JPH08238090A - 新規カルシウム結合タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なカルシウム結合蛋白を提供する。 【構成】 ヒトに由来し、所定のアミノ酸配列を有する
カルシウム結合タンパク、その製造方法該タンパクに対
する抗体及びその利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規カルシウム結合タ
ンパク、それをコードするＤＮＡ、該カルシウム結合タ
ンパクに対する抗体、該抗体を産生するハイブリドー
マ、該抗体を含んで成る診断薬等に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞外カルシウムイオン濃度は、細胞増
殖や分化の調節に関与していることが知られている。一
方、細胞内カルシウムイオンは、細胞内情報伝達の鍵と
なる伝達因子の一つである。このカルシウムシグナル
は、各種のカルシウム結合タンパク（ＣａＢＰ）により
媒介される。カルシウム結合タンパクは、カルモジュリ
ン、トロポニンＣ、Ｓ１００タンパクファミリーなどの
ＥＦハンドモチーフ（カルシウム結合部位）を有するも
のと、アネキシンファミリーなどのＥＦハンドを持たな
いものとに大別できる。これらはそれぞれ異なったそれ
ぞれに重要な生理的役割を担っていると推測されるが、
その生理的役割は必ずしも明らかではない。

【０００３】カルモジュリンは、カルシウムイオン依存
的な細胞反応の多くを媒介し、細胞分裂に必要とされる
一般的なＣａＢＰである。これに対し、Ｓ１００タンパ
クファミリーのＣａＢＰは細胞周期特異的または、細胞
種特異的に発現し、細胞分裂・分化の特定のシグナルの
伝達に係わっていると推測されている。Ｓ１００タンパ
クファミリーには、Ｓ１００α、Ｓ１００β、カルサイ
クリン、ＭＲＰ８、ＭＲＰ１４などがあり、それぞれ２
つのＥＦハンドモチーフを有する。

【０００４】最近ウシ羊水中に多量のカルシウム結合活
性を持つタンパクが存在することが見いだされた。これ
はＳ１００タンパクファミリーに属する新規タンパクで
あることが明らかとなり、ＣＡＡＦ１（Ｃａｌｃｉｕｍ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｍｎｉｏ
ｔｉｃ Ｆｌｕｉｄ １）と名付けられた。

【０００５】配列番号：２に示すウシカルシウム結合タ
ンパクは、皮膚、角膜、および全身の扁平上皮粘膜の扁
平上皮細胞、また好中球、マクロファージに発現し、細
胞の分化、増殖に関連していると考えられている。ま
た、上記ウシカルシウム結合タンパクに対する抗体を用
いた免疫組織学的解析から、ヒトにおいても上記ウシカ
ルシウム結合タンパクに相同なタンパクの存在が強く示
唆されている。また癌（扁平上皮癌）、炎症性疾患等の
病変部における、その発現様式の正常部位との差異か
ら、診断薬としての有用性も示唆されている。

【０００６】このようなことから、ＣａＢＰの存在、機
能を調べることは細胞増殖、分化機構の解明に重要であ
り、それに関連した疾患の解明、診断及び治療に有用な
知見を与えると期待される。特に、ヒトでの上記ウシカ
ルシウム結合タンパクに相同なタンパクの存在、その発
現様式、生理的役割等に強い関心が持たれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、新規
カルシウム結合タンパク及びその製造方法、その製造の
ための遺伝子系、該タンパクに対する抗体、その利用方
法等を提供しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、図２に示
すウシのカルシウム結合タンパクをコードするｃＤＮＡ
によりヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことにより新規ｃＤＮＡをクローニングすることに成功
した。さらにそのＤＮＡ配列を決定し、コードされるア
ミノ酸配列を推定した。このタンパクはこれまで知られ
ていなかったＳ１００タンパクファミリーに属する新規
カルシウム結合タンパクであり、ＣＡＡＦ１と命名し
た。

【０００９】従って本発明は、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含んで成るカ
ルシウム結合タンパクを提供する。本発明はまた、上記
タンパクをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発
現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された
宿主を提供する。

【００１０】本発明はまた、ヒトの組織から抽出するこ
とによる、又は上記の宿主を用いる、前記カルシウム結
合タンパクの製造方法を提供する。本発明はさらに、前
記カルシウム結合タンパクに対する抗体、該抗体を産生
するハイブリドーマ及び該抗体の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記抗体を含んで成る診断薬及び分析
方法を提供する。

【００１１】

【具体的な説明】本発明のカルシウム結合タンパクは配
列番号：１に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸
配列を含んで成る。実質的に同一とは、完全に同一であ
るか、又は１個もしくは少数個のアミノ酸において修飾
されており、且つカルシウム結合活性を維持しているこ
とを意味する。ここで修飾とは、配列番号：１に示すア
ミノ酸配列に対してアミノ酸が欠失、付加もしくは他の
アミノ酸による置換が行われているか、又はこれらの組
合わせによりアミノ酸配列が変更されていることを意味
する。

【００１２】また少数個とは、例えば配列番号：１に示
すアミノ酸配列の全アミノ酸数に対して１０％程度以
下、例えば１０個以下、好ましくは５個以下を意味す
る。従って、本発明において配列番号：１に示すアミノ
酸配列と実質的に同じアミノ酸配列には、１〜１０個、
好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加、欠失又は置換さ
れており、なおカルシウム結合活性をもたらすアミノ酸
配列を包含する。本発明はまた、上記のごとき種々のア
ミノ酸配列を有するカルシウム結合タンパクの断片をも
含む。これらの断片は、それがカルシウム結合活性を有
するか否かに拘らず、カルシウム結合タンパクに対する
抗体の製造のための免疫原として有用である。

【００１３】本発明はまた、上記のごときカルシウム結
合タンパク又はその断片と、他のタンパクとの融合タン
パクをも包含する。融合タンパクを構成するパートナー
となるタンパクとしては、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ｌａｃ
Ｚ等、任意のタンパクが挙げられる。このような融合タ
ンパクは、本発明のカルシウム結合タンパク又はその断
片を組換え技法により効率よく発現させるために有用で
ある。本発明は、上記カルシウム結合タンパクおよびそ
の断片の誘導体に関する。

【００１４】本明細書に含まれるカルシウム結合タンパ
クの誘導体は、グリコシル化変異体及び他の化学成分と
の共有又は凝集接合体を包含する。共有誘導体は該カル
シウム結合タンパクのアミノ酸側鎖、Ｎ−又はＣ−末端
の官能基を、当業界において良く知られている手段によ
り結合することによって調製され得る。これらの誘導体
は、カルボキシル末端又はカルボキシル基を含む残基の
脂肪族エステル又はアミド、ヒドロキシル基を含む残基
のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端又はアミノ基含有
残基、たとえばリジン又はアルギニンのＮ−アシル誘導
体を含有するが、但しこれだけには限定されない。アシ
ル基はアルキル成分、たとえばＣ₃ 〜Ｃ ₁₈の直鎖アルキ
ルの基から選択され、それによって、アルカノイルアロ
イル種を形成する。

【００１５】主要誘導体は、他のタンパク質とカルシウ
ム結合タンパク質又はそのフラグメントとの共有接合体
である。これらの誘導体は、組換え培養、たとえばＮ
−、Ｃ−末端融合において、又は反応性側基をとおして
のタンパク質の架橋において有用な当業界において知ら
れている物質の使用により合成され得る。架橋剤とのカ
ルシウム結合タンパク質の好ましい反応部位は、遊離ア
ミノ基、遊離カルボキシル基、炭水化物成分及びシステ
イン残基である。

【００１６】本発明はまた、化学成分との共有又は凝集
会合による誘導体の使用にも関する。本発明のカルシウ
ム結合タンパクはまた、たとえば該カルシウム結合タン
パク測定系に利用するため、たとえばクロラミンＴ方法
により放射性ヨウ素化され、稀土類キレート等の蛍光成
分、又は他の検出可能基に結合、ラベルされ得る。本発
明はさらに、前記のカルシウム結合タンパク質、その断
片又はその融合蛋白質の製造方法をも提供する。

【００１７】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する
カルシウム結合タンパクは、例えばヒトの組織から単離
・精製することができる。単離・精製は既知の様々な精
製法を組み合わせることにより、必要とされる純度に精
製することができる。精製法には、例えば、陽イオン交
換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水性、等電点、免疫ア
フィニティー、キレートアフィニティー、逆相などの各
クロマトグラフィー、塩析などの分別沈殿等が用いられ
る。他の方法も可能である。

【００１８】充分な純度および量の該カルシウム結合タ
ンパクを得た後、そのままプロテインシークエンサーに
より、Ｎ末端からアミノ酸配列を決定することができ
る。Ｎ末端付近以外のアミノ酸配列は、たとえばまず適
当なプロテアーゼ等により該カルシウム結合タンパクを
分解し、分解産物である部分ペプチドを、逆相クロマト
グラフィーなどの精製法により精製し、そのアミノ酸配
列をＮ末端から同様に決定し、その配列を組み合わせる
ことにより全体のアミノ酸配列を決定することができ
る。

【００１９】このようにして全アミノ酸配列を決定する
ことができるが、それは必ずしも必要ではない。たとえ
ば下記に示す一般的方法にて、一部のアミノ酸配列から
該カルシウム結合タンパクをコードするＤＮＡをクロー
ニングしてその塩基配列を決定し、その配列から該カル
シウム結合タンパクのアミノ酸配列を導き出すことも可
能である。

【００２０】本発明のカルシウム結合タンパク及びその
断片はまた、常法に従って化学合成することもできる。
それらの方法は、Janis D.Young, Solid Phase Peptide
Synthesis. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 19
84); M.Bondanszky 及びA.Bondanszky. The Practice o
f Peptide Synthesis. (Springer-Verlag. New York.19
84)並びにM.Bondanszky. The Principles of Peptide S
ynthesis. (Springer-Verlag. New York. 1984)に記載
されているような方法を包含する。それらの全てが本明
細書中に参考として含まれる。

【００２１】例えば、アジド法、酸クロリド法、酸無水
物法、混合酸無水物法、活性エステル（例えば、ｐ−ニ
トロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルまたはシアノメチルエステル）法、カルボジイ
ミダゾール法、酸化−還元法、またはＤＣＣ／添加剤法
を使用することができる。固相及び溶液相合成の両方が
前記方法に適用可能である。

【００２２】カルシウム結合タンパク質は、ペプチド合
成において典型的に使用されるような上記方法に従っ
て、通常はアミノ酸を末端アミノ酸に１つずつ順番に縮
合させることを含んで成るいわゆる段階法により、また
はペプチド断片を末端アミノ酸にカップリングさせるこ
とにより、適当に調製される。正しくない位置における
カップリングを防ぐために、カップリング反応で使われ
ないアミノ基を保護しなければならない。

【００２３】固相合成を採用する場合、Ｃ末端アミノ酸
がそのカルボキシル基を通して不溶性担体または支持体
に結合される。不溶性担体はそれが反応性カルボキシル
基への結合能力を有する限り特に限定されない。そのよ
うな不溶性担体の例としては、ハロメチル樹脂、例えば
クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂、ヒドロキシ
メチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキ
シカルボニルヒドラジド化樹脂等が挙げられる。

【００２４】アミノ基が保護されたアミノ酸は、その活
性化カルボキシル基と予め形成されたペプチド鎖の反応
性アミノ基との縮合を介して順次結合され、段階的にペ
プチドが合成される。完全な配列が合成された後、不溶
性担体からペプチドが切断され、ペプチドが得られる。
この固相アプローチは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄらにより
J.Am.Chem.Soc, 85:2149-2156 (1963)中に一般的に記載
されている。この記載は参考として本明細書中に組み込
まれる。一般的なペプチド分離の手段、例えば抽出、沈
殿、電気泳動および様々な形態のクロマトグラフィー等
により、調製した該カルシウム結合タンパク又はその断
片を反応混合物から単離精製することができる。

【００２５】しかしながら、本発明のカルシウム結合タ
ンパク、その断片又はその融合タンパクの好ましい製造
方法は遺伝子工学的方法である。この方法においては、
所望のタンパク又はポリペプチドをコードするＤＮＡを
含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培
養し、該培養物から目的とするタンパク又はポリペプチ
ドを採取する。このための宿主としては、原核細胞でも
真核細胞でもよい。原核細胞は例えば細菌であり、これ
はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。

【００２６】グラム陰性菌の例としては大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられ、グラム陽性
菌としては例えばバシルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・リウクエホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｆｏｒｍｉｓ）等、宿
主として常用されているものを有利に用いることができ
る。原核性宿主としてはさらに、放細菌、例えばストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物を
用いることもできる。

【００２７】真核性宿主としては、下等真核細胞でも高
等真核細胞でもよい。下等真核細胞としては、例えば扱
子菌、真菌等が挙げられる。真菌としては、単細胞真菌
である酵母、又は糸状真菌が好ましい。酵母としては、
例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙
げられ、糸状真菌としてアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ）属糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギ
ルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａ
ｅ）等、さらにはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕ
ｓ）属糸状菌等が用いられる。

【００２８】高等真核生物宿主としては、動物でも植物
でもよい。動物性宿主としては昆虫又はその培養細胞、
哺乳類又はその培養細胞等が挙げられる。昆虫としては
典型的にはカイコ及びその培養細胞が使用され、哺乳類
としては、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ等
又はその培養細胞、あるいはヒトの培養細胞が使用でき
る。動物細胞の具体例としては、例えばチャイニーズ・
ハムスター・卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、小ラ
ット腎臓細胞（ＢＲＫ）、サル細胞（ＣＯＳ）等が挙げ
られる。

【００２９】宿主が細胞である場合には、それを培養す
ることにより、宿主が動・植物の場合にはそれらを飼育
又は栽培することにより行われる。培養、飼育、栽培は
すでに確立されている常法に従って行うことができる。
培養物から、本発明のタンパクを単離・精製するには、
タンパクの単離・精製に用いられる常法を用いればよ
く、例えばヒトの組織単離・精製する方法として前に列
挙した単離操作を適宜組合わせて行うことができる。

【００３０】本発明のカルシウム結合タンパク又はその
断片は、それの所望の用途に依存して様々な純度におい
て得ることができる。本明細書中に開示されるタンパク
質精製技術を使って、または本明細書に記載される抗体
による免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて
精製を行うことができる。この免疫アフィニティークロ
マトグラフィーの概要は、本明細書中に示されている。

【００３１】本発明は、例えば上記のタンパクの製造に
使用するため、本発明のタンパクをコードする遺伝子、
典型的にはＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、典型的に
は配列番号：１に示す塩基配列を有するものが挙げられ
るが、それに限定されるものではなく、配列番号：１に
記載するアミノ酸配列をコードするコドンの縮重に基づ
く種々の塩基配列を有するＤＮＡも本発明に含まれる。
さらに、上に記載した意味において、配列番号：１に記
載するアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含ん
で成るタンパクをコードするＤＮＡも本発明に含まれ
る。さらには、前記のタンパク断片又は融合タンパクを
コードするＤＮＡも本発明に含まれる。

【００３２】本発明はさらに、上記の種々のＤＮＡとハ
イブリダイズすることができる程度に相同性を有し、な
おカルシウム結合活性を有するタンパクをコードしてい
るＤＮＡをも包含する。ハイブリダイゼーション（ある
いは相補的ＤＮＡ鎖の２本鎖形成過程であるリアソシエ
ーション）に及ぼす因子は、温度、塩濃度、塩基対形成
の誤り、ＤＮＡ断片の長さ、多様性、などがある。また
形成された２本鎖核酸の安定性は、融解温度（Ｔｍ、５
０％融解を起こす温度）で表わされるが、一般にプロー
ブＤＮＡが１５０塩基対以上の場合、最も高いハイブリ
ダイゼーション速度が得られるＴｍ−２５℃の温度でハ
イブリダイゼーションを行うのが一般的である。

【００３３】ＴｍはプローブとＤＮＡの塩基配列の相同
性に影響をうけるが、ハイブリダイゼーションを行う温
度として、通常６８℃、５０％ホルムアルデヒド存在下
では４２℃が用いられることが多い。この場合のハイブ
リダイゼーションの条件としては、例えば、６ＸＳＳ
Ｃ、５０％ホルムアミド、５Ｘデンハルツ溶液、２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ml
変性サケ精子ＤＮＡ、pH７．５溶液中、４２℃、１昼夜
が用いられる。相同性の程度は好ましくは６０％以上、
さらに好ましくは７０％以上である。

【００３４】上記のＤＮＡを得るには、典型的には、ヒ
トの組織、例えばヒトの好中球又はケラチノサイトから
作製したｃＤＮＡライブラリーを、ヒト該カルシウム結
合タンパクをコードするｃＤＮＡ又はその断片から調製
したプローブによりスクリーニングすることにより得ら
れる。こうして得られたＤＮＡは、例えば配列番号：１
に示す塩基配列を有する。

【００３５】他の方法、たとえば該カルシウム結合タン
パクから得られたアミノ酸配列を使ってＰＣＲプライマ
ーを推定し、ＲＴ−ＰＣＲによりＤＮＡプローブを合成
し、次いで該ＤＮＡプローブを用いて該カルシウム結合
タンパクのｃＤＮＡを単離できる。幾つかの標準法はＭ
ａｎｉａｔｉｓら、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor NY) またはＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Biolog
y (Greene Publishing Associates. Brooklyn,NY)に記
載されているかまたは参照されている。

【００３６】ｃＤＮＡが単離されれば、既知の方法によ
りその塩基配列を決定する事ができる。該塩基配列か
ら、ＣＡＡＦ１の一次翻訳産物のアミノ酸配列、即ち、
起こりうる翻訳後修飾前のアミノ酸配列が導き出され
る。配列番号：１に示すアミノ酸配列と同一ではないが
実質的に同じアミノ酸配列、すなわち、１〜少数個のア
ミノ酸の付加、欠失、置換等の修飾を有するアミノ酸配
列をコードするＤＮＡは、例えば配列番号：１に示す塩
基配列を有するＤＮＡを鋳型として用い、変異原プライ
マーにより部位特定変異誘発を生じさせることにより作
製することができる。

【００３７】変異部位は予め決められているが、それは
必要条件ではない。例えば、特定の残基位置における変
異体の性質を最適化するために、標的コドンにおいてラ
ンダム突然変異誘発を行い、次いで発現されたＣＡＡＦ
１変異体を所望の性質についてスクリーニングすること
ができる。既知配列を有するＤＮＡ中の予め決められた
部位に置換変異を作製する方法は当業界で公知であり、
例えばＭ１３プライマー突然変異誘発がある。

【００３８】また、前記タンパクの断片をコードするＤ
ＮＡは、目的とする断片より長いタンパクをコードする
ＤＮＡを制限酵素で切断することにより、もしくはエキ
ソヌクレアーゼにより任意の長さに短縮することによ
り、または、目的とする断片より長いタンパクをコード
するＤＮＡに翻訳開始コドン又は翻訳終止コドンを導入
することにより作製することができる。

【００３９】あるいは、本発明のＤＮＡは、常法によ
り、例えば固相合成法、例えばホスホアミダイト法、等
により化学合成することもできる。融合タンパクをコー
ドするＤＮＡは、本発明のカルシウム結合タンパク又は
その断片をコードするＤＮＡと、融合タンパクを構成す
るパートナータンパクをコードするＤＮＡとを連結する
ことにより作製される。

【００４０】本発明の目的上、ＤＮＡ配列は互いに機能
的に関連する時それらは作用可能に連結される。例え
ば、ポリペプチドがプレタンパク質として発現されるか
または膜への該ポリペプチドの局在化もしくは該ポリペ
プチド分泌に関係するならば、プレ配列または分泌リー
ダーのＤＮＡ該ポリペプチドに作用可能に連結される。
ポリペプチドの転写を調節する場合、プロモーターがコ
ード配列に作用可能に連結される。翻訳を可能にするよ
うにコード配列が置かれる場合、リボゾーム結合部位が
コード配列に作用可能に連結される。一般に、作用可能
に連結されるとは、連続しており且つ読み枠内であるこ
とを意味する。しかしながら、或は遺伝的要素例えばリ
プレッサー遺伝子は連続的には連結されないが、発現を
調節するオペレーター配列に結合している。

【００４１】本発明は、該カルシウム結合タンパクまた
はその断片をコードするＤＮＡを発現するベクターを提
供する。発現ベクターは、通常は適当な宿主細胞中で認
識される適当な遺伝的調節要素に、作用可能に連結され
た目的遺伝子を含有する自己複製性ＤＮＡまたはＲＮＡ
構成物である。それらの調節要素は適当な宿主内での発
現に作用することができる。発現に必要な調節要素の特
定の型は、使用する最後の宿主細胞に依存するだろう。

【００４２】一般に、遺伝子調節要素は原核プロモータ
ー系または真核プロモーター発現調節系であることがで
き、そのようなものとしては、転写プロモーター、転写
の開始を調節する任意のオペレーター、ｍＲＮＡ発現レ
ベルを高める転写エンハンサー、適当なリボソーム結合
部位をコードする配列、並びに転写および翻訳を終結さ
せる配列が挙げられる。発現ベクターは通常該ベクター
を宿主細胞と独立に複製させる複製開始点も含む。

【００４３】本発明のベクターは、本発明のタンパクを
コードするＤＮＡを含む。該ＤＮＡはウイルス性プロモ
ーターの調節下にあることができ、そして選択マーカー
をコードすることができる。本発明は、原核または真核
宿主中で、本発明のタンパクをコードするＤＮＡを発現
することができる発現ベクターの利用も包含する。個々
で、該ベクターは宿主と適合性であり、本発明のタンパ
クをコードするＤＮＡは、該ベクターを含む宿主に発現
されるようにベクター中に挿入される。

【００４４】一般に発現ベクターは、それらの宿主細胞
中で安定な発現のため、または細胞あたりの所望の遺伝
子のコピー数を大きく増やす増幅のためにデザインされ
る。しかしながら、常に発現ベクターが宿主細胞中で増
殖することを要求する必要はない。宿主細胞により認識
される複製開始点を含まないベクターを使って様々な宿
主中で本発明のタンパクの一時的発現を行うことが可能
である。組み換えによって宿主ＤＮＡ中への本発明のタ
ンパクをコードするＤＮＡの組み込みを引き起こすベク
ターを用いることも可能である。

【００４５】ベクターは、プラスミド、ウイルス、バク
テリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、および宿
主のゲノム中へのＤＮＡの組み込みが可能である他のビ
ヒクルを含んで成る。発現ベクターは、作用可能に連結
された遺伝子の発現を行う遺伝的調節配列を含む特殊化
されたベクターである。プラスミドが最もよく使われて
いるベクターの形態であるが、同等な機能を供給しそし
て当業界で既知であるかまたは既知になる他のあらゆる
形態のベクターも本明細書中での使用に適当である。

【００４６】適当な宿主としては、前記のごとく、原核
生物、下等真核生物および酵母または高等真核生物が挙
げられる。原核生物としては、グラム陰性およびグラム
陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＢ．サ
ブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。下等
真核生物としては、酵母、例えばＳ．セレビシェー
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア（Ｐｉｃｈ
ｉａ）並びにタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉ
ｕｍ）といった種が挙げられる。高等真核生物として
は、昆虫細胞のような非哺乳類起源と、ヒト、霊長類お
よびげっ歯類のような哺乳類起源の両方の動物細胞から
の確立された組織培養細胞系が挙げられる。

【００４７】原核宿主−ベクター系は、多数の様々な種
のための広範なベクターを含む。本明細書で使用する
時、大腸菌とそのベクターなる語は、他の原核生物用の
同等なベクターを包含するように包括的に用いられるだ
ろう。ＤＮＡを増幅させるための代表的なベクターはｐ
ＢＲ３２２または任意のその誘導体である。カルシウム
結合タンパク質またはその断片を発現させるのに使われ
るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含むもの
（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むもの
（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含む
もの（ｐＩＮシリーズ）：λ−ｐＰまたはｐＲプロモー
ターを含むもの（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃといった
ハイブリッドプロモーターを含むもの（ｐＤＲ５４０）
といったベクターが挙げられるがそれに限定されない。
Ｂｒｏｓｉｕｓら、 "Expression Vector Employing La
mbda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", Vec
tors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and The
ir Uses (Raymond L.RodriguezおよびDavid T.Denhardt
編）中、Buttersworth. Boston. 1988. 10章、205-236
を参照のこと。

【００４８】酵母およびタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏ
ｓｔｅｌｉｕｍ）といった下等真核生物を、本発明のタ
ンパクコード配列含有ベクターを使って形質転換するこ
とができる。本発明の目的上、多数の他の株および種も
利用できるけれども、最もよく使われる下等真核宿主は
パン酵母のサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｃ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）であり、それ
は下等真核生物を包括的に表わすのに用いられるだろ
う。酵母ベクターは、複製開始点（組み込み型のもので
ない限り）、選択遺伝子、プロモーター、本発明のタン
パクをコードするＤＮＡ、翻訳終結、ポリアデニル化お
よび転写終結のための配列から成る。

【００４９】適当な酵母用発現ベクターは、３−ホスホ
グリセレートキナーゼのような構成的プロモーターおよ
び種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターまたはアルコ
ールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチ
オネインプロモーターのような誘導性プロモーターを含
む。適当なベクターは、次の型の誘導体を含む：自己複
製性低コピー数型（例えばＹＲｐシリーズ）：組み込み
型（例えばＹＩｐシリーズ）、またはミニクロモソーム
型（例えばＹＣｐシリーズ）。

【００５０】高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活
性な該カルシウム結合タンパクの発現に好ましい宿主細
胞である。理論的には、無脊椎動物源からであろうと任
意の真核生物組織培養細胞系が利用できる。しかしなが
ら哺乳類細胞が好ましい。そのような細胞の形質転換ま
たはトランスフェクションおよび増殖は日常的技術とな
っている。有用な細胞系の例としては、ＨｅＬａ細胞、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、子ラッ
ト腎臓（ＢＲＫ）細胞系、昆虫細胞系およびサル（ＣＯ
Ｓ）細胞系が挙げられる。

【００５１】そのような細胞系のための発現ベクター
は、通常、複製開始点、プロモーター、リボソーム結合
部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡを使用する
場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含
む。それらのベクターは通常は選択遺伝子または増幅遺
伝子も含有する。適当な発現ベクターは、アデノウイル
ス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルスま
たはシトメガロウイルスのように起源に由来するプロモ
ーターを担持しているプラスミド、ウイルスまたはレト
ロウイルスであることができる。

【００５２】適当な発現ベクターの代表例としては、ｐ
ＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Mol. Cell Bi
ol.5:1136-1142. 1985):pMClneo Poly A（Ｔｈｏｍａｓ
ら、Cell 51:503-512. 1987)：およびｐＡＣ３７３また
はｐＡＣ６１０といったバキュロウイルスベクターが挙
げられる。本発明は、カルシウム結合タンパク質または
その断片をコードするＤＮＡを含むベクターにより、形
質転換された細胞を提供する。

【００５３】形質転換された細胞は、組み換えＤＮＡ技
術を使って作製された該カルシウム結合タンパク発現ベ
クターにより形質転換またはトランスフェクトされてい
る細胞である。形質転換された宿主細胞はカルシウム結
合タンパク質またはその断片を発現するが、そのＤＮＡ
のクローニング、増幅および操作の目的ではカルシウム
結合タンパクを発現する必要はない。本発明のタンパク
及びそれをコードするＤＮＡは、種々の用途を有する。
すなわちＤＮＡは、それがコードしているタンパクの製
造のために使用されるほか、関連のもしくは相同のカル
シウム結合タンパクをコードする遺伝子、カルシウム結
合タンパクサブタイプをコードする遺伝子および異なる
種の該カルシウム結合タンパクをコードする遺伝子を検
出又は同定するのに特に有用である。

【００５４】本発明はまた、該カルシウム結合タンパク
の存在を検出又は定量するための種々の測定系及び診断
薬における、該カルシウム結合タンパク、その断片、ペ
プチド及びそれらの融合生成物の使用にも関する。本発
明のカルシウム結合タンパク又はその断片は、上記測定
系における、標準物質としても利用可能である。

【００５５】本発明のカルシウム結合タンパク質および
その断片は、該カルシウム結合タンパク又はその断片に
特異的な抗血清又は抗体産生のための免疫原として使用
され得る。精製された該カルシウム結合タンパクは、純
度の高くない該カルシウム結合タンパク調製物の免疫に
より調製されるモノクローナル抗体をスクリーニングす
るためにも使用され得る。さらに、該カルシウム結合タ
ンパク断片はまた、本発明の抗体を産生するための免疫
原としても利用することができる。

【００５６】本発明は、該カルシウム結合タンパクと親
和性を有する抗体を提供する。たとえば、本発明は、配
列番号：１に示されるアミノ酸配列を持つカルシウム結
合タンパクへの親和性を有する、又はそれに対して作製
された抗体、およびその抗体のフラグメントに関する。
抗体は、その天然に存在する型及びその組換え体型の該
カルシウム結合タンパク及びその断片に対し、作製する
ことができる。本発明のカルシウム結合タンパクの断片
に対する抗体は、免疫原性タンパク質と該断片との接合
体により動物を免疫する事により作製することができ
る。モノクローナル抗体は、所望する抗体を分泌する細
胞から調製される。これらの抗体は、カルシウム結合タ
ンパク質に対する結合についてスクリーンされ得る。

【００５７】本発明のカルシウム結合タンパク及びその
断片は、免疫原として使用されるべきポリペプチドに融
合、または共有結合して、免疫する事ができる。カルシ
ウム結合タンパク質及びそのフラグメントは、種々の免
疫原、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、ウ
シ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に融合、又は共
有結合して免疫する事ができる。免疫する動物は、ウ
シ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、モルモッ
ト、ラット、マウス等、免疫し目的の抗体を得る事がで
きる動物であればその種を選ばない。

【００５８】ポリクローナル抗血清を調製するための方
法の説明には、たとえば、Microbiology, Hoeber Medic
al Division (Harper and Row. 1969), Landsteiner, S
pecificity of Serological Reactions (Dover Publica
tions. New York. 1962)及びＷｉｌｌｉａｍｓなど、Me
thods in Immunology and Immunochemistry 、第１巻
（Academic. Press. New York. 1967)（これらすべて
は、引用により本発明書に組込まれる）を参照のこと。
典型的な方法は、抗原による動物の過剰免疫を包含す
る。

【００５９】本発明のポリクローナル抗体は、常法に従
って得ることができる。ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウ
サギ、ニワトリ、モルモット等の動物に上記抗原ペプチ
ドを単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に
免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、免疫した動
物の血液、卵等を採取し、ポリクローナル抗体を回収す
ることができる。本発明はまた、該カルシウム結合タン
パクと結合性を有するモノクローナル抗体を提供する。
本発明はさらに、前記のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを提供する。

【００６０】多くの場合、種々の哺乳類宿主、たとえば
マウス、ラットなどのゲッ歯類、霊長類、ヒト等からモ
ノクローナル抗体を調製することが所望される。そのよ
うなモノクローナル抗体を調整するための技法の説明
は、Ｓｔｉｔｅｓなど、Basicand Clinical Immunolog
y. (Lang Medical Publications. Los Altos. CA. 第４
版）及びこの中の引例、及び特に、Kohler and Milstei
n. Nature 256:495 〜497 (1975)（モノクローナル抗体
の１つの作製方法を論じる）に見出され得る。

【００６１】簡単に要約すれば、マウス、ラット等に上
記抗原を単独で、あるいはアジュバントと混合して定期
的に免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、例えば
脾臓、リンパ節を摘出し、そのＢ細胞を適当な骨髄腫細
胞と細胞融合させる。その融合細胞は、インビトロで培
養できる「ハイブリドーマ」である。得られたハイブリ
ドーマ細胞を、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ
−ＲＰＭＩ１６４０培地等の適当な培養液中で培養す
る。

【００６２】培養上清中に産生された抗体を例えばＲＩ
Ａ，ＥＬＩＳＡ等で検出することにより、カルシウム結
合タンパク質に対し特異的に反応する抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞株を選択し、クローン化する。各クロ
ーンは、免疫原に対する１つの抗体種を分泌する。得ら
れる個々の抗体種は、免疫原性物質上に認識される特異
的部位（エピトープ）に応答して生成される、免疫動物
からの単一のＢ細胞の生成物である。ＣＡＡＦ１と反応
するモノクローナル抗体は、例えばマウスまたはラット
腹腔にハイブリドーマ細胞を移植し、得られた腹水から
回収することができる。また、ハイブリドーマ細胞の培
養上清から回収することもできる。

【００６３】回収したモノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体は、硫安沈殿、クロマトグラフィーなどの
公知の方法により分離精製することができる。本発明の
抗体はまた、アフィニティークロマトグラフィーのため
に使用され得る。このアフィニティークロマトグラフィ
ーは、該カルシウム結合タンパクの精製に用いることが
できる。抗体が固体支持体、たとえば粒子、たとえばア
ガロース、セファロース又は同様のものに結合されてい
るカラムを調製し、ここで該カルシウム結合タンパクを
含む試料をカラムに通し、カラムが洗浄され、続いて弱
い変性剤を流すことにより、精製された該カルシウム結
合タンパクが溶出される。

【００６４】本発明はまた、前記抗体を含んで成る、該
カルシウム結合タンパクの測定方法およびその断片の検
出法および測定方法を提供する。該カルシウム結合タン
パクの検出系、測定系は、均質（遊離試薬と該カルシウ
ム結合タンパク−抗体複合体との間で分離段階を含まな
い）又は不均質（分離段階を含む）であり得る。該カル
シウム結合タンパクの検出系、測定系は典型的には、該
カルシウム結合タンパクに結合親和性を有する標識され
た抗体、カルシウム結合タンパク質の源（天然に存在す
るもの又は組換えのもの）及びラベルされた遊離化合物
から結合体を分離するための手段、たとえば該カルシウ
ム結合タンパクを固定するための固相化した該カルシウ
ム結合タンパクに結合親和性を有する抗体を含んで成
る。

【００６５】これらの測定系において、抗体、又は該カ
ルシウム結合タンパクおよびその断片を、共有結合又は
非共有結合により直接的又は間接的に標識することによ
って、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に得るこ
とができる。直接的な標識には、たとえば放射性ラベ
ル、たとえば ¹²⁵Ｉ、酵素（アメリカ特許第３，６４
５，０９０号）、たとえばペルオキシダーゼ及びアルカ
リフォスファターゼ、及び蛍光ラベル（アメリカ特許第
３，９４０，４７５号）などがある。また、たとえばビ
オチニル化と、ビオチンへの上記標識群の１つで標識し
たアビジン、ストレプトアビジンの結合を包含する。た
とえば、標識されていない抗体は、その抗体を認識する
標識された第２抗体を用いることによって使用され得
る。

【００６６】得られた該カルシウム結合タンパクに対す
る抗体を用い、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、などの公
知の免疫測定法を構築することにより、該カルシウム結
合タンパクまたはその断片を検出又は測定することがで
きる。公知の免疫測定法の一つの例として、いわゆる競
合免疫測定法の応用が考えられる。例えば、検体に放射
性同位元素等で標識した該カルシウム結合タンパクを一
定量混合し、さらに抗該カルシウム結合タンパク抗体を
混合し検体中の該カルシウム結合タンパクおよび標識該
カルシウム結合タンパクと反応させる。

【００６７】検体中の該カルシウム結合タンパクは、標
識該カルシウム結合タンパクと競合して抗該カルシウム
結合タンパク抗体と反応するため、検体中に該カルシウ
ム結合タンパクが存在する分、標識該カルシウム結合タ
ンパクとの反応が減少する。反応後、抗該カルシウム結
合タンパク抗体をあらかじめ固相担体に結合させておく
か、抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡと抗該カル
シウム結合タンパク抗体を反応させること等により、結
合、非結合標識該カルシウム結合タンパクを分離する。
一般に用いられる方法により結合していない分画を除
き、結合した放射性同位元素等の標識を検出する事によ
り該カルシウム結合タンパクを測定することが可能とな
る。

【００６８】公知の免疫測定法のもう一つの例として、
いわゆる２抗体サンドイッチ系の応用が考えられる。例
えば、抗該カルシウム結合タンパク抗体をマイクロタイ
タープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン
膜等の免疫測定法に一般に用いられる固相担体に結合さ
せ、これを検体と接触させる事により、検体中の該カル
シウム結合タンパクを固相担体上にある抗該カルシウム
結合タンパク抗体と反応させる。

【００６９】一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオ
チン等で標識した抗該カルシウム結合タンパク抗体と接
触させ、担体上にある抗該カルシウム結合タンパク抗体
と結合した該カルシウム結合タンパクと反応させる。一
般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、
標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオ
チン等を検出する事により該カルシウム結合タンパクを
測定することが可能となる。

【００７０】この測定系に用いる抗該カルシウム結合タ
ンパク抗体、標識抗カルシウム結合タンパク質抗体は、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはその
組み合わせ何れを用いる事も可能である。ここで肝要な
ことは、担体に結合する抗体と該カルシウム結合タンパ
クとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み
合わせることであり、このような抗体の組み合わせは、
前述の系を組み立て、その系に適用してみることにより
選択することができる。

【００７１】また免疫組織染色により、組織中のカルシ
ウム結合タンパク質またはその断片を検出することがで
き、さらにその、組織および細胞内での局在様式を知る
ことができる。免疫組織染色に用いる抗体の標識の例と
しては、光学顕微鏡用には蛍光色素と酵素、電子顕微鏡
用にはフェリチンと金コロイドなどがある。免疫組織染
色のためには、例えば典型的には組織切片または細胞を
アルコール、アセトン、パラホルムアルデヒドなどの適
当な固定剤により固定し、抗カルシウム結合タンパク質
抗体をこれに反応させる。

【００７２】洗浄後、直接標識の場合はそのまま、間接
標識の場合はさらに標識体と反応させ洗浄した後、蛍光
標識の場合は蛍光顕微鏡により、酵素標識の場合は適当
な基質との反応後光学顕微鏡により、金属粒子標識の場
合は電子顕微鏡により標識の検出を行う。これらの免疫
測定法は、文献においても集約的に論ぜられて来た。本
発明の抗体はまた、診断のためにも有用である。

【００７３】上記免疫組織染色や免疫測定法によって得
られた結果から、カルシウム結合タンパク質の組織内お
よび細胞内における存在様式、局在様式を知ることがで
きる。それによりカルシウム結合タンパク質の生理的役
割に関する知見が得られると共に、各種疾患との関連性
も明らかにできる。疾患との関連は、その疾患における
診断薬としての有用性を示唆するものである。

【００７４】例えば、癌細胞特異的に存在する抗原であ
れば、癌マーカーとして診断に有用であり得る。また、
例えば、好中球などの炎症に関与する細胞群に多量に存
在する抗原であれば、それは炎症の進行と共に血中に漏
れ出し、その血中濃度が炎症マーカーとして診断に有用
であり得る。また、例えば、ある皮膚疾患に関連して、
異常発現する抗原であればその疾患のマーカーになり得
る。

【００７５】従って、上記該カルシウム結合タンパク又
はその断片の測定系を診断薬として用いることにより、
炎症性疾患マーカーとして、腫瘍性疾患（特に皮膚、口
腔、食道、呼吸器、子宮頚部等の扁平上皮癌）マーカー
として、皮膚疾患マーカーとして、あるいは血液疾患マ
ーカーとして検診時等での患者のスクリーニング、疾患
の性質の特定、および治療時の治療効果モニタリング等
に有用な情報が得られる。測定対照は例えば、患者の血
液、唾液等の体液、尿、便等の排出物、採取した組織、
細胞などである。

【００７６】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．プローブの調製 ウシＣＡＡＦ１のＤＮＡ配列から、種間でよく保存され
ていると予測されるＥＦハンドモチーフ領域の配列を選
び、ＰＣＲプライマーとして下記のｐｒｉｍｅｒ、ＢＰ
７／２４２−２６１（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：）と
ＢＰ７／４０８−３８９（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉ
ｍｅｒ）を合成した。

【００７７】BP7 ／242 −261 ：５′−ATCATCAACATCTT
CCACCA−３′ （配列番号：３） BP7 ／408 −389 ：５′−TCTTTATCGGCATCCAGGTC−３′
（配列番号：４） このプライマーを用いて、ヒト末梢血好中球及びヒト培
養表皮細胞（クラボウ）（血清添加後４８時間培養）よ
り抽出分離したＰｏｌｙ Ａ ＲＮＡ ５０ngより、Ｒ
ＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（宝酒造）を用い、ＲＴ−ＰＣＲ
を行った。Ｐｏｌｙ Ａ ＲＮＡを逆転写後、ｃＤＮＡ
溶液１０μｌに各プライマー３μｌ（１０pmole ／μ
ｌ）ずつを加え、１０×ＰＣＲバッファー（１００mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５００mM ＫＣｌ，１
５mM ＭｇＣｌ₂ ，０．０１％ゼラチン）１０μｌ，２
mM ｄＮＴＰ １０μｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ ０．５μｌ（５Ｕ／μｌ：宝酒造）に滅菌
蒸留水を加え１００μｌにした。ＰＣＲ反応はＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用い、９４℃１分、４８℃２分、
７２℃２分の反応を３５サイクル行った。

【００７８】いずれのサンプルからも予測された約１７
０bpのＰＣＲ産物が増幅された。ヒト末梢血好中球由来
のＤＮＡ断片をＭａｒｍａｄｅ Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ
キット（Ｂｉｏ １０１）を用いて、４％のアガロース
ゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＮｕＳｉｅｖ
ｅ ＧＴＧ３：１）で電気泳動後、精製し、１０μｌの
ＴＥ溶液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１
mM ＥＤＴＡ）に回収した。

【００７９】このＤＮＡ断片溶液５μｌを、ｐＭＯＳＢ
ｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（アマシャム）を用
いて、ｐＭＯＳＢｌｕｅベクターにライゲーションし、
このベクター液５μｌにより、大腸菌ＪＭ１０９（東洋
紡）をＨａｎａｈａｎの方法(DNA cloning：A practica
l approach(ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC pres
s,(1985))に従って形質転換させた。Ｘ−ｇａｌを含む
Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する
事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損
のコロニーを選択した。

【００８０】選択したクローンを、２×ＹＴ−ａｍｐ培
地（１．６％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、
０．５％ ＮａＣｌ、１００μｇ／mlアンピシリン）で
培養し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてメーカーの
推奨する方法に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。調
製したＤＮＡを、ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて、メーカーの推
奨する条件に従って反応させ、Ａ．Ｌ．Ｆ．IIＤＮＡ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア）により塩基配列を
決定した。この配列はウシＣＡＡＦ１の塩基配列と約８
０％の相同性を持つことを確認した。

【００８１】さらに、得られた塩基配列の検証を目的に
下記のプライマーＰＭＮ．ＨＰ７Ｓ１−１５，ＰＭＮ．
ＨＰ７Ａ １２６−１１２を合成し、前述のＰｏｌｙ
ＡＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ
（宝酒造）を用い同様の方法で、９４℃１分、５０℃１
分、７２℃２分の反応条件のもと３５サイクル行った。 PMN.HP7S 1−15：５′−TACTCAGTTCGGAAG −３′
（配列番号：５） PMN.HP7A 126− 112：５′−TTGGAATATTTCATC −３′
（配列番号：６）

【００８２】いずれのサンプルからも予測された約１３
０bpのＰＣＲ産物が増幅された。ヒト末梢血好中球由来
のＤＮＡ断片をＭａｒｍａｄｅ Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ
キット（Ｂｉｏ １０１）を用いて、４％のアガロース
ゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＮｕＳｉｅｖ
ｅ ＧＴＧ３：１）で電気泳動後、精製し、このＤＮＡ
断片をＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲIIベクターにライゲーション
した。このベクター液５μｌにより、大腸菌ＪＭ１０９
（東洋紡）をＨａｎａｈａｎの方法(DNA Cloning：A pr
actical approach(ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC
press, (1985))に従って形質転換させ、Ｘ−ｇａｌを含
むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択す
る事により、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠
損のコロニーを選択した。

【００８３】選択したクローンｐＨＰ７／ＰＭＮを、２
×ＹＴ−ａｍｐ培地（１．６％バクト−トリプトン、１
％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１００μｇ／mlア
ンピシリン）で培養し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｅｐ ＤＮ
Ａ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用
いてメーカーの推奨する方法に従ってＤＮＡを精製し
た。調製したＤＮＡを、ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて、メーカ
ーの推奨する条件に従って反応させ、Ａ．Ｌ．Ｆ．II
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア）により塩
基配列を決定した。この配列はウシＣＡＡＦ１の塩基配
列と約８０％の相同性を有し、前述の塩基配列とその重
複部分が完全に一致した。

【００８４】得られたクローンｐＨＰ７／ＰＭＮのＤＮ
Ａ２μｇを、ＥｃｏＲＩ（２０Ｕ／μｌ：宝酒造）によ
り３７℃で１時間反応させて切断した。このＤＮＡ断片
全量を４％のアガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ：ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧ３：１）で電気泳動
し、約１３０bpのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。こ
のＤＮＡ断片をＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ
１０１）を用いて精製し、１０μｌのＴＥ溶液（１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ）に
回収した。

【００８５】このＤＮＡ断片溶液３μｌ（約２５ng）を
鋳型ＤＮＡとして、メガプライムＤＮＡ標識システム
（アマシャム）を用い、メーカーの推奨する方法に従っ
て、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシャム）で標識した。
標識終了後、Ｎｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（ファルマシア）
を用いて標識ＤＮＡを精製した。これを³²Ｐ標識プロー
ブとして、ヒトＣＡＡＦ１ ｃＤＮＡの単離に用いた。

【００８６】実施例２．ヒトＣＡＡＦ１ ｃＤＮＡの単
離と塩基配列決定 ヒト成人食道組織０．５ｇから、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジ
ーン）を用いてＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡ約１．
５mgを得た。このトータルＲＮＡより、Ｏｌｉｇｏｔｅ
ｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（日本ロシュ）を用いメー
カーの推奨する方法に従ってＰｏｌｙ Ａ ＲＮＡを調
製し、約５０μｇのＰｏｌｙ Ａ ＲＮＡを得た。

【００８７】このＰｏｌｙ Ａ ＲＮＡ ５μｇより、
ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する
方法に従いｃＤＮＡを合成した。プライマーには、Ｎｏ
ｔＩ／Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８ ｐｒｉｍｅｒ（Ｄｉｒ
ｅｃｔｉｏｎａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ、
ファルマシア）を用いた。合成したｃＤＮＡの両端にＥ
ｃｏＲＩアダプターを結合させ燐酸化処理をし、さらに
ＮｏｔＩを加えて消化した後、脱燐酸化処理をしたλＥ
ｘＣｅｌｌ（λＥｘＣｅｌｌ ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／
ＣＩＰ、ファルマシア）に組み込んだ。

【００８８】次に、Ｇｉｇａｐａｃｋ III Ｇｏｌｄ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いメーカーの推奨
する方法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング反
応を行った。反応終了後、パッケージング反応液の一部
をマルトース添加ＮＺＹ培地（１０ｇ／ｌ ＮＺ ａｍ
ｉｎｅ，５ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，５ｇ
／ｌ ＮａＣｌ，２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ）で
培養し、１０mM ＭｇＳＯ₄ にＯＤ６００＝２．０とな
るように再懸濁させた大腸菌ＮＭ５２２株に感染させ
た。その結果パッケージング反応液中には１．０×１０
⁶ pfu ／mlの感染能力のあるファージが存在した。

【００８９】作成したヒト成人食道由来ｃＤＮＡライブ
ラリーを、大腸菌ＮＭ５２２株に感染させ、９０mmディ
シュあたり１×１０⁴ プラークとなるように蒔いた。こ
の９０mmディシュを２０枚作成し、約２．０×１０⁵ の
プラークを形成させた。形成したプラークをＨｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ⁺ 膜（アマシャム）に転写し、膜を０．５ＭＮａ
ＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で２分、０．５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で
５分処理し、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１Ｍ酢酸アン
モニウムでよく洗浄後、濾紙上で風乾させた。

【００９０】プラークＤＮＡの結合した膜面をＵＶ処理
し、ＤＮＡを膜にクロスリンキングさせた。この膜を、
プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＮＥＴ、０．２
×Ｂｌｏｔｔｏ、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤ
Ｓ、２００μｇ／ml変成サケ精子ＤＮＡ）中で、４２℃
２時間保温し、ブロッキングした。プレハイブリダイゼ
ーション溶液を捨て、新しいハイブリダイゼーション溶
液（５×ＮＥＴ、０．１×Ｂｌｏｔｔｏ、３０％ホルム
アミド、０．４％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、２
００μｇ／ml変成サケ精子ＤＮＡ）に、９６℃５分処理
後の急冷により１本鎖に変成させた³²Ｐ標識プローブを
加え、膜を浸し、４２℃で１晩保温し、ハイブリダイズ
させた。

【００９１】膜を２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液で室
温１５分、同じ組成の溶液で５０℃１５分、続いて０．
５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で５０℃１５分、さら
に同じ組成の溶液で５０℃１５分、洗浄した。これを露
光フィルムとカセットに入れ、−８０℃で１昼夜露光さ
せ、現像した。ハイブリダイズシグナルが検出された領
域のプラークを回収し、さらに同様の方法でプラークを
形成させ、プラークの単離を行った。このようにして目
的のＤＮＡ断片を含む１個のファージクローンλＥｘＣ
ｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０を得た。

【００９２】ファージクローンλＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７
／ＥＳＯ３１０を大腸菌ＮＰ６６株に感染させることよ
り、λＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０からファー
ジミドｐＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０をｉｎ
ｖｉｖｏで放出させ、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ
ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て分離回収した。次に精製したｐＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７
／ＥＳＯ３１０を大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡）に感染さ
せ形質転換させた。Ｘ−ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプレー
トに蒔き、白色のコロニーを選択する事により、アンピ
シリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択
した。

【００９３】選択したコロニーをヘルパーファージＶＣ
ＳＭ−１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に２×ＹＴ−
ａｍｐ培地（１．６％バクト−トリプトン、１％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｌ、アンピシリン１００μｇ／m
l、カナマイシン４０μｇ／ml）で培養し、Ｗｉｚａｒ
ｄ Ｍ１３ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーの推奨する方法に従っ
て一本鎖ＤＮＡを分離精製した。

【００９４】ｐＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０の
一本鎖ＤＮＡ ２μｇを、ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて、メー
カーの推奨する条件に従って反応させ、Ａ．Ｌ．Ｆ．II
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア）により
塩基配列を決定した。この配列はウシＣＡＡＦ１の塩基
配列と７３％の相同性を有し、前述のｐＨＰ７／ＰＭＮ
の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。

【００９５】さらに、得られた塩基配列の検証を目的に
下記のプライマーを合成し、ヒト成人食道由来のＰｏｌ
ｙ Ａ ＲＮＡ １００ngより、ＲＴ−ＰＣＲを行っ
た。第１鎖ｃＤＮＡは、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ＧＯ Ｔ−
Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（フ
ァルマシア）を用いて、メーカーの推奨する方法に従い
合成した。ＰＣＲは９４℃１分、６０℃１分、７２℃１
分の反応条件のもと３５サイクル行った。 HP7S 7−26：５′−ACATTAGGCTGGGAAGATGA−３′ （配
列番号：７） HP7A 336−317 ：５′−GGACATTGCTGGGTAAAAAG−３′
（配列番号：８）

【００９６】その結果、予測された３３０bpのＰＣＲ産
物が増幅され、４％のアガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ３：１）で
電気泳動後、精製し、このＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｍ
ａＩで消化したＰＣＲＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）に組み込んだ。このベクターｐＨＰ７／
ＥＳＯにより、大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡）を形質転換
させ、Ｘ−ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白
色のコロニーを選択する事により、アンピシリン耐性で
βガラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。

【００９７】選択したクローンを、ヘルパーファージＶ
ＣＳＭ−１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に２×ＹＴ
−ａｍｐ培地（１．６％バクト−トリプトン、１％酵母
エキス、０．５％ ＮａＣｌ、アンピシリン１００μｇ
／ml、カナマイシン４０μｇ／ml）で培養し、Ｗｉｚａ
ｒｄ Ｍ１３ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を用いてメーカーの推奨する方法に従っ
て一本鎖ＤＮＡを分離精製した。

【００９８】ｐＨＰ７／ＥＳＯの一本鎖ＤＮＡ ２μｇ
を、ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ
（ファルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に
従って反応させ、Ａ．Ｌ．Ｆ．II ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ（ファルマシア）により塩基配列を決定した。
この配列は前述のｐＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１
０の塩基配列とその重複部分が完全に一致した。一方、
ヒト好中球由来のＰｏｌｙ Ａ ＲＮＡを用いて、同様
にＲＴ−ＰＣＲを行い、塩基配列を決定し、ｐＥｘＣｅ
ｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０の塩基配列の確認を行っ
た。

【００９９】ヒト成人好中球由来のＰｏｌｙ Ａ ＲＮ
Ａ １００ngから、ＴａＫａＲａＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉ
ｔ（宝酒造）を用いて、メーカーの推奨する方法に従
い、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、プライマー
に上記のＨＰ７Ｓ ７−２６，ＨＰ７Ａ ３３６−３１
７を用い、９４℃１分、５８℃１分、７２℃２分の反応
条件のもと３５サイクル行った。

【０１００】その結果、予測された３３０bpのＰＣＲ産
物が増幅された。この一部を、４％のアガロースゲル
（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＮｕＳｉｅｖｅ Ｇ
ＴＧＡｇａｒｏｓｅ）で電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲル
から回収精製した。このＤＮＡ断片を、ＴＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、メー
カーの推奨する方法に従って、ｐＣＲIIベクター（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９（東
洋紡）を形質転換させた。これをＸ−ｇａｌを含むＬ−
ａｍｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択する事に
より、アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ欠損のコ
ロニーを選択した。

【０１０１】選択したコロニーを、２ｘＹＴ−ａｍｐ培
地（１．６％バクト−トリプトン、１％酵母エキス、
０．５％ＮａＣｌ、アンピシリン１００μｇ／ml、カナ
マイシン４０μｇ／ml）で培養し、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーの
推奨する方法に従いＤＮＡを調製した。このプラスミド
ＤＮＡを、ｐＨＰ７／ＮＥＵと名付けた。

【０１０２】ｐＨＰ７／ＮＥＵ ＤＮＡ１０μｇを、Ａ
ｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ファ
ルマシア）を用いて、メーカーの推奨する条件に従って
反応させ、Ａ．Ｌ．Ｆ．II ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒ（ファルマシア）によりベクターに組み込まれたＤＮ
Ａの塩基配列を決定した。この配列は前述のｐＥｘＣｅ
ｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０の塩基配列とその重複部分
が完全に一致した。

【０１０３】また、ヒトケラチノサイトについても同様
にＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅物の塩基配列を決定したと
ころ、ｐＥｘＣｅｌｌ／ＨＰ７／ＥＳＯ３１０の塩基配
列とその重複部分が完全に一致した。決定された全塩基
配列を、図１に示す。この塩基配列から、ヒトＣＡＡＦ
１の一次翻訳産物のアミノ酸配列、即ち、起こりうる翻
訳後修飾前のアミノ酸配列が導き出される。

【０１０４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴：ヒト由来のカルシウム結合タンパクをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるアミ
ノ酸配列。 配列 GGTTAACATT AGGCTGGGAA G ATG ACA AAA CTT GAA GAG CAT CTG GAG 48 Met Thr Lys Leu Glu Glu His Leu Glu 5 GGA ATT GTC AAT ATC TTC CAC CAA TAC TCA GTT CGG AAG GGG CAT 93 Gly Ile Val Asn Ile Phe His Gln Tyr Ser Val Arg Lys Gly His 10 15 20 TTT GAC ACC CTC TCT AAG GGT GAG CTG AAG CAG CTG CTT ACA AAG 138 Phe Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu Leu Lys Gln Leu Leu Thr Lys 25 30 35 GAG CTT GCA AAC ACC ATC AAG AAT ATC AAA GAT AAA GCT GTC ATT 183 Glu Leu Ala Asn Thr Ile Lys Asn Ile Lys Asp Lys Ala Val Ile 40 45 50 GAT GAA ATA TTC CAA GGC CTG GAT GCT AAT CAA GAT GAA CAG GTC 228 Asp Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ala Asn Gln Asp Glu Gln Val 55 60 65 GAC TTT CAA GAA TTC ATA TCC CTG GTA GCC ATT GCG CTG AAG GCT 273 Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser Leu Val Ala Ile Ala Leu Lys Ala 70 75 80 GCC CAT TAC CAC ACC CAC AAA GAG TAGGTAGCTC TCTGAAGGCT 317 Ala His Tyr His Thr His Lys Glu 85 90 TTTTACCCAG CAATGTCCTC AATGAGGGTC TTTTCTTTCC CTCACCAAAA 367 CCCAGCCTTG CCCGTGGGGA GTAAGAGTTA ATAAACACAC TCACGAAAAG 417 TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA TTCT 441

【０１０５】配列番号：２ 配列の長さ：４２９ 配列の型： 鎖の数：二本鎖 配列の種類： 配列の特徴：ウシ羊水由来のカルシウム結合タンパクの
アミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列。 配列 CTGGCATTCC ACACTTCTGT GCAGAGGGGT GAACGTAGTT TGGTAAA ATG 50 Met 1 ACT AAG CTG GAA GAT CAC CTG GAG GGA ATC ATC AAC ATC TTC CAC 95 Thr Lys Leu Glu Asp His Leu Glu Gly Ile Ile Asn Ile Phe His 5 10 15 CAG TAC TCC GTT CGG GTG GGG CAT TTC GAC ACC CTC AAC AAG CGT 140 Gln Tyr Ser Val Arg Val Gly His Phe Asp Thr Leu Asn Lys Arg 20 25 30 GAG CTG AAG CAG CTG ATC ACA AAG GAA CTT CCC AAA ACC CTC CAG 185 Glu Leu Lys Gln Leu Ile Thr Lys Glu Leu Pro Lys Thr Leu Gln 35 40 45 AAC ACC AAA GAT CAA CCT ACC ATT GAC AAA ATA TTC CAA GAC CTG 230 Asn Thr Lys Asp Gln Pro Thr Ile Asp Lys Ile Phe Gln Asp Leu 50 55 60 GAT GCC GAT AAA GAC GGA GCC GTC AGC TTT GAG GAA TTC GTA GTC 275 Asp Ala Asp Lys Asp Gly Ala Val Ser Phe Glu Glu Phe Val Val 65 70 75 CTG GTG TCC AGG GTG CTG AAA ACA GCC CAC ATA GAT ATC CAC AAA 320 Leu Val Ser Arg Val Leu Lys Thr Ala His Ile Asp Ile His Lys 80 85 90 GAG TAGGAA GCTCTTTCCA GCAATGTCCC CAAGAAGACT TACCCTTCTC 369 Glu CTCCCTGAGG CTGCCTTACC CGAGGGAAGA GAGAATTAAT AAACGTACTT 419 TGGCAAAGTT 429

【０１０６】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 ATCATCAACA TCTTCCACCA 20

【０１０７】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 TCTTTATCGG CATCCAGGTC 20

【０１０８】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG 24

【０１０９】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 TTGACACCAG ACCAACTGGT AATG 24

【０１１０】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 ACATTAGGCT GGGAAGATGA 20

【０１１１】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 GGACATTGCT GGGTAAAAAG 20

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１１月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０８】配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 TACTCAGTTC GGAAG 15

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０９】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成 配列 TTGGAATATT TCATC 15

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 8828−4Ｂ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｄ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山口 建 東京都中央区築地５丁目１番１号 国立が んセンター内 (72)発明者 山村 篤司郎 東京都中央区築地５丁目１番１号 国立が んセンター内

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列と実質
   的に同一のアミノ酸配列を含んで成るカルシウム結合タ
   ンパク。
2. 【請求項２】 配列番号：１に示すアミノ酸配列から成
   るカルシウム結合タンパクＣＡＡＦ１。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のタンパクの部分
   であるタンパク又はペプチド。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタ
   ンパク又はペプチドと他のタンパク又はペプチドとから
   成る融合タンパク。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタ
   ンパクをコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号：１に示すヌクレオチド配列を
   有するＤＮＡとハイブリダイズすることができ、且つカ
   ルシウム結合活性を有するタンパクをコードしているＤ
   ＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載のＤＮＡに遺伝的
   制御要素が結合して成る組換えＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 前記遺伝的制御要素が原核性プロモータ
   ー系又は真核性発現制御系である請求項７に記載の組換
   えＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 請求項７又は８に記載の組換えＤＮＡ分
   子を含んで成る発現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の発現ベクターにより
    形質転換された組換え宿主。
11. 【請求項１１】 宿主が原核細胞又は真核細胞である請
    求項１０に記載の組換え宿主。
12. 【請求項１２】 原核細胞が細菌である、請求項１１に
    記載の組換え宿主。
13. 【請求項１３】 前記細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
    ｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１２に記載の組換え
    宿主。
14. 【請求項１４】 前記真核細胞が酵母又は糸状菌であ
    る、請求項１１に記載の組換え宿主。
15. 【請求項１５】 前記真核細胞が植物細胞又は動物細胞
    である請求項１１に記載の組換え宿主。
16. 【請求項１６】 請求項２に記載のカルシウム結合タン
    パクの製造方法であって、ヒトの組織から該タンパクを
    単離することを特徴とする方法。
17. 【請求項１７】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    タンパクの製造方法であって、該タンパクをコードする
    ＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された
    宿主を培養し、培養物から該タンパクを採取することを
    特徴とする方法。
18. 【請求項１８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    タンパクに対して結合親和性を有する抗体。
19. 【請求項１９】 ポリクローナル抗体又はモノクローナ
    ル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のモノクローナル抗
    体を産生するハイブリドーマ。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のハイブリドーマを
    培養することを特徴とする、請求項１９に記載のモノク
    ローナル抗体の製造方法。
22. 【請求項２２】 請求項１８又は１９に記載の抗体を含
    んで成る、炎症性疾患、腫瘍性疾患（特に扁平上皮
    癌）、皮膚疾患、又は血液疾患の診断薬。
23. 【請求項２３】 請求項１８又は１９に記載の抗体を含
    んで成るカルシウム結合タンパク測定用試薬。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の試薬を使用するこ
    とを特徴とする、カルシウム結合タンパクの測定方法。