CN101449163B - S100a12蛋白作为结肠直肠癌标记的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结肠直肠癌的诊断。描述了蛋白S100A12在结肠直肠癌诊断中的用途。本发明涉及从来源于个体的粪便样品中通过测定所述样品中的S100A12来诊断结肠直肠癌的方法。S100A12的测定可用于例如结肠直肠癌的早期检测或诊断。

Description

S100A12蛋白作为结肠直肠癌标记的用途
本发明涉及结肠直肠癌的诊断。描述了S100A12蛋白(＝钙粒蛋白)作为标记分子在结肠直肠癌诊断中的用途。另外，特别涉及从来源于个体的粪便样品中，通过测定所述样品中的S100A12来进行结肠直肠癌诊断的方法。S100A12的测定可用于例如结肠直肠癌的早期检测和诊断。
尽管检测和治疗手段不断进步，癌症仍构成主要的公众健康威胁。在各种癌症中，结肠直肠癌(＝CRC)是西方世界最常发生的癌症之一。
癌症被检测/诊断的越早，则总的存活率越高。特别是对CRC更是如此。肿瘤在发展期的预后是较差的。超过三分之一的患者在诊断后五年内将死于进行性疾病，对应的五年存活率约为40％。目前的治疗仅仅是治愈一部分患者，而且无疑对那些在疾病早期阶段即被诊出的患者有最好的效果。
对于作为公众健康问题的CRC，有必要开发更为有效的筛选和预防结肠直肠癌的方法。
目前对结肠直肠癌最早的检测方法包括对粪便血的检测或内窥镜方法。不过，典型地，在进行粪便血检测前必需有相当大的肿瘤体积。对于从粪便样品中检测CRC，目前该领域中应用是愈创木脂法便潜血试验。
近年来，已报道了大量所谓的结肠特异的、或所谓的结肠直肠癌特异的基因。最主要的相关研究文章或专利申请是基于通过分析结肠(癌)组织相对于不同组织或邻近的正常组织中的RNA表达模式而获得的数据。这些方法可概括为差异mRNA展示技术。
作为从mRNA展示技术获得的数据的实施例，可参见并讨论WO01/96390。该申请描述并请求保护超过200个分离的多核苷酸和相应的多肽、及其在检测CRC中的用途。但通常已知mRNA水平的差异并不真实反应相应的蛋白水平。由少量mRNA编码的蛋白可能具有很高的量，而由丰富mRNA编码的蛋白可能很难被检测和发现。这种mRNA水平和蛋白水平间缺乏一致性是由于例如mRNA稳定性、翻译效率、蛋白稳定性等原因造成的。
也发展了新的方法来研究不同组织或健康与疾病组织间蛋白图谱(protein pattern)的差异，从而鉴定出可用于CRC诊断的候选标记分子。Brünagel，G.et al.，Cancer Research 62(2002)2437-2442，鉴定了7种与邻近正常组织相比，在CRC组织中更为丰富的核基质蛋白。但没有来自个体体液和粪便样品的数据的报道。
WO 02/078636通过表面增强的激光解析附离子化(SELDI)技术发现了约9个结肠直肠癌相关的斑点。与健康对照血清相比，这些斑点在来自CRC患者的血清中更经常被发现。但对这种斑点中所含分子的鉴定，例如(其序列)还是未知的。
尽管在CRC领域中候选蛋白标记的清单很庞大并且仍在增加，但迄今对这些分子的临床/诊断用途还是未知的。为了具有临床应用价值，作为单标记的新型诊断标记应该至少与本领域已知的最好的单标记一样好用。或者，新型标记如果单独使用、或与一个或多个其它标记联合使用时，应该在诊断灵敏度和/或特异性上更进一步。检测的诊断灵敏度和/或特异性通常以其受体操作性来进行评估，将在下文进行详细所述。
例如，目前有一种基于检测肿瘤相关糖蛋白——癌胚抗原(CEA)的诊断性血液检测，在CRC领域用于辅助诊断。CEA在95％的患有结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌的患者的组织样品中、及大多数乳腺癌、肺癌及头颈部癌中是增加的(Goldenberg，D.M.et al.，J.Natl.CancerInst.(Bethesda)57(1976)11-22)。也在患有非恶性疾病的患者中报道了增加的CEA水平，而许多患有结肠直肠癌的患者在血清中具有正常的CEA水平，特别是在疾病的早期阶段(Carriquiry，LA.and Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.et al.，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.et al.，N.Eng 1.J.Med.299(1978)448-451)。据报道使用从血清或血浆中测定的CEA来检测复发是有争议的，但仍被广泛使用(Martell，R.E.et al.，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.et al.，JAMA 270(1993)943-947)。
根据可获得的数据，血清CEA测定缺乏使其在无症状群体中用作结肠直肠癌筛选检测法的灵敏度及特异性(Reynoso，G.et al.，JAMA220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clin.Chem.48(2002)1151-1159)。
从粪便提取的样品其优势在于可通过非侵入方式尽可能早地进行取样。
如上所述，愈创木脂试验是目前使用最广泛的从粪便中检测CRC的方法。但愈创木脂试验具有较低灵敏度和特异性。基于愈创木脂的粪便潜血检测法的灵敏度约为26％，这表明约74％患有恶性疾病的患者没有被检测出来(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。
癌症前期和癌损伤的造影术是早期检测的最好方法，但结肠镜检查是侵入性的，而且花费、风险和并发疾病的可能性均很高(Silvis，S.E.et al.，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.et al.，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.et al.，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
最近，Sieg，A.等已调查了愈创木脂试验的诊断性替代方法的灵敏度和特异性Int.J.Colorectal Dis.14(1999)267-271。特别是对粪便样品中的血红蛋白和血红蛋白-触珠蛋白复合物的测定进行了比较。已发现血红蛋白检测法对结肠直肠瘤的检测灵敏度不令人满意。而在其进行性癌变阶段的癌症检出灵敏度约为87％，没有足够的灵敏度检测出更早的肿瘤阶段。血红蛋白-触珠蛋白复合物检测法在检测早期阶段的CRC方面具有更高的灵敏度。但更灵敏的检测伴随着较差的特异性。但是，由于较差的特异性导致大量不必要的后继检查，例如结肠镜检查，因此具有较差特异性的检测法也无法满足通常可接受的筛选方法的要求。
已在美国5,455,160，及相应地在由Roseth，A.G等发表的科学论文(Scand.J.Gastroenterol.27(1992)793-798；Scand.J.Gastroenterol.28(1993)1073-1076)中描述了可作为从粪便样品中检测CRC的替代分子标记——钙防卫蛋白。虽然钙防卫蛋白是炎症疾病的标记，但其作为标记从粪便中检测CRC的潜力已被一些文献所公开(Johne，B.，etal.，Scand.J.Gastroenterol.36(2001)291-296；Limburg，P.J.，et al.，Am.J.Gastroenterol.98(2003)2299-2305；Hoff，G.，et al.，Gut 53(2004)1329-1333)。当钙防卫蛋白的灵敏度和特异性与免疫血红蛋白检测法相比较时，钙防卫蛋白比血红蛋白表现出某些更利于作为诊断生物标记物的特性。它在粪便中均匀分布，在室温下稳定，从而便于将样品递送到实验室，而且它与食物成分或药物化合物没有干扰性(Ton，H.，et al.，Clin.Chim.Acta 292(2000)41-54)。但随着钙防卫蛋白浓度增加，则在患有CRC、克罗恩病或炎症性肠病患者的粪便样品中检测到S100A8和S100A9的异源二聚体。这些结果与钙防卫蛋白在炎症反应中更普遍的作用是一致的(Ryckman，C.，et al.，J.Immunol.170(2003)3233-3242)。因此，钙防卫蛋白在胃肠病学中的用途不仅仅局限于检测CRC，也可以检测其它疾病，特别是炎症性肠病，如Poullis，A.，etal.(J.Gastroenterol.Hepatol.18(2003)756-762)所述。
最近发表了作为愈创木脂试验的替代方法的另一种从粪便中检测CRC的，其包括通过免疫组织化学法在脱落在粪便中的结肠细胞内检测结肠直肠癌特异性抗原“微小染色体维持蛋白2”(MCM2)。由于进行的研究较少，因此其在检测结肠直肠癌上诊断价值的结论只是初步的。但该检测法似乎只有较低的灵敏度来检测右侧直肠癌(Davies，R.J.et al.，Lancet 359(2002)1917-1919)。
最近，在市场上引入了一种检测丙酮酸激酶M2同工酶(M2-PK)的方法(Schebo Biotech，Gieβen，Germany)。例如Vogel，T.等，Dtsch.Med.Wochenschr.130(2005)872-877已进行了对愈创木脂试验与血红蛋白及M2-PK免疫检测法的比较。他们表明免疫检测法优于愈创木脂试验，而且在同等特异性的情况下，与血红蛋白检测法相比，M2-PK检测法在检测CRC时的灵敏度更低。但作者认为这两种基于粪便的检测方法的应用性均值得商榷。
通过非侵入性方式从粪便样品中进行可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期CRC肿瘤标记的鉴定，能够用来进行诊断性检测，从而极大地辅助诊断及对该病的管理。因此，对于改进CRC诊断，特别是从粪便中的诊断具有迫切的临床需求。改进CRC的早期诊断特别重要，因为早期诊断患者的存活机会远远高于在疾病发展期被诊断的患者。
本发明的目标是调查是否可鉴定一种新型的、辅助的CRC诊断的标记。优选地，这种标记存在于粪便中，可进行非侵入性诊断。
令人惊讶的是，已发现用S100A12蛋白作为CRC的标记至少可克服本领域已知的部分问题。
因此，本发明涉及一种诊断结肠直肠癌的方法，包括以下步骤a)提供从个体获得的粪便样品，
b)将所述样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12形成复合物的条件下接触，
c)测定步骤(b)中形成的复合物的量，及
d)将(c)中测定的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
如本领域技术人员所知，可在体外进行任何这种S100A12的测定。然后将患者样品丢弃。患者样品仅用于本发明的体外方法中，没有患者样品的材料会转移回患者体内。也不会在人或动物体内进行关于S100A12的测定或CRC的评估。
根据本发明所述的体外诊断方法用于评估S100A12在粪便样品中是否存在或其相对浓度。例如，测定的S100A12的值可在医生评估CRC进行临床诊断和/或确定合适的治疗方案时起辅助作用。
在一个优选实施方案中，对粪便样品进行处理，以获得比粪便样品易于操作的处理后的液体样品。然后将这种处理后的样品与S100A12的特异结合剂一起温育。因此，本发明也涉及一种诊断结肠直肠癌的方法，包括以下步骤
a)提供从个体获得的粪便样品，
b)处理所述样品，以获得处理后的液体样品，
c)将所述处理后的液体样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂和S100A12之间形成复合物的条件下接触，及
d)将(c)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
本发明另一个优选实施方案是一种诊断结肠直肠癌的方法，包括以下步骤
a)处理从个体获得的粪便样品，以获得处理后的液体样品，
b)将所述处理后的液体样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂和S100A12之间形成复合物的条件下接触，
c)测定步骤(b)中形成的复合物的量，及
d)将(c)中测定的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
在进一步优选的实施方案中，本发明描述了一种诊断结肠直肠癌的方法，包括以下步骤：提供从个体获得的粪便样品，将所述样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12之间形成复合物的条件下接触，将所述样品与第二标记的特异结合剂在适于所述结合剂和第二标记之间形成复合物的条件下接触，检测S100A12和至少一种第二标记形成的复合物的量，然后将测定的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联，所述的第二标记的特异性结合剂选自血红蛋白/触珠蛋白复合物、血红蛋白、金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)及肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)。在进一步优选的实施方案中，本发明中的方法是基于分别测定S100A12和作为第二标记的血红蛋白、测定S100A12和作为第二标记的血红蛋白/触珠蛋白复合物、测定S100A12和作为第二标记的TIMP-1、及测定S100A12和作为第二标记的M2-PK的量。对技术人员显而易见的是，测定S100A12及测定至少一种第二标记可分别对同一份粪便样品、或处理后的粪便样品进行，或分别对患者的不同份的粪便样品，或对患者经处理后的不同份粪便样品进行。
在进一步优选的实施方案中，粪便样品被处理，以回收结肠细胞，然后将其在显微载玻片上涂片。然后将这种处理后的样品与S100A12特异结合剂一起温育。因此，本发明也涉及一种诊断结肠直肠癌的方法，该方法包括以下步骤
a)提供从个体获得的粪便样品，
b)处理所述样品，以回收结肠细胞，
c)将所述处理样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂和S100A12形成复合物的条件下接触，及
d)将(c)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
S100A12蛋白(＝钙粒蛋白C)以SEQ ID NO：1所示的序列为特征。
S100A12也称为CAAF1；CAGC；羊水中的钙结合蛋白；钙粒蛋白相关蛋白；CGRP；羊水1中的钙结合蛋白；钙粒蛋白C；ENRAGE(细胞外新鉴定的RAGE结合蛋白)；中性粒细胞S100蛋白；S100钙结合蛋白A12。由该基因编码的蛋白是含2个EF-手性钙结合部分的S100蛋白家族的成员。S100蛋白位于多种细胞的细胞质和/或细胞核中，参与多种细胞过程，例如细胞周期进程及分化的调控。S100基因包括至少13个以簇的形式位于染色体1q21上的成员。该蛋白可能参与特异的、钙依赖的信号传导途径，其对细胞骨架组分的调控作用可能调控多种中性粒细胞的活性。
S100A12的生理相关结构是Ca2+-结合同源二聚体。由于S100A12也从细胞中释放出来，因此其细胞外功能，例如调控炎症过程已有描述(Foell，D.et al.Clin.Chim.Acta 344(2004)37-51)。S100A12与S100A8(＝钙粒蛋白A)和S100A9(钙粒蛋白B)一起在粒细胞中表达，其中钙粒蛋白在可溶性胞质蛋白中含量达50％。在急性炎症中，S100A12被释放，已在不同的疾病，包括肠易激症、克隆氏症、川崎氏病或类风湿关节炎中发现该蛋白(Burmeister，G.and Gallacchi，G.，Inflammopharmacology 3(1995)221-230；Foell，D.et al.，Rheumatology42(2003)1383-1389)。在研究S100A12应答的级联信号时发现，它通过晚期糖基化终产物受体(＝RAGE)与一种新型的炎症中枢(inflammatory axis)连接。该受体可存在于多种类型的组织、包括例如内皮和免疫系统的细胞中(Hofmann，M.A.et al.，Cell 97(1999)889 901；Schmidt，A.M.et al.，J.Clin.Invest.108(2001)949-955)。除了参与炎症应答，也报道了RAGE途径参与伤口愈合、肿瘤生长或系统性淀粉样变病(Hofmann，M.A.et al.，supra；Schmidt，A.M.et al.，supra；Yan，S.S.et al.，Nat.Med.9(2003)287-293；Hofmann，M.A.et al.，Genes Immun.3(2002)123-135)。因此，S100A12可能具有广泛的作用。但迄今没有与肿瘤进展相关性的描述。
在一个优选实施方案中，使用新型标记S100A12来筛选CRC。当用于患者监测时，如本发明所述的诊断方法可在随访患者中辅助评估肿瘤负荷、治疗效果和肿瘤的复发。S100A12的水平增加与肿瘤负荷直接相关。在短期化疗后(几小时到14天)，S100A12的增加可作为肿瘤细胞死亡的指示物。在手术和/或化疗后的长期随访患者(从3个月到10年)中，S100A12的增加可作为在结肠直肠中肿瘤复发的指示物。
在一个优选实施方案中，如本发明所述的诊断方法可用于筛选目的。即，通过测定粪便样品中的S100A12水平，并将所测定的水平与是否存在CRC相关联，对前期没有诊断为CRC的患者进行评估。
如技术人员所知，在这种筛选方法中，需注意应使用合适量的粪便样品。优选地，使用确定量的粪便样品来测定其所含的S100A12。优选地，S100A12的量以每粪便样品中S100A12的量来表示，即给出S100A12的相对浓度。
该诊断方法不仅可用于筛选普通无症状群体，在可选择的优选实施方案中，也用于监测高危个体。这种高危个体优选地选自具有缺铁性贫血、CRC患者的一级亲属、具有CRC家族史的患者及具有新检测的鼻息肉或有胃肠道肿瘤家族史的患者。
对于筛选检测法而言，并非仅有AUC值是相关的。在筛选时至关重要的必要条件是在特异性很高并且是临床相关水平时，要具有足够好的灵敏度。高特异性非常关键，因为如果不能达到这个要求，则可能造成很高的假阳性结果，并在随后的过程中给患者带来不必要的痛苦。在其它优选实施方案中，与临床相关筛选群体的CRC阴性个体相比较，将特异性水平分别设定为96％、97％、98％或99％。
如技术人员所知，S100A12的截断值(cutoff value)是基于在来源于健康正常人群的粪便样品所测定的S100A12值来确定的。在筛选时，临床相关的正常人群优选地由年龄为55到65岁的健康人组成。粪便样品中的S100A12值在确定的截断值之上可认为是CRC的指示，或至少可以据此确定该个体应进行进一步的诊断检测。
结肠直肠癌特别易于从腺瘤(息肉)发展为恶性肿瘤。
根据程度、进展和严重性对癌症的阶段进行疾病分类。从而将癌症患者分组，以便于对进展和治疗选择进行归一化。
CRC的不同阶段通常根据Dukes’阶段A到D进行划分。目前，TNM系统是最广泛使用的解剖学范畴的癌症分类。它代表一种国际上所接受的、统一的分段系统。共有3个基本变量：T(原发肿瘤的程度)、N(区域性淋巴结状态)及M(是否存在向远处转移)。TNM标准由UICC(国际抗癌联盟)公布(Sobin，L H.，Wittekind，Ch.(eds)：恶性肿瘤的TNM分类，第六版，2002)。一旦确定TNM状态，则患者被分组到由罗马数字I到IV所表示的疾病阶段，其中IV是最高级的疾病状态。TNM阶段和UICC疾病阶段是相互对应的，如下表1所示，引自Sobin LH.and Wittekind(eds.)，同上。
表1：TNM阶段和UICC疾病阶段的相互关系
 
UICC疾病阶段 T阶段 N阶段 M阶段
阶段O Tis N0 M0
阶段I T1，T2 N0 M0
阶段IIA T3 N0 M0
 
阶段IIB T4 N0 M0
阶段IIIA T1，T2 N1 M0
阶段IIIB T3，T4 N1 M0
阶段IIIC Any T N2 M0
阶段IV Any T Any N M1
特别重要的是，CRC的早期诊断可提供更好的预后。结肠直肠的恶性肿瘤是由良性瘤，即腺瘤引起的。因此，最好的预后是那些在腺瘤阶段被诊断的患者。早在Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0阶段被诊断的患者如果治疗适当，则在诊断后有90％的机会可存活5年，而对诊断出已发生远处转移的患者，其存活的5年的几率仅为10％。
在本发明内容中，CRC的早期诊断是指在没有发生任何转移的肿瘤阶段(既不接近＝N0，也不远离＝M0)，即在Tis、N0、M0或T1-4；N0；M0阶段的诊断。Tis表示原位癌。
优选地，CRC是在还没有完全穿过肠壁，因此既没有脏腹膜穿孔、也没有侵入其它器官或结构的情况下被诊断的，即，在从Tis；N0；M0到T3；N0；M0(＝Tis-3；N0；M0)的任何阶段被诊断。
如本发明所述的诊断方法是基于来源于个体的粪便样品。提取粪便样品，从该处理的粪便样品中通过使用特异结合剂来特异地测定S100A12。
特异结合剂有，例如S100A12受体、与S100A12结合的凝集素、S100A12的核酸适体、或S100A12抗体。特异结合剂与其对应靶分子的亲和性至少为1071/mol。优选地，特异结合剂与其靶分子的亲和性为1081/mol，或更优选地为1091/mol。如技术人员所知，术语“特异”是用于表明样品中存在的其它生物分子不与S100A12特异结合剂显著结合。优选地，对除靶分子之外的生物分子的结合水平仅为靶分子亲和性的10％，更优选地为5％或更少。最优选的特异结合剂可达到上述亲和性和特异性的最小标准。
特异结合剂优选地是与S100A12反应的抗体。术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、所述抗体的片段、及含抗体结合结构域的基因构建体。可使用任何具有上述特异结合剂标准的抗体片段。抗体通过本领域已知的技术制备，例如，如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)the whole book，especially43-78，Elsevier，Amsterdam)所述。另外，技术人员熟知基于免疫吸附剂的方法可用于抗体的特异分离。通过这些方法可提高多克隆抗体的质量，从而提高其在免疫检测中的作用(Tijssen，P.，同上，108-115页)。
为了实现本发明所述的目标，使用了来自兔的多克隆抗体。但显然，也可使用来自不同物种，例如鼠或豚鼠的多克隆抗体和单克隆抗体。由于可以任意所需量产生具有稳定特性的单克隆抗体，因此它们是开发临床所用检测法的理想工具。如本发明所述的方法中产生和使用S100A12的单克隆抗体也是另一个优选的实施方案。
如技术人员所知，S100A12已通过在免疫检测法中的测定而被鉴定为用于CRC诊断的标记，也可使用其它备择方法获得与本发明相当的结果。可通过任何合适的方法来检测标记S100A12蛋白，并用作CRC的标记。这种优选的合适方法包括通过免疫检测法、液相色谱——特别是高效液相色谱、电泳——特别是与Western印迹法联合使用的SDS-PAGE以及质谱法来检测S100A12多肽。
对于测定而言，粪便样品是从个体获得的。可直接使用一份粪便样品。优选地，对小份的粪便样品进行处理以产生液体样品。处理后的粪便样品是用提取缓冲液提取粪便样品而获得的液体样品。
粪便样品的处理可通过专门优化过的提取缓冲液来完成。该提取缓冲液至少应满足3个基本要求：可从粪便基质中释放目的分析物。可稳定游离的分析物。使粪便基质的对随后检测分析物干扰为最小。由于标记联合制剂可能具有额外的诊断能力，因此优化的缓冲液不仅需要适用于一种特定的生物标记，而且需要适用于全部目的分析物。提取缓冲液可包含尿素，以提高粪便样品的均质化及提取。可包含Ca2+，以稳定Ca2+结合蛋白。由于已知S100蛋白是Ca2+结合蛋白，因此提取缓冲液优选地包含Ca2+离子，以稳定这类蛋白。应使用较弱的螯合剂，它可破坏Ca2+结合蛋白与粪便基质之间的离子桥。但另一方面，这些Ca2+复合剂与Ca2+离子的结合必须足够弱，以避免从S100A12上夺取Ca2+离子。优选地，氨三乙酸(nitrilotriacetic acid)或柠檬酸可用作粪便提取缓冲液中的螯合剂。优化的优选提取缓冲液含有尿素、Ca2+离子和螯合剂。优选地，螯合剂选自氨三乙酸或柠檬酸。一种优化的提取缓冲液是，例如实施例4b中所述的用来处理粪便样品的缓冲液。
最为便利的是将优化的提取缓冲液与定制的粪便取样容器联合使用。在最便利的方式中，个体可收集确定量的粪便样品，并将其直接转移到预装了稳定性提取缓冲液的收集器中。这种便利的取样和提取方式可使样品在转移到诊断实验室时不会发生分析物的降解。由于粪便样品的提取可直接在取样容器中完成，因此可减少所需的处理与转移方法。
最近的几项进展均集中在便于粪便样品取样和处理容器的开发上。EP 1 366 715描述了一种特定的收集粪便样品的收集管。该提取管主要包含(a)内部中空的容器体，在上部开口，并可接收缓冲液，(b)顶盖具有一个小螺杆，以收集粪便样品，当顶盖到达容器体顶端时，所述螺杆沿轴突出到容器体内，及(c)在所述容器体内部中间位置提供分离区，以使上部区域与所述容器体内的底部区域分离，所述分离区具有适于所述小螺杆通过的轴向孔，从而可在所述上部区域保留多余的粪便，并可使小杆的螺旋部分进入所述底部区域。该提取管进一步具有一个在底部开口的容器体，并具有可移动到容器体底端的底盖，因此，所述提取管可直接用作插入到自动分析仪的样品支持台中的初步取样管，然后除去所述底盖，并倒转所述容器体。在EP1366715中描述的容器可方便处理确定量的粪便样品，其优势是在适当提取后，该管可直接放在自动分析仪的样品支持台上。
在WO 03/068398中描述了适于方便取样和处理粪便样品的精密粪便取样容器的另一个实施例。
优选地，粪便样品在取样或冷冻储存、或者更为便利地冻存后直接使用或处理。冻存的粪便样品可通过融化、然后在合适的缓冲液中稀释、混合、离心而进行处理。上清作为液体样品用于随后的标记S100A12的测定。
将小份处理的粪便样品与S100A12特异结合剂在适于形成S100A12结合剂复合物的条件下进行温育。这种条件不需特别限定，因为技术人员无须进行任何创新劳动即可容易地确定这种适合的温育条件。
如本发明所述的方法，其最后一步是测定复合物的量，并与CRC的诊断相关联。如技术人员所知，有多种方法可测定S100A12特异结合剂复合物的量，均在相关书籍中有详细描述(例如，Tijssen P.，同上，或Diamandis et al.(eds.)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。
优选地，用三明治方式的检测法来检测S100A12。在这种检测法中，第一种特异结合剂用于在一侧捕获S100A12，而在另一侧使用第二种被直接标记或间接检测的特异结合剂。
S100A12抗体也可在其它方法中用于评估CRC，例如，在活组织检查中或在免疫组织化学染色方法中用于原位检测结肠直肠癌细胞。
优选地，S100A12抗体用于定性(S100A12存在与否)或定量(测定S100A12的量)的免疫检测法中。
如上所述，令人惊讶的是，已发现可测定从个体样品获得的粪便样品中的S100A12。在诊断CRC时，使用S100A12标记不需要组织和活组织检查样品。
而对组织样品使用常规蛋白质组学方法，例如通过比较健康和癌症组织，可鉴定多种用于筛选组织/疾病的有潜力的候选标记，但这些候选标记在循环系统中仅偶尔或基本不被发现。令人惊讶的是，本发明的发明人可在粪便样品中检测S100A12蛋白。已证明在这种从个体获得的粪便样品中存在S100A12可与结肠直肠癌的诊断相关联。
已发现在这种从个体获得的粪便样品中是否存在S100A12与患者是否患有结肠直肠癌是相关的。本发明也涉及一种用来排除结肠直肠癌的方法，包括以下步骤：a)提供从个体获得的粪便样品，b)处理所述样品，以获得处理的液体样品，c)将所述处理的液体样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12形成复合物的条件下接触，及d)用(c)中不存在复合物来作为没有患有结肠直肠癌的指示。
如技术人员所知，S100A12在粪便样品中的阳性结果不一定表明患者患有CRC。但S100A12在粪便样品中的阳性值可认为是需进行进一步和更精密诊断的明确指示。在一个优选实施方案中，从粪便样品中测定的S100A12的阳性值可作为该患者应进行进一步检查、特别是虚拟计算断层X光摄影装置结肠成像(virtual computed tomographiccolonography；VCTC)或结肠镜检查的指示。优选地，在粪便样品的阳性值用作要求患者在下一步的(诊断)检查中应进行结肠镜检查的指示。
已证明测定S100A12蛋白水平在CRC领域有很多用途。因此，在进一步的优选实施方案中，本发明涉及使用S100A12蛋白作为从来源于个体的粪便样品中诊断结肠直肠癌的标记分子。
术语“标记分子”用来指示从个体获得的、处理后的粪便样品经测定其中存在分析物S100A12或分析物S100A12水平增加，从而表明患有CRC。显然，标记S100A12可通过任何合适的方法进行测定，其存在或测定的数值可用于评估CRC。
如技术人员所知，本发明不应被解释为限定于测定SEQ ID NO：1中的全长S100A12蛋白。当使用本发明时，也可测定S100A12的生理活性片段，并作为CRC的标记。优选地，免疫学上可检测的片段至少含有6、7、8、10、12、15或20个所述标记多肽的连续氨基酸。本领域技术人员应理解，由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白可在，例如炎症过程中被破坏，从而被降解或切割为这种片段。如技术人员所知，S100A12或其片段也可作为复合物的一部分而存在。这种复合物也可作为本发明所述的标记。另外，或选择性地，S100A12多肽可进行翻译后修饰，这种修饰的S100A12也可作为CRC的标记。
S100A12的人工片段可用作例如免疫检测法中的阳性对照或免疫原。人工片段优选地包括合成产生的或通过重组技术产生的肽，含有至少6、7、8、9、10、12或至少15个来源于SEQ ID NO：1所述序列中的连续氨基酸。优选地，这种人工片段包含至少一个诊断目标的抗原决定簇。而且优选地，人工片段包含至少两个目标抗原决定簇，从而适于在三明治免疫检测法中用作阳性对照。
优选地，在结肠直肠癌的早期诊断中使用新型标记S100A12。但，如技术人员所知，和其它标记一样，S100A12在诊断中及处于肿瘤更高阶段的CRC患者的随访中也具有很大优势。
S100A12浓度与CRC中的肿瘤负荷紧密相关。因此，该标记也适于治疗后CRC患者的随访。在一个优选实施方案中，新型标记S100A12用作患有CRC的患者的随访。通过定期，例如3个月、6个月或1年间隔测定CRC，可对肿瘤进展和/或肿瘤复发事件进行评估。
高于正常截断值的S100A12的增加或重现分别被认为是CRC肿瘤发展或肿瘤复发的指示。因此，进一步优选的实施方案涉及通过体外测定来评估患有结肠直肠癌的患者在手术后对癌损伤的清除，该方法包括以下步骤a)提供从所述患者获得的粪便样品，b)将所述样品与S100A12特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12形成复合物的条件下接触，c)测定在步骤(b)中形成的复合物的量，及d)将(c)中测定的复合物的量与结肠直肠癌的复发或发展相关联。从粪便样品中测定S100A12是特别有用的，在优选实施方案中，可用作胃肠道内CRC肿瘤复发的早期检测。
结肠和直肠均为胃肠道的一部分。已表明S100A12最可能用于筛选患有结肠直肠癌的患者，因此很可能在粪便样品中存在的S100A12也可用作评估其它类型的胃肠道癌症的诊断辅助。在进一步优选实施方案中，本发明涉及使用从粪便中测定的S100A12来评估胃肠道肿瘤。优选地，从粪便样品中测定的S100A12也用于评估胃部肿瘤。从粪便样品中测定S100A12是有用的，因此，可视为如本发明所述的、对胃肠道内的胃肠道肿瘤复发进行早期检测的优选实施方案。
S100A12蛋白本身的用途代表着从粪便诊断CRC的挑战性领域的一个显著进步。与其它的已知标记，例如血红蛋白或血红蛋白-触珠蛋白复合物、或其它用于检测CRC的标记联合测定S100A12，可以或者可能进一步改进对CRC的评估。因此，在进一步优选的实施例中，本发明涉及在从个体获得的粪便样品的结肠直肠癌诊断中，与一或多种其它结肠直肠癌的标记分子联合使用的、作为结肠直肠癌标记分子的S100A12的用途。优选的与S100A12测定一起使用的其它CRC标记有TIMP-1、钙防卫蛋白、肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)、血红蛋白和/或血红蛋白-触珠蛋白复合物。
本发明进一步优选的实施方案公开了与一个或多个选自血红蛋白/触珠蛋白复合物、血红蛋白、金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)、钙防卫蛋白及肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)的其它结肠直肠癌标记分子联合使用的、作为结肠直肠癌标记分子的S100A12蛋白的用途。
在一个优选实施方案中，本发明涉及含标记S100A12及TIMP-1的标记组合在评估CRC中的用途，其中两种标记均从粪便样品中测定。
在一个优选实施方案中，本发明涉及含标记S100A12及血红蛋白的标记组合在评估CRC中的用途，其中两种标记均从粪便样品中测定。
在一个优选实施方案中，本发明涉及含标记S100A12及血红蛋白/触珠蛋白复合物的标记组合在评估CRC中的用途，其中两种标记均从粪便样品中测定。
在一个优选实施方案中，本发明涉及含标记S100A12及肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)的标记组合在评估CRC中的用途，其中两种标记均从粪便样品中测定。
在另一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及含标记S100A12、TIMP-1及血红蛋白的标记组合在评估CRC中的用途，其中所有3种标记均从粪便样品中测定。
在另一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及含标记S100A12、TIMP-1及血红蛋白/触珠蛋白复合物的标记组合在评估CRC中的用途，其中所有3种标记均从粪便样品中测定。
TIMP-1(＝组织纤溶酶原激活物1)
基质金属蛋白酶(MMP′s)在癌症生长和扩散方面发挥着关键作用，可导致细胞外基质的酶降解。天然存在的MMP′s抑制剂被称为MMP′s的组织抑制剂或TIMP′s。TIMP′s与MMP′s活性形式形成紧密的1:1化学计量复合物，因此可抑制这些酶的催化活性。
已描述了多种检测TIMP-1(Kodama，S.，et al.，Matrix 9(1989)1-6；Cooksley，S.，et al.，Matrix 10(1990)285-291；Clark，I.M.，et al.，Matrix11(1991)76-85)和TIMP-2(Fujimoto，N.，et al.，Clin.Chim.Acta 220(1993)31-45)的酶联免疫检测法。这些检测法已应用于体液，例如血清、血浆、羊水、脑脊髓液和尿液的检测。但在本领域没有数据表明TIMP-1存在于粪便样品中。在本领域也没有数据表明在粪便样品中存在TIMP-1会具有临床用途。
本领域中特异结合检测法，例如免疫检测法中的诊断试剂通常以包含特异结合剂及进行检测所需的辅助试剂的试剂盒的形式提供。因此，本发明也涉及含有至少一种S100A12特异结合剂及用来测定S100A12的辅助试剂的免疫试剂盒。
诊断检测法的精确性通常以其受试者操作特征(receiver operatingcharacteristics ROC)来描述(特别可参见Zweig，M.H.and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是根据高于观测数据整个范围的、连续变化的决定阈所获得的、所有灵敏度/特异性数对的曲线图。
实验室检测的临床性能依赖于其诊断精确性，或将受试者正确划分到临床相关亚组中的能力。诊断精确性测定的是正确区分被测试受试者的两种不同症状的检测能力。这种症状是例如区分健康和疾病，或区分良性及恶性疾病。
在每种情况下，ROC曲线均通过整个决定阈范围内的灵敏度对1-特异性的作图来描述两个分布之间的重叠性。Y轴是灵敏度，或真阳性率[定义为(真阳性检测结果的数目)/(真阳性数目+假阴性检测结果的数目)]。它也表示疾病或症状存在的阳性率。它仅由患病的亚组计算而得。X轴是假阳性率，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的指标，是完全通过未患病的亚组计算而得的。由于真阳性率和假阳性率是通过来自两个不同亚组的实验结果完全独立计算的，因此ROC曲线与样品中疾病的流行性不相关。ROC曲线上的每个点均代表相对于特定决定阈的灵敏度/1-特异性的数对。具有理想辨别力(在结果的两个分布中无重叠)的检测法，其ROC曲线通过左上角，其中真阳性率为1.0，或100％(理想的灵敏度)，而假阳性率为0(理想的特异性)。没有任何辨别力(对两组结果的分布相同)的检测法的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大部分曲线落在这两种极端情况之间。(如果ROC曲线完全在45°对角线之下，则可通过将“阳性率”的标准从“大于”反向改为“小于”进行校正，反之亦然)。定性地，曲线越接近左上角，则检测法的整体精确性越高。
对实验室检测法的诊断精确性进行定性的一个便利目标是通过单一的数值来表示其性能。最常用的全局测度是ROC曲线下的面积。根据惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，则可将规则反向而使其面积达到规定)。其数值在1.0(两组检测值理想分开)到0.5(两组检测值之间没有表观分布差异)之间。该面积不仅仅取决于曲线的特定部分，例如最接近对角线的点或在90％特异性时灵敏度，而是取决于整个曲线。这是AUC如何接近理想情况(面积＝1.0)的一个定量的描述性表达。
已通过受试者操作特征分析(ROC；Zweig，M.H.and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)将新型标记S100A12与已确定的标记血红蛋白及与血红蛋白相比或相联合使用在临床应用中进行评估。该分析基于来源于实施例部分给出的确定患者组的样品。
基于单独测定S100A12的诊断方法与单独的、已确定的标记血红蛋白的比较，表明它至少具有如曲线下面积所表示的良好的诊断精确性(灵敏度/特异性特征)。
以下提供的实施例、附图及序列表用于理解本发明，其实际范围列在所附的权利要求中。应理解到在不偏离本发明主旨的情况下可对所列出的方法进行修改。
附图简要描述
图1：Western印迹分析
通过Western印迹用抗人S100A12的多克隆抗体来分析4个CRC患者的肿瘤和正常组织。在大肠杆菌中以6xHis标签表达的重组蛋白用作阳性对照。重组蛋白迁移图谱的差异是由所含的6xHis-标签引起的。当手术切除肿瘤时，从患者回收正常组织。M：分子量标准；r.p.：重组蛋白；T：肿瘤组织；N：正常组织。
图2：ROC曲线
给出了对从患有CRC的患者获得的23份样品与从健康个体获得的18份样品进行评估的受试者操作特征(ROC)曲线。
图3：CRC患者中S100A12浓度的散点曲线
Ca2+离子对粪便提取物中S100A12测定的影响。将粪便提取物在没有(图3a)或存在(图3b)Ca2+离子的情况下进行稀释。在存在Ca2+离子时的可检测浓度更高，而且分布超出了增加的动态范围。
缩写
ABTS　　　　　　　　 2，2连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6))二铵盐
BSA                 牛血清白蛋白
cDNA                互补DNA
DMSO                二甲基亚砜
DTT                 二硫苏糖醇
EDTA                乙二胺四乙酸
ELISA               酶联免疫吸收检测法
ESI                  电喷雾离子化
FCS                  胎牛血清
IAA                  碘乙酰胺
IgG                  免疫球蛋白G
LC                   液相色谱
MS                   质谱
MES                　
Figure G2007800180591D0018150728QIETU
基；2，4，6-三甲苯基
PAGE                 聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS                  磷酸缓冲盐
PI                   等电点
POD                  辣根过氧化物酶
RTS                  快速翻译系统
SDS                  十二烷基磺酸钠
实施例1
可用作结肠直肠癌标记的S100A12的鉴定
组织来源
为了鉴定可用作结肠直肠癌诊断标记的肿瘤特异蛋白，通过蛋白质组方法对3种不同的组织进行了分析。
对共来自10个患有结肠直肠癌的患者的组织样品进行了分析。通过治疗性切除术从每个患者中收集3种不同的组织：肿瘤组织(>80％肿瘤)(T)，临近的健康组织(N)及临近健康黏膜的剥离黏膜(M)。后两种组织类型作为相匹配的健康对照样品。在切除后立即将组织速冻，然后储存在-80℃备用。通过组织病理学标准来诊断肿瘤。
组织制备
将0.8-1.2g冷冻的组织放在研钵中，并用液氮完全冷冻。在研钵中将组织研磨成粉，溶解在10倍体积的(w/v)裂解缓冲液(40mM柠檬酸钠、5mM MgCl2、1％Genapol X-080、0.02％叠氮钠、无EDTA的
Figure G2007800180591D00181
[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Cat.No.1 873 580])中，然后在
Figure G2007800180591D00182
玻璃匀浆器(20x松连接(loosefitting)，20x紧连接(tight fitting))中匀浆。将3ml匀浆液于4,500 x g进行1小时的蔗糖密度离心(10-60％蔗糖)。在离心步骤后，获得3个组分。在顶部的梯度组分含有可溶性蛋白，用于进一步分析。
LC-ESI-MSMS分析的样品制备
根据供应商的说明书用
Figure G2007800180591D00191
蛋白测定法(Cat.No.500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，Germany)来测定可溶性蛋白组分的蛋白浓度。将4ml还原缓冲液(9M尿素、2mM DTT、100mMKH2PO4、pH 8.2 NaOH)加入到相应于200μg蛋白的体积中，并温育1小时。将溶液在
Figure G2007800180591D00192
 Ultra 10kD设备(Millipore GmbH，Schwalbach，Germany)中浓缩至250μl。将此250μl转移到1ml烷化缓冲液(9M尿素、4mM碘乙酰胺、100mM KH2PO4、pH 8.2 NaOH)中，温育6小时进行烷化反应，然后在
Figure G2007800180591D00193
 Ultra 10kD设备中浓缩到250μl。加入1ml 9M尿素进行洗涤，并再次在
Figure G2007800180591D00194
 Ultra10kD设备中浓缩到250μl。洗涤重复进行3次。
将浓缩的溶液稀释于2.5M尿素，并与4μg胰蛋白酶(蛋白质组学级别，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)温育过夜进行蛋白酶消化。加入1ml 1％甲酸终止消化反应并进行分析。
LC-ESI-MSMS分析
将胰蛋白酶消化液(500μl)在由SCX和RP Pepmep C18柱(LCPackings，Idstein，Germany)所组成的二维Nano-HPLC-系统(Ultimate，Famos，Switchos；LC Packings，Idstein，Germany)进行分离。共分离11个SCX组分(用0、5、10、25、50、100、200、300、400、500、1.500mMNH4Ac进行洗脱)，随后用90分钟梯度(5-95％乙腈)在RP柱上进行进一步分离，并通过ESI-MS离子阱(LCQ deca XP；Thermo Electron，Massachusetts，USA，参见表2参数)数据依赖性扫描进行在线分析。对每个样品进行3轮操作。用Bioworks 3.1软件(Thermo Electron，Massachusetts，USA)根据表2列出的参数对原始数据进行加工。将从重复操作所得到的关于相同的肽和蛋白的列表合并在一起。
在表3中给出的部分序列有助于鉴定S100A12蛋白。
作为结肠直肠癌潜在标记的S100A12的检测
对每个患者，将来自肿瘤样品的鉴定蛋白以及相应肽的数目与来自临近正常组织和来自剥离的正常黏膜组织的对应结果进行比较。通过这种方法发现，S100A12蛋白在肿瘤组织中特异表达或强烈过表达，而在健康的对照组织中没有或很少检测到，或者表达不强。因此，它和许多其它蛋白可用作诊断结肠直肠癌的候选标记。
S100A12蛋白在患有结肠直肠癌的患者的肿瘤组织中强烈过量存在。肿瘤组织中的S100A12蛋白的以下肽序列是通过Bioworks 3.1形式的LCQ-MS2数据进行鉴定的：
表2：MS/MS-数据采集及Bioworks 3.1搜索参数
MSMS-数据采集 MS排除 350-2,000Da前体离子
重复计算 2
重复持留 0.25min
排除列表大小 25
排除持留 5min
排除质量宽度 下限为0.5Da，上限为1.5Da
Bioworks 离子数目 35
最小离子密度 100,000点(counts)
前体质量耐受 1.2Da
片段质量耐受 1.4Da
Xcorr >2；2.5；3(z＝1；2；3)
dCn >0.1
Sp >500
数据库 Swissprot；Humangp(通过Roche生物信息学排列)
表3：发现的序列
 
iii TKLEEHLEGIVNIFHQYSVRGHFDTLSKGELK
上述两个肽序列已被鉴定为S100A12的部分序列。序列(i)代表SEQ ID NO：1中氨基酸2到氨基酸21的氨基酸位置，而序列(ii)代表SEQ ID NO：1中氨基酸23到氨基酸34的氨基酸位置。
实施例2
针对结肠直肠癌标记S100A12蛋白的抗体的生成
生成针对结肠直肠癌标记S100A12蛋白的多克隆抗体，以进一步用于血清、血浆、血液、及特别是粪便样品中S100A12的测定。这种S100A12的测定是通过例如免疫检测法，例如Western印迹及ELISA来进行的。
重组蛋白在大肠杆菌中的表达
为了产生针对S100A12的抗体，进行了蛋白的重组表达以获得免疫原。联合使用RTS100表达系统和大肠杆菌进行表达。首先，分析DNA序列，并通过“ProteoExpert RTS E.coli HY”系统获取可高产cDNA沉默突变变异体及对应的PCR引物序列的相关信息。这是一个商业化网站的服务(www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，可应用从cDNA产生线性PCR模板、并体外转录和表达编码S100A12蛋白的核苷酸序列的“RTS 100 E.coli Linear Template Generation Set，His-tag”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Cat.No.3186237)系统。为便于Western印迹和随后的纯化，表达的蛋白含有His标签。鉴定了最好的表达变异体。从PCR到表达及检测的所有步骤均根据厂商的说明书进行。将含有所有必需的T7调控区(启动子、核糖体结合位点及T7终止子)的各个PCR产物根据厂商说明书克隆到pBAD载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，Cat.No.K4300/01)上。对于用T7调控序列进行的表达，将构建体转化到大肠杆菌BL 21(DE3)(Studier，F.W.，et al.，Methods Enzymol.185(1990)60-89)中，并将转化的细菌一次培养1升用于蛋白表达。
在Ni螯合柱上根据标准方法进行His-S100A12融合蛋白的纯化。简言之，将含有His-S100A12融合蛋白表达载体的1升细菌培养物通过离心沉淀。将细胞沉淀重悬在含50mM磷酸钠、pH8.0、300mMNaCl、1mg/mL溶菌酶、2x Complete(无EDTA)和DNase的裂解缓冲液中，然后用French press(型号：IUL Basic Z)进行细胞破碎。通过高速离心将不溶物质沉淀，然后将上清液经过Ni螯合的色谱柱。用几倍柱床体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、pH8.0、300mM NaCl、20mM咪唑)对柱进行洗脱。最后，用含50mM磷酸钠、pH 8.0、300mM NaCl的线性梯度为20到500mM咪唑的洗脱缓冲液将结合的抗原分离下来。
针对S100A12的单克隆抗体的产生
a)鼠的免疫
将12周龄的A/J小鼠用100μg S100A12进行第一次腹膜内免疫。然后在6周后以1个月的间隔再进行两次腹膜内免疫。在该过程中，对每只小鼠给药100μg吸附于氢氧化铝的S100A12和109百日咳杆菌(Bordetella pertussis)。然后在融合前的第三和第二天，对每只鼠用溶于PBS缓冲液中的100μg S100A12进行最后两次静脉内免疫。
b)融合和克隆
将a)中免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞根据如Galfre，G.，andMilstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46所述进行融合。在该过程中，将约1×108免疫鼠的脾细胞与2x107骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合，并离心(300 x g，4℃，离心10分钟)。然后将细胞用无胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基洗涤1次，并在50ml离心管中于400 x g再次离心。除去上清液，轻轻拍打使细胞沉淀逐渐松散，加入1ml PEG(分子量4,000，Merck，Darmstadt)，并通过吹吸使其混合。在37℃水浴1分钟，然后在室温下，于4-5分钟内逐滴加入5ml无FCS的RPMI 1640。在约1分钟内逐滴加入5ml含10％FCS的RPMI 1640后，完全混合，用培养基(RPMI1640+10％FCS)补充到50ml，然后于4℃以400x g离心10分钟。将沉淀的细胞悬浮在含10％FCS的RPMI 1640培养基中，并接种到次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(在RPMI 1640+10％FCS中含100mmol/l次黄嘌呤及1μg/ml重氮丝氨酸)中。向培养基中加入100U/ml作为生长因子的白介素6。
约10天(ca.10)后检测初级培养物中的特异抗体。将S100A12阳性的初级培养物通过荧光激活细胞分选仪克隆到96孔培养板。在该过程中再次向培养基中加入100U/ml作为生长添加剂的白介素6。
c)从细胞培养上清液中分离免疫球蛋白
将获得的杂交瘤细胞以每ml 1x105细胞的密度接种到含10％FCS的RPMI 1640培养基中，在发酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，Order No.144-050)中增殖7天。在培养上清液中获得平均浓度为每ml100μg的单克隆抗体。通过蛋白质化学领域中的传统方法从培养上清液中纯化该抗体(例如，根据Bruck，C.，et al.，Methods in Enzymology 121(1986)587-596)。
多克隆抗体的产生
a)免疫
制备蛋白溶液(100μg/ml S100A12蛋白)和完全弗氏佐剂的比例为1:1的新鲜乳浊液用于免疫。用1ml该乳液在1、7、14及30、60和90天对每只兔子进行免疫。采集血液，将得到的抗S100A12血清用于实施例3和4所述的进一步实验中。
b)用辛酸和硫酸铵通过分级沉淀从兔血清中纯化IgG(免疫球蛋白G)
将1体积的兔血清用4倍体积的醋酸缓冲液(60mM，pH4.0)进行稀释。用2M Tris碱将pH调整到4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸(25μl/ml稀释的样品)。将样品离心(13,000x g，30min，4℃)30分钟后，除去沉淀，收集上清液。通过加入2M Tris碱将上清液pH调整为7.5，并进行过滤(0.2μm)。
在剧烈搅拌下通过逐滴加入4M硫酸铵溶液至终浓度为2M来沉淀将上清液中的免疫球蛋白。通过离心(8,000x g，15min，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
除去上清液。将沉淀溶解在10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中，并进行完全透析。将透析物离心(13,000xg，15min，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化
用10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl将多克隆兔IgG配制为10mg/ml。对每ml IgG溶液加入50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(溶解在DMSO中，浓度为3.6mg/ml)。于室温下反应30分钟后，将样品在
Figure G2007800180591D0023151430QIETU
 200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mMNaCl)上进行色谱分析。收集含生物素化IgG的组分。根据相同方法将单克隆抗体进行生物素化。
多克隆兔IgG的地高辛化
用10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl将多克隆兔IgG配制为10mg/ml。对每ml IgG溶液加入50μl地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，Cat.No.1333 054)(溶解在DMSO中，浓度为3.8mg/ml)。于室温下反应30分钟后，将样品在
Figure G2007800180591D00241
 200(10mMNaH2PO4/NaOH，pH 7.5，30mM NaCl)上进行色谱分析。收集含地高辛化IgG的组分。根据相同方法将单克隆抗体进行地高辛化。
实施例3
在癌症和健康组织中分别进行S100A12的Western印迹检测
根据实施例1所述的“组织制备”方法来制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解物。
用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和Western印迹。对每个待检测的组织样品，将10μg组织裂解物稀释在还原性(Invitrogen)SDS样品缓冲液中，于95℃加热10分钟。将样品在MES电泳缓冲液系统中的4-12％
Figure G2007800180591D00243
凝胶(Tris-甘氨酸)上进行电泳。用Invitrogen XCell II Blot Module(Invitrogen)和NuPAGE转移缓冲液系统将凝胶分离的多肽印迹到硝酸纤维素膜上。将膜在PBS/0.05％ Tween-20中洗涤3次，并用-Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。将作为一抗的多克隆兔抗S100A12血清(按实施例2所述来生成)在
Figure G2007800180591D00245
-Block封闭缓冲液中按1:10,000稀释，并与膜温育1小时。将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。用在0.5x
Figure G2007800180591D00246
-Block封闭缓冲液中稀释为10mU/ml的、耦联了POD的多克隆羊抗兔IgG抗体来标记特异性结合的一抗兔抗体。温育1小时后，将膜在PBS/0.05％ Tween-20.中洗涤6次。为了检测结合了耦联POD的抗兔抗体，将膜与Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate(Order-No.2015196，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)温育，并曝光到放射性自显影胶片上。
当对来自4个诊断为CRC的个体的肿瘤和正常组织进行所述的印迹实验时，在肿瘤组织中可检测到S100A12蛋白的高表达，而在正常组织中没有或很少有S100A12(图1)。
实施例4
粪便样品的加工处理
a)去污剂提取
由患者在特定的Sarstedt，Germany，Order-No.80.623.022取样容器中收集每份约1g的粪便样品，冷冻并储存在-70℃。为了进行分析，将粪便样品融化，用添加了一种来自德国Roche的蛋白酶抑制剂混合物--Mini Complete EDTA-free(定单号：11 873 580)的、pH7.4的磷酸缓冲液将约100mg粪便样品稀释10倍：
Na2HPO4                 53.4mM
KH2PO4                  12.3mM
NaN3                    0.1％
Na2EDTA                 1.07mM
鸡蛋清(Chichken albumen)1.0％
Nonidet P-40            0.5％
在连续振荡下，将样品于室温温育1小时，然后在4℃静置1小时以上。在3.000 x g离心15分钟后，将上清液吸出并用孔径5μm的膜过滤。将样品等分并储存在-70℃。通过ELISA将一份这种处理后的粪便样品用于S100A12的定量。
b)尿素提取
为了改进对粪便样品中S100A12及其它目标标记的测定，使用了“优化的提取缓冲液”。通过向以下缓冲液中加入蛋白酶抑制剂混合物(Mini Complete EDTA-free，Roche，Germany)而新鲜制备了用于粪便样品的处理的提取缓冲液：
TRIS                  0.10mol/l，pH8.0
柠檬酸                0.10mol/l
尿素                  1.0mol/l
CaCl2                 0.01mol/l
BSA                   0.50％
融化粪便样品，并将50-100mg每份样品转移到粪便样品制备试剂盒(cat.-no.：10745804 Roche，Germany)中。根据粪便样品的重量加入优化的提取缓冲液，将其稀释50倍。将样品在定轨摇床上剧烈混合30分钟，然后转移到10ml试管(Sarstedt，Germany)中，于1200g离心10分钟。用5μm截断(cut-off)的滤膜(
Figure G2007800180591D00261
-CL，Millipore，Germany)过滤上清液，等分并储存在-70℃用于进一步分析。这些粪便提取物适于本发明中所有的目标生物标记。
实施例5
用于测定人粪便样品中S100A12的ELISA
开发了用于测定从粪便中S100A12的三明治ELISA。用在大肠杆菌中表达的重组全长S100A12通过免疫来产生多克隆兔抗体。将抗血清中纯化的IgG片段生物素化或地高辛化，以用于通过96孔链霉抗生物素板(Streptawell，HighBind，Roche，Germany)进行三明治ELISA。将粪便提取物在样品稀释缓冲液(100mM Tris，pH8.0，2mM CaCl2，1.5％KCL，0.3％Triton X-100，0.2％酪蛋白，2％蔗糖)中以1：25稀释，然后将50μl样品或标准品转移到孔中。随后，通过加入50μl含0.5μg/ml生物素化多克隆抗体PAB<S100A12>-Bi及0.5μg/ml地高辛化多克隆抗体PAB<S100A12>-Dig的抗体混合物的、检测缓冲液(PBS，pH 7.4，0.1％牛IgG，0.9％NaCl，0.5％Thesit，1％PEG 40.000，0.1％牛IgG，0.025％乙酰化牛γ球蛋白)来起始抗原-抗体复合物的形成。将板温育60分钟，每孔用350μl洗涤缓冲液(100mM PBS，pH 7.4，0.05％TWEEN-20)洗涤3次。然后，每孔加入100μl 25mU/mlMAB<Dig>-POD耦联物(Roche Diagnostics，Germany)，并再次温育60分钟。每孔用350μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每孔加入100μlABTS溶液(Roche Diagnostics，Germany)，并将板温育60分钟。用ELISA读数仪(SLT.Spectra II)测定405/620nm处的吸收。重组的全长S100A12作为校正标准品。
实施例6
在尿素提取物中分析物的稳定性
在用4b中所述的提取方法制备的粪便提取物中，S100A12比血红蛋白更为稳定。当在室温下储存粪便提取物1或3天时，与血红蛋白的平均回收率相比，S100A12的平均回收率更高，分散性更低。在20个用于评估稳定性的样品中，有两个是血红蛋白阴性的：
表4：稳定胁迫后的回收率
 
N 样品浓度范围 室温1天后的回收率 室温3天后的回收率
S100A12 20 21-67,663ng/g 87％(±15％) 73％(±20％)
血红蛋白 18 0.32-10,364μg/g 79％(±23％) 59％(±30％)
实施例7
S100A12在结肠直肠癌中的临床用途
通过分析从确诊患者群体获得的粪便样品来评估S100A12的临床用途。对每个患者测定了2份来自相同肠运动的粪便样品，并对浓度进行分析。通过可揭示紧密相关的Pearson相关系数评估了两个浓度的相关性。为了提高检测灵敏度，使用两个配对样品中浓度测定为最大的那个进行进一步分析。通过如Zweig等(同上)所述的ROC分析评估S100A12的诊断值。
根据实施例4a对第一次的两个研究群体的粪便样品进行提取。用含1.0mM CaCl2、1.2mM氨三乙酸、0.1％牛血清白蛋白的pH 7.4的磷酸缓冲液进行稀释。根据实施例4b对第三个研究群体的粪便样品进行提取，并用实施例5给出的样品稀释缓冲液进行稀释。尽管使用不同的提取方法，但对所有患者群体测定S100A12的ELISA方法是相同的(参见实施例5)。
第一个研究群体
获得了来自18个无CRC的患者、10个通过结肠镜检查诊断为腺瘤阳性的患者及23个诊断为UICC阶段III和IV的进行性CRC的患者的粪便样品。如上所述测定从每个个体获得的粪便样品中的S100A12。
根据Zweig，M.H.，and Campbell，同上，进行ROC分析。根据曲线下面积的测定发现，区分CRC组患者和健康个体的辨别能力对CRC与健康对照而言为97％(图2)，对CRC+腺瘤与健康对照而言是85％，而对腺瘤与健康对照而言为57％。
Ca2+离子的存在对粪便中S100A12测定的正面影响如图3所示。当粪便提取物在没有CaCl2和氨三乙酸的、pH为7.4的含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中稀释时，检出S100A12的浓度(图3a)比在存在CaCl2和氨三乙酸时测定的S100A12浓度(图3b)要低。在没有Ca2+时更小的ELISA动态范围也会导致ROC曲线的AUC降低，对CRC和健康对照为94％，而在改进的缓冲液体系中AUC是97％。如果CRC+腺瘤和健康对照的AUC在没有Ca2+时是81％，则在存在CaCl2和氨三乙酸时为85％。
第二个扩大的研究群体：
从来自10个通过结肠镜检查诊断为腺瘤阳性的患者、50个诊断为CRC(9个为UICC阶段I；4个为UICC阶段II；21个为UICC阶段III；13个为UICC阶段IV；2个为UICC阶段I到III，即不是阶段IV；及1个没有分段的CRC)和50个对照(7个来自其它GI疾病，即非CRC的患者；16个来自具有憩室病的患者；8个来自作为GI健康的捐献者；及19个来自患有痔疮的患者)获得粪便样品。如上所述测定从每个个体获得的粪便样品中的S100A12。
根据Zweig，M.H.，and Campbell，同上，进行ROC分析。根据曲线下面积的测定发现，区分CRC组患者和健康个体的辨别能力对CRC和健康对照而言为90％，对CRC+腺瘤和健康对照而言是86％，而对腺瘤和健康对照而言为66％。这表明甚至可以在早期UICC阶段从粪便样品中检测S100A12。
第三个研究群体
测定更广泛的第三个研究群体(患者特征参见表5)的S100A12。在多中心研究的框架工作中预先收集大量已鉴定的粪便样品。在胃肠病诊室招收作为对照收集组的患者(进行结肠镜检查)，他们代表平均危险系数的筛选群体。将患有炎症性肠道疾病及任何腺瘤的患者排除在对照收集组之外。由于在筛选群体中结肠直肠癌患者的低流行性，因此在不同的外科诊室收集来自癌症患者的样品。结肠直肠癌的诊断由医生确诊，而且对每个癌症患者均提供其病理状态。为了评估通过基于愈创木脂的FOBT预筛选患者的普通诊断方法而可能引入的偏差，也收集了没有预先进行基于愈创木脂的FOBT的亚组。所有由于可见的直肠出血而被检测的患者均排除在该亚组之外，因为这可能对血红蛋白的优势引入偏差。
获得了来自252个对照个体的粪便样品。在这些患者中，有135个是通过结肠镜检查确定为GI-健康的，而其余的对照样品具有几种相关的GI疾病。CRC群体包括186个来自UICC阶段I-IV的CRC样品(表6)。有38个CRC患者的确切阶段是未知的。因此，表6中具有确定的UICC阶段的CRC患者总数相加不是186个患者。共评估了101个无FOBT预筛选的CRC患者。
如上所述测定了来自每个个体粪便样品中的S100A12。根据Zweig，M.H.，and Campbell，同上，进行ROC分析。根据曲线下面积的测定(表6)发现，区分CRC组患者和对照个体的辨别能力对CRC与所有对照而言为94％，对无FOBT预筛选的CRC与对照而言也是94％。通过疾病阶段对CRC患者分组发现，对UICC阶段I的曲线下面积为90％，对UICC阶段II-IV为96-97％。没有检测到通过FOBT预筛选产生的偏差，因为这些患者的曲线下面积与整个CRC群体的曲线下面积是相同的。
表5：第三个研究群体的患者特征
 
总数 年龄(岁) 性别(女/男)
对照 252 63，0+/-8，0 151/101
-健康对照(无任何肠道疾病) 132 62，3+/-6，8 81/51
-痔疮 28 60，1+/-7，1 13/15
-憩室病 73 64，7+/-9，5 46/27
-塑胶息肉 14 67，9+/-9，9 8/6
-其它GI疾病 5 59，2+/-6，7 3/2
CRC(所有样品) 186 66.1+/-11.9 93/93
CRC(亚收集w/o血液/FOBT) 101 68，4+/-11，5 48/53
表6：第三个研究群体的ROC分析
 
样品板 N AUG％
CRC样品总数 186 94
CRC样品w/o血液/FOBT 101 94
UICC阶段　I 39 90
UICC阶段　II 38 97
UICC阶段　III 42 96
UICC阶段　IV 29 97
实施例8
S100A12与其它粪便标记的联合使用
评估了S100A12与粪便提取物中其它生物标记的联合使用效果。用商品化ELISAs测定了标记血红蛋白、血红蛋白和触珠蛋白异源复合物、钙防卫蛋白、TIMP-1、M2-PK和CEA。从德国的R-Biopharm获得血红蛋白、血红蛋白/触珠蛋白及钙防卫蛋白的测定检测法。Calpro钙防卫蛋白ELISA由挪威的Calpro SA制造，在德国之外以PhiCalTM Test进行销售。从德国的Roche Diagnostics获得测定CEA的检测法。M2-PK检测法由德国的Schebo Biotech提供，TIMP-1检测法由美国的R＆D Systems提供。其中一些检测法是用于粪便提取物中的测定，对于两个名为CEA和TIMP-1的检测法，粪便不是通用的样品材料。因此，这些检测法必需调整为可测定代表所提取粪便样本的样品中的相应分析物。将样品(粪便提取物)预稀释20倍用于CEA测定，但其它方面是根据制造商说明书进行该检测法的。同样地，将样品预稀释3倍用于TIMP-1的测定，不必改变检测方法本身。
为了检测是否标记联合使用可改进CRC的诊断，将标记通过Bayes Logistic Regression(BLR)进行组合。在BLR算法中使用高斯先验分布来评估标记的联合使用效果，可通过Alexander Genkin，David D.Lewis，and David Madigan(Large-scale Bayesian logisticregression for text categorization.Technometrics)BBR软件执行该算法。使用以下设置：无自动特征选择，先验变量固定为0.05，无截断值调整，及通过归一化的输入标准化。对数字过程，缺省设置是收敛截断值为0.0005，1000次反复与无精确性模式仍保持不变。通过在Monte-Carlo交叉验证设计中运行100次来评估基本算法的结果。在每次运行中，三分之二的事件和对照通过
Figure G2007800180591D00311
 R2006a嵌入式功能试样分别被选择作为训练集，对缺省随机数字发生器而言，其初始值为19022007。对训练集应用基本算法，以生成诊断规则。对所评估的晚期事件概率的截断值是由训练集的对照确定的，以分别达到95％或98％的特异性。然后将诊断规则应用于另外那个第三个数据，以评估在给定的截断值下的灵敏度和特异性。
为了避免对血红蛋白或血红蛋白/触珠蛋白中的任何偏差，在评估中仅使用了101个未进行预先FOBT预筛选的CRC患者。对于筛选检测法，不仅ROC曲线的AUC是相关的。在筛选设置中的一个非常关键的要求是在高特异性条件下要具有足够好的灵敏度。高特异性是关键的，因为低特异性将造成大量的假阳性结果，并在随后的过程中给患者带来不必要的痛苦。表7总结了在特异性分别为95％和98％时所评估的AUC的值及灵敏度。当某些测定的单个标记通过BLR联合使用时，CRC诊断的AUC值非常相似，范围在+/-1％。另一方面，可通过S100A12与其它标记联合来显著提高CRC检测中的总体灵敏度，特别是在特异性水平为98％的情况下尤为如此。单独使用S100A12的灵敏度为67％，而包括两种标记S100A12和血红蛋白-触珠蛋白复合物的标记联合使用的灵敏度为79％，最好的标记联合使用是包括三种标记S100A12、血红蛋白-触珠蛋白复合物和TIMP-1，它在相同特异性水平的条件下可将灵敏度进一步增加至82％。因此认为这些标记联合使用在检测CRC、特别是早期阶段的CRC方面是非常重要的。如表7所示，特别是阶段I的结肠直肠癌通过标记的联合使用其检出率更高。使用了标记S100A12是这些标记联合使用从而提高ROC的关键因素。
表7：检测CRC的标记组合
Figure G2007800180591D00321
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
     F.Hoffmann-La Roche AG
<120>S100A12作为结肠直肠癌标记的用途
<130>23747WO
<150>EP 06010439
<151>2006-05-19
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>92
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Thr Lys Leu Glu Glu His Leu Glu Gly Ile Val Asn Ile Phe His
1               5                   10                  15
Gln Tyr Ser Val Arg Lys Gly His Phe Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu
            20                  25                  30
Leu Lys Gln Leu Leu Thr Lys Glu Leu Ala Asn Thr Ile Lys Asn Ile
        35                  40                  45
Lys Asp Lys Ala Val Ile Asp Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ala Asn
    50                  55                  60
Gln Asp Glu Gln Val Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser Leu Val Ala Ile
65                  70                  75                  80
Ala Leu Lys Ala Ala His Tyr His Thr His Lys Glu
                85                  90

Claims (9)

1.S100A12蛋白特异结合剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于诊断结肠直肠癌，其中所述诊断结肠直肠癌包括以下步骤
a)提供从个体获得的粪便样品，
b)将所述样品与S100A12蛋白特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12蛋白形成复合物的条件下接触，
c)测定步骤(b)中形成的复合物的量，及
d)将(c)中测定的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
2.S100A12蛋白特异结合剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于诊断结肠直肠癌，其中所述诊断结肠直肠癌包括以下步骤
a)提供从个体获得的粪便样品，
b)将所述样品与S100A12蛋白特异结合剂在适于所述结合剂与S100A12蛋白形成复合物的条件下接触，
c)将所述样品与第二标记的特异性结合剂在适于所述结合剂与第二标记形成复合物的条件下接触，所述的第二标记选自血红蛋白/触珠蛋白复合物、血红蛋白、金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)及肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)，
d)检测步骤(b)和(c)中形成的复合物的量，及
e)将步骤(d)中测定的复合物的量与结肠直肠癌的诊断相关联。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述第二标记是血红蛋白。
4.如权利要求2所述的用途，其中所述第二标记是血红蛋白/触珠蛋白复合物。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述第二标记是TIMP-1。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述第二标记是M2-PK。
7.S100A12蛋白作为标记分子在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于在从个体获得的粪便样品中诊断结肠直肠癌。
8.S100A12蛋白作为标记分子在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于在从个体获得的粪便样品中早期诊断结肠直肠癌。
9.S100A12蛋白作为结肠直肠癌标记分子与一种或多种其它结肠直肠癌标记分子联合使用在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于从个体获得的粪便样品中诊断结肠直肠癌，所述其它结肠直肠癌标记分子选自血红蛋白/触珠蛋白复合物、血红蛋白、金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP-1)及肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)。
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