JP4673895B2 - 直腸結腸癌用マーカーとしてのascの使用 - Google Patents
直腸結腸癌用マーカーとしてのascの使用 Download PDFInfo
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Description
CRCは先進諸国において、男性と女性の両方の2番目に一般的な悪性疾患である。その高い有病率、その長い無症候段階および前悪性病変の存在のために、CRCはスクリーニングについての多くの基準に満たす。明らかに、許容可能な感度および特異性を有する血清腫瘍マーカーは、FOB試験または内視鏡検査のいずれよりもスクリーニングに適している。
手術前のCEA値は制限された診断値である。にもかかわらず、腫瘍マーカーの欧州委員会(ECTM)が、基準値を設けるためおよび予後を評価するため、手術前にCFAを測定すべきであると推奨する。本発明のデータに従った単一マーカーとして、ASCは少なくともCEAと同程度に良好か、または優れてさえいる単一マーカーであり得るので、診断補助として、特に手術前に基準値を設けることでASCを使用することが期待されるはずである。
CRCを有する患者における予後の決定のための黄金標準は、Duke's、TNMまたは他の段階付けシステムにより規定されるような、疾患の程度(extend)である。結果の予想にCEA等のマーカーが使用される場合、既存の段階付けシステムに求められるものより強力な予後的情報、既存のシステムから独立した情報、または既存の基準、例えばDuke's Bまたはノードネガティブ患者により規定される特異的な部分集団内の予後的データが提供される必要がある。
多くの報告では、進行したCRCを有する患者の処置のモニタリングにおけるCEAの使用が記載されている(概略について、 参照文献 Duffy, M.J., Clin. Chem. 47 (2001) 625-630; Fletcher, R.H., Ann. Int. Med. 104 (1986) 66-73; 匿名, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 2843-2877を参照)。これらのほとんどは、後ろ向きで無作為ではなく、少数の患者を含んだ。これらの研究は、a)化学療法を受けている間にCEAレベルが減少した患者は、一般的に、CEAレベルが減少しなかった患者よりも良好な結果を有し、かつ(b)ほぼすべての患者で、CEAレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示唆した。
治癒を目的とした外科的切除を受ける患者のおよそ50%は、後に転移性疾患の再発が起こる(Berman, J.M.,ら, Lancet 355 (2000) 395-399)。これらの再発のほとんどは、診断から最初の2〜3年以内に起こり、通常、肝臓、肺または局所(locoregional)領域の部分に限定される。再発性/転移性疾患は、常に致死的であるため、相当な研究が、その初期、したがってもしかすると処置可能な段階での同定に焦点を当てている。その結果、これらの患者の多くは、多くの場合CEAの定期的モニタリングを含む、術後のサーベイランスプログラムを受ける。
解糖酵素エノラーゼ(2-ホスホ-D-グリセリン酸ヒドロラーゼ、EC 4.2.1.11、分子量およそ80kD)は、α、βおよびγと称する3つの免疫学的に異なるサブユニットを含む種々の二量体アイソフォームで存在する。エノラーゼのα-サブユニットは、哺乳動物の多くの型の組織に存在するが、β-サブユニットは、主に、心臓および横紋筋系に見られる。エノラーゼアイソフォームαγおよびγγは、ニューロン-特異的エノラーゼ(NSE)またはγ-エノラーゼと呼ばれ、主に、ニューロンおよび神経内分泌細胞ならびにこれらに由来する腫瘍において高濃度で検出され得る(Lamerz, R., NSE (Neuronen-spezifische Enolase), γ-Enolase. In: Thomas L (編) Clinical Laboratory Diagnosis, TH-Books, Frankfurt, 英語版第1版 1998: 979-981, 5. deutsche Auflage 1998:1000-1003)。
測定されたCA 19-9値は、モノクローナル抗体1116-NS-19-9の使用によって規定される。およそ10,000ダルトンの分子量を有する糖脂質上の1116-NS-19-9-反応性決定基が測定される。このムチンはルイスa血液型決定基のハプテンに相当し、多くの粘膜細胞の成分である(Koprowski, H.,ら, Somatic Cell Genet 5 (1979) 957-971)。
CEAは、およそ45〜60%の変動的糖鎖成分を有する単量体糖タンパク質(分子量およそ180.000ダルトン)である(Gold, P.およびFreedman, S.O., J. Exp. Med. 121 (1965) 439-462)。
「CYFRA 21-1」のアッセイでは、循環系内に存在するサイトケラチン19の可溶性断片が特異的に測定される。CYFRA 21-1の測定は、典型的には2つのモノクローナル抗体を基本とする(Bodenmueller, H.,ら, Int. J. Biol. Markers 9 (1994) 75-81)。Roche Diagnostics, GermanyのCYFRA 21-1アッセイでは、2つの特異的モノクローナル抗体(KS 19.1およびBM 19.21)が使用され、およそ30,000ダルトンの分子量を有するサイトケラチン19の可溶性断片が測定される。
タンパク質ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ (NNMT; Swiss-PROT: P40261)は、29.6 kDaの見かけ分子量および5.56の等電点を有する。
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンゾチアゾリン(ethylbenzthiazoline)スルホネート(6)]ジアンモニウム塩
BSA ウシ血清アルブミン
cDNA 相補DNA
CHAPS (3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]- 1-プロパン-スルホネート)
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオトレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素免疫測定法
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
IAA ヨードアセトアミド
IgG 免疫グロブリンG
IEF 等電点電気泳動(focussing)
IPG 固定pH勾配(immobilized pH gradient)
LDS ドデシル硫酸リチウム
MALDI-TOF マトリックス支援レーザー脱離/イオン化法-飛行時間型質量分析法
MES メシチル、2,4,6-トリメチルフェニル
OD 光学濃度
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PI 等電点
RTS ラピッドトランスレーションシステム(rapid translation system)
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
潜在的な癌マーカーとしてのASCの同定
胸部腫瘍患者由来の疾患組織および正常組織の試料を使用するASCの最初の確認の後、マーカーを、他の癌および特に結腸直腸癌について試験する(以下の表6を参照)。さらに、結腸直腸癌患者由来の血清および血漿試料を分析する。結果として、この型の癌について、データは、生化学的マーカーとしてのASCの有用性を示す。
マーカータンパク質ASCに対する抗体の生成
癌マーカータンパク質ASCに対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングおよびELISAによるASCの血清および血漿ならびに血液レベルの測定における抗体のさらなる使用のために生成する。
ASCに対する抗体を生成するために、タンパク質の組換え発現を、免疫原を得るために実施する。発現を、RTS100発現系および大腸菌(E.coli)の組み合わせを利用して実施する。第1工程において、DNA配列を分析して、高収量cDNAサイレント変異バリアントおよびそれぞれのPCRプライマー配列に対する推奨を「ProteoExpert RTS E.coli HY」系を使用して得る。これは、市販のウェブベースのサービスである(
1181096595562_0)。推奨されたプライマー対を使用して、ASCタンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロ転写および発現のためのcDNAから直線状PCRテンプレートを生成するために「RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag」(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat.No. 3186237)系を使用する。ウエスタンブロット検出および後の精製のために、発現されたタンパク質は、His-タグを含む。最も発現するバリアントを同定する。PCRから発現および検出までの全ての工程を製造業者の指示書に従って実施する。全ての必要なT7調節領域(プロモーター、リボソーム結合部位およびT7ターミネーター)を含むそれぞれのPCR産物を、製造業者の指示書に従ってpBAD TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Cat. No. K 4300/01)にクローニングする。T7調節配列を使用する発現のために、構築物で大腸菌BL21(DE3)(Studier, F.W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89)を形質転換し、形質転換された細菌をタンパク質発現のために1lのバッチで培養する。
合成を、ヘテロ二官能性化学(マレイミド/SH化学)を使用して実施する。ASC−ペプチドを含む選択されたシステインを、Concholepas concholepas (Sigma, B-8556)からの3−マレイミドヘキサノイル−N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MHS)活性化ヘモシアニンに結合する。
ASCに対する抗体を生成するために、SlyD-ASC融合タンパク質の組換え発現を実施し、Scholz, C., et al., J. Mol. Biol. 345 (2005) 1229-1241に記載される方法に類似して免疫原を得る。従って、SlyD-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHHをコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築する。精製およびウエスタンブロット検出のために、構築物は、カルボキシ末端His-Tag (HHHHHH)を含む。さらなるGS-リンカー((GGGS)5-GGG)および第Xa因子に対する切断部位(IEGR)がSlyDとASCとの間に挿入される。発現を、大腸菌中でT5−プロモーターの制御下で実施する。
a)マウスの免疫
12週齢のA/Jマウスを、100μgのASC、融合タンパク質またはヘモシアニン−ペプチド結合体(上記を参照)で最初に腹腔内免疫する。この後、6週後に、1月の間隔で2回のさらなる腹腔内免疫を実施する。このプロセスにおいて、各マウスに、水酸化アルミニウムおよび109の百日咳菌(Bordetella pertussis)に吸着された100μgのASCまたはヘモシアニン−ペプチド結合体を投与する。続いて、最後の2回の免疫を、融合体がPBSバッファ中100μgのASCまたはヘモシアニン−ペプチド結合体を各々について使用する3日および2日前に、静脈内で実施する。
a)に従って免疫されたマウスの脾臓細胞を、Galfre, G., and Milstein, C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って、骨髄腫細胞と融合する。このプロセスにおいて、免疫されたマウスの約1×108の脾臓細胞を、2×107の骨髄腫細胞(P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離(300×gおよび4℃で10分)する。次いで、細胞を、ウシ胎児血清(FCS)を含まないRPMI1640培地で1回洗浄し、50mlの円錐形チューブ中で400×gで再度遠心分離する。上清を捨て、細胞沈渣を軽くたたくことによってゆっくりとほぐし、1mlのPEG(分子量 4000, Merck, Darmstadt)を添加し、ピペッティングによって混合する。1分後、37℃の水浴中で、FCSを含まない5mlのRPMI 1640を4〜5分以内に室温で滴下する。その後、10%FCSを含む5mlのRPMI 1640を、約1分以内に滴下し、完全に混合し、培地(RPMI 1640+10% FCS)で50mlまで満たし、続いて、400×gおよび4℃で10分遠心分離する。沈殿した細胞を、10% FCSを含むRPMI 1640培地に集め、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地(RPMI 1640+10% FCS 中100mmol/l ヒポキサンチン、1μg/mlアザセリン)に播種する。100U/mlでインターロイキン6を、増殖因子として培地に添加する。
得られたハイブリドーマ細胞を、10%FCSを含むRPMI 1640培地に1mlあたり1×105細胞の密度で播種し、7日間発酵槽(Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, Order No. 144-050)中で増殖する。平均して、mlあたり100μgのモノクローナル抗体の濃度を、培養上清に得る。培養上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法(例えば、Bruck, C., et al., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695に従う)によって実施する。
a)免疫
免疫のために、1:1の比でタンパク質溶液(100μg/ml ASC、融合タンパク質またはヘモシアニン-ペプチド結合体)と完全フロイントアジュバントの新鮮なエマルジョンを調製する。各ウサギを第1日、第7日、第14日および第30日、第60日および第90日に1mlのエマルジョンで免疫する。血液を採取し、得られた抗−ASC血清を、実施例3および4に記載されるようにさらなる実験のために使用する。
ウサギ血清の1体積を4体積の酢酸バッファ(60mM、pH4.0)で希釈する。pHを2MのTris塩基で4.5に調整する。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を、よく攪拌しながら滴下する。30分後、試料を遠心分離(13,000×g、30分、4℃)し、ペレットを捨て、上清を回収する。上清のpHを2MのTris塩基の添加によって7.5に調整し、濾過(0.2μm)する。
ポリクローナルウサギIgGを、10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり、50μlのビオチン−N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中3.6mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料を、Superdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH, pH7.5, 30mM NaCl)でクロマトグラフィーにかける。ビオチン化IgGを含む画分を回収する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってビオチン化する。
ポリクローナルウサギIgGを、10mM NaH2PO4/NaOH, 30mM NaCl, pH7.5中10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり、50μlのジゴキシゲニン−3−O−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (DMSO中3.8mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をSuperdex(登録商標)200 (10mM NaH2PO4/NaOH, pH7.5, 30mM NaCl)でクロマトグラフィーにかける。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を回収する。モノクローナル抗体を同じ手順に従ってジゴキシゲニンで標識する。
ヒト血清および血漿試料中のASCの検出のためのウエスタンブロット
SDS-PAGEおよびウエスタンブロットを、Invitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬および装置を使用して実施する。ヒト血漿試料を、還元NuPAGE(登録商標) (Invitrogen) LDS試料バッファ中で1:20に希釈し、95℃で5分間加熱する。10μlのアリコートを、MESランニングバッファ系中で4〜12%NuPAGE(登録商標)ゲル(Bis-Tris)に流す。ゲルで分離されたタンパク質の混合物を、Invitrogen XCell IIO Blot Module (Invitrogen)およびNuPAGE(登録商標)転写バッファ系を使用してニトロセルロース膜にブロットする。膜をPBS/0.05% Tween-20中で3回洗浄し、SuperBlock Blocking Buffer (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)でブロックする。ビオチン化一次抗体を、SuperBlock Blocking Buffer (0.01-0.2μg/ml)中に希釈し、1時間膜と共にインキュベートする。膜をPBS/0.05% Tween-20中で3回洗浄する。特異的に結合したビオチン化一次抗体を、ストレプトアビジン−HRP結合体(SuperBlock Blocking Buffer中20mUABTS/ml)で標識する。1時間のインキュベーションの後、膜をPBS/0.05% Tween-20中で3回洗浄する。結合したストレプトアビジン−HRP結合体を、化学発光基質(SuperSignal West Femto Substrate, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)およびオートラジオグラフィーフィルムを使用して検出する。露光時間は、10分〜一晩まで変動する。
ヒト血清および血漿試料中のASCの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のASCの検出のために、サンドイッチELISAが開発される。抗原の捕捉および検出のために、抗−ASCポリクローナル抗体のアリコート(実施例2を参照)を、ビオチンおよびジゴキシゲニンそれぞれと結合体化する。
マーカー評価、感度および特異性;
診断精度に関して臨床的有用性を評価するためのROC分析
十分に特徴付けられた患者コホートから得られた個々の液体試料を分析することによって、精度を評価する。コントロール集団A(表1を参照)は、271人の献血者および結腸鏡検査を受けた46人の患者を含む317人の個体を含む。コントロール集団Bは、非癌疾患を有する87人の患者を含む。
マーカーパネル
実施例5に示されるように、ASCは、1つ以上の他のマーカーと組み合わせる、結腸マーカーパネル中のメンバーとして、評価のための見込みのある候補である。このために、予備的な多変量解析を実施する。
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Claims (7)
- a)試料におけるカスパーゼ関連リクルートドメインを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質(ASC)の濃度を測定する工程、
b)任意に試料における1つ以上の結腸直腸癌の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに
c)工程a)で測定された濃度および任意に工程b)で測定された濃度を結腸直腸癌の有無に相関させる工程、ここで、ASCの濃度の上昇が結腸直腸癌の存在を示す、
を含むインビトロで結腸直腸癌を評価する方法。 - 該試料が、血清、血漿、および全血からなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項1記載の方法。
- 該1つ以上の他のマーカーが、NSE、CYFRA21-1、NNMT、CA19-9、CA72-4、およびCEAからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 該1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1であることをさらに特徴とする、請求項3記載の方法。
- 該1つ以上の他のマーカーがNSEであることをさらに特徴とする、請求項3記載の方法。
- 結腸直腸癌の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質ASCの使用であって、ASCの濃度の上昇が結腸直腸癌の存在を示す、使用。
- 結腸直腸癌の評価における、ASCおよび結腸直腸癌に対する1つ以上の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用であって、ASCの濃度の上昇が結腸直腸癌の存在を示す、使用。
Applications Claiming Priority (3)
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