabo por vía intravenosa, en el 3^{er.} y 2º día antes de la fusión, utilizando 100 \mug de S100A12, en tampón de PBS, para cada una.

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b) Fusión y clonación

Células del bazo, de los ratones inmunizados en concordancia con a), se fusionan con células de mieloma, en concordancia con Galfre, Gl, y Milstain, C, Methods in Ezymology, - Procedimientos en enzimología -, 73 (1981) 3 - 46. En el proceso correspondiente a este procedimiento, se procede a mezclar aproximadamente 1*10^{8} células del bazo del ratón inmunizado, con 2x10^{7} células de mieloma (P3X63Ag8-653, ATCC CRL1580), y se centrifugan (10 minutos, a 300 x g, y a una temperatura de 4ºC). A continuación, se procede a lavar las células, una vez, con medio RPMI 1640, sin suero de ternero fetal (FCS) y se centrifugan otra vez, a 400 x g, en un tubo cónico, de 50 ml. El sobrenadante, se deshecha, el sedimento de células, se suelta suavemente mediante golpecitos, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 4.000, Merck, Darmstad) y se mezcla mediante pipeta. Después de un transcurso de tiempo de 1 minuto, en un baño de agua, a una temperatura de 37ºC, se procede a añadir 5 ml de RPMI 1640, sin FCS, mediante procedimiento de goteo, a la temperatura ambiente, en un transcurso de tiempo de 4 - 5 minutos. A continuación de ello, se procede a añadir 5 ml de RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS, por procedimiento de goteo, en un transcurso de tiempo de aproximadamente 1 minuto, se mezcla íntimamente, se llena a 50 ml con medio (RPMI 1640 + 10% FCS) y, a continuación, se centrifuga, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a 400 x g, y a una temperatura de 4ºC. Las células sedimentadas, se recogen en medio RPM 1640, que contiene un 10% de FCS, y se siembran en un medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmol/l hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% FCS). Se procede a añadir interleucina 6, a 100 U/ml, al medio, como factor de crecimiento.

Después de un transcurso de tiempo de aproximadamente 10 días, los cultivos primarios, se someten a test de ensayo, para anticuerpo específico. Los cultivos primarios S100A12-positivos, se clonan en placas de cultivo de 96 hoyos, por mediación de un clasificador de células activado mediante fluorescencia. En este proceso, se añade interleucina 6, otra vez, a 100 U/ml, al medio, como factor de crecimiento.

c) Aislamiento de inmunoglobulina a partir de sobrenadantes del cultivo de células

Las células de hibridoma obtenidas, se siembran a una densidad de 1 x 10^{5} células por ml, en medio de cultivo RPMI 1640, que contiene un 10% de FCS, y proliferan durante un transcurso de tiempo de 7 días, en un fermentador (Thermodux Co, Wetheim/Main, Modelo MCS-104XL, nº de pedido 144-050). Se obtienen, de media, en el cultivo de sobrenadante, concentraciones de 100 \mug de anticuerpo monoclonal por ml. La purificación de este anticuerpo, a partir del cultivo del sobrenadante, se lleva a cabo mediante medios convencionales en la química de la proteínas (por ejemplo, según Bruck C., et al., Methods in Enzymology, - Procedimientos en enzimología -, 121 (1986) 587 - 596).

Generación de anticuerpos policlonales a) Inmunización

Para la inmunización, se procede a preparar una emulsión fresca de solución de proteína (100 \mug/ml de proteína S100A12), y adyuvante de Freund, completo, a un valor de relación de 1:1. Cada conejo, se inmuniza con un 1 ml de la emulsión, en los días 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrae sangre y, el suero anti- S100A12 resultante, se utiliza para experimentos adicionales, tal y como se describen en los ejemplos 3 y 4.

b) Purificación de igG (inmunoglobulina G) a partir de suero de conejo, mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico

Se procede a diluir un volumen de suero de conejo, con 4 volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). El pH, se ajusta a un valor de 4,5, con base Tris 2M. Se añade ácido caprílico (25 \mul/ml de muestra diluida), por procedimiento de goteo, bajo una agitación vigorosa. Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, la muestra, se centrifuga (13.000xg, 30 minutos, 4ºC), se deshecha el gránulo, y se recolecta el sobrenadante. El pH del sobrenadante, se ajusta a un valor de 7,5, mediante la adición de base Tris 2M, y se filtra (0,2 \mum).

La inmunoglobulina en el sobrenadante, se precipita bajo la acción de una agitación vigorosa, mediante adición por procedimiento de goteo, de una solución de sulfato amónico 4 M, a una concentración final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas, se recolectan, mediante centrifugación (8.000xg, 15 minutos, 4ºC).

Se deshecha el sobrenadante. El gránulo, se disuelve en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl, y se dializa de una forma exhaustiva. El dializado, se centrifuga (13.000xg, 15 minutos, 4ºC), y se filtra (0,2 \mum).

Biotinilación de IgG del conejo

Se procede a llevar IgG policlonal del conejo, a 10 mg/ml, en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl. Se procede a añadir, por ml de solución de IgG, 50 \mul de Biotin-N-hidroxisuccinamida (3,6 mg/ml en DMSO). Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, la muestra, se cromatografía sobre Superdex 200 (10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). La fracción que contiene igG biotinilizada, se recolecta. Los anticuerpos monoclonales, se biotinilizan en concordancia con el mismo procedimiento.

Digoxigenilación de IgG del conejo

Se procede a llevar IgG policlonal del conejo, a 10 mg/ml, en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl. Se procede a añadir, por ml de solución de IgG, 50 \mul de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocapróico (Roche Diagnostis, Mannheim, Alemania, Cat. nº 1 333 054)(3,8 mg/ml en DMSO). Después de un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, la muestra, se cromatografía sobre Superdex 200 (10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). La fracción que contiene igG digoxigenilizada, se recolecta. Los anticuerpos monoclonales, se marcan con digoxigenina, en concordancia con el mismo procedimiento.

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Ejemplo 3

Transferencia Western, para la detección de la S100A12, en tejido de cáncer colorrectal humano, y tejido sano, respectivamente

Se procede a preparar lisados de tejido, a partir de muestras de tumores, y muestras de control sanas, tal y como se describe en el ejemplo 1, "Preparación del tejido".

Se procede a realizar SDS-PAGE y transferencia Western, utilizando reactivos y equipamiento de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Para cada muestra de tejido sometida a test de ensayo, se procede a diluir 10 \mug de lisado de tejido, en tampón de muestra en SDS de NuPAGE® de reducción (Invitrogen) y se calienta, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 95ºC. Las muestras, se ensayan sobre geles de NuPAGE® al 4 - 12% (Tris-glicina), en el sistema de tampón de ensayo de MES. Los polipéptidos separados por gel, se transfieren, sobre membranas de microcelulosa, utilizando el módulo de transferencia del tipo Invitrogen XCEll II® Blot Module (Invitrogen), y el sistema de tampón de transferencia de NuPAGE®. Las membranas, se lavan 3 veces, en PBS/0,05% Tween-20 y se bloquean con tampón de bloqueo Roti®Block (A141.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania), durante un transcurso de tiempo de 2 horas. El anticuerpo primario, suero anti-S100A12 de conejo, policlonal (generación descrita en el ejemplo 2), se diluye a 1:10.000 en tampón de bloqueo Roti®-Block,y se incuba con la membrana, durante un transcurso de tiempo de 1 hora. Las membranas, se lavan 6 veces, en PBS/0,05% Tween-20. El anticuerpo primario de conejo, específicamente enlazado, se marca con un anticuerpo anti-IgG de conejo, policlonal, de oveja, diluido a 10 mU/ml, en 0,5 x tampón de bloqueo Roti®-Block. Después de la incubación, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, las membranas, se lavan 6 veces en PBS/0,05% Tween-20. Para la detección del anticuerpo anti-conejo POD-conjugado, la membrana, se incuba con el Substrato de transferencia Western Lumi-Light^{PLUS} (Nº de pedido, 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), y se expone a una película anti-radiográfica.

Cuando el tejido tumoral y el tejido normal, se derivan de individuos diagnosticados con CRC, se someten a transferencia, de la forma descrita, se detecta una alta expresión de la S100A12, en el tejido tumoral, mientras que, no se encuentra S100A12, ó mucho menos S100A12, respectivamente, en un tejido normal (Figura 1).

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Ejemplo 4

Procesado de un espécimen de heces Extracción de detergente

a) Se procede a recolectar aproximadamente 1 g de heces por muestra, de los pacientes, en un dispositivo especial de muestreo, de la firma Sarsted, Alemania, nº de pedido 80.623.022, se congelan y se almacenan a una temperatura de -70ºC. Para el análisis, las muestras de heces, se descongelan, se procede a diluir por un factor de diez, 100 mg de muestra de heces, con un tampón fosfato, pH 7,5, suplementado Mini Complete exento de EDTA, un cóctel inhibidor de proteasa, de la firma Roche (nº de pedido: 11 873 580):

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Las muestras, se incuban durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente, mediante una agitación continua, y durante un transcurso de tiempo adicional de 1 hora más, sin agitación, a una temperatura de 4ºC. Después de la centrifugación, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a 3.000 x g, se procede a extraer el sobrenadante mediante pipeta y éste se filtra, utilizando un filtro de membranas, con tamaño de poro de 5 \mum. Las muestras se convierten en alícuotos, y se almacenan a una temperatura de -70ºC. Un alícuoto de esta muestra de sangre procesada, se utiliza para la cuantificación de S100A12, mediante ELISA.

Extracción de urea

Con objeto de mejorar las mediciones de la S100A12 y de otros marcadores de interés, en muestras de heces, se utiliza un "tampón de extracción optimizado". Para el procesado de muestras de heces, se prepara, de una forma fresca, el tampón de extracción, mediante la adición de cóctel inhibidor de proteasa (Mini Complete EDTA-free, Roche, Alemania) al siguiente tampón:

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Las muestras de heces, se descongelan, y se procede a transferir 50 - 100 mg de cada muestra, a un equipo, a modo de "kit", de preparación de muestras fecales (nº de cat. 10745804, Roche, Alemania). Se añade tampón de extracción optimizado, en concordancia con el peso de las muestras de heces, para proporcionar una dilución de un factor de 50. la muestras, se mezclan vigorosamente, en un agitador orbital, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos. Los sobrenadantes, se filtran, utilizando un filtro de 5 \mum de corte (Ultrafree®s CL, Millipore, Alemania), se convierten en alícuotos, y se almacenan para análisis adicional, a una temperatura de -70ºC. Estos extractos de heces, son apropiados para todos los biomarcadores de interés, en este estudio.

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Ejemplo 5

ELISA para la medición de la S100A12 en un espécimen de heces humanas

Para la determinación de la S100A12, procedente de las heces, en suero humano o plasma, se desarrolló un ELISA sándwich. Se producen anticuerpos policlonales del conejo, mediante inmunización con S100A12 recombinante, de longitud completa, expresado en E. coli. La fracción de Ig del antisuero, purificada, se biotiniliza o se digoxigeniliza, para ser utilizada para establecer un ELISA sándwich, utilizando placas de estreptavidina, de 96 hoyos (Streptawell, HighBind, Roche, Alemania). Las muestras de heces, se diluyen a 1:25, en un tampón de dilución de las muestras (100 mM Tris, pH 8,0, 2 mM CaCl_{2}, 1,5% KCl, 0,3% Triton X-100, 0,2% caseína, 2% sacarosa) y 50 \mul de muestra o patrón standard, se transfieren a cada hoyo. Subsiguientemente, se inicia la formación del complejo antígeno - anticuerpo, mediante la adición de 50 \mul de una mezcla de anticuerpo, que contiene 0,5 \mug/ml de anticuerpo policlonal digoxigenilitado PAB<S100A12>Dig, en un tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, 0,1 IgG bovina, 0,9% NaCl, 0,5% Thesit, 1% PEG 40.000, 0,1% igG bovina, 0,025% gammaglobulina bovina acetilada). Las placas, se incuban durante un transcurso de tiempo de 50 minutos, se lavan tres veces, con 350 \mul de tampón de lavado por hoyo (100 mM PBS, pH 7,4, 0,05 TWENN-20). A continuación, se añaden 25 mU/ml de conjugado MAB<Dig>POD (Roche Diagnostics, Alemania), por pozo, y se procede a incubar, durante un transcurso de tiempo adicional de otros 60 minutos. Después de este lavado de tres veces, con 350 \mul de tampón de lavado, por hoyo, se añaden 100 \mul de solución ABTS (Roche Diagnostics, Alemania), por hoyo, y, las placas, se incuban durante un transcurso de tiempo de 60 minutos. Se procede a medir la absorbencia, a 405/620 nm, utilizando un lector de ELISA (SLT.Spectra II). Para la calibración, se utiliza S100A12 de longitud total, recombinante.

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Ejemplo 6

Estabilidad de analitos en extracto de urea

La S100A12, parecer ser más estable, que la hemoglobina, en los extractos de heces preparados utilizando el procedimiento de extracción descrito en 4b. Cuando los extractos de heces se almacenan durante un transcurso de tiempo de 1 ó 3 días, a la temperatura ambiente, la recuperación media, para la S100A12, es mayor, y parece mostrar menos dispersión que la recuperación media de la hemoglobina. De las 20 muestras utilizadas para valorar la estabilidad, dos son hemoglobina-negativas.

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TABLA 4 Recuperación, después del estrés de temperatura

7

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Ejemplo 7

Utilidad clínica de la S100A12, en el cáncer colorrectal

La utilidad clínica de la S100A12, se valora, procediendo a analizar muestras de heces, obtenidas de cohortos de pacientes, bien caracterizados. Para cada paciente, se miden dos muestras de heces, procedentes del mismo movimiento intestinal, y se analizan las concentraciones. Se mide la correlación de ambas concentraciones, mediante el coeficiente de correlación de Pearson, revelando una íntima correlación. Con objeto de mejorar la sensibilidad del ensayo, se procede a medir la concentración máxima en una de las dos muestras emparejadas, para un análisis adicional. El valor de diagnóstico de la S100A12, se evalúa mediante análisis ROC, en concordancia con Zweig et al. (Citado anteriormente, arriba).

Se procede a extraer muestras de heces de las primeras dos poblaciones de estudio, en concordancia con el ejemplo 4a. Para la dilución, se utiliza suero salino tamponado, pH 7,4, 1,0 M CaCl_{2}, 1,2 mM ácido nitrilotriacético, 1,0 albúmina de suero bovino. Las muestras de heces de la tercera población de estudio, se extraen, en concordancia con el ejemplo 4b, y se diluyen con el tampón de dilución, según se describe en el ejemplo 5. A pesar de los diferentes procedimientos de extracción, el procedimiento ELISA utilizado para la medición de la S100A12, es idéntica, para todas las poblaciones de pacientes (comparar con el Ejemplo 5).

Primer estudio de población

Se procede a obtener muestras de heces de 18 pacientes exentos de CRC, 10 pacientes diagnosticados con adenoma positivo, mediante colonoscopia, y 23 pacientes diagnosticados con CRC progresado, clasificado con las etapas II y IV, según la clasificación de UICC.

Se realiza un análisis ROC, en concordancia con Zweig, M. H., y Campbell, citado anteriormente, arriba. Se encuentra que, el poder discriminatorio para diferenciar pacientes, en el grupo de CRC, de los individuos sanos, según se mide mediante el área que se encuentra por debajo de la curva, es del 97%, para CRC versus controles sanos (figura 2), del 85% para CRC + adenoma versus controles sanos y del 57% para adenoma versus controles sanos, respectivamente.

El efecto positivo de la presencia del Ca^{2+}, en la determinación de la S100A12, a partir de las heces, se ilustra en la figura 3. Cuando los extractos de heces se diluyen en el suero salino tamponado con fosfato, pH 7,4, 0,1% albúmina de suero bovino, en ausencia de ambos, el CaCl_{2} y el ácido nitrilotriacético, se detectan concentraciones más bajas de S100A12 (Figura 3a), si se comparan con las concentraciones de S100A12, medidas en presencia de CaCl_{2} y ácido nitrilotriacético (Figura 3b). El rango dinámico más reducido de ELISA, en ausencia de Ca^{2+}, conduce, también a un valor de AUC reducido, del trazado gráfico ROC, del 94%, para el CRC versus controles sanos, mientras que, con el sistema de tampón mejorado, se observa un valor de AUC del 97%. Si se considera CRC + adenoma versus controles sanos, el valor de AUC, es del 81%, sin Ca^{2+}, y del 85%, en presencia de CaCl_{2} y ácido nitrilotriacético, respectivamente.

Segundo estudio, ampliado, de población

Se obtienen muestras de heces, de 10 pacientes diagnosticados como adenoma-positivo, mediante colonoscopia, 50 pacientes diagnosticados como CRC (9 clasificados como etapa I, según clasificación de la UICC; 4 clasificados como etapa II, según clasificación de la UICC; 21 clasificados como etapa III, según clasificación de la UICC; 13 clasificados como etapa IV, según clasificación de la UICC; 2 clasificados como etapas I a III, según la clasificación de la UICC, es decir, no pertenecientes a la etapa IV; y 1 CRC, sin ninguna clasificación), y 50 controles (7 procedentes de pacientes con otra enfermedad GI, es decir, no CRC; 16 procedentes de pacientes con diverticulosis; 8 procedentes de donantes clasificados como GI-sanos; y 19 procedentes de pacientes que sufrían de hemorroides). Se procede a medir la S100A12, según se describe anteriormente, arriba, en una muestra de heces, obtenida de cada uno de estos individuos.

Se realiza un análisis ROC, en concordancia con Zweig, M. H., y Campbell, mencionados anteriormente, arriba. Se encuentra que, el poder discriminatorio para diferenciar pacientes, en el grupo de CRC, de los individuos sanos, según se mide mediante el área que se encuentra por debajo de la curva, es del 90%, para CRC versus controles sanos, del 86% para CRC + adenoma versus controles sanos y del 66% para adenoma versus controles sanos, respectivamente. Esto es indicativo del hecho de que incluso se detectan las etapas tempranas, según la clasificación de la UICC, si se mide la S100A12, a partir de una muestra de heces.

Tercer estudio de población

Se procede a medir la S100A12, en un tercer estudio de población, más extenso (para las características de los pacientes, compárese la Tabla 5). Se recoge, de una forma prospectiva, un alto número de muestras bien caracterizadas desde el punto de vista clínico, en marco de trabajo del estudio multi-central. Los pacientes (que experimentan una colonoscopia) para el control colectivo, se reclutan en unidades de gastroenterología, y representan una población de rastreo de exploración de riesgo medio. Los pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino y con cualquier tipo de adenoma, se excluyen de del control colectivo. Debido al reducido predominio de pacientes con cáncer colorrectal, en una población de rastreo de exploración, las muestras procedentes de pacientes con cáncer, se recolectan en diferentes unidades quirúrgicas. La diagnosis del cáncer colorrectal, se confirma, por parte de un médico, que proporciona, también, la clasificación patológica para cada paciente con cáncer. Con objeto de valorar cualquier predisposición que pueda introducirse mediante un proceso común de diagnóstico de pacientes con una prueba FOBT (prueba de sangre oculta en las heces - [FOBT = de sus iniciales en inglés] -), basada en guaiac, se recolecta, también, un rastreo exploratorio previo, de un sub-colectivo, sin una prueba FOBT basada en guaiac. Todos los pacientes que se detectan, debido a un sangrado rectal visible, se excluyen de este sub-colectivo, también, debido a que éstos introducirían una predisposición a la ventaja de la hemoglobina.

Se obtienen muestras de heces, de 252 individuos de control. De éstos, 135 se encuentran confirmados, mediante colonoscopia, que son GI-sanos, mientras que, las restantes muestras de control, cubren algunas enfermedades de GI relevantes. La población CRC, incluye 186 muestras de CRC, procedentes de pacientes de las etapas I - IV, según clasificación de la UICC (Tabla 6). Para 38 pacientes con CRC, la clasificación exacta, no se conoce. Así, por lo tanto, los pacientes con CRC, con una clasificación definida, según la UICC, en la Tabla 6, no suman para un total de 186 pacientes. En total, se evalúan 101 pacientes con CRC, sin un rastreo de exploración previo, mediante la prueba FOBT.

Se procede a medir la S100A12, según se ha descrito anteriormente, arriba. En una muestra de heces, obtenida de cada uno de estos individuos. Se realiza un análisis ROC, en concordancia con Zweig, M. H., y Campbell, mencionados anteriormente, arriba. Se encuentra que, el poder discriminatorio para diferenciar pacientes, en el grupo de CRC, de los individuos sanos, según se mide mediante el área que se encuentra por debajo de la curva (Tabla 6), es del 94%, para CRC versus todos los controles, así como también de un 94% para CRC sin un rastreo de exploración previa versus controles. El agrupamiento de pacientes con CRC, por etapas de la enfermedad, revela un área, bajo la curva, del l90%, para la etapa I según clasificación UICC, y del 96 - 97%, para las etapas II - IV, según clasificación UICC. No se detecta ninguna predisposición para una predisposición mediante un rastreo exploratorio FOBT, puesto que, el área bajo la curva de estos pacientes, es idéntica a la del área bajo la curva de la población total con CRC.

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TABLA 5 Características de los pacientes de la población del tercer estudio

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TABLA 6 Análisis ROC de la tercera población de estudio

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Ejemplo 8

Combinaciones e la S100A12 con otros marcadores de heces

Se procede a evaluar las combinaciones de la S100A12, con otros biomarcadores de extractos de heces. Los marcadores hemoglobina, hetero-complejo de hemoglobina con haptoglobina, Calprotectina, TIMP-1, M2PK y CEA, se miden utilizando el ELISAS comerciales. Los ensayos para el las mediciones de hemoglobina, hemoglobina/haptoglobina y calprotectina, se obtienen de la firma R-Biopharm, Alemania. La Calpro Calprotectina ELISA, se fabrica por parte de la firma Calpro S.A., Noruega, y se comercializa, fuera de Alemania, como test de ensayo "PHiCal® test". El ensayo para M2-PK, se suministra por parte de Schebo Biotech, Alemania, y el ensayo para TIMP-1, por parte de la firma R&D Systems, Estados Unidos de América, respectivamente. Mientras que, algunos de los ensayos, están previstos para mediciones en extractos de heces, para dos ensayos, a saber, CEA y TIMP-1, de una forma usual, no se utilizan las heces, como material de muestra. Así de este modo, los ensayos, deben ajustarse a las mediciones del correspondiente analito, en una muestra que represente un espécimen extraído heces. La muestras (extractos de heces), se pre-diluyen a un valor de 20, para las determinaciones de CEA, pero, de otro modo, el ensayo, se realiza en concordancia con las recomendaciones del fabricante. De una forma similar, las muestras, se pre-diluyen a un valor de 3, para la medición del TIMP-1, sin cambiar el procedimiento de ensayo, en sí mismo.

Para ensayar si una combinación de marcadores mejorará la diagnosis para CRC, los marcadores, se combinan mediante Nayes Logistic Regression (BRL. En el algoritmo BLR, para la evaluación de las combinaciones de marcadores, se utiliza, previamente, una distribución de Gaus, y se implementa en un sistema software informático de Alexander Genkin, David D. Lewis, y David Madigan (Regresión logística Bayesiana, a gran escala, para categorización de textos. Technometrics). Se utiliza la siguiente composición o ajuste: ninguna selección automática de características, previamente, fijación de la variancia a un valor de 0,05, no se ajusta ningún umbral, y estandarización de entrada, mediante normalización. Para el proceso numérico, se retienen, incambiables, las composiciones o ajustes por defecto, a un umbral de 0,0005, 1000 interacciones y modo de no precisión. Los resultados con el algoritmo básico, se evalúan mediante 100 pasadas en un diseño de validación cruzada de Monte-Carlo. En cada pasada, se seleccionan dos tercios de todos los casos y controles, respectivamente, como juego o conjunto de preparación, vía la muestra aleatoria con la función construida en su interior de Matlab® R2006, con un valor de partida de 19022007, para el generador de números aleatorios por defecto. El algoritmo básico, se aplica en el juego o conjunto de preparación, para generar una regla de diagnóstico. Se procede a determinar un umbral en las probabilidades de casos posteriores estimados, en los controles del juego o conjunto de preparación, con objeto de lograr una especificidad del 95% ó del 98%, respectivamente. La regla de diagnóstico, se aplica, a continuación, al otro tercio de los datos, para estimar la sensibilidad o la especificidad al umbral dado.

Con objeto de evitar cualquier predisposición para la hemoglobina o hemoglobina/haptoglobina, en la valoración, se utilizan únicamente los 101 pacientes sin FOBT previa. Para el ensayo de rastreo exploratorio, no ricamente es relevante la AUC del gráfico ROC. Un requerimiento bastante crítico en el ajuste del rastreo exploratorio, es una sensibilidad lo suficientemente buena, a una alta especificidad. La alta especificidad, es crucial, debido al hecho de que, una baja especificidad, provocaría un alto número resultados positivos falsos, acompañado de procedimientos innecesarios de seguimiento, y una angustia para los pacientes. La tabla 7, resume los valores de AUC de la evaluación, así como las sensibilidades a la presente especificidad del 95% y del 98%, respectivamente. Cuando algunos de los marcadores individuales medidos se combinan mediante BLR, los valores de UC para las diagnosis de CRC, son muy similares, dentro de unos márgenes de +/- 1%. Por otro lado, la sensibilidad total, en la detección del CRC, puede mejorarse de una forma significativa, mediante combinaciones de la A100A12, con otros marcadores, particularmente, a un nivel de especificidad de un 98%. Mientras que, la A100A12 sola, tiene una sensibilidad del 67%, las combinaciones de marcadores, incluyendo los dos marcadores, la A100A12 y el complejo hemoglobina/haptoglobina, exhiben una sensibilidad del 79% y, la mejor combinación de marcadores, incluyendo la A100A12, el complejo hemoglobina/haptoglobina y TIMP-l, muestra un incremento adicional del 82%, en sensibilidad, al mismo nivel de especificidad. Estas combinaciones de marcadores, se consideran como muy importantes, con objeto de detectar el CRC, especialmente, el CRC en etapas tempranas o precoces. Tal y como resulta obvio, a raíz de la Tabla 7, de una forma particular, un cáncer, en la etapa I, se detecta en una tasa mucho mayor, mediante la utilización de una combinación de marcadores. El uso del marcador A100A12, es clave, para un ROC mejorado, obtenido con estas combinaciones de marcadores.

TABLA 7 Combinaciones de marcadores para la detección del CRC

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<110> Roche Diagnostics GmbH

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F. Hoffmann-La Roche AG

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<120> Uso de la S100A12, como marcador para cáncer Colorrectal

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<130> 23747 WO

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<150> EP 06010439

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<151> 2006-05-19

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<160> 1

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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Claims (9)

1. Un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo,

b) contactar la citada muestra, con un agente de unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

c) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa b) y

d) correlacionar la cantidad de complejo formado en (c), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

2. Un procedimiento para la diagnosis del cáncer colorrectal, que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra de heces, obtenida de un individuo,

b) contactar la citada muestra líquida, con un agente de unión específico para la S100A12, bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

c) contactar la citada muestra líquida, con un segundo agente de unión específico para un segundo marcador, seleccionado de entre el grupo consistente en un complejo de hemoglobina/haptoglobina, hemoglobina, tejido inhibidor de metaloproteasas 1 (TIMP-1) y piruvato-quinasa M2 tumoral (M2PK), bajo unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre el citado agente de enlace o unión y la S100A12,

d) detección de la cantidad de complejo formado en las etapas (b) y (c), y

e) correlacionar la cantidad de complejo determinado en la etapa (d), a la diagnosis del cáncer colorrectal.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en donde, el citado segundo marcador, es hemoglobina.

4. El procedimiento según la reivindicación 2, en donde, el citado segundo marcador, es el complejo de hemoglobina/haptoglobina.

5. El procedimiento según la reivindicación 2, en donde, el citado segundo marcador, es TIMP-1.

6. El procedimiento según la reivindicación 2, en donde, el citado segundo marcador, es M2-PK.

7. Uso de la proteína S100A12, como molécula marcadora en la diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces obtenida de un individuo.

8. Uso de la proteína S100A12, como molécula marcadora en la diagnosis temprana del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces obtenida de un individuo.

9. Uso de la proteína S100A12, como molécula marcadora para el cáncer colorrectal, en combinación con una o más moléculas marcadoras distintas para el cáncer colorrectal, seleccionadas de entre el grupo consistente en complejo de hemoglobina/haptoglobina, hemoglobina, tejido inhibidor de metaloproteasas 1 (TIMP-1) y piruvato-quinasa M2 tumoral (M2PK), en diagnosis del cáncer colorrectal, a partir de una muestra de heces obtenida de un individuo.