JP4942813B2 - 結腸直腸癌のマーカーとしてのタンパク質s100a12の使用 - Google Patents
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Description
a) 個体から得られた便試料を提供する工程、
b) 前記試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、
c) 工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびに
d) (c)で測定された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法に関する。
a) 個体から得られた便試料を提供する工程、
b) 前記試料を処理して処理済液体試料を得る工程、
c) 前記処理済液体試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、ならびに
d) (c)で形成された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の診断方法に関する。
a) 個体から得られた便試料を処理して、処理済液体試料を得る工程、
b) 前記処理済液体試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、
c) 工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびに
d) (c)で測定された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法である。
a) 個体から得られた便試料を提供する工程、
b) 前記試料を回収結腸細胞に処理する工程、
c) 前記処理済試料とS100A12に対する特異的結合剤を、前記結合剤とS100A12の複合体の形成に適した条件下で接触させる工程、ならびに
d) (c)で形成された複合体の量と結腸直腸癌の診断を相関させる工程
を含む結腸直腸癌の診断方法に関する。
マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)は腫瘍の成長および拡散に中心的な役割を果たし、細胞外マトリクスの酵素分解に寄与する。天然に存在するMMPのインヒビターは、MMP組織インヒビターまたはTIMPと称される。TIMPはMMPの活性化形態と密な1:1化学量論的複合体を形成し、これらの酵素の触媒活性を阻害する。
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホネート(6)]ジアンモニウム塩
BSA ウシ血清アルブミン
cDNA 相補DNA
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオトレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素免疫測定法
ESI エレクトロスプレーイオン化
FCS ウシ胎児血清
IAA ヨードアセトアミド
IgG 免疫グロブリンG
LC 液体クロマトグラフィー
MS 質量分析
MES メシチル-2,4,6-トリメチルフェニル
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PI 等電点
POD ホースラディッシュペルオキシダーゼ
RTS ラピッドトランスレーションシステム
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
潜在的な結腸直腸癌のマーカーとしてのS100A12の同定
組織源
結腸直腸癌の潜在的な診断的マーカーとしての腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミクス法を用いて3つの異なる種類の組織の分析を行う。
0.8〜1.2 gの凍結組織を乳鉢に入れ、液体窒素により完全に凍結させる。組織を乳鉢の中で微粉状にし、10倍容量(w/v)の溶解緩衝液(40mMクエン酸Na(Na-citrate)、5mM MgCl2、1%ゲナポール(Genapol)X-080、0.02%アジ化Na(Na-azide)、Complete(登録商標)EDTA非含有 [Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号1 873 580] )に溶解し、その後Wheaton(登録商標)ガラスホモジナイザー(20 x ゆるいフィッティング(loose fitting)、20 x きつい(tight)フィッティング)でホモジナイズする。3mlのホモジネートを1時間、4,500 x gで、ショ糖密度遠心分離(10〜60%のショ糖)に供する。この遠心分離工程の後、3つの画分を得る。勾配の頂部の画分は、可溶性タンパク質を含有し、さらなる分析に用いる。
供給業者のマニュアルの指示に従い、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度をBio-Rad(登録商標)タンパク質アッセイ(カタログ番号500-0006、Bio-Rad Laboratories GmbH、Muenchen、Germany)を用いて測定する。200μgのタンパク質に相当する容積に、4mlの還元緩衝液(9 M 尿素、2mM DTT、100mM KH2PO4、pH8.2 NaOH)を加え、1時間インキュベートする。溶液をAmicon(登録商標)Ultra 10 kD デバイス(Millipore GmbH、Schwalbach、Germany)で250μlに濃縮する。アルキル化のために、該250μlを1mlのアルキル化緩衝液(9 M 尿素、4mM ヨードアセトアミド、100mM KH2PO4、pH8.2 NaOH)に移し、6時間インキュベートし、その後Amicon(登録商標)Ultra 10 kD デバイスで250μlに濃縮する。洗浄のために1mlの9 M 尿素を加え、再度Amicon(登録商標)Ultra 10 kD デバイスで250μlに濃縮する。洗浄を3回繰り返す。
トリプシン消化産物 (500μl)を、SCXおよびRP Pepmep C18カラム (LC Packings、Idstein、Germany)からなる2次元Nano-HPLC-System (Ultimate、Famos、Switchos;LC Packings、Idstein、Germany)で分離する。90分のグラジエント(5〜95%のアセトニトリル)を用い、RPカラムで、連続的にさらに分離し、ESI-MSイオントラップ (LCQ deca XP;Thermo Electron、Massachusetts、USA;パラメーターについては表2参照)で、データ依存的スキャンを用いてオンライン分析する、11個のSCX画分(0、5、10、25、50、100、200、300、400、500、1,500mM NH4Acを用いる段階溶離)を得る。各試料について、3回のランを行う。表2に記載されたパラメーターを用いて、生のデータをBioworks 3.1ソフトウェア(Thermo Electron、Massachusetts、USA)で処理する。反復ランから得られる同定されたペプチドおよびタンパク質の併せたリストを得る。
各患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質、および対応するペプチドの数を、近隣の正常な組織、およびはぎ取った正常な粘膜組織に由来する対応する結果と比較する。この手段によって、タンパク質S100A12は、腫瘍組織において、特異的に発現されているか、または強く過剰発現されており、健常な対照組織においては、検出し得ない、もしくは少しは検出し得るか、または少し強く発現されていることがわかる。したがって、多くの他のタンパク質の中で、S100A12は、結腸直腸癌の診断における使用のための候補マーカーとして適する。
結腸直腸癌のマーカータンパク質S100A12に対する抗体の産生
血清、血漿、血液および特に便試料中のS100A12の測定におけるさらなる使用のために、結腸直腸癌のマーカーのタンパク質S100A12に対するポリクローナル抗体を産生させる。例えば、S100A12のかかる測定は、免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングおよびELISAによって行なわれる。
S100A12に対する抗体を産生させるために、免疫原を得るために、タンパク質の組み換え発現を行う。RTS 100発現系および大腸菌の組み合わせを適用することにより発現させる。最初の段階において、「ProteoExpert RTS E.coli HY」システムを用いて、該DNA配列を解析し、高収率のcDNAサイレント変異バリアント、およびそれぞれのPCRプライマー配列についての推奨を得る。これは商業的なウェブに基づくサービス(www.proteoexpert.com)である。推奨されるプライマー対を用い、cDNAから直鎖状PCR鋳型を産生させるための、ならびにS100A12タンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロの転写および発現のための、「RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag(RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set、His-tag)」(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号3186237)システムを用いる。ウエスタンブロット検出および後の精製のために、発現されるタンパク質はHisタグを含む。最もよく発現するバリアントを同定する。PCRから発現および検出までのすべての工程は、製造業者の使用説明書に従って行う。すべての必要なT7調節領域(プロモーター、リボソーム結合部位、およびT7ターミネーター)を含むそれぞれのPCR産物を、製造業者の使用説明書に従い、pBAD TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen、Karlsruhe、Germany、カタログ番号K 4300/01)の中にクローン化させる。T7調節配列を用いる発現のために、該構築物を大腸菌BL 21 (DE 3)に形質転換させ (Studier、F.W.,ら、Methods Enzymol. 185 (1990)60〜89)、形質転換された細菌をタンパク質発現のために1lのバッチで培養する。
a)マウスの免疫化
最初に100μgのS100A12で12週齢のA/Jマウスを腹腔内で免疫する。これに続いて6週間後に、1ヶ月間隔で2回さらに腹腔内で免疫する。この方法において、各マウスに、水酸化アルミニウムに吸着された100μgのS100A12、および細菌数109の百日咳菌(Bordetella pertussis)を投与する。その後、最後の2回の免疫化を、各々についてPBS緩衝液中の100μgのS100A12を用いる融合の3日前、および2日前に、静脈内で行う。
a)に従って免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre、G.およびMilstein、C.、Methods in Enzymology 73 (1981)3〜46に従って骨髄腫細胞と融合させる。この方法において、免疫したマウスの約1*108の脾臓細胞を2x107の骨髄腫細胞(P3X63-Ag8-653、ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離する(300 x g 、4℃で10分)。次いで細胞をウシ胎児血清(FCS)なしのRPMI 1640培地で一度洗浄し、50mlの円錐管で、400 x gで再度遠心分離する。上清を捨て、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、1mlのPEG(分子量4,000、Merck、Darmstadt)を加え、ピペッティングにより混合する。1分間37℃の水浴の中に入れた後、FCSなしの5mlのRPMI 1640を室温で4〜5分かけて滴下する。その後、10%のFCSを含有する5mlのRPMI 1640を、約1分以内で滴下し、完全に混合し、培地(RPMI 1640+10% FCS)を満たして50 mlにし、続いて400 x g で10分間4℃で遠心分離する。沈降した細胞を10%のFCSを含有するRPMI 1640培地に回収し、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地(RPMI 1640+10% FCS中の100 mmol/l ヒポキサンチン、1μg/ml アザセリン)中に播種する。成長因子として100 U/mlのインターロイキン 6を培地に加える。
得られたハイブリドーマ細胞を、10%のFCSを含有するRPMI 1640培地に、1 mlあたり1x105細胞の密度で播種し、発酵槽(Thermodux Co.、Wertheim/Main、Model MCS-104XL、注文番号144-050)の中で7日間増殖させる。培養物上清において、平均して1 mlあたり100μgのモノクローナル抗体の濃度が得られる。培養物上清からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における従来の方法(例えばBruck、C.ら、Methods Enzymol. 121 (1986)587〜695による)により行う。
a)免疫化
免疫化のために、タンパク質溶液の新鮮なエマルション(100μg/mlのタンパク質S100A12)および1:1の比のフロイント完全アジュバントを調製する。各ウサギを1日目、7日目、14日目、ならびに30日目、60日目、および90日目に1mlのエマルションで免疫する。血液を採り、得られた抗S100A12血清を、実施例3および実施例4に記載したように、さらなる実験に用いる。
ウサギ血清1容を酢酸塩緩衝液(60mM、pH4.0)4容で希釈する。2 M Tris塩基でpHを4.5に調節する。カプリル酸(25μl/mlの希釈した試料)を激しく攪拌しながら滴下する。30分後、試料を遠心分離し(13,000 x g、30分、4℃)、ペレットを捨て、上清を収集する。2 M Tris塩基を加えることにより上清のpHを7.5に調節し、濾過する(0.2μm)。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中で10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中の3.6 mg/ml)を加える。室温で30分静置した後に、試料をSuperdex 200でクロマトグラフィーに供する(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)。ビオチン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってビオチン化する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl、pH7.5中で10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche Diagnostics、Mannheim、Germany、カタログ番号1 333 054)(DMSO中3.8 mg/ml)を加える。室温で30分静置した後に、試料をSuperdex(登録商標)200でクロマトグラフィーに供する(10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)。ジゴキシゲニン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってジゴキシゲニンで標識する。
癌組織および健常組織それぞれにおけるS100A12のウエスタンブロッティング検出
腫瘍試料および健常対照試料からの組織溶解物を実施例1「組織の調製」に記載されるように調製する。
便被検物質の処理
a)洗剤抽出
Sarstedt(ドイツ)製のオーダー番号80.623.022の特別な試料採取デバイスにおいて患者から試料あたり約1gの便を採取し、凍結し、-70℃で保存する。分析のため、便試料を解凍し、ほぼ100mgの便試料を、Roche、ドイツ製(オーダー番号:11 873 580)プロテーゼインヒビターカクテルMini Complete無EDTA:
を加えたリン酸緩衝液、pH7.4で10倍希釈する。
便試料中のS100A12および他の目的のマーカーの測定を改善するため、「最適化抽出緩衝液」が使用される。該抽出緩衝液は、便試料の処理のために、プロテーゼインヒビターカクテル(Mini Complete 無EDTA、Roche、Germany)を以下の緩衝液:
に添加することにより新たに調製する。
ヒト便被検物質中のS100A12の測定のためのELISA
便由来のS100A12測定のためのサンドイッチELISAを開発する。ポリクローナルウサギ抗体を大腸菌内で発現された組換え完全長S100A12での免疫によって生成させる。96ウェルストレプトアビジンプレート(Streptawell、HighBind、Roche、Germany)を使用するサンドイッチELISAを確立するために使用するため、抗血清の精製IgG画分をビオチン化またはジゴキシゲニン化する。便抽出物を試料希釈緩衝液(100mM Tris、pH8.0、2mM CaCl2、1.5% KCL、0.3% Triton X-100、0.2%カゼイン、2%スクロース)中で1:25に希釈し、50μlの試料または標準品を、各ウェルに移す。続いて、アッセイ緩衝液(PBS、pH7.4、0.1% ウシIgG、0.9% NaCl、0.5% Thesit、1% PEG 40,000、0.1% ウシIgG、0.025% ウシγグロブリンアセチル化)に0.5μg/ml ビオチン化ポリクローナル抗体PAB<S100A12>-Biおよび0.5μg/ml ジゴキシゲニン化ポリクローナル抗体PAB<S100A12>-Digを含有する抗体混合物50μlを添加することにより、抗原-抗体複合体の形成が開始される。プレートを60分間インキュベートし、350μlの洗浄緩衝液/ウェル(100mM PBS、pH7.4、0.05% TWEEN-20)で3回洗浄する。その後、100μlの25mU/ml MAB<Dig>-PODコンジュゲート(Roche Diagnostics、Germany)/ウェルを添加し、さらに60分間インキュベートする。350μlの洗浄緩衝液/ウェルで3回洗浄後、100μlのABTS溶液(Roche Diagnostics、Germany)/ウェルを添加し、プレートを60分間インキュベートする。ELISAリーダー(SLT.Spectra II)を使用し、405/620nmで吸光度を測定する。較正のため、組換え完全長S100A12が使用される。
尿素抽出物中の被検物質安定性
S100A12は、4bに記載の抽出方法を用いて調製された便抽出物中において、ヘモグロビンよりも安定なようである。便抽出物を1または3日間室温で保存した場合、S100A12の平均回収はヘモグロビンの平均回収よりも高く、より少ないばらつきを示すようである。安定性を評価するために使用した20個の試料のうち、2つがヘモグロビン陰性である。
結腸直腸癌におけるS100A12の臨床的有用性
S100A12の臨床的有用性は、充分特徴付けされた患者コホートから得られた便試料を分析することにより評価される。各患者について、同じ腸運動からの2つの便試料を測定し、濃度を分析する。両濃度の相関をピアソン相関係数によって評価すると、密接な相関性が示される。アッセイの感度を改善するため、2つの対の試料の一方において測定された最大濃度を、さらなる分析に使用する。S100A12の診断値をZweig et al(上記)によるROC分析によって評価する。
18名の無CRC患者、結腸鏡検査法によって腺腫陽性と診断された10名の患者、ならびにUICC病期IIIおよびIVに分類される進行CRCを有すると診断された23名の患者由来の便試料を得る。S100A12は、各個体から得られた便試料において上記のようにして測定する。
結腸鏡検査法によって腺腫陽性と診断された10名の患者、CRCと診断された50名の患者(9名はUICC病期Iに分類;4名はUICC病期IIに分類;21名はUICC病期IIIに分類;13名はUICC病期IVに分類、2名はUICC病期I〜IIIに分類、すなわちIVでない;および1名は病期なしのCRC)ならびに50名の対照(他のGI-疾患を有する、すなわちCRCでない患者から7名;憩室症を有する患者から16名;GI健常に分類されたドナーから8名;および痔を有する患者から19名)から便試料を得る。これらの各個体から得た便試料において、上記のようにしてS100A12を測定する。
S100A12を、より拡張された第3の試験集団(患者の特徴については表5参照)において測定する。多施設研究のフレームワークにおいて、多数の臨床的に充分特徴付けされた便試料を予見的(prospectively)に採取する。対照集団の患者(結腸鏡検査法を受けている)を、胃腸疾患部門(unit)において集め、平均リスクスクリーニング集団とする。炎症性腸疾患およびいずれかの種類の腺腫を有する患者は、対照集団から除外する。スクリーニング集団における結腸直腸癌患者の低有病率のため、癌患者由来の試料は、種々の外科部門で集める。医師は、結腸直腸癌の診断を確認し、また、各癌患者について病理学的病期分類を示す。グアヤク系FOBTプレスクリーニングによる患者の一般的な診断検査によって導入され得る任意の偏りを評価するため、事前にグアヤク系FOBTを行なっていない亜集団もまた集める。また、可視的であるため直腸出血が検出された患者はすべて、ヘモグロビンの利点に対する偏りが導入され得るため、この亜集団から除外する。
S100A12と他の便マーカーとの組合せ
S100A12と便抽出物由来の他のバイオマーカーの組合せを評価する。市販のELISAを用いて、マーカー、ヘモグロビン、ヘモグロビンとハプトグロビンとのヘテロ複合体、カルプロテクチン、TIMP-1、M2-PKおよびCEAを測定する。ヘモグロビン、ヘモグロビン/ハプトグロビンおよびカルプロテクチンの測定のためのアッセイは、R-Biopharm、Germanyから入手される。Calpro Calprotectin ELISAは、Calpro SA、Norwayで製造されており、ドイツ国外でPhiCalTM Testとして販売されている。CEAの測定のためのアッセイは、Roche Diagnostics、Germanyから入手される。M2-PK用のアッセイはSchebo Biotech、Germanyから、TIMP-1用のアッセイはR&D Systems、USAからそれぞれ供給されている。いくつかのアッセイは便抽出物における測定が意図されるが、2つのアッセイ、すなわちCEAおよびTIMP-1では、便は一般的に使用される試料材料ではない。したがって、アッセイは、抽出便被検物質を代理(represent)する試料中の対応する被検物質の測定に調整されなければならない。CEA測定のため、試料(便抽出物)を20倍に予備希釈するが、それ以外は製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。同様に、TIMP-1の測定のために、アッセイ手順自体は変更せずに試料を3倍に予備希釈する。
のBBR-Softwareにおいて実行する。以下の設定:自動フィーチャー選択なし、事前に分散を0.05に固定、閾値調整なし、および正規化による入力標準化を使用する。数値処置のため、収束閾値0.0005、イテレーション1000および非精密モードでのデフォルト設定は、未変更のままとする。基本アルゴリズムでの結果を、Monte-Carloクロス確認設計において100回の実行によって評価する。各実行において、すべての場合の3分の2および対照を、それぞれ、デフォルト乱数発生器の開始値を19022007にしたMatlab(登録商標)R2006a内臓機能ランドサンプル(randsample)により、トレーニングセット(training set)として選択する。基本アルゴリズムをトレーニングセットに適用し、診断公式を得る。推定罹患事後確率(posterior case-probability)に対する閾値を、トレーニングセットの対照に関して決定し、それぞれ、95%または98%の特異性を得る。次いで、診断公式をデータのその他の3分の1に適用し、所定の閾値における感度および特異性を推定する。
Claims (9)
- a) 個体から得られた便試料を提供する工程、
b) 前記試料をS100A12に対する特異的結合剤と、前記結合剤とS100A12との複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
c) 工程(b)で形成された複合体の量を測定する工程、および
d) (c)で測定された複合体の量を結腸直腸癌の検出と相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の検出方法。 - a) 個体から得られた便試料を提供する工程、
b) 前記試料をS100A12に対する特異的結合剤と、前記結合剤とS100A12との複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
c) 前記試料を、ヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、組織メタロプロテアーゼインヒビター1(TIMP-1)、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ(M2-PK)からなる群より選択される第2のマーカーに対する特異的結合剤と、前記結合剤と第2のマーカーとの複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、
d) 工程(b)および(c)で形成された複合体の量を測定する工程、ならびに
e) 工程(d)で測定された複合体の量を結腸直腸癌の検出と相関させる工程
を含む、結腸直腸癌の検出方法。 - 前記第2のマーカーがヘモグロビンである、請求項2記載の方法。
- 前記第2のマーカーがヘモグロビン/ハプトグロビン複合体である、請求項2記載の方法。
- 前記第2のマーカーがTIMP-1である、請求項2記載の方法。
- 前記第2のマーカーがM2-PKである、請求項2記載の方法。
- 個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の検出におけるマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
- 個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の早期検出におけるマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
- 個体から得られた便試料からの結腸直腸癌の検出における、ヘモグロビン/ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン、組織メタロプロテアーゼインヒビター1(TIMP-1)、および腫瘍M2ピルビン酸キナーゼ(M2-PK)からなる群より選択される結腸直腸癌の1種類以上の他のマーカー分子と組み合せた、結腸直腸癌のマーカー分子としてのタンパク質S100A12の使用。
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