KR20090007454A

KR20090007454A - 결장직장암에 대한 마커로서 단백질 ｓ100ａ12 의 용도

Info

Publication number: KR20090007454A
Application number: KR1020087028063A
Authority: KR
Inventors: 노르베르트 빌트; 헤르베르트 안드레스; 우르줄라 가르크차렉; 안드레아 가이슈탄거; 마리에-루이제 하그만; 요한 칼; 프리데만 크라우제; 미하엘 프페퍼; 볼프강 롤링거; 미하엘 타케; 미하엘 티에롤프
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2009-01-16
Also published as: DK2021794T3; US20090286328A1; MX2008014482A; AU2007251933B2; ATE471512T1; JP2009537798A; EP2021794A1; CN101449163A; US20150192587A1; EP2021794B8; PL2021794T3; HK1133295A1; JP4942813B2; EP2021794B1; DE602007007209D1; CA2651709A1; ES2347485T3; KR101147586B1; CN101449163B; US20170115294A1

Abstract

본 발명은 결장직장암의 진단에 관한 것이다. 본 발명은 결장직장암의 진단에서 단백질 S100A12 의 용도를 기재한다. 본 발명은 대변 샘플에서 S100A12 을 측정하여 개체로부터 유도된, 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단 방법에 관한 것이다. S100A12 의 측정은 예를 들어, 결장직장암의 초기 검출 또는 진단에 사용될 수 있다.

Description

결장직장암에 대한 마커로서 단백질 Ｓ100Ａ12 의 용도 {USE OF PROTEIN S100A12 AS A MARKER FOR COLORECTAL CANCER}

본 발명은 결장직장암의 진단에 관한 것이다. 본 발명은 결장직장암의 진단에서 마커 분자로서 단백질 S100A12 (=칼그래눌린 C (Calgranulin C)) 의 용도를 기재한다. 게다가, 이것은 특히 대변 샘플에서 S100A12 를 측정하여 개체로부터 유도된, 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단 방법에 관한 것이다. S100A12 의 측정은, 예를 들어 결장직장암의 초기 검출 또는 진단에 사용될 수 있다.

암은 검출 및 요법의 진전에도 불구하고 대중의 주요한 건강 문제로 남아있다. 다양한 유형의 암 중에서, 결장직장암 (=CRC) 은 서구에서 가장 흔한 암 중 하나이다.

암을 초기에 검출/진단할 수 있으면, 전체적인 생존률이 더욱 양호해진다. 이것은 특히 CRC 에 대해 사실이다. 진행된 단계의 종양에서 예후는 열악하다. 1/3 이 넘는 환자는 5 년 동안 약 40% 의 생존률에 해당하는, 진단 후 5 년 내에 진행된 질환으로 사망할 것이다. 현행 치료는 오직 일부분의 환자만을 치료하는 것이고, 명백하게 질환의 초기 단계로 진단된 환자들에게만 최적 효과가 있다.

대중의 건강 문제로서 CRC 과 관련하여, 결장직장암에 대한 더욱 효과적인 스크리닝 및 예방적 측정이 개발되는 것이 필수적이다.

결장직장암에 대해 현재 이용가능한 가장 빠른 검출에는 혈변 검사 또는 내시경 절차를 사용하는 것이 포함된다. 그러나, 유의한 종양 크기가 전형적으로 혈변이 검출되기 전에 존재해야만 한다. 대변 샘플로부터 CRC 의 검출과 관련하여, 당업계의 현 상태는 구아이악-기반 분변 잠혈 검사이다.

최근 수많은 양의 소위 결장 특이적 또는 심지어 소위 결장직장암 특이적 유전자라 불리는 유전자가 보고되고 있다. 해당하는 연구 논문 또는 특허 출원 대다수는 결장 (암) 조직 대 상이한 조직 또는 인접 정상 조직, 각각에서의 RNA 발현 패턴의 분석에 의해 수득된 데이터에 기반한다. 이러한 접근은 차별적 mRNA 디스플레이 기술로 요약될 수 있다.

mRNA-디스플레이 기술로부터 이용가능한 데이터에 대한 예로서, WO 01/96390 를 언급 및 논의해야한다. 상기 출원은 200 개가 넘는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 상응하는 폴리펩티드 뿐 아니라 CRC 검출에서의 그의 용도를 기재 및 주장하고 있다. 그러나, mRNA 수준 상의 차이는 해당하는 단백질의 수준에 의해 반영되지 않는다는 것이 일반적인 지식이다. 희귀한 mRNA 에 의해 코딩된 단백질이 매우 많은 양으로 발견될 수 있고, 풍부한 mRNA 에 의해 코딩된 단백질임에도 불구하고 전혀 검출 및 발견되지 않을 수 있다. mRNA-수준과 단백질 수준과의 이러한 상관성 결여는 mRNA 안정성, 번역의 효율, 단백질의 안정성, 등과 같은 이유로 인한 것이다.

또한 CRC 의 진단에 사용될 수 있을 후보 마커 분자를 확인하기 위해, 상이한 조직 간에 또는 건강한 조직과 질환 조직 간의 단백질 패턴을 조사하는 최근의 접근법이 있다. [Brunagel, G. et al., Cancer Research 62 (2002) 2437-2442] 에서, 주변 정상 조직과 비교해 CRC 조직에 더욱 풍부한 것으로 나타난 7 개의 핵 매트릭스 단백질이 확인되었다. 개체로부터 수득된 소변 및 대변 샘플로부터의 데이터는 보고되지 않는다.

WO 02/078636 호에는 표면-증강 레이저 탈착 및 이온화 (surface-enhanced laser desorption and ionization: SELDI) 에 의해 발견된 약 9 개의 결장직장암-관련 스팟이 보고된다. 상기 스팟은 건강한 대조군으로부터 수득된 혈청과 비교해 CRC 환자로부터 수득된 혈청에서 더욱 흔히 보인다. 그러나, 상기 스팟에 포함된 분자(들) 의 확인, 예를 들어, 그의 (그들의) 서열은 알려지지 않는다.

CRC 의 분야에서 후보 단백질 마커의 많고 지금까지 증가하는 목록에도 불구하고, 현재까지 상기 분자의 임상/진단 유용성은 공지되지 않았다. 임상적 유용성을 위해서는 단일 마커로서 신규 진단 마커가 당업계에 공지된 최상의 단일 마커에 필적할 정도로 적어도 양호해야만 한다. 또는, 신규 마커는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 마커와 조합으로 사용되는 경우 각각 진단 감수성 및/또는 특이성의 향상을 가져와야만 한다. 검사의 진단 감수성 및/또는 특이성은 하기에 더욱 상세히 기재될 그의 수용자-작동 특성에 의해 종종 평가된다.

현재, 예를 들어, 종양-관련 당단백질, 암배아 항원 (CEA) 의 검출에 근거한 진단 혈액 검사가 CRC 의 분야에서 진단을 돕기에 이용가능하다. CEA 는 결장직장암, 위암 및 췌장암 환자로부터 수득된 조직 샘플의 95% 및 대부분의 유방암, 폐암 및 머리 및 목 암종에서 증가되어 있다 (Goldenberg, D.M. et al., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22). 상승된 CEA 수준은 또한 비악성 질환 환자에서도 보고되어 있고, 많은 결장직장암 환자는 혈청에서, 특히 질환의 초기 단계 동안 정상 CEA 수준을 갖는다 (Carriquiry, L.A. and Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929; Herrera, M.A. et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J. et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451). 재발 검출에서의 혈청 또는 혈장에서 측정되는 CEA 의 유용성은 보도에 따르면 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못한다 (Martell, R.E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C.G. et al., JAMA 270 (1993) 943-947).

이용가능한 데이터의 견지에서, 혈청 CEA 측정은 무증상 집단에서 결장직장암에 대한 스크리닝 검사로서 사용하게 하는 감수성 또는 특이성 어느 쪽도 가지지 않는다 (Reynoso, G. et al., JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon, C, Clin. Chem. 48 (2002) 1151-1159).

대변으로부터 취해진 샘플은 그의 샘플링이 비-침습적 수단에 의해 용이하게 가능하는 장점이 있다.

상기 언급된 바와 같이, 구아이악 검사는 현재 대변으로부터의 CRC 에 대한 스크리닝 어세이로서 가장 널리 사용된다. 그러나, 구아이악 검사는, 열악한 감수성 뿐 아니라 열악한 특이성을 모두 갖는다. 구아이악-기반 분변 잠혈 검 사의 감수성은 ~26% 로, 이것은 악성 병반을 가진 환자의 74% 가 미검출로 남아있을 것임을 의미한다 (Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55).

전암성 및 암성 병반의 가시화는 초기 검출에 대한 최상의 접근법을 나타내지만, 결장경 검사는 상당한 비용, 위험 및 합병증으로 침해된다 (Silvis, S.E. et al., JAMA 235 (1976) 928-930; Geenen, J.E. et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235; Anderson, W.F. et al., J. Natl. Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133).

구아이악 검사에 대한 진단 대안의 감수성 및 특이성은 최근 [Sieg, A. et al., Int. J. Colorectal Dis. 14 (1999) 267-271] 에 의해 조사되어 왔다. 특히 대변 견본으로부터 헤모글로빈 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체의 측정이 비교된다. 헤모글로빈 어세이는 결장직장 신생물의 검출에 대해 만족스럽지 않은 감수성을 갖는 것으로 유념된다. 진행된 암종 단계의 암은 약 87% 의 감수성으로 검출되는 반면 더 초기의 종양 단계는 충분한 감수성으로 검출되지 않는다. 헤모글로빈-합토글로빈 복합체 어세이는 초기 단계 CRC 의 검출에 더욱 민감하였다. 상기 더욱 민감한 검출은 열악한 특이성을 동반하였다. 그러나 열악한 특이성은 결장경 검사와 같이 많은 수의 불필요한 2 차 조사로 이어지기 때문에, 열악한 특이성의 어세이는 또한 일반적으로 허용되는 스크리닝 어세이의 필요조건을 충족하지 못한다.

칼프로텍틴은 US 5,455,160 및 대응하는 과학 문헌 [Roseth, A.G., et al. (Scand. J. Gastroenterol. 27 (1992) 793-798; Scand. J. Gastroenterol. 28 (1993) 1073-1076)] 에서 대변 샘플로부터의 CRC 의 검출에 대한 대안적인 생마커로서 기재되었다. 칼프로텍틴이 염증성 질환의 마커임에도 불구하고, 대변으로부터의 CRC 의 검출에 대한 마커로서 그의 잠재성이 여러 공개문헌에 언급되었다 (Johne, B., et al., Scand. J. Gastroenterol. 36 (2001) 291-296; Limburg, P.J., et al., Am. J. Gastroenterol. 98 (2003) 2299-2305; Hoff, G., et al., Gut 53 (2004) 1329-1333). 칼프로텍틴의 감수성 및 특이성은 면역학적 헤모글로빈 어세이에 필적할만하면서, 칼프로텍틴은 헤모글로빈에 비해 진단 생마커에 호의적인 일부 특징을 갖는 것으로 보인다. 이것은 배설물에 균등하게 분포하고, 이것은 실온에서 안정하여 샘플을 실행가능한 연구실로 우편 전달하게 하며, 식품 성분 또는 약학 화합물을 방해하지 않는다 (Ton, H., et al., Clin. Chim. Acta 292 (2000) 41-54). 그러나, 칼프로텍틴, S100A8 및 S100A9 의 이종이량체의 상승된 농도가 CRC, 크론 질환 (Crohn's disease) 또는 염증성 장 질환 환자로부터의 대변 샘플에서 검출되었다. 이러한 결과는 염증에서 칼프로텍틴의 더욱 일반적인 역할과 일치한다 (Ryckman, C, et al., J. Immunol. 170 (2003) 3233-3242). 그러므로, 위장병학에서의 칼프로텍틴의 용도는 CRC 의 검출에 제한되는 것이 아니라 다른 질환, 특히 [Poullis, A., et al. (J. Gastroenterol. Hepatol. 18 (2003) 756-762)] 에 의해 검토되는 바와 같이 염증성 장 질환으로도 확장된다.

대변 중의 CRC 의 검출을 위한 구아이악 검사에 대해 추가적 대안 방법이 최 근 공개되었고, 대변 내로 탈피된 결장 세포에서 면역조직화학에 의해 결장직장암-특이적 항원, "미니염색체 유지 단백질 2" (MCM2) 의 검출로 이루어진다. 작은 연구 크기로 인해, 결장직장암의 검출을 위한 진단 값에 대한 결론은 예비적이다. 그러나, 시험은 우측 결장암을 검출하는 단지 제한된 감수성을 갖는 것 같다 (Davies, R.J. et al., Lancet 359 (2002) 1917-1919).

최근, 피루베이트 키나아제 M2 동종효소 (M2-PK) 의 검출을 위한 어세이가 시장에 도입되었다 (Schebo Biotech, Giesen, Germany). 구아이악 어세이 대 헤모글로빈 및 M2-PK 에 대한 면역 어세이의 비교를 예를 들어 [Vogel, T. et. al., Dtsch. Med. Wochenschr. 130 (2005) 872-877] 에 의해 수행하였다. 이들은 면역학적 어세이가 구아이악 검사보다 우세하고, 비교가능 특이성에서 M2-PK 어세이가 헤모글로빈 어세이에 비해 CRC 을 검출하는데 덜 민감하다는 것을 보여준다. 그러나, 저자는 상기 대변 기반 어세이 모두의 유용성이 여전히 의문의 여지가 있다고 결론내렸다.

신뢰성있는 암 검출을 가능하게 하거나 대변 시편으로부터 비-침습적 수단에 의해 초기 예후 정보를 제공하게 할 것인 초기 CRC 종양 마커의 확인은 상기 질환의 진단 및 관리에 큰 도움을 줄 진단 어세이를 야기할 수 있을 것이다. 그러므로, 특히 대변으로부터의 CRC 의 진단을 개선시키기 위해 시급한 임상적 요구가 존재한다. 초기 진단된 환자에 있어서, 생존 기회가 질환의 진행된 단계에서 진단받은 환자들과 비교해서 훨씬 높으므로, 특히 CRC 의 초기 진단을 개선하는 것이 중요하다.

신규 마커가 CRC 진단에 도움을 줄 수 있는 것으로 확인될 수 있는 지의 여부를 조사하는 것이 본 발명의 과제였다. 바람직하게는 이러한 마커는 대변에 존재할 것이고, 비-침습적 진단을 가능하게 할 것이다.

놀랍게는, CRC 에 대한 마커로서 단백질 S100A12 의 사용이 당업계에 공지된 문제를 적어도 일부 극복할 수 있다는 것을 발견하였다.

그러므로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법에 관한 것이다:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

c) 단계 (b) 에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계, 및

d) 단계 (c) 에서 측정된 복합체의 양을 결장직장암의 진단과 연관시키는 단계.

당업자가 인식할 것처럼, 이러한 S100A12 의 임의의 측정은 시험관 내에서 이루어진다. 환자 샘플은 이후 폐기한다. 환자 샘플은 본 발명의 시험관 내 방법에 단독으로 사용되고, 환자 샘플의 어떤 물질도 환자의 체내로 재도입되지 않는다. S100A12 의 측정 또는 CRC 의 평가 중 어느 것도 인간 또는 동물 신체 상에서 수행되지 않는다.

본 발명에 따른 시험관 내 진단 절차는 대변 샘플 내에 S100A12 의 부재, 존재 또는 상대적 농도를 평가하기 위해 사용된다. S100A12 에 대해 측정된 값은 임상의가 CRC 의 평가, 예를 들어, 임상적 진단의 확립 및/또는 적합한 치료에 대한 결정을 하도록 도울 것이다.

바람직한 구현예에서 대변 샘플을 가공하여 대변 시편보다 취급하기 더욱 편리한 가공된 샘플 액체를 수득한다. 그 다음 이러한 가공된 샘플을 S100A12 에 대한 특이적인 결합제와 인큐베이션한다. 그러므로 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법에 관한 것이다:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플을 가공하여 가공된 액체 샘플을 수득하는 단계,

c) 상기 가공된 액체 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및

d) 단계 (c) 에서 형성된 복합체의 양을 결장직장암의 진단과 연관시키는 단계.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예는 하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법이다:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 가공하여 가공된 액체 샘플을 수득하는 단계,

b) 상기 가공된 액체 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

c) 단계 (b) 에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계, 및

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, 상기 샘플과 헤모글로빈/합토글로빈 복합체, 헤모글로빈, 메탈로프로테아제 1 의 조직 억제제 (TIMP-1), 및 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK) 로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 마커에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 제 2 마커 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, S100A12 및 하나 이상의 제 2 마커에 대해 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계, 및 측정된 복합체의 양을 결장직장암의 진단과 연관시키는 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법을 기재한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 제 2 마커로서의 S100A12 및 헤모글로빈의 측정, 제 2 마커로서의 S100A12 및 헤모글로빈/합토글로빈 복합체의 측정, 제 2 마커로서의 S100A12 및 TIMP-1 의 측정, 및 제 2 마커로서의 S100A12 및 M2-PK 의 측정에 각각 기반한다. 당업자에게 명백하듯이, S100A12 의 측정 및 하나 이상의 제 2 마커의 측정은 대변 샘플 또는 가공된 대변 샘플의 동일한 분취물, 각각으로부터, 또는 환자의 대변 샘플의 상이한 분취물 또는 환자의 가공된 대변 샘플의 상이한 분취물, 각각으로부터 행해질 수 있다.

또다른 바람직한 구현예에서, 대변 샘플을 가공하여 결장세포를 회수하고, 그 다음 현미경 슬라이드 상에 도말한다. 그 다음 이러한 가공된 샘플을 S100A12 에 대한 특이적인 결합제와 인큐베이션한다. 그러므로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법에 관한 것이다:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플을 가공하여 결장세포를 회수하는 단계,

c) 상기 가공된 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및

단백질 S100A12 (=칼그래눌린 C) 은 SEQ ID NO: 1 로 제시된 서열을 특징으로 한다.

S100A12 은 또한 CAAF1; CAGC; 양수 내의 칼슘 결합 단백질; 칼그래눌린 관련 단백질; CGRP; 양수 내의 칼슘 결합 단백질 1; 칼그래눌린 C; ENRAGE (세포외 새롭게 확인된 RAGE 결합 단백질); 중성구 S100 단백질; S100 칼슘 결합 단백질 A12 로 불린다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 2 EF-핸드 (hand) 칼슘 결합 모티프를 함유하는 단백질의 S100 족의 일원이다. S100 단백질은 다양한 세포의 세포질 및/또는 핵에 위치하고, 세포 주기 진행 및 분화와 같은 다수의 세포 과정의 조절에 연관된다. S100 유전자에는 염색체 Iq21 상에 클러스터로 위치하는 13 개 이상의 일원이 포함된다. 상기 단백질은 특이적 칼슘-의존적 신호 전달 경로에 연관되는 것으로 제안되고, 세포골격 성분에 대한 그의 조절 효과는 다양한 중성구 활성을 조절할 수 있다.

S100A12 의 생리학적으로 관련된 구조는 Ca²⁺-결합 동종이량체이다. 또한 S100A12 가 세포로부터 방출되기 때문에, 세포외 기능이 예를 들어, 염증 과정의 조절에 기재되었다 (Foell, D. et al. Clin. Chim. Acta 344 (2004) 37-51). S100A8 (= 칼그래눌린 A) 및 S100A9 (칼그래눌린 B) 와 함께 S100A12 는, 칼그래눌린 단백질이 가용성 세포질 단백질 함량의 50% 이하를 구성하는 과립구에서 발현된다. 급성 염증시, S100A12 가 방출되며, 이것은 과민성 장 질환, 모르부스 크론 (Morbus Crohn), 가와사키 질환 (Kawasaki's disease) 또는 류마티스 관절염을 포함하는 상이한 질환에서 발견된다 (Burmeister, G. and Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230; Foell, D. et al., Rheumatology 42 (2003) 1383-1389). S100A12 반응의 신호 연속단계를 조사했을 때, 이것은 최종 당화 산물에 대한 수용체 (receptor for advanced glycated endproducts =RAGE) 를 통해 신규 염증 축에 연결되었다. 상기 수용체는 예를 들어, 내피 및 면역계 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에서 발견될 수 있다 (Hofmann, M.A. et al., Cell 97 (1999) 889 - 901; Schmidt, A. M. et al., J. Clin. Invest. 108 (2001) 949-955). 염증 반응에 포함되는 것 외에도, RAGE-경로는 또한 상처 치유, 종양 증식물 또는 전신아밀로이드증에서 기재되었다 (Hofmann, M.A. et al., supra; Schmidt, A.M. et al., supra; Yan, S.S. et al., Nat. Med. 9 (2003) 287-293; Hofmann, M.A. et al., Genes Immun. 3 (2002) 123-135). 그러므로, S100A12 는 다양한 범위의 효과를 가질 수 있을 것이다. 그러나, 종양 과정에 대한 관련성은 지금까지 기재되지 않았다.

바람직한 구현예에서, 신규 마커 S100A12 는 CRC 의 스크리닝에 사용된다. 환자 모니터링에 사용하는 경우, 본 발명에 따른 진단 방법은 종양 하중, 치료 효과 및 환자의 추적 조사시 종양 재발을 평가하는데 도움을 줄 수 있다. 증가된 수준의 S100A12 는 직접적으로 종양 적재와 관련된다. 화학요법 후 단기간 (수 시간 내지 14 일) S100A12 의 증가는 종양 세포 치사의 지표로서 담당할 수 있다. 수술 및/또는 화학요법 후 환자의 장기간 추적 조사시 (3 개월 내지 10 년) S100A12 의 증가는 결장직장에서의 종양 재발에 대한 지표로 사용될 수 있다.

바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 진단 방법은 스크리닝 목적에 사용된다. 즉, 이것은 대변 샘플 중의 S100A12 의 수준을 측정하여 측정된 수준을 CRC 의 존재 또는 부재와 관련시켜 CRC 의 이전 진단 없이 대상을 평가하는데 사용된다.

당업자가 쉽게 인식할 것처럼, 이러한 스크리닝 관리에서 적합한 양의 대변 샘플이 사용되도록 취해져야만 한다. 바람직하게는 정의된 양의 대변 샘플이 그 안에 포함된 S100A12 의 측정을 위해 사용된다. 바람직하게는 S100A12 의 양은 대변의 양 당 S100A12 의 양으로 표현되고, 즉, S100A12 의 상대적 농도로 제시된다.

진단 방법은 일반적 무증상 집단의 스크리닝 뿐 아니라, 고 위험 개체의 감시에 대해 대안적인 바람직한 구현예에서 사용할 수 있다. 이러한 고 위험 개체는 바람직하게는 철 결핍 빈혈증이 있는 개체, CRC-환자의 1 등급 친척, CRC 의 가족력을 가진 환자 및 새롭게 검출된 폴립 또는 위장관 신생물 내력을 가진 환자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

스크리닝 어세이에 대해, AUC 값 또한 관련된다. 스크리닝 설정에 꽤 중요한 필요조건은 충분히 높은 양호한 특이성 및 임상적으로 관련된 수준의 특이성이다. 고 특이성은 상기 필요조건이 만족되지 않는다면, 다수의 가 양성이 환자에게 불필요한 후속 절차 및 곤란을 야기할 것이기 때문에 중요하다. 다른 바람직한 구현예에서, 특이성 수준은 임상적으로 관련된 스크리닝 집단의 CRC-음성 개체와 비교해 96%, 97%, 98% 또는 99%, 각각으로 설정된다.

당업자가 인식할 것처럼, S100A12 에 대한 적절한 컷 오프 (cut off) 값은 건강한 정상 집단의 개체로부터 유래된 대변 샘플에서 측정된 바와 같은 S100A12-값에 근거하여 성립된다. 스크리닝 설정 중의 임상적으로 관련된 정상 집단은 바람직하게는 55 내지 65 세의 연령의 임상적으로 건강한 개체로 이루어진다. 성립된 컷-오프 값 초과의 대변 샘플 중의 S100A12-값은 CRC 에 대한 지표로 간주될 수 있거나 적어도 각 개체의 추가 진단 시험에 대한 보증일 수 있다.

결장직장암은 가장 종종 샘종 (폴립) 에서 악성 암종으로 진행한다.

암의 단계화는 범위, 진행 및 심각성에 대한 질환의 분류이다. 이것은 암 환자를 그룹화하여 예후 및 요법의 선택에 대해 일반화시킬 수 있다.

상이한 병기의 CRC 가 듀크 병기 A 에서 D (Dukes' stages A to D) 에 따라 분류되어 사용되었다. 오늘날, TNM 시스템은 가장 널리 사용되는 암의 해부학적 범위의 분류이다. 이것은 국제적으로 승인된, 균일한 단계 시스템을 나타낸다. 3 가지 기본 변수가 있다: T (1 차 종양의 범위), N (부위림프절의 상태) 및 M (먼 전이의 존재 또는 부재). TNM 병기는 UICC 에 의해 공개된다 (International Union Against Cancer), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, sixth edition, 2002). 일단 TNM 병기가 측정되면, 환자는 I 에서 IV (IV 가 가장 진행된 질환 단계임) 의 범위의 로마 숫자에 의해 표시되는 질환 단계로 그룹화된다. TNM 병기 및 UICC 질환 단계는 상기 Sobin L.H. 및 Wittekind (eds.) 에 의해 채택된 하기 표 1 에 제시되는 바와 같이 서로에 해당하였다.

표 1 : TNM 병기 및 UICC 질환 단계의 상호 관계

특히 중요한 것은, CRC 의 초기 진단이 훨씬 더 양호한 예후를 가져온다는 것이다. 결장직장의 악성 종양은 양성 종양, 즉 샘종으로부터 발생한다. 그러므로, 최상의 예후는 샘종 단계에서 진단된 환자들이 갖는다. 병기 T_is, N0, M0 또는 T1-3; N0; M0 와 같이 초기에 진단된 환자는, 적합하게 치료받는다면, 먼 전이가 존재할때 진단 받은 환자의 오직 10% 의 5 년 생존률에 비해 진단 후 생존 5 년의 90% 초과의 기회를 갖는다.

본 발명에 있어서, CRC 의 초기 진단은 전이가 전혀 (근접 = N0, 또는 먼 = M0 모두 없음) 존재하지 않는 종양 단계, 즉 병기 T_is, N0, M0 또는 T1-4; N0; M0 에서의 진단을 말한다. T_is 는 그 자리 암종을 나타낸다.

CRC 가 창자 벽을 통해 아직 완전히 성장하지 않아, 내장쪽복막이 관통되거나 다른 기관 또는 구조가 침입되지 않았을 때 진단되는 것이, 즉, 진단이 T_is; N0; M0 내지 T3; N0; M0 (=T_is-3; N0; M0) 중 임의의 단계에서 이뤄지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 진단 방법은 개체 유래의 대변 샘플에 근거한다. 대변 샘플이 추출되고 S100A12 가 특이적 결합제를 사용하여 상기 가공된 대변 샘플로부터 특이적으로 측정된다.

특이적 결합제는 예를 들어, S100A12 에 대한 수용체, S100A12 에 결합하는 렉틴, S100A12 에 대한 압타머, 또는 S100A12 에 대한 항체이다. 특이적 결합제는 그의 상응하는 표적 분자에 대해 10⁷ l/몰 이상의 친화성을 갖는다. 특이적 결합제는 바람직하게는 그의 표적 분자에 대해 10⁸ l/몰의 친화성 또는 더욱 바람직하게는 10⁹ l/몰의 친화성을 갖는다. 당업자가 인식할 것처럼, 용어 특이적은 샘플 중에 존재하는 다른 생분자가 S100A12 에 특이적인 결합제와 유의하게 결합하지 않는 것을 표시하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 표적 분자 외의 생분자에 대한 결합 수준은 표적 분자의 친화성의 오직 10%, 더욱 바람직하게는 오직 5% 이하인 결합 친화성을 야기한다. 가장 바람직한 특이적인 결합제는 친화성 뿐 아니라 특이성에 대한 상기 최소 범주 모두를 완수할 것이다.

특이적인 결합제는 바람직하게는 S100A12 에 반응성인 항체이다. 용어 항체는 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 그러한 항체의 분절 뿐 아니라 항체의 결합 도메인을 포함하는 유전적 구축물을 말한다. 특이적 결합제의 상기 범주를 보유하는 임의의 항체 분절이 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990) 전체 책, 특히 페이지 43-78, Elsevier, Amsterdam) 에 기재된 바와 같은 당업계의 절차에 의해 발생된다. 또한, 당업자는 항체의 특이적 단리에 사용할 수 있는 면역흡착 기재 방법을 인지한다. 상기 수단에 의해, 폴리클론 항체의 품질 및 그러므로 면역어세이 중의 그의 성능이 향상될 수 있다 (Tijssen, P., supra, 페이지 108-115).

본 발명에 기재된 바와 같은 달성을 위해 토끼에서 상승된 폴리클론 항체를 사용하였다. 그러나 명확하게 또한 다른 종, 예를 들어 래트 또는 기니 피그로부터의 폴리클론 항체 뿐 아니라 모노클론 항체도 사용할 수 있다. 모노클론 항체가 일정한 특성에 필요한 임의의 양으로 생성될 수 있으므로, 이들은 임상적 관례에 필요한 어세이의 개발에 이상적인 도구를 나타낸다. 본 발명에 따른 방법에서 S100A12 에 대한 모노클론 항체의 발생 및 용도는 또다른 바람직한 구현예이다.

당업자가 인식할 것처럼 이제, S100A12 는 CRC 의 진단에 유용한 마커로서 면역어세이에서 측정에 의해 확인되었고, 대안적인 방식이 본 발명의 달성에 필적할만한 결과에 도달하기 위해 사용될 수 있다. 마커 단백질 S100A12 는 임의의 적합한 방식에 의해 검출될 수 있고, CRC 의 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 바람직한 적합한 수단은 면역어세이 절차에 의한, 액체 크로마토그래피, 특히 고성능 액체 크로마토그래피에 의한, 전기영동, 특히 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting) 과 조합된 SDS-PAGE 에 의한, 그리고 질량 분광법에 의한 S100A12 폴리펩티드의 검출을 포함한다.

측정을 위해, 대변 샘플을 개체로부터 수득한다. 대변 샘플의 분취물은 직접적으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 대변 샘플의 분취물을 가공하여 액체 샘플을 산출한다. 가공된 대변 샘플은 추출 완충액으로 대변 샘플의 추출 시 수득된 액체 샘플이다.

대변 샘플의 가공은 업무에 최적화된 추출 완충액으로 달성된다. 이것은 적어도 하기 3 가지 기본 필요조건을 충족해야한다: 이것은 대변 매트릭스로부터 관심의 분석물 (analyte) 을 방출해야만 한다. 이것은 유리 분석물을 안정화해야만 한다. 이것은 분석물의 연이은 검출시 대변 매트릭스의 간섭을 최소화해야만 한다. 마커 조합이 추가적인 진단 잠재성을 유지할 수 있으므로, 최적화된 완충액은 하나의 특이적 생마커에 대해 뿐 아니라, 모든 관심의 분석물에 적용가능해야만 한다. 추출 완충액은 대변 샘플의 균질화 및 추출을 개선하기 위해 우레아를 함유할 수 있다. Ca²⁺ 는 Ca²⁺-결합 단백질의 안정화에 포함될 수 있다. S100 단백질이 Ca²⁺-결합 단백질로 알려져 있으므로, 추출 완충액은 이러한 단백질을 안정화시키기 위해 바람직하게는 Ca²⁺-이온을 함유할 것이다. 약한 킬레이트제는 반면 Ca²⁺-결합 단백질과 대변 매트릭스 사이에 이온 가교를 절단할 수 있도록 사용되어야만 한다. 그러나, 반면, 상기 Ca²⁺-복합체 작용제는 S100A12 로부터 Ca²⁺-이온의 박탈을 피하기에 충분히 약하게 Ca²⁺-이온에 결합한다. 바람직하게는 니트릴로트리아세트산 또는 시트레이트는 대변 추출 완충액에서 킬레이트제로서 사용된다. 최적화되고 바람직한 추출 완충액은 우레아, Ca²⁺-이온 및 킬레이트제를 함유한다. 바람직하게는 킬레이트제는 니트릴로트리아세트산 또는 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 최적화된 추출 완충액은 예를 들어, 실시예 4b 에서 제시되는 바와 같이 대변 샘플의 가공에 사용된다.

최적화된 추출 완충액을 맞춤 대변 샘플링 장치와 조합으로 사용하는 것이 가장 편리하다. 가장 편리한 방법에서, 개체가 정의된 양의 대변 샘플을 모으고, 이것을 안정화 추출 완충액으로 미리 채워진 수집물로 직접 옮긴다. 상기 편리한 샘플링 및 추출 방식은 분석물의 분해 없이 진단 실험실로의 시편의 수송을 가능하게 한다. 대변 샘플의 추출이 샘플링 장치에서 직접 달성될 수 있으므로, 필요한 취급 및 이동 절차가 감소된다.

여러 최근의 개발은 대변 샘플의 샘플링 및 취급을 용이하게 하는 장치에 초점을 맞추고 있다. EP 1 366 715 호에는 대변 샘플 수집용 특별 수집 튜브를 기재한다. 상기 추출 튜브는 본질적으로 하기 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다: (a) 내부가 비고, 상부로 열고, 완충액을 담을 수 있는 용기 본체, (b) 배설물 샘플의 수집용 실을 꿴 소형 막대가 제공된 상부 캡, 상기 실을 꿴 소형 막대는 상부 캡이 용기 본체의 상부 말단에 적용되는 경우, 용기 본체 내부에 축방향으로 돌출되어 있음, 및 (c) 상기 용기 본체 내부에 상부 챔버에서 바닥 챔버로 분리되도록 상기 용기 본체 내부의, 중간 위치에서 제공된 분할된 구획, 상기 분할된 구획은 상기 상부 챔버 내에 과량의 배설물을 보유하고 상기 소형 막대의 실을 꿴 부분을 상기 바닥 챔버로 통과시키도록 상기 실을 꿴 소형 막대가 통과할 수 있는 적합한 축 구멍을 가짐. 상기 추출 튜브는 추가로 바닥에서 열리고 용기 본체의 바닥 말단에 움직일 수 있게 적용될 수 있는 바닥 캡으로 제공된 용기 본체를 포함하여, 상기 추출 튜브가 자동 분석기의 샘플-홀더 플레이트 내에 삽입 후, 상기 바닥 캡의 제거 및 상기 용기 본체의 전복되는 1 차 샘플링 튜브로서 직접적으로 사용될 수 있게한다. EP 1 366 715 에 기재된 장치는 정의된 양의 대변 샘플의 편리한 취급을 가능하게 하고 적합한 추출 후 튜브를 자동 분석기의 샘플-홀더 내에 직접적으로 둘 수 있다는 장점을 갖는다.

대변 샘플의 편리한 샘플링 및 취급에 적합한 정교한 대변 샘플링 장치의 두번째 예는 WO 03/068398 에 기재되어 있다.

대변 샘플은 바람직하게는 샘플링 또는 저장된 냉각된 또는 더욱 편리하게는 저장된 냉동된 후 직접 사용 또는 가공된다. 냉동된 대변 샘플은 해동 후, 적합한 완충액 중의 희석, 혼합 및 원심분리로 가공할 수 있다. 상청액은 마커 S100A12 의 연이은 측정을 위한 액체 샘플로서 사용된다.

가공된 대변 샘플의 분취물을 결합제 S100A12-복합체의 형성에 적합한 조건 하에서, S100A12 에 대해 특이적 결합제와 인큐베이션한다. 이러한 조건은 당업자가 임의의 진보성 없이 이러한 적합한 인큐베이션 조건을 쉽게 확인할 수 있으므로, 구체적일 필요는 없다.

본 발명에 기재된 방법에 따른 최종 단계로서, 복합체의 양이 측정되고 CRC 의 진단과 연관된다. 당업자가 인식할 것처럼 관련 서적에 상세히 기재된 모든 특이적 결합제 S100A12-복합체의 양의 수 많은 측정 방법이 있다 (참조, 예를 들어, Tijssen P., supra, 또는 Diamandis et al. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)).

바람직하게는 S100A12 는 샌드위치 유형 어세이 포맷에서 검출된다. 이러한 어세이에서 제 1 특이적 결합제는 한 면 상에 S100A12 를 포획하는데 사용되고 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하게 표지된 제 2 특이적 결합제는, 다른 한 면에 사용한다.

S100A12 에 대한 항체는 또한 예를 들어, 생검 중 또는 면역조직화학 염색 절차 중의 제 자리 결장직장암 세포의 검출을 위한 다른 절차 중의 CRC 의 측정에 사용될 수 있다.

바람직하게는, S100A12 에 대한 항체는 정성적 (S100A12 존재 또는 부재) 또는 정량적 (S100A12 양을 검출함) 면역어세이에 사용된다.

상기 언급된 바와 같이, 놀랍게도 S100A12 가 개체 샘플로부터 수득된 대변 샘플로부터 측정될 수 있다는 것이 발견되었다. CRC 의 진단에서 마커 S100A12 를 적용하기 위해 어떠한 조직 및 생검 샘플도 필요가 없다.

예를 들어, 건강한 조직과 암성 조직의 비교에 의한 조직 샘플에 대한 정규 단백체학 방법의 적용이, 선택된 조질/질환에 대한 많은 잠재적 마커 후보의 확인을 야기하는 반면, 상기 마커 후보는 오직 우연하게, 그리고 흔치 않은 경우에 순환에서 발견된다. 놀랍게는, 본 발명의 출원인은 대변 샘플 중의 단백질 S100A12 를 검출하는 것이 가능하였다. 이들은 개체로부터 수득된 이러한 대변 샘플 중의 S100A12 의 존재가 결장직장암의 진단과 연관될 수 있다는 것을 증명할 수 있다.

또한 개체로부터 수득된 이러한 대변 샘플 중의 S100A12 의 존재 또는 부재가 환자에서 결장직장암의 존재 또는 부재와 연관될 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 결장직장암의 배재 방법에 관한 것이다: a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계, b) 상기 샘플을 가공하여 가공된 액체 샘플을 수득하는 단계, c) 상기 가공된 액체 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및 d) 단계 (c) 의 복합체의 부재를 결장직장암의 부재에 대한 지표로서 사용하는 단계.

당업자가 인식할 것처럼, 대변 샘플 중의 S100A12 에 대한 양성 결과가 반드시 환자가 CRC 를 갖는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 그러나, 대변 샘플 중의 S100A12 에 대한 양성 값이 추가적이고 더욱 정교한 진단을 정당화하는 명쾌한 지표로 간주되어야만 한다. 바람직한 구현예에서 대변 샘플로부터 측정된 바와 같은 S100A12 에 대한 양성 값이 환자가 추가 조사, 특히 시각적 컴퓨터 단층 대장검사 (VCTC) 또는 대장내시경검사를 받아야만 한다는 지표로서 사용된다. 바람직하게는, 대변 샘플 중의 양성 값은 환자의 (진단) 검사의 다음 단계로서 대장내시경검사가 정당화되는 지표로 사용된다.

단백질 S100A12 의 수준의 측정은 CRC 분야에서 매우 유리한 것으로 입증된다. 그러므로, 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 수득된 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단에서 마커 분자로서 단백질 S100A12 의 용도에 관한 것이다.

용어 마커 분자는 개체로부터 수득된 가공된 대변 샘플로부터 측정된 바와 같이 분석물 S100A12 의 존재 또는 증가된 수준이 CRC 의 존재를 표시하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 명백하게는 마커 S100A12 는 CRC 의 평가에 사용된 임의의 적합한 수단 및 존재 또는 측정된 값에 의해 측정될 수 있다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 의 전장 단백질 S100A12 의 측정에 제한되는 것으로 해석되서는 안된다. S100A12 의 생리학적 분절은 또한 본 발명의 실시 동안 CRC 에 대한 마커로서 측정 및 사용될 수 있다. 면역학적으로 검출가능한 분절은 바람직하게는 상기 마커 폴리펩티드의 적어도 6, 7, 8, 10, 12, 15 또는 20 개의 연속 아미노산을 포함한다. 당업자는 세포에 의해 분비되는 또는 세포외 매트릭스에 존재하는 단백질이, 예를 들어 염증 동안 손상될 수 있고, 이러한 분절로 분해 또는 절단될 수 있을 것이라는 것을 인지할 것이다. 당업자가 인식할 것처럼, S100A12 또는 그의 분절은 또한 복합체의 일부로서 존재할 수 있다. 이러한 복합체는 또한 본 발명의 문맥에서 마커로서 사용될 수 있다. 또한, 또는 대안적으로 S100A12 폴리펩티드는 번역-후 개질될 수 있으며, 이러한 개질된 S100A12 는 또한 CRC 의 마커로서 담당할 수 있다.

S100A12 의 인공적 분절은 예를 들어, 면역 어세이 중 양성 대조군으로 또는 면역원으로 사용될 수 있다. 인공적 분절은 바람직하게는 SEQ ID NO:1 에 기재된 서열 유래의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 12 개, 또는 적어도 15 개 연속 아미노산으로 이루어진 합성적으로 또는 재조합 기술에 의해 제조된 펩티드를 포함한다. 바람직하게는 이러한 인공적 분절은 진단 관심의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 또한 바람직한 인공적 분절은 관심의 2 개 이상의 에피토프를 포함하고, 샌드위치 면역어세이에서 양성 대조군으로 사용하기에 적합하다.

결장직장암의 초기 진단에 신규 마커 S100A12 를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자가 인식할 것처럼, 다른 마커와는 달리 S100A12 는 또한, 진단 및 종양 진행의 이미 더욱 진행된 단계에서 CRC 를 이미 갖고 있는 환자의 추적 조사에 큰 장점이 될 것이다.

S100A12 농도는 CRC 에서의 종양 적재와 밀접하게 연관된다. 그러므로 마커는 또한 치료 후 CRC 환자의 추적 조사에 적합하다. 바람직한 구현예에서, 신규 마커 S100A12 는 CRC 환자의 추적 조사에 사용된다. CRC 를 정기적으로, 예를 들어 3 개월, 6 개월 또는 1 년 간격으로 측정하여, 종양 진행 및/또는 종양 재발일 수 있는 경우를 평가할 수 있다.

정상 컷-오프 (cut-off) 값 S100A12 초과의 증가 또는 재-출현은 CRC 종양 진행 또는 종양 재발 각각에 대한 지표로 간주된다. 그러므로 추가의 바람직한 구현예는 암성 병반 제거 수술 후 결장직장암을 겪고 있는 환자에서 시험관 내 측정에 의한 평가 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 환자로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계, b) 상기 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, c) 단계 (b) 에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계 및 d) 단계 (c) 에서 측정된 복합체의 양을 결장직장암의 재발 또는 진행과 연관시키는 단계. 대변 샘플로부터의 S100A12 의 측정은 특히 유익하고, 바람직한 구현예에서, 위장관 내의 CRC 종양 재발의 초기 검출에 사용된다.

결장 뿐 아니라 직장 모두 위장관의 일부이다. S100A12 가 결장직장암에 대한 환자의 스크리닝에 가장 유용할 것 같기 때문에, 대변 샘플 중의 S100A12 의 존재가 다른 유형의 위장관 암의 평가에 진단 보조로서 사용될 수 있을 것이 매우 가능할 것 같다. 추가의 바람직한 구현예에서 본 발명은 위장관 종양의 평가에서 대변 샘플로부터 측정된 바와 같은 S100A12 의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 대변 샘플로부터 측정된 바와 같은 S100A12 는 또한 위 종양의 평가에 사용된다. 대변 샘플로부터의 S100A12 의 측정은 유익할 수 있어, 위장관 내 위장관 종양 재발의 초기 검출에 있어서 본 발명에 따른 바람직한 구현예를 나타낸다.

단백질 S100A12 그 자체의 용도는, 대변으로부터의 CRC 진단의 도전적인 분야에 대한 뚜렷한 진보를 나타낸다. S100A12 와 다른 공지된 마커, 헤모글로빈 또는 헤모글로빈-합토글로빈 복합체, 또는 CRC 의 다른 마커와의 조합 측정은 아직 발견되지 않고, 각각 CRC 의 평가에 있어서 추가 개선을 야기 및 야기할 수 있다. 그러므로 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체로부터 수득된 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단에서 결장직장암에 대한 하나 이상의 다른 마커 분자와 조합으로 결장직장암에 대한 마커 분자로서의 S100A12 의 용도에 관한 것이다. S100A12 의 측정이 조합될 수 있는 바람직한 선택된 다른 CRC 마커는 TIMP-1, 칼프로텍틴, 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK), 헤모글로빈 및/또는 헤모글로빈-합토글로빈 복합체이다.

추가의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 헤모글로빈/합토글로빈 복합체, 헤모글로빈, 메탈로프로테아제의 조직 억제제 1 (TIMP-1), 칼프로텍틴, 및 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK) 로 이루어진 군으로부터 선택된 결장직장암에 대한 하나 이상의 다른 마커 분자(들) 과 조합으로 결장직장암에 대한 마커 분자로서 단백질 S100A12 의 용도를 기재한다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12 및 TIMP-1 을 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 2 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12 및 헤모글로빈을 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 2 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12 및 헤모글로빈/합토글로빈 복합체를 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 2 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12 및 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK) 를 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 2 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

또다른 추가의 바람직한 구현에에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12, TIMP-1 및 헤모글로빈을 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 3 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

또다른 추가의 바람직한 구현에에서 본 발명은 CRC 의 평가에서 마커 S100A12, TIMP-1 및 헤모글로빈/합토글로빈 복합체를 포함하는 마커 조합의 용도에 관한 것이고, 상기 모든 3 가지 마커는 대변 샘플로부터 측정된다.

TIMP-1 (=조직 플라스미노겐 활성자 1)

매트릭스 메탈로프로테이나아제 (MMP's) 는 세포외 매트릭스의 효소 분해에 기여하는 암 성장 및 번식에 중추적인 역할을 한다. MMP's 의 자연 발생적 억제제는, MMP's 또는 TIMP's 의 조직 억제제라고 부른다. TIMP's 는 MMP's 의 활성화 형태와 단단한 1:1 화학량적 복합체를 형성하여 상기 효소의 촉매적 활성을 억제한다.

TIMP-1 (Kodama, S., et al., Matrix 9 (1989) 1-6; Cooksley, S., et al., Matrix 10 (1990) 285-291; Clark, I.M., et al., Matrix 11 (1991) 76-85) 및 TIMP-2 (Fujimoto, N., et al., Clin. Chim. Acta 220 (1993) 31-45) 의 검출을 위한 다수의 효소-연결 면역어세이가 기재되어 있다. 상기 어세이는 체액, 예를 들어 혈청, 혈장, 양수, 뇌척수액 및 소변에 적용된다. 당업계에서는 대변 샘플 중의 TIMP-1 의 존재를 증명하는 어떠한 데이터도 발견될 수 없었다. 당업계에서는 대변 샘플 중의 TIMP-1 의 존재가 임상적으로 유용할 것이라는 사실에 대한 지표가 되는 데이터가 이용가능하지 않았다.

면역어세이와 같은 특이적 결합 어세이 분야에서 진단 시약은 일반적으로 어세이를 수행하기 위해 필요한 특이적 결합제 및 보조 시약을 포함하는, 키트의 형태로 최상으로 제공된다. 그러므로 본 발명은 또한 S100A12 에 대한 하나 이상의 특이적 결합제 및 S100A12 의 측정을 위한 보조 시약을 포함하는 면역학적 키트에 관한 것이다.

진단 검사의 정확성은 종종 그의 수용자-작동 특성 (ROC) 에 의해 기재된다 (특히 Zweig, M. H. and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577 참조). ROC 그래프는 관찰된 전체 범위의 데이터에 대한 결정 역치를 지속적으로 달리하여 산출된 모든 감수성/특이성 쌍의 곡선이다.

실험실 검사의 임상적 성능은 진단 정확성, 또는 대상을 임상적으로 관련된 서브그룹으로 올바르게 분류하는 능력에 따라 다르다. 진단 정확성은 조사되는 대상의 2 가지 상이한 상태를 올바르게 구별하는 검사 능력을 측정한다. 이러한 상태는, 예를 들어 건강 및 질환 또는 양성 대 악성 질환이다.

각 경우, ROC 곡선은 결정 역치의 완전한 범위에 대해 감수성 대 1 - 특이성을 플롯팅하여 2 가지 분포 사이의 중복을 묘사한다. y-축에서 감수성이거나, 참-(+) 분획이다 [(참-(+) 검사 결과의 수) / (참-(+) 의 수 + 가-(-) 검사 결과의 수) 로 정의됨]. 이것은 또한 질환 또는 상태의 존재 시 명확 (positivity) 으로 언급된다. 이것은 영향이 있는 서브그룹으로부터 단독으로 계산된다. x-축에서 가-(+) 분획이거나, 1 - 특이성이다 [(가-(+) 결과의 수) / (참-(-) 의 수 + 가-(+) 결과의 수) 로 정의됨]. 이것은 특이성의 지표이고, 비영향이 있는 서브그룹으로부터 전체적으로 계산된다. 참- 및 가-(+) 분획이 2 가지 상이한 서브그룹으로부터의 검사 결과를 사용하여 전체적으로 개별적으로 계산되기 때문에, ROC 곡선은 샘플 중의 질환의 유병율과 독립적이다. ROC 곡선 상의 각 지점은 특정 결정 역치에 상응하는 감수성/ 1 - 특이성 쌍을 나타낸다. 완벽한 판별의 검사는 (결과의 2 가지 분포에 중복이 없음) 상부 좌측 구석을 통과하는 ROC 곡선을 가지며, 여기서 참-(+) 분획은 1.0, 또는 100% (완전한 감수성) 이고, 가-(+) 분획은 0 (완전한 특이성) 이다. 판별이 없는 검사에 대한 이론상 곡선은 (2 가지 그룹에 대한 결과의 일치하는 분포) 하부 좌측 구석에서 상부 우측 구석까지의 45°대각선이다. 최상의 곡선은 상기 2 가지 극단 사이에 놓인다. (ROC 곡선이 완전히 45°대각선 아래에 놓이는 경우, 이것은 "초과" 에서 "미만" 또는 그 반대까지의 "명확" 에 대한 기준을 뒤집어 쉽게 교정된다) 정성적으로, 곡선이 상부 좌측 구석에 더 가까울 수록, 검사의 전체적인 정확성이 더 높다.

실험실 검사의 진단 정확성을 정량화 하기 위한 하나의 통상적인 목표는 단일 숫자에 의해 그의 성능을 표현하는 것이다. 가장 공통적인 포괄적 측정은 ROC 곡선의 곡선 하 면적이다. 통상적으로, 상기 영역은 항상 0.5 이상이다 (그렇지 않다면, 그렇게 하기 위해 결정 법칙을 뒤집을 수 있다). 값은 1.0 (2 개 군의 검사 값의 완벽한 분리) 내지 0.5 (검사 값의 2 개 군 사이에 명백한 분포 차이가 없음) 에 이른다. 영역은 곡선의 특정 부분, 예컨대 대각선에 가장 가까운 지점 또는 90% 특이성에서 감수성인 지점에만 종속되는 것이 아니고, 전체 곡선에 종속된다. 이것은 AUC 가 완벽한 것에 얼마나 가까운지의 정량적, 묘사적 표현이다 (영역 = 1.0).

신규 마커 S100A12 의 임상적 유용성은 수용자 작동 특성 분석을 사용하여 성립된 마커 헤모글로빈과 비교하여, 그리고 이와 조합으로 평가하였다 (ROC; Zweig, M. H. and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). 상기 분석은 실시예 섹션에 제시된 바와 같이 잘 정의된 환자 지원자 유래의 샘플에 근거하였다.

성립된 마커 헤모글로빈 단독과 비교하여 S100A12 단독의 측정에 근거한 진단 방법은 곡선 하 면적으로 나타낸 진단 정확도 (감수성/특이성 프로파일) 만큼 적어도 양호한 것으로 밝혀졌다.

하기 실시예, 도면 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되고, 이의 참 범주는 청구의 범위에서 언급된다. 본 발명의 취지에서 벗어남 없이 언급된 절차에 변형이 이뤄질 수 있다는 것으로 이해된다.

도 1: 웨스턴 블롯 분석

4 명의 CRC 환자의 종양 및 정상 조직을 인간 S100A12 에 대한 폴리클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 6xHis-태그된 단백질로서 이콜라이에서 발현된 재조합 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다. 재조합 단백질의 이동 패턴의 차이는 그곳에 포함된 6xHis-태그에 의해 야기된다. 정상 조직은 종양이 수술로 제거될 때 환자로부터 회수되었다. M: 분자량 마커; r.p.: 재조합 단백질; T: 종양 조직; N: 정상 조직.

도 2: ROC 곡선

건강한 개체로부터 수득된 18 개의 샘플과 비교한 CRC 환자로부터 수득된 23 개의 샘플의 측정을 위한 수용자 작동 특성 (ROC) 의 곡선을 제시한다.

도 3: CRC 환자 중의 S100A12 농도의 산점도

대변 추출물 중의 S100A12 의 측정에 대한 Ca²⁺-이온의 효과. 대변 추출물을 Ca²⁺-이온의 부재 (도 3a) 또는 존재 (도 3b) 에서 희석하였다. 검출가능한 농도는 Ca²⁺-이온의 존재 하에서 더욱 높고 증가된 동적 범위에 걸쳐 분포한다.

약어

ABTS 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트 (6)] 디암모늄 염

BSA 소혈청 알부민

cDNA 상보성 DNA

DMSO 디메틸 술폭시드

DTT 디티오트레이톨

EDTA 에틸렌 디아민 테트라아세트산

ELISA 효소-연결 면역흡착 어세이

ESI 전기분무 이온화

FCS 우태 혈청

IAA 요오도아세타미드

IgG 면역글로불린 G

LC 액체 크로마토그래피

MS 질량 분광법

MES 메시틸, 2,4,6-트리메틸페닐

PAGE 폴리아크릴아미드 젤 전기영동

PBS 인산염 완충 식염수

PI 등전위점

POD 호스래디쉬 퍼옥시다아제

RTS 빠른 번역 시스템

SDS 나트륨 도데실 술페이트

실시예 1

잠재적 결장직장암 마커로서의 S100A12 의 확인

조직의 근원

결장직장암에 대한 잠재적 진단 마커로서 종양-특이적 단백질을 확인하기 위해, 단백체학 방법을 사용하는 3 가지 상이한 종류의 조직의 분석을 수행하였다.

전체적으로, 10 명의 결장직장암 환자로부터의 조직 시편을 분석하였다. 각 환자로부터 3 가지 상이한 조직 유형을 치료적 절제로부터 수집하였다: 종양 조직 (>80% 종양) (T), 인접 건강한 조직 (N) 및 인접 건강한 점막으로부터 벗겨낸 점막 (M). 후자의 2 개 조직 유형은 매치된 건강한 대조군 샘플로서 담당한다. 조직을 절제 후 즉시 급냉시키고, 가공 전 -80℃ 에서 저장하였다. 종양을 조직병리학 기준에 의해 진단하였다.

조직 준비

0.8 내지 1.2 g 의 냉동 조직을 사발에 넣고 액체 질소로 완전히 냉동시킨다. 조직을 사발에서 분쇄하고, 10 배 부피 (w/v) 의 용해 완충액 (40 mM Na-시트레이트, 5 mM MgCl₂, 1% Genapol X-080, 0.02% Na-아지드, Complete^® EDTA-free [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 873 580]) 에 용해하고, 이어서 Wheaton^® 유리 호모게나이저 (20 x 성긴 핏팅, 20 x 치밀 핏팅) 에서 균질화하였다. 3 ml 의 균질화물을 4,500 x g 에서 수크로오스-밀도 원심분리 (10 내지 60% 수크로오스) 에 1 시간 동안 적용허였다. 상기 원심분리 단계 후 3 가지 분획을 수득하였다. 구배 상부에 있는 분획은 가용성 단백질을 함유하고, 추가 분석에 사용된다.

LC-ESI-MSMS-분석용 샘플 준비

가용성 단백질 분획의 단백질 농도는 공급자의 매뉴얼 지침에 따라 Bio-Rad^® 단백질 어세이 (Cat.No. 500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Germany) 를 사용하여 측정되었다. 200 μg 의 단백질에 해당하는 부피에 4 ml 환원 완충액 (9 M 우레아, 2 mM DTT, 100 mM KH₂PO₄, pH 8.2 NaOH) 을 첨가하고, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 Amicon^® Ultra 10 kD 장치 (Millipore GmbH, Schwalbach, Germany) 에서 250 μl 로 농축하였다. 알킬화를 위해 250 μl 을 1 ml 알킬화 완충액에 옮기고 (9 M 우레아, 4 mM 요오도아세타미드, 100 mM KH₂PO₄, pH 8.2 NaOH), 6 시간 동안 인큐베이션하고 이어서 Amicon^® Ultra 10 kD 장치에서 250 μl 로 농축하였다. 세정을 위해 1 ml 9 M 우레아를 첨가하고 다시 Amicon^® Ultra 10 kD 장치에서 250 μl 로 농축하였다. 세정을 3 회 반복하였다.

프로테아제 소화를 위해, 농축 용액을 2.5 M 우레아로 희석하고 4 μg 트립신 (Proteomics grade, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 으로 밤새 인큐베이션하였다. 1 ml 1% 포름산을 첨가하여 소화를 중지하고 분석하였다.

LC-ESI-MSMS-분석

트립신 소화물 (500 μl) 을 SCX 및 RP Pepmep C18 컬럼 (LC Packings, Idstein, Germany) 으로 이루어진 2-차원 Nano-HPLC-System (Ultimate, Famos, Switchos; LC Packings, Idstein, Germany) 에서 분리하였다. 11 SCX 분획 (0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1,500 mM NH₄Ac 로 단계 용리) 여기에서 90 분 구배 (5-95% 아세토니트릴) 로 RP 컬럼 상에서 연속적으로 추가 분리되고 ESI-MS 이온 트랩 (LCQ deca XP; Thermo Electron, Massachusetts, USA; 파라미터에 대해 표 2 참조) 으로 데이터 의존적 스캔을 사용하여 온라인 분석된다. 각 샘플에 대해 3 회 동작을 수행하였다. 원 데이터를 표 2 에 열거된 파라미터를 사용하는 Bioworks 3.1 소프트웨어 (Thermo Electron, Massachusetts, USA) 로 가공하였다. 복제물로부터 확인된 펩티드 및 단백질의 수득 목록을 조합된 곳에서 수행한다.

단백질 S100A12 는 표 3 에 제시된 일부 서열의 도움으로 확인된다.

결장직장암에 대한 잠재적인 마커로서의 S100A12 의 검출

각 환자에 대해 확인된 단백질 및 종양 샘플로부터의 해당하는 펩티드의 수를 인접 정상 조직 및 벗겨낸 정상 점막 조직으로부터의 일치 결과와 비교한다. 이에 의해, 단백질 S100A12 는 종양 조직에서 특이적으로 발현되거나 강하게 과발현되고 건강한 대조군 조직에서 전혀 또는 거의 검출가능하지 않거나 또는 덜 강하게 발현되는 것으로 발견된다. 이것은 그러므로 - 많은 다른 단백질 중에서 - 결장직장암의 진단에 사용하기 위한 후보 마커로서 적격이다.

단백질 S100A12 는 결장직장암 환자로부터의 종양 조직에서 강하게 제시되었다. 단백질 S100A12 의 하기 펩티드 서열을 종양 조직에서의 LCQ-MS²-데이터로 부터 Bioworks 3.1 로 확인하였다:

표 2 : MS/MS-데이터 습득 및 Bioworks 3.1 조사 파라미터

표 3 : 발견된 서열

상기 2 개 펩티드 서열이 S100A12 의 일부 서열로서 확인되었다. 서열 (i) 은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 2 에서 아미노산 21 까지의 아미노산 위치를 나타내고, 서열 (ii) 는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 23 에서 아미노산 34 까지의 아미노산 위치를 각각 나타낸다.

실시예 2

결장직장암 마커 단백질 S100A12 에 대한 항체의 발생

결장직장암 마커 단백질 S100A12 에 대한 폴리클론 항체는 혈청, 혈장, 혈액 및 특히 대변 샘플 중의 S100A12 의 측정에 추가 사용을 위해 발생되었다. S100A12 의 이러한 측정은, 예를 들어 면역검출 어세이, 예컨대 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 에 의해 수행된다.

이콜라이에서의 재조합 단백질 발현

S100A12 에 대한 항체를 발생시키기 위해, 단백질의 재조합 발현을 면역원 수득을 위해 수행하였다. RTS 100 의 발현 시스템 및 이콜라이의 조합을 적용하여 발현을 수행하였다. 제 1 단계에서, DNA 서열을 분석하고 고수율 cDNA 침묵 돌연변이화 변이체 및 각각의 PCR-프라이머 서열에 대한 추천을 "ProteoExpert RTS E.coli HY" 시스템을 사용하여 수득하였다. 이것은 상업적인 웹 기반 서비스이다 (www.proteoexpert.com). 추천된 프라이머 쌍을 사용하여, cDNA 로부터 선형 PCR 주형을 발생시키고 S100A12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 시험관 내 전사 및 발현을 위해 "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat.No. 3186237) 시스템을 사용하였다. 웨스턴 블롯 검출 및 차후 정제를 위해, 발현된 단백질은 His-태그를 함유하였다. 최고 발현 변이체를 확인하였다. 발현 및 검출을 위한 PCR 로부터의 모든 단계를 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 모든 필요한 T7 조절 영역 (프로모터, 리보좀 결합 부위 및 T7 종결자) 를 함유하는, 각각의 PCR 생성물을 제조자의 지침에 따라 pBAD TOPO^® 벡터 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Cat. No. K 4300/01) 내로 클로닝하였다. T7 조절 서열을 사용하는 발현을 위해, 구축물을 E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89) 내로 형질전환하고, 형질전환된 박테리아를 단백질 발현을 위해 1 l 배치에 배양하였다.

His-S100A12 융합 단백질의 정제는 Ni-킬레이트 컬럼 상에서 표준 절차를 따라 수행하였다. 간략하게는, His-S100A12 융합 단백질에 대한 발현 벡터를 함유하는 1 l 의 박테리아 배양물을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 50 mM Na-인산염, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mg/mL 라이소자임, 2x Complete (EDTA-free) 및 DNase 를 함유하는 용해 완충액에 재현탁한 후, French 프레스 (Model: IUL Basic Z) 를 사용하여 세포를 붕괴시켰다. 불용성 물질을 고속 원심분리에 의해 펠렛화하고 상청액을 Ni-킬레이트 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 여러 층 부피의 세정 완충액 (50 mM Na-인산염, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸) 으로 세정하였다. 마지막으로, 결합된 항체를 20 내지 500 mM 이미다졸의 선형 구배로 50 mM Na-인산염, pH 8.0, 300 mM NaCl 을 함유하는 용리 완충액을 사용하여 단리하였다.

S100A12 에 대한 모노클론 항체의 생성

a) 마우스의 면역화

12 주령 A/J 마우스를 100 μg S100A12 로 복막내에 처음으로 면역화하였다. 이 후 6 주 후 2 회 추가 복막내 면역화를 개월 간격으로 수행하였다. 상기 방법에서 각 마우스에 알루미늄 히드록시드에 흡수된 100 μg S100A12 및 보르데텔 라 페르투시스 (Bordetella pertussis) 10⁹ 병원균을 투여하였다. 이어서 최종 2 회 면역화를 각각에 대해 PBS 완충액 중의 100 μg S100A12 를 사용한 융합 제 3 일 및 제 2 일 전 정맥내로 수행하였다.

b) 융합 및 클로닝

상기 a) 에 따라 면역화된 마우스의 비장 세포를 [Galfre, G., and Milstein, C, Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46] 에 따라 골수종 세포와 융합시켰다. 상기 방법에서 면역화된 마우스의 약 1x10⁸ 개의 비장 세포를 2x10⁷ 개의 골수종 세포 (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) 와 혼합하고 원심분리하였다 (300 x g 및 4℃ 에서 10 분). 그 다음 세포를 태아 송아지 혈청 (FCS) 이 없는 RPMI 1640 배지로 1 회 세정한 다음 50 ml 코니칼 튜브에서 400 x g 로 다시 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 퇴적물을 탭핑으로 완만히 풀어주고, 1 ml PEG (분자량 4,000, Merck, Darmstadt) 을 첨가하고 파이펫팅으로 혼합하였다. 37℃ 의 수조에서 1 분 후, FCS 가 없는 5 ml RPMI 1640 을 4 내지 5 분의 기간 내 실온에서 적가하였다. 후에 10% FCS 를 함유한 5 ml RPMI 1640 을 약 1 분 내에 적가하고, 전체적으로 혼합하고, 배지 (RPMI 1640+10% FCS) 로 50 ml 까지 채우고, 이어서 400 x g 및 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 퇴적된 세포를 10% FCS 를 함유한 RPMI 1640 배지에 취하고, 하이포크산틴-아자세린 선별 배지 (RPMI 1640+10% FCS 중의 100 mmol/l 하이포크산틴, 1 μg/ml 아자세린) 에 파종하였다. 100 U/ml 의 인터루킨 6 을 성장 인자로서 배지에 첨가하였다.

약 10 일 후, 1 차 배양물을 특정 항체에 대해 검사하였다. S100A12-양성 1 차 배양물을 형광 활성화 세포 분류기에 의해 96-웰 세포 배양 플레이트에 클로닝하였다. 상기 방법에서 다시 100 U/ml 의 인터루킨 6 을 성장 첨가제로서 배지에 첨가하였다.

c) 세포 배양 상청액으로부터의 면역글로불린 단리

수득된 하이브리도마 세포를 10% FCS 함유 RPMI 1640 배지 ml 당 1x10⁵ 세포의 밀도로 파종하고, 7 일 동안 발효기에서 증식시켰다 (Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, Order No. 144-050). ml 당 100 μg 단일클론 항체의 평균 농도로 배양 상청액에서 수득하였다. 배양 상청액으로부터의 상기 항체의 정제를 단백질 화학에서 통상적인 방법에 의해 수행하였다 (예를 들어, Bruck, C, et al., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-596 에 따름).

폴리클론 항체의 발생

a) 면역화

면역화를 위해, 단백질 용액 (100 μg/ml 단백질 S100A12) 의 신규 에멀젼 및 완전 프로인트 (Freund) 항원보강제를 1:1 의 비율로 제조하였다. 각 토끼를 제 1, 7, 14 및 30, 60 및 90 일에 1 ml 의 에멀젼으로 면역화하였다. 혈액을 채취하고 실시예 3 및 4 에 기재된 바와 같이 추가 실험을 위해 수득된 항-S100A12 혈청을 사용하였다.

b) 카프릴산 및 암모늄 술페이트로의 연속 침전에 의한 토끼 혈청으로부터의 IgG (면역글로불린 G) 의 정제

1 부피의 토끼 혈청을 4 부피의 아세테이트 완충액 (60 mM, pH 4.0) 으로 희석하였다. pH 를 2 M Tris-염기로 4.5 로 조정하였다. 카프릴산 (25 μl/ml 의 희석 샘플) 을 강한 교반 하에서 적가하였다. 30 분 후, 샘플을 원심분리하고 (13,000 x g, 30 분, 4℃), 펠렛을 폐기하고 상청액을 수집하였다. 상청액의 pH 는 2 M Tris-염기의 첨가로 7.5 로 조정되고 여과된다 (0.2 μm).

상청액 중의 면역글로불린은 4 M 암모늄 술페이트 용액의 적가에 의해 강한 교반하에 2 M 의 최종 농도로 침전된다. 침전된 면역글로불린은 원심분리에 의해 수집하였다 (8,000 x g, 15 분, 4℃).

상청액을 폐기하였다. 펠렛을 10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl 에 용해하고 남김없이 투석하였다. 투석액을 원심분리하고 (13,000 x g, 15 분, 4℃) 여과하였다 (0.2 μm).

폴리클론 토끼 IgG 의 비오티닐화

폴리클론 토끼 IgG 를 10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl 중 10 mg/ml 이 되게하였다. IgG 용액 ml 당 50 μl 비오틴-N-히드록시숙신이미드 (DMSO 중 3.6 mg/ml) 를 첨가하였다. 실온에서 30 분 후, 샘플을 Superdex 200 (1O mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 3O mM NaCl) 상에서 크로마토그래피하였다. 비오티닐화 IgG 를 함유하는 분획을 수집하였다. 모노클론 항체를 동일한 절차에 따라 비오티닐화하였다.

폴리클론 토끼 IgG 의 디곡시게닐화

폴리클론 토끼 IgG 를 10 mM NaH₂PO₄/NaOH, 30 mM NaCl, pH 7.5 중 10 mg/ml 이 되게하였다. IgG 용액 ml 당 50 μl 디곡시게닌-3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (DMSO 중 3.8 mg/ml) 를 첨가하였다. 실온에서 30 분 후, 샘플을 Superdex^® 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 3O mM NaCl) 상에서 크로마토그래피하였다. 디곡시게닐화 IgG 를 함유하는 분획을 수집하였다. 모노클론 항체를 동일한 절차에 따라 디곡시게닌으로 표지하였다.

실시예 3

암 및 건강한 조직, 각각에서의 S100A12 의 웨스턴 블롯 검출

종양 샘플 및 건강한 대조군 샘플로부터의 조직 용해물을 실시예 1, "조직 준비" 에 기재된 바와 같이 준비한다.

SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯팅을 [Invitrogen, Karlsruhe, Germany] 의 시약 및 장비를 사용하여 수행한다. 검사된 각 조직 샘풀에 대해, 10 μg 의 조직 용해물을 환원 NuPAGE^® (Invitrogen) SDS 샘플 완충액에 희석하고 10 분 동안 95℃ 에서 가열하였다. 샘플을 MES 수행 완충액 시스템 중의 4 내지 12% NuPAGE^® 젤 (Tris-Glycine) 에서 수행하였다. 젤-분리된 폴리펩티드를 Invitrogen XCell II™ Blot Module (Invitrogen) 및 NuPAGE^® 이동 완충액 시스템을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상에 블롯팅하였다. 막을 PBS/0.05% Tween-20 으로 3 회 세정하고, Roti^®-Block 차단 완충액 (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany) 으로 2 시간 동안 차단하였다. 1 차 항체, 폴리클론 토끼 항-S100A12 혈청 (실시예 2 에 기재된 발생) 을, Roti^®-Block 차단 완충액에서 1:10,000 으로 희석하고 막과 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 PBS/0.05% Tween-20 으로 6 회 세정하였다. 특이적으로 결합된 1 차 토끼 항체를 0.5 x Roti^®-Block 차단 완충액에 10 mU/ml 으로 희석된, POD-공액 폴리클론 양 항-토끼 IgG 항체로 표지하였다. 1 시간 동안 인큐베이션 후, 막을 PBS/0.05% Tween-20 으로 6 회 세정하였다. 결합된 POD-공액 항-토끼 항체의 검출을 위해, 막을 Lumi-Light^PLUS Western Blotting Substrate (Order-No. 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 과 인큐베이션하고, 방사능사진 필름에 노출시켰다.

CRC 로 진단된 4 명의 개체로부터 유래된 종양 및 정상 조직을 기재된 바와 같이 블롯팅했을 때, S100A12 단백질의 고 발현이 종양 조직에서 검출된 반면, S100A12 은 전혀 또는 훨씬 적게, 각각 정상 조직에서 발견되었다 (도 1).

실시예 4

대변 시편의 가공

a) 세제 추출

Sarstedt, Germany, Order-No. 80.623.022 의 특별 샘플링 장치에 샘플 당 약 1 g 의 대변을 환자로부터 수집하고, -70℃ 에서 냉동 및 저장하였다. 분석을 위해, 대변 샘플을 해동하고, 대략 100 mg 의 대변 샘플을 Mini Complete EDTA-free, Roche, Germany 의 프로테아제 억제제 칵테일 (order-no.: 11 873 580) 이 보충된, 인산염 완충액, pH 7.4 로 10 배 희석하였다:

Na₂HPO₄ 53.4 mM

KH₂PO₄ 12.3 mM

NaN₃ 0.1 %

Na₂EDTA 1.07 mM

닭 알부멘 1.0 %

Nonidet P-40 0.5 %

샘플을 지속적으로 교반하면서 실온에서 1 시간 동안, 그리고 4℃ 에서 교반 없이 1 시간 더 인큐베이션 하였다. 3,000 x g 에서 15 분 동안 원심분리 후, 상청액을 파이펫으로 모아 공극 크기가 5 μm 인 막 필터를 사용해 여과하였다. 샘플을 분취하고 -70℃ 에서 저장하였다. 상기 가공된 대변 샘플의 분취물을 ELISA 에 의한 S100A12 의 정량에 사용하였다.

b) 우레아 추출

대변 샘플 중 S100A12 및 관심의 기타 마커의 측정을 개선하기 위해 "최적화된 추출 완충액" 을 사용하였다. 대변 샘플의 가공을 위해 추출 완충액을 하기 완충액에 프로테아제 억제제 칵테일 (Mini Complete EDTA-free, Roche, Germany) 을 첨가하여 새롭게 제조하였다:

TRIS 0.10 mol/l, pH 8.0

시트르산 0.10 mol/1

우레아 1.0 mol/1

CaCl₂ 0.01 mol/1

BSA 0.50 %

대변 샘플을 녹이고, 각 샘플의 50 내지 100 mg 을 배설물 샘플 제조 키트 (cat.-no.: 10745804 Roche, Germany) 로 옮겼다. 최적화된 추출 완충액을 대변 샘플의 중량에 따라 첨가하여 50 배 희석시켰다. 샘플을 30 분 동안 환상 교반기에서 강하게 혼합하고, 10 ml 튜브 (Sarstedt, Germany) 로 옮기고 1200 g 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 5 μm 컷-오프 필터 (Ultrafree^®-CL, Millipore, Germany) 를 사용하여 여과하고, 분취 및 추가 분석을 위해 -70℃ 에서 저장하였다. 상기 대변 추출물은 본 연구에서 관심의 모든 생마커에 적합하다.

실시예 5

인간 대변 시편 중의 S100A12 의 측정을 위한 ELISA

샌드위치 ELISA 를 대변으로부터의 S100A12 의 측정을 위해 개발하였다. 폴리클론 토끼 항체를 이콜라이에서 발현된 재조합 전장 S100A12 와의 면역화에 의해 생성하였다. 항혈청의 정제된 IgG 분획을 비오티닐화 또는 디곡시게닐화하 여 96-웰 스트렙타비딘 플레이트 (Streptawell, HighBind, Roche, Germany) 를 사용하는 샌드위치 ELISA 를 성립하기 위해 사용하였다. 대변 추출물을 샘플 희석 완충액 (100 mM Tris, pH 8.0, 2 mM CaCl₂, 1.5% KCL, 0.3% Triton X-100, 0.2% 카세인, 2% 수크로오스) 에 1:25 로 희석하고, 50 μl 의 샘플 또는 표준을 각 웰에 옮긴다. 그 후 항원-항체 복합체의 형성은 어세이 완충액 (PBS, pH 7.4, 0.1% 소 IgG, 0.9% NaCl, 0.5% Thesit, 1% PEG 40.000, 0.1% 소 IgG, 0.025% 아세틸화된 소 감마 글로불린) 중에 0.5 μg/ml 비오티닐화 폴리클론 항체 PAB<S100A12>-Bi 및 0.5 μg/ml 디곡시게닐화 폴리클론 항체 PAB<S100A12>-Dig 를 함유하는 항체 혼합물 50 μl 을 첨가하여 시작되었다. 플레이트를 60 분 동안 인큐베이션하고, 웰 당 350 μl 세정 완충액으로 3 회 세정하였다 (100 mM PBS, pH 7.4, 0.05% TWEEN-20). 그 후 웰 당 100 μl 의 25 mU/ml MAB<Dig>-POD 공액 (Roche Diagnostics, Germany) 을 첨가하고 또다시 60 분 동안 인큐베이션하였다. 웰 당 350 μl 세정 완충액으로 3 회 세정한 후, 웰 당 100 μl ABTS 용액 (Roche Diagnostics, Germany) 을 첨가하고, 플레이트를 60 분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 판독기 (SLT.Spectra II) 를 사용하여 405/620 nm 에서 흡수를 측정하였다. 재조합 전장 S100A12 를 검정에 사용하였다.

실시예 6

유레아 추출물 중의 분석물 안정성

S100A12 는 4b 에서 기재된 추출 방법을 사용하여 제조된 대변 추출물 중의 헤모글로빈보다 더욱 안정한 것으로 보인다. 대변 추출물이 실온에서 1 또는 3 일 동안 저장될 때 S100A12 에 대한 평균 회수는 더 높고 헤모글로빈의 평균 회수보다 덜 분산됨을 나타내는 것으로 보인다. 안정성을 평가하기 위해 사용된 20 개의 샘플 중 2 개는 헤모글로빈 음성이다:

표 4 : 온도 스트레스 후 회수

실시예 7

결장직장암 중의 S100A12 의 임상적 유용성

S100A12 의 임상적 유용성을 잘 특징화된 환자 지원자로부터 수득된 대변 샘플을 분석하여 평가하였다. 각 환자에 대해 동일한 창자 운동으로부터 2 개의 대변 샘플을 측정하고 농도를 분석하였다. 두 농도 사이의 상관관계를 밀접한 상관관계를 밝히는 페아손 상관관계 계수 (Pearson's correlation coefficient) 로 평가하였다. 어세이의 감수성을 개선하기 위해, 2 쌍 샘플 중 하나에서 측정된 최대 농도를 추가 분석에 사용하였다. S100A12 의 진단값을 Zweig et al (supra) 에 따른 ROC 분석에 의해 평가하였다.

첫번째 2 개 연구 집단의 대변 샘플을 실시예 4a 에 따라 추출하였다. 희석을 위해 인산염 완충 식염수 pH 7.4, 1.0 mM CaCl₂, 1.2 mM 니트릴로트리아세트산, 0.1% 소 혈청 알부민을 사용하였다. 세번째 연구 집단의 대변 샘플을 실시 예 4b 에 따라 추출하고, 실시예 5 에 제시된 바와 같이 샘플 희석 완충액으로 희석하였다. 상이한 추출 절차에도 불구하고, S100A12 의 측정에 사용된 ELISA 절차는 모든 환자 집단에서 동일하였다 (참조. 실시예 5).

첫번째 연구 집단:

18 명의 CRC 이 없는 환자, 대장내시경검사에 의해 샘종 양성으로 진단된 10 명의 환자, 및 UICC 병기 III 및 IV 로 분류된 진행된 CRC 로 진단된 23 명의 환자로부터의 대변 샘플을 수득하였다. S100A12 를 각각의 상기 개체로부터 수득된 대변 샘플에서 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.

ROC-분석을 [Zweig, M. H., 및 Campbell, supra] 에 따라 수행하였다. 곡선 하 면적에 의해 측정된 바와 같이 건강한 개체로부터 CRC 군으로 환자를 구별하는 식별력은 CRC 대 건강한 대조군에 대해 97% (도 2), CRC + 샘종 대 건강한 대조군에 대해 85% 및 샘종 대 건강한 대조군에 대해 57%, 각각으로 밝혀졌다.

대변으로부터 S100A12 의 측정에 대한 Ca²⁺-이온의 존재의 양성 효과를 도 3 에 예증한다. 대변 추출물을 CaCl₂ 및 니트릴로트리아세트산 모두의 부재 하에 인산염 완충 식염수 pH 7.4, 0.1% 소 혈청 알부민에 희석한 경우, CaCl₂ 및 니트릴로트리아세트산의 존재 하에 측정된 S100A12 농도와 비교해 (도 3b), 더 낮은 농도의 S100A12 가 검출가능하다 (도 3a). Ca²⁺ 의 부재하의 ELISA 의 더 적은 동적 범위는 또한 CRC 대 건강한 대조군에 대해 94% 의 ROC 곡선의 감소된 AUC 를 야기 하였으며, 개선된 완충액 시스템으로는 97% 의 AUC 를 관찰하였다. CRC + 샘종 대 건강한 대조군이 고려되는 경우, AUC 는 각각 Ca²⁺ 없이 81% 이고, CaCl₂ 및 니트릴로트리아세트산의 존재 하에 85% 였다.

두번째, 확장된, 연구 집단:

대장내시경검사에 의해 샘종 양성으로 진단된 10 명의 환자, CRC 로 진단된 50 명의 환자 (UICC 병기 I 로 분류된 9 명; UICC 병기 II 로 분류된 4 명; UICC 병기 III 으로 분류된 21 명; UICC 병기 IV 로 분류된 13 명, UICC 병기 I 내지 III (즉 IV 이 아님) 으로 분류된 2 명; 및 병기 없는 CRC 1 명) 및 50 명의 대조군 (다른 GI-질환, 즉, CRC 가 아닌 환자 7 명; 게실증 환자 16 명; GI-건강한 것으로 분류된 기증자 8 명; 및 치질 환자 19 명) 으로부터 대변 샘플을 수득하였다. S100A12 를 각각의 상기 개체로부터 수득된 대변 샘플에서 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.

ROC-분석을 [Zweig, M. H., and Campbell, supra] 에 따라 수행하였다. 곡선 하 면적에 의해 측정된 바와 같이 건강한 개체로부터 CRC 군으로 환자를 구별하는 식별력은 CRC 대 대조군에 대해 90%, CRC + 샘종 대 건강한 대조군에 대해 86% 및 샘종 대 건강한 대조군에 대해 66%, 각각으로 밝혀졌다. 이것은 S100A12 가 대변 샘플로부터 측정된다면, 심지어 초기 UICC 병기가 검출되는 것을 나타낸다.

세번째 연구 집단

S100A12 를 더욱 집중적인, 세번째 연구 집단에서 측정하였다 (환자 특성에 대해: 표 5 참조). 다수의 임상적으로 잘 특징화된 대변 샘플을 다중심 연구의 프레임-작업으로 예상적으로 수집하였다. 대조군 집합에 대한 환자 (대장내시경검사 진행) 를 위장병학 단위로 모집하며 평균-위험 스크리닝 집단을 나타낸다. 염증성 장 질환 환자 및 임의의 종류의 샘종 환자를 대조군 집합에서 배제하였다. 스크리닝 집단에서 결장직장암 환자의 낮은 유병율로 인해, 암 환자로부터의 샘플을 상이한 수술 단위에서 수집하였다. 결장직장암의 진단을 의사에 의해 확인 받고 또한 각 암 환자에 대해 병리 단계를 제공하였다. 구아이악-기반 FOBT 예비스크리닝에 의한 환자의 통상 진단 오류에 의해 도입될 수 있는 임의의 치우침을 평가하기 위해, 전 구아이악-기반 FOBT 없는 서브-집합을 또한 모집하였다. 가시적 직장 출혈로 인해 검출되는 모든 환자는 헤모글로빈에 유리하게 치우칠 것 같기 때문에, 마찬가지로 상기 서브-집합에서 배재하였다.

대변 샘플을 252 명의 대조군 개체로부터 수득하였다. 이 중 135 명이 GI-건강한 것으로 대장내시경검사에 의해 확인된 반면, 나머지 대조군 샘플은 여러 관련 GI-질환을 포함하였다. CRC 집단에는 UICC 병기 I 내지 IV (표 6) 으로부터의 186 개의 CRC 샘플이 포함된다. 38 명의 CRC 환자에 대해, 정확한 병기를 알지 못했다. 그러므로 표 6 에 정의된 UICC-병기의 CRC 환자는 총 186 명의 환자에 더하지 않는다. 총 101 명의 CRC 환자에서 FOBT 에 의한 예비스크리닝이 없이 평가되었다.

S100A12 를 각각의 상기 개체로부터 수득된 대변 샘플에서 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. ROC-분석을 [Zweig, M. H., and Campbell, supra] 에 따라 수행하였다. 곡선 하 면적에 의해 측정된 바와 같이 대조군 개체로부터 CRC 군으로 환자를 구별하는 식별력 (표 6) 은 CRC 대 모든 대조군에 대해 94%, 마찬가지로 FOBT 예비 스크리닝이 없는 CRC 대 대조군에 대해 94% 로 밝혀졌다. 질환 병기에 의한 CRC 환자의 그룹화는 UICC-병기 I 에 대해 90% 및 UICC-병기 II 내지 IV 에 대해 96 내지 97% 의 곡선 하 면적을 밝혔다. FOBT 예비스크리닝에 의한 치우침에 대한 증거는, 상기 환자의 곡선 하 면적이 총 CRC 환자의 곡선 하 면적과 일치하므로, 검출되지 않는다.

표 5 : 세번째 연구 집단의 환자 특성

표 6 : 세번째 연구 집단의 ROC 분석

실시예 8

S100A12 와 다른 대변 마커와의 조합

S100A12 와 대변 추출물로부터의 다른 생마커와의 조합을 평가하였다. 마커 헤모글로빈, 헤모글로빈과 합토글로빈과의 헤테로-복합체, 칼프로텍틴, TIMP-1, M2-PK 및 CEA 를 통상의 ELISA 를 사용하여 측정하였다. 헤모글로빈, 헤모글로빈/합토글로빈 및 칼프로텍틴의 측정용 어세이는 [R-Biopharm, Germany] 로부터 수득하였다. Calpro Calprotectin ELISA 는 [Calpro SA, Norway] 에서 제조되고, PhiCal™ Test 로서 독일 외부에 판매된다. CEA 의 측정용 어세이는 [Roche Diagnostics, Germany] 로부터 수득된다. M2-PK 의 어세이는 [Schebo Biotech, Germany], 및 TIMP-1 의 어세이는 [R&D Systems, USA] 로, 각각 공급된다. 어세이 중 일부가 2 개 어세이, 즉 CEA 및 TIMP-1 에 대해 대변 추출물에서 측정을 위해 의도되는 경우, 대변은 통상적으로 사용되는 샘플 물질이 아니다. 그러므로, 어세이는 추출된 대변 시편을 나타내는 샘플 중 상응하는 분석물의 측정에 대해 조정되어야만 한다. 샘플 (대변 추출물) 은 CEA 측정을 위해 20 배 미리 희석되나, 그렇지 않으면 어세이는 제조자의 권고에 따라 수행된다. 유사하게는 샘플은 어세이 절차 그 자체는 변경시키지 않고 TIMP-1 의 측정을 위해 3 배 미리 희석한다.

마커 조합이 CRC 의 진단을 개선할 것인지를 시험하기 위해, 마커는 Bayes Logistic Regression (BLR) 에 의해 조합된다. 마커 조합의 평가에 대한 BLR 알고리즘에서 Gaussian 이 이전에 사용되고 Alexander Genkin, David D. Lewis, 및 David Madigan 의 BBR-Software (텍스트 분류에 대한 대규모 Bayesian 로지스틱 회귀. Technometrics,) 로 실시된다. 하기 설정이 사용된다: 자동 특징 선택 없음, 0.05 에 고정된 사전 분산, 역치-조율 없음, 및 정규화에 의한 입력 표준화. 수 공정에 대해 0.0005 의 수렴 역치, 1000 반복 및 비-정확-모드를 가진 디폴트 설정이 변하지 않고 유지되었다. 기본 알고리즘으로의 결과는 Monte-Carlo 크로스-확인 디자인에서 100 회 수행하여 평가하였다. 각 수행에서, 모든 경우 및 대조군 각각 중 2/3 은, 디폴트 무작위 수 생성기에 대해 시작 값 19022007 로 Matlab^® R2006a 내장 함수 랜드샘플 (randsample) 을 통해 훈련 세트로 선택하였다. 기본 알고리즘을 진단 규칙을 생성하기 위해 훈련 세트에 적용한다. 추정된 사후 경우-가능성에 대한 역치를 95% 또는 98% 의 특이성, 각각을 달성하기 위한 훈련 세트의 대조군에 대해 결정하였다. 그 다음 진단 규칙을 제시된 역치에서 감수성 및 특이성을 추정하기 위해 다른 세번째 데이터에 적용한다.

헤모글로빈 또는 헤모글로빈/합토글로빈에 대한 임의의 치우침을 피하기 위 해 오직 101 명의 사전 FOBT 예비 스크리닝이 없는 CRC 환자를 평가에 사용하였다. 스크리닝 어세이에 대해 ROC 곡선의 AUC 도 관련된다. 스크리닝 설정에 꽤 중요한 필요조건은 고 특이성에서 충분히 양호한 감수성이다. 고 특이성은, 저 특이성이 불필요한 추적 조사 과정에 의해 달성되는 수 많은 가 양성 결과 및 환자에게 고통을 야기할 것이기 때문에 중요하다. 표 7 은 95% 및 98%, 각각의 현 특이성에서 감수성 뿐 아니라 평가의 AUC 값을 요약한다. 측정된 개별 마커 중 일부가 BLR 에 의해 조합되는 경우 CRC 의 진단에 대한 AUC 값은 +/- 1% 의 범위 내에서 매우 유사하다. 반면 CRC 의 검출 시 전반적인 감수성은 S100A12 과 다른 마커의 조합에 의해, 특히 98% 의 특이성 수준으로, 유의하게 증가될 수 있다. S100A12 단독이 67% 의 감수성을 갖는 반면, 2 개 마커 S100A12 및 헤모글로빈-합토글로빈 복합체를 포함하는 마커 조합은 79% 의 감수성을 나타내고, 3 개 마커, S100A12, 헤모글로빈-합토글로빈 복합체 및 TIMP-1 을 포함하는, 최상의 마커 조합은 동일한 고수준의 특이성에서 감수성이 82% 까지 추가 증가를 보였다. 상기 마커 조합은 CRC, 특히 초기 단계의 CRC 를 검출하기 위해 매우 중요한 것으로 고려된다. 표 7 에서 명백한 바와 같이, 특히 병기 I 의 결장직장암은 마커 조합의 사용에 의해 더 높은 비율로 검출된다. 마커 S100A12 의 사용은 상기 마커 조합으로 수득된 개선된 ROC 에 대한 핵심이다.

표 7 : CRC 의 검출용 마커 조합

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Use of S100A12 as a marker for colorectal cancer <130> 23747 WO <150> EP 06010439 <151> 2006-05-19 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Lys Leu Glu Glu His Leu Glu Gly Ile Val Asn Ile Phe His 1 5 10 15 Gln Tyr Ser Val Arg Lys Gly His Phe Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu 20 25 30 Leu Lys Gln Leu Leu Thr Lys Glu Leu Ala Asn Thr Ile Lys Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Lys Ala Val Ile Asp Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ala Asn 50 55 60 Gln Asp Glu Gln Val Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser Leu Val Ala Ile 65 70 75 80 Ala Leu Lys Ala Ala His Tyr His Thr His Lys Glu 85 90

Claims

하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

c) 단계 (b) 에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계, 및

d) 단계 (c) 에서 측정된 복합체의 양을 결장직장암의 진단과 연관시키는 단계.
하기 단계를 포함하는 결장직장암의 진단 방법:

a) 개체로부터 수득된 대변 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플과 S100A12 에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 S100A12 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

c) 상기 샘플과 헤모글로빈/합토글로빈 복합체, 헤모글로빈, 메탈로프로테아제 1 의 조직 억제제 (TIMP-1), 및 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK) 로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 마커에 대한 특이적인 결합제를, 상기 결합제와 제 2 마커 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

d) 단계 (b) 및 (c) 에서 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계, 및

e) 단계 (d) 에서 측정된 복합체의 양을 결장직장암의 진단과 연관시키는 단 계.
제 2 항에 있어서, 상기 제 2 마커가 헤모글로빈인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 제 2 마커가 헤모글로빈/합토글로빈 복합체인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 제 2 마커가 TIMP-1 인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 제 2 마커가 M2-PK 인 방법.
개체로부터 수득된 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단에서 마커 분자로서의 단백질 S100A12 의 용도.
개체로부터 수득된 대변 샘플로부터의 결장직장암의 초기 진단에서 마커 분자로서의 단백질 S100A12 의 용도.
개체로부터 수득된 대변 샘플로부터의 결장직장암의 진단에서, 헤모글로빈/합토글로빈 복합체, 헤모글로빈, 메탈로프로테아제 1 의 조직 억제제 (TIMP-1), 및 종양 M2 피루베이트 키나아제 (M2-PK) 로 이루어진 군으로부터 선택된 결장직장암에 대한 하나 이상의 다른 마커 분자(들) 과 조합되는 결장직장암에 대한 마커 분 자로서의 단백질 S100A12 의 용도.