BRPI0711763A2 - uso de proteìna s100a12 como marcador para o cáncer coloretal - Google Patents

Abstract

USO DE PROTEìNA S100A12 COMO MARCADOR PARA O CáNCER COLORETAL. A presente invenção refere-se ao diagnóstico de câncer coloretal. Ela apresenta o uso da proteína S100A12 no diagnóstico do câncer coloretal. Ela refere-se a um método para o diagnóstico do câncer coboretal a partir de uma amostra de fezes, derivado de um indivíduo, ao medir a S100A12 na dita amostra. A medição de S100A12 pode, por exemplo, ser usada na detecção ou no diagnóstico precoces do câncer coloretal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE PROTEÍNA S100A12 COMO MARCADOR PARA O CÂNCER COLORE- AL".

A presente invenção refere-se ao diagnóstico do câncer colore- tal. Ela apresenta o uso da proteína S100A12 (= Calgranulina C) como uma molécula de marcador no diagnóstico do câncer coloretal. Além disso, ela refere-se especialmente a um método para o diagnóstico do câncer coloretal de uma amostra de fezes, derivado de um indivíduo através da medição da S100A12 na dita amostra. A medição da S100A12 pode, por exemplo, ser usada na detecção ou no diagnóstico precoces do câncer coloretal.

O câncer permanece como um grande desafio da saúde pública apesar do progresso na detecção e na terapia. Dentre os vários tipos de câncer, o câncer coloretal (= CRC) é um dos cânceres mais freqüentes no mundo ocidental.

Quanto mais cedo o câncer puder ser detectado/diagnosticado, melhor é a taxa de sobrevivência total. Isto é especialmente verdadeiro para o CRC. O prognóstico em estágios avançados do tumor é pobre. Mais de um terço dos pacientes irá morrer da doença avançada dentro de cinco anos após o diagnóstico, o que corresponde a uma taxa de sobrevivência de cer- ca de 40% para cinco anos. O tratamento atual está curando somente uma fração dos pacientes e tem claramente o melhor efeito nos pacientes diag- nosticados em um estágio inicial da doença.

No que diz respeito ao CRC como um problema de saúde públi- ca, é essencial que uma seleção mais eficaz e que medidas preventivas pa- ra o câncer coloretal sejam desenvolvidas.

Os procedimentos de detecção mais precoce disponíveis atual- mente para o câncer coloretal envolvem o uso de testes para o sangue fecal ou procedimentos endoscópicos. No entanto, o tamanho significativo do tu- mor deve existir tipicamente antes que o sangue fecal seja detectado. No que diz respeito à detecção do CRC de uma amostra de fezes, o estado da técnica atual é o teste de sangue oculto fecal baseado em guaiacina.

Nos últimos anos, foi relatada uma tremenda quantidade dos chamados genes específicos do cólon ou até mesmo chamados genes es- pecíficos de câncer coloretal. A vasta maioria dos documentos de pesquisa correspondentes ou dos pedidos de patentes é baseada nos dados obtidos pela análise de padrões de expressão do RNA no tecido do cólon (câncer) versus um tecido diferente ou um tecido normal adjacente, respectivamente. Tais abordagens podem ser resumidas como técnicas de exibição diferencial de mRNA.

Como um exemplo para os dados disponíveis de técnicas de e- xibição de mRNA, o pedido de patente WO 01/96390 será mencionado e discutido. Este pedido descreve e reivindica mais de duzentos polinucleotí- deos isolados e os polipeptídeos correspondentes como tais, bem como o seu uso na detecção do CRC. No entanto, é de conhecimento geral que as diferenças no nível do mRNA não são espelhadas pelo nível das proteínas correspondentes. Uma proteína codificada por um mRNA raro pode ser en- contrada em quantidades muito elevadas e uma proteína codificada por um mRNA abundante pôde no entanto ser duro de detectar e encontrar de fato. Esta falta de correlação entre o nível de mRNA e o nível de proteína é devi- do a razões tais como a estabilidade do mRNA, a eficiência da translação, a estabilidade da proteína, etc.

Também há abordagens recentes que investigam as diferenças em padrões de proteína entre tecidos diferentes ou entre o tecido saudável e o tecido doente a fim de identificar as moléculas marcadoras candidatas que podem ser usadas no diagnóstico de CRC. Brünagel, G. et al., Câncer Re- search 62 (2002) 2437-2442, identificaram sete proteínas nucleares de ma- triz que parecem ser mais abundantes no tecido do CRC em comparação ao tecido normal adjacente. Nenhum dado das amostras do líquido e das fezes obtidas de um indivíduo é relatado.

O pedido de patente WO 02/078636 relata cerca de nove pontos associados com o câncer coloretal tal como encontrado pela dessorção e ionização a laser intensificada na superfície (SELDI). Estes pontos são vistos mais normalmente nos soros obtidos de pacientes com CRC em compara- ção aos soros obtidos de controles saudáveis. No entanto, a identidade da (s) molécula(s) compreendida(s) em tal ponto, por exemplo, (sua seqüência), não é conhecida.¶

Apesar da lista grande e sempre crescente de marcadores de proteínas candidatos no campo do CRC, até a presente data a utilidade clí- nica/de diagnóstico destas moléculas não é conhecida. A fim de ser de utili- dade clínica, um novo marcador de diagnóstico como um marcador simples deve ser pelo menos tão bom quanto o melhor marcador simples conhecido no estado da técnica. Ou um novo marcador deve conduzir a um progresso na sensibilidade e/ou na especificidade de diagnóstico se ele for usado tanto sozinho quanto em combinação com um ou mais outros marcadores, respec- tivamente. A sensibilidade e/ou a especificidade de diagnóstico de um teste são avaliadas freqüentemente pelas suas características de operação de receptor, as quais serão descritas em detalhes a seguir.

Atualmente, por exemplo, os testes de sangue de diagnóstico baseados na detecção do antígeno carcinoembriônico (CEA), uma glicopro- teína associada a um tumor, estão disponíveis para ajudar no diagnóstico de campo de CRC. O CEA é aumentados em 95% das amostras do tecido obti- das dos pacientes com câncer coloretal, gástrico e pancreático e na maior parte dos carcinomas de mama, do pulmão, e da cabeça e da garganta (Goldenberg, D. M. et al., J. Natl. Câncer lnst. (Bethesda) 57 (1976) 11-22). Altos níveis de CEA também foram relatados nos pacientes com doença não malignas, e muitos pacientes com câncer coloretal têm níveis normais de CEA no soro, em especial durante o estágio inicial da doença (Carriquiry, L. A. e Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999) 921-929; Herrera, M. A. et al., Ann. Surg. 183 (1976) 5-9; Wanebo, H. J. et al., N. Engl. J. Med. 299 (1978) 448-451). A utilidade de CEA tal como medido a partir do soro ou do plasma na detecção de recorrências é notadamente controversa e ainda tem ser aplicada amplamente (Martell, R. E. et al., Int. J. Biol. Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C. G. et al., JAMA 270 (1993) 943-947).

À luz dos dados disponíveis, a determinação do CEA de soro não possui a sensibilidade nem a especificidade para permitir o seu uso co- mo um teste de seleção para o câncer coloretal na população assintomática (Reynoso, G. et al., JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon, C., Clin. Chem. 48 (2002) 1151-1159).

As amostras tomadas das fezes têm a vantagem que a sua a- mostragem é facilmente possível por meios não invasivos.

Tal como mencionado acima, o teste de guaiacina é atualmente mais amplamente usado como um ensaio de seleção para o CRC das fezes. O teste de guaiacina, no entanto, tem tanto uma sensibilidade pobre quanto uma especificidade pobre. A sensibilidade dos testes de sangue oculto fecal baseados em guaiacina é de -26%, que significa que 74% dos pacientes com lesões malignas irão permanecer não detectados (Ahlquist, D. A., Gas- troenterol. Clin. North Am. 26 (1997) 41-55).

A visualização de lesões pré-cancerosas e cancerosas repre- senta a melhor abordagem para a detecção precoce, mas a colonoscopia é invasiva com custos, riscos, e complicações significativos (Silvis, S. E. et al., JAMA 235 (1976) 928-930; Geenen, J. E. et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235; Anderson, W. F. et al., J. Natl. Câncer Institute 94 (2002) 1126- 1133).

A sensibilidade e a especificidade de alternativas de diagnóstico para o teste de guaiacina foram investigadas recentemente por Sieg, A. et al., Int. J. Colorectal Dis. 14 (1999) 267-271. Especialmente a medição da hemoglobina e do complexo de hemoglobina-haptoglobina do espécime das fezes foi comparada. Foi observado que o ensaio da hemoglobina tem uma sensibilidade insatisfatória para a detecção de neoplasmas colorectais. En- quanto o câncer em seu estágio de carcinoma avançado é detectado com uma sensibilidade de cerca de 87%, os primeiros estágios do tumor não são detectados com uma sensibilidade suficiente. O ensaio de complexo de he- moglobina-haptoglobina foi mais sensível na detecção dos primeiros está- gios do CRC. Esta detecção mais sensível foi acompanhada por uma espe- cificidade pobre. Uma vez que a especificidade pobre, no entanto, se traduz em um número elevado de investigações secundárias desnecessárias, tal como a colonoscopia, um ensaio com uma especificidade pobre também não preenche os requisitos de um ensaio de seleção geralmente aceito. A calprotectina foi descrita como um biomarcador alternativo pa- ra a detecção do CRC de amostras de fezes na patente U.S. N9 5.455.160 e de maneira correspondente na literatura científica por Roseth, A. G., et al. (Scand. J. Gastroenterol. 27 (1992) 793-798; Scand. J. Gastroenterol. 28 (1993) 1073-1076). Embora a calprotectina seja um marcador de doenças inflamatórias, o seu potencial como um marcador para a detecção do CRC das fezes é documentado por diversas publicações (Johne, B., et al., Scand. J. Gastroenterol. 36 (2001) 291-296; Limburg, P. J., et al., Am. J. Gastroen- terol. 98 (2003) 2299-2305; Hoff, G., et al., Gut 53 (2004) 1329-1333). Embo- ra a sensibilidade e a especificidade da calprotectina sejam comparáveis ao ensaio imunológico de hemoglobina, a calprotectina parece ter algumas ca- racterísticas favoráveis para um biomarcador de diagnóstico em comparação com a hemoglobina. Ela é distribuído uniformemente nas fezes, é estável à temperatura ambiente, tornando a entrega de correio da amostra ao Iabora- tório praticável, e não mostra nenhuma interferência em componentes de alimentos ou compostos farmacêuticos (Ton, H., et al., Clin. Chim. Acta 292 (2000) 41-54). No entanto, altas concentrações de calprotectina, do hetero- dímero de S100A8 e de S100A9, foram detectadas em amostras de fezes de pacientes que sofrem de CRC, mal de Crohn ou doença inflamatória do in- testino. Estes resultados estão de acordo com o papel mais geral da calpro- tectina na inflamação (Ryckman, C., et al., J. Immunol. 170 (2003) 3233- 3242). Desse modo, o uso de calprotectina na gastroenterologia não fica limitado à detecção do CRC mas se estende a outras doenças, em especial a doença inflamatória do intestino tal como revisto por Poullis, A., et al. (J. Gastroenterol. Hepatol. 8 (2003) 756-762).

Um outro método alternativo ao teste de guaiacina para a detec- ção de CRC nas fezes foi publicado recentemente e consiste na detecção do antígeno específico de câncer coloretal, "a proteína de manutenção de mini- cromossoma 2" (MCM2) por imunohistoquímica nas células docólon vertidas nas fezes. Devido ao estudo de tamanho pequeno, a conclusão sobre o va- lor de diagnóstico para a detecção do câncer coloretal é preliminar. No en- tanto, o teste parece ter uma sensibilidade apenas limitada para detectar o câncer de cólon do lado direito (Davies, R. J. et al., Lancet 359 (2002) 1917- 1919).

Recentemente, um ensaio para a detecção de isoenzima M2 de quinase de piruvato (M2-PK) foi introduzido no mercado (Schebo Biotech1 Giessen, Alemanha). Uma comparação do ensaio de guaiacina com os en- saios imunológicos para a hemoglobina e a M2-PK foi feita, por exemplo, por Vogel, por T. et. al., Dtsch. Med. Wochenschr. 130 (2005) 872-877. Eles mostram que os ensaios imunological são superiores ao teste de guaiacina e que a uma especificidade comparável o ensaio de M2-PK é menos sensível na detecção do CRC em comparação ao ensaio de hemoglobina. Além dis- so, os autores concluem que a utilidade de ambos estes ensaios baseados nas fezes ainda é questionável.

A identificação de um marcador de tumor de CRC inicial que de- ve permitir a detecção confiável do câncer ou fornecer a informação de prognóstico precoce por meios não invasivos de um espécime de fezes pode conduzir a um ensaio de diagnóstico que deve ajudar bastante no diagnósti- co e no gerenciamento desta doença. Portanto, existe uma necessidade clí- nica urgente para melhorar o diagnóstico de CRC1 especialmente das fezes. É especialmente importante melhorar o diagnóstico precoce de CRC, uma vez que para os pacientes diagnosticados logo as chances de sobrevivência são muito maiores em comparação com aqueles diagnosticados em um es- tágio avançado da doença.

A tarefa da presente invenção era a investigação se pode ser identificado um novo marcador que possa ajudar no diagnóstico do CRC. De preferência, tal marcador deve estar presente nas fezes e permitir um diag- nóstico não invasivo.

Surpreendentemente, foi verificado que o uso da proteína S100A12 como um marcador para o CRC pode superar pelo menos parcial- mente os problemas conhecidos do estado da técnica.

A presente invenção refere-se, portanto, a um método para o di- agnóstico do câncer coloretal, o qual compreende as etapas de:

a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo, b) colocação da dita amostra em contato com um agente de li- gação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12,

c) determinando da quantidade de complexo formada na etapa (b), e

d) correlação da quantidade de complexo determinada em (c) com o diagnóstico de câncer coloretal.

Tal como deve ser apreciado pelo elemento versado na técnica, uma medição de S100A12 é feita in vitro. A amostra do paciente é descarta- da mais tarde. A amostra do paciente é usada unicamente para o método in vitro da invenção e nenhum material da amostra do paciente é transferido de volta ao corpo do paciente. Nem a medição de ST00A12 nem a avaliação de CRC são feitas no corpo humano ou animal.

O procedimento de diagnóstico in vitro de acordo com a presen- te invenção é usado para avaliar a ausência, a presença ou a concentração relativa de S100A12 em uma amostra de fezes. O valor medido para S100A12 irá ajudar o clínico na avaliação do CRC, por exemplo, ao estabe- lecer um diagnóstico clínico e/ou na sua decisão quanto a um tratamento apropriado.

Em uma realização preferida, a amostra de fezes é processada para obter um líquido processado da amostra que seja mais conveniente de manipular do que um espécime de fezes. Tal amostra processada é então incubada com o agente de ligação específico para S100A12. A presente in- venção também refere-se, portanto, a um método para o diagnóstico do cân- cer coloretal, o qual compreende as etapas de:

a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo,

b) processamento da dita amostra para obter uma amostra lí- quida processada,

c) colocação da dita amostra líquida processada em contato com um agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropri- adas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12, e d) correlação da quantidade de complexo formada em (c) com o diagnóstico de câncer coloretal.

Uma outra realização preferida da invenção é um método para o diagnóstico de câncer coloretal, o qual compreende as etapas de:

a) processamento de uma amostra de fezes obtida de um indi- víduo para obter uma amostra líquida processada,

b) colocação da dita amostra líquida processada em contato com um agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropri- adas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12,

c) determinação da quantidade de complexo formada na etapa (b),e

d) correlação da quantidade de complexo determinada em (c) com o diagnóstico de câncer coloretal.

Em uma outra realização preferida da presente invenção é a- presentado um método para o diagnóstico de câncer coloretal, o qual com- preende as etapas de emprego de uma amostra de fezes obtida de um indi- víduo, colocação da dita amostra em contato com um agente de ligação es- pecífico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12, colocação da dita a- mostra em contato com um agente de ligação específico para um segundo marcador selecionado do grupo que consiste em complexo de hemoglobi- na/haptoglobina, hemoglobina, inibidor de tecido de metaloproteases 1 (TIMP-1), e quinase de piruvato M2 de tumor (M2-PK) sob condições apro- priadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e o segundo marcador, detecção da quantidade de complexo formada para S100A12 He pelo menos um segundo marcador, e correlação da quantidade de complexos determinados com o diagnóstico de câncer coloretal. Em ou- tras realizações preferidas, o método de acordo com a presente invenção é baseado na determinação de S100A12 e da hemoglobin como segundo marcador, na determinação de S100A12 e do complexo de hemoglobi- na/haptoglobina como segundo marcador, na determinação de S100A12 e de TIMP-1 como segundo marcador, e na determinação de S100A12 e de M2-PK como segundo marcador, respectivamente. Como fica óbvio ao ele- mento versado na técnica, a medição de S100A12 e a medição de pelo me- nos um segundo marcador podem ser feitas a partir da mesma alíquota de uma amostra de fezes ou de uma amostra de fezes processada, respectiva- mente, ou de alíquotas diferentes da amostra de fezes de um paciente ou de alíquotas diferentes da amostra de fezes processada de um paciente, res- pectivamente.

Em uma outra realização preferida, a amostra de fezes é pro- cessada para recuperar os colonócitos, os quais são então manchados em slide de microscópio. Tal amostra processada é então incubada com o agen- te de ligação específico para S100A12. A presente invenção, portanto, tam- bém refere-se a um método para o diagnóstico de câncer coloretal que com- preende as etapas de:

a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo,

b) processamento da dita amostra para recuperar colonócitos,

c) colocação da dita amostra processada em contato com um agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12, e

d) correlação da quantidade de complexo formado em (c) com o diagnóstico de câncer coloretal.

A proteína S100A12 (= Calgranulina C) é caracterizada pela se- qüência fornecida pela ID SEQ N°: 1.

S100A12 também é chamada de CAAF1; CAGC; proteína de li- gação de cálcio no fluido amniótico; proteína relacionada com a calgranulina; CGRP; proteína de ligação de cálcio em no fluido amniótico 1; Calgranulina C; ENRAGE (proteína de ligação celular de RAGE recém identificada); prote- ína do neutrófilo S100; proteína A12 de ligação de cálcio S100. A proteína codificada por este gene é um membro da família S100 das proteínas que contêm dois motivos de ligação cálcio de duas mãos de EF. As proteínas S100 ficam localizadas no citoplasma e/ou no núcleo de uma ampla gama de células, e estão envolvidas na regulação de uma série de processos celu- lares tais como a progressão e a diferenciação do ciclo das células. Os ge- nes S100 incluem pelo menos 13 membros que são posicionados como um aglomerado no cromossoma 1q21. Esta proteína é proposta como estando envolvida em rotas de transdução de sinal dependentes de cálcio específi- cas, e o seu efeito regulador em componentes citoesqueletais pode modular várias atividades de neutrófilos.

A estrutura fisiologicamente relevante de S100A12 é um homo- dímero de ligação de Ca2+. Uma vez que o S100A12 também é liberada das células, as funções extracelulares foram descritas, por exemplo, a regulação de processos inflamatórios (Foell, D. et al., Clin. Chim. Acta 344 (2004) 37- 51). Junto com a S100A8 (= calgranulina A) e a S100A9 (calgranulina Β), o S100A12 é expressa nos granulócitos, onde as proteínas de calgranulina constituem até 50% do teor de proteína citosólica solúvel. Com a inflamação aguda, o S100A12 é liberada e encontrada em doenças diferentes incluindo doenças de intestino irritável, Morbus Crohn, Kawasaki ou a artrite reumatói- de (Burmeister, G. e Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230; Foell, D. et al., Rheumatology 42 (2003) 1383-1389). Quando a cascata de sinais da resposta de S100A12 foi investigada, ela foi associada a um novo eixo inflamatório através do receptor para avançado produtos finais glicados avançados (= RAGE). Este receptor pode ser encontrado em vários tipos de tecidos incluindo, por exemplo, o endotélio e as células do sistema imunoló- gico (Hofmann, M. A. et al., Cell 97 (1999) 889 - 901; Schmidt, A. M. et al., J. Clin. Invest. 108 (2001) 949-955). Além do envolvimento na resposta infla- matória, a rota de RAGE também foi descrita na cura de feridas, em conse- qüência do crescimento de tumor ou amiloidose sistêmica (Hofmann, M. A. et al., supra; Schmidt, A. M. et al., supra; Yan, S. S. et al., Nat. Med. 9 (2003) 287-293; Hofmann, M. A. et al., Genes Immun. 3 (2002) 123-135). Desse modo, o S100A12 pode ter uma ampla gama de efeitos. No entanto, nenhu- ma relação aos processos de tumor foi descrita até a presente data.

Em uma realização preferida, o novo marcador de S100A12 é usado na seleção para o CRC. Quando é empregado no paciente para moni- toramento, o método de diagnóstico de acordo com a presente invenção po- de ajudar a avaliar a carga do tumor, a eficácia do tratamento e o retorno do tumor no acompanhamento dos pacientes. Os níveis aumentados da S100A12 são diretamente correlacionados com a carga do tumor. Depois da quimioterapia, um aumento por um período curto (de poucas horas até 14 dias) na S100A12 pode servir como um indicador da morte da célula do tu- mor. No acompanhamento a longo prazo dos pacientes após a cirurgia e/ou a quimioterapia (de 3 meses a 10 anos) um aumento da S100A12 pode ser usado como um indicador para o retorno do tumor no coloreto.

Em uma realização preferida, o método de diagnóstico de acor- do com a presente invenção é usado para finalidades de seleção. Isto é, ele é usado para avaliar indivíduos sem um diagnóstico prévio do CRC através da medição do nível de S100A12 em uma amostra de fezes e da correlação do nível medido à presença ou à ausência do CRC.

Como deve ser imediatamente apreciado por um elemento ver- sado na técnica, em tal seleção tem que ser tomado cuidado para que uma quantidade apropriada de uma amostra de fezes seja usada. Uma quantida- de definida de amostra de fezes é usada de preferência para a medição da S100A12 nela presente. A quantidade de S100A12 é de preferência expres- sa em termos de uma quantidade de S100A12 por uma quantidade de fezes, isto é, a concentração relativa de S100A12 é fornecida.

O método de diagnóstico pode não somente ser usado para a seleção da população assintomática geral, mas também em uma realização preferida alternativa para a observação de indivíduos de alto risco. Tais indi- víduos de alto risco são selecionados de preferência do grupo que consiste em indivíduos anemia de carência de ferro, os parentes de primeiro grau de pacientes de CRC, os pacientes com um histórico de família do CRC e os pacientes com pólipos recém detectados ou um histórico de neoplasia gas- trointestinal.

Para um ensaio da seleção, não somente o valor de AUC é re- levante. Um requisito bastante crítico em um ajuste de seleção é uma sensi- bilidade boa o bastante a um nível alto e clinicamente relevante de especifi- cidade. A especificidade elevada é crucial porque, se este requisito não for preenchido, isto deve resultar em um número elevado dos resultados positi- vos falsos acompanhados por procedimentos de acompanhamento desne- cessários e por aflição para os pacientes. Em outras realizações preferidas, o nível de especificidade é ajustado em 96%, 97%, 98% ou 99%, respecti- vãmente, em comparação aos indivíduos de CRC negativos da população de seleção clinicamente relevante.

Tal como deve ser apreciado por um elemento versado na téc- nica, valor de corte para S100A12 é estabelecido com base nos valores de S100A12 tal como medido na amostra de fezes derivada dos indivíduos de uma população normal saudável. A população normal clinicamente relevante em um ajuste de seleção consiste de preferência em indivíduos clinicamente saudáveis com uma idade de 55 a 65 anos. Um valor de S100A12 em uma amostra de fezes acima de um valor de corte estabelecido pode ser conside- rado indicativo para o CRC ou pode pelo menos assegurar mais exame de diagnóstico do respectivo indivíduo.

O câncer coloretal progride mais normalmente de adenomas (pólipo) a carcinomas malignos.

Os estágios do câncer consistem na classificação da doença em termos da extensão, da progressão, e da gravidade. São agrupados os paci- entes do câncer de modo que generalizações possam ser feitas sobre o prognóstico e a escolha da terapia.

Os estágios diferentes do CRC costumam ser classificados de acordo com os estágios Aa Dde Duke. Atualmente, o sistema de TNM é a classificação mais amplamente usada da extensão anatômica do câncer. Ele representa um sistema de estágios uniforme internacionalmente aceito. Há três variáveis básicas: T (a extensão do tumor primário), N (o status de nós de Iinfa regionais) e M (a presença ou a ausência de metástases distantes). Os critérios de TNM são publicados pela UICC (International Union Against Câncer), Sobin, L. H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, sexta edição, 2002). Uma vez que o status de TNM é determinado, os pacientes estão agrupados nos estágios da doença que são denotados por algarismos romanos que variam de I a IV em que IV é o estágio mais avançado da doença. Os estágios de TNM e os estágios da doença da UICC correspondem uns aos outros, tal como mostrado na seguinte Tabela 1 to- mada de Sobin L. H. e Wittekind (eds.) supra.

Tabela 1: Interrelação de estágios de TNM e estágios da doença da UICC

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O que é especialmente importante é que o diagnóstico precoce do CRC se traduz em um prognóstico muito melhor. Os tumores malignos do coloreto derivam dos tumores benignos, isto é, de adenoma. Portanto, o me- lhor prognóstico é daqueles pacientes diagnosticados no estágio do adeno- ma. Os pacientes diagnosticados como no início no estágio Tis, NO, MO ou T1-3; NO; MO, se forem tratados corretamente, têm uma possibilidade de mais de 90% de sobrevivência cinco anos após o diagnóstico em compara- ção a uma taxa da sobrevivência de cinco anos de somente 10% para os pacientes diagnosticados quando as metástases distantes já estão presen- tes.

No sentido da presente invenção, o diagnóstico precoce do CRC refere-se a um diagnóstico em um estágio do tumor onde nenhuma metásta- se (nem proximal = NO, nem distai = MO) esteja presente em verdade, isto é, os estágios de Tjs, NO, MO ou T1-4; NO; MO. Tis denota o carcinoma in situ.

É preferível que o CRC seja diagnosticado quando ainda não cresceu completamente através da parede do intestino, e desse modo nem o peritoneum visceral é perfurado nem outras órgãos ou estruturas são invadi- dos, isto é, que o diagnóstico é feito «m qualquer estágio de Tis; NO; MO a Τ3; NO; MO (= Tis-3; NO; MO).

O método de diagnóstico de acordo com a presente invenção é baseado em uma amostra de fezes que é derivada de um indivíduo. A amos- tra de fezes é extraída e o S100A12 é medido especificamente a partir desta amostra de fezes processada pelo uso de um agente de ligação específico.

Um agente de ligação específico é, por exemplo, um receptor para S100A12, uma Iectina que se liga o S100A12, um aptâmero para o S100A12, ou um anticorpo para o S100A12. Um agente de ligação específi- co tem pelo menos uma afinidade de 107 l/mol em relação à sua molécula alvo correspondente. O agente de ligação específico tem de preferência uma afinidade de 108 l/mol ou até mesmo mais preferida de 109 l/mol em relação à sua molécula alvo. Tal como deve ser apreciado por um elemento versado na técnica, o termo específico é usado para indicar que outras biomoléculas presentes na amostra não se ligam significativamente com o agente de Iiga- ção específico para o S100A12. De preferência, o nível de ligação a um bi- omolecule que não a molécula alvo resulta em uma afinidade de ligação que é somente 10%, e com mais preferência somente 5% da afinidade da molé- cula alvo, ou menos. Um agente de ligação específico mais preferido irá sa- tisfazer ambos os critérios mínimos acima tanto para a afinidade quanto para a especificidade.

Um agente de ligação específico é de preferência um anticorpo reativo com o S100A12. O termo anticorpo refere-se a um anticorpo policlo- nal, um anticorpo monoclonal, fragmentos de tais anticorpos, bem como os construtos genéticos que compreendem o domínio de ligação de um anticor- po. Qualquer fragmento de anticorpo que retém os critérios acima de um agente de ligação específico pode ser usado. Os anticorpos são gerados por procedimentos do estado da técnica, por exemplo, tal como descrito em Tijs- sen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990), o livro inteiro, em especial as páginas 43 a 78, Elsevier, Amsterdam). Além disso, o elemento versado na técnica está bem ciente dos métodos basea- dos em imunosorventes que podem ser usados para o isolamento específica de anticorpos. Por estes meios, a qualidade de anticorpos policlonais, e des- se modo o seu desempenho nos imunoensaios, podem ser realçados (Tijs- sen, P., supra, páginas 108 a 115).

Para as realizações tal como descrito na presente invenção, fo- ram usados anticorpos policlonais que foram desenvolvidos em coelhos. No entanto, é claro que também os anticorpos policlonais de espécies diferen- tes, por exemplo, de ratos ou porquinhos da índia, assim como anticorpos monoclonais, também podem ser usados. Uma vez que os anticorpos mono- clonais podem ser produzidos em qualquer quantidade requerida com pro- priedades constantes, eles representam ferramentas ideais no desenvolvi- mento de um ensaio para a rotina clínica. A geração e o uso de anticorpos monoclonais para S100A12 em um método de acordo com a presente in- venção constituem no entanto uma outra realização preferida.

Tal como deve ser agora apreciado por um elemento versado na técnica, que essa S100A12 foi identificada pela medição em um imunoen- saio como um marcador que era útil no diagnóstico do CRC, maneiras alter- nativas podem ser usadas para se obter um resultado comparável às reali- zações da presente invenção. A proteína de marcador S100A12 pode ser detectada por quaisquer meios apropriados e usada como um marcador de CRC. Tais meios apropriados preferidos compreendem a detecção do poli- peptídeo de S100A12 por um procedimento de ensaio imunológico, peta cromatografia líquida, em especial a cromatografia líquida de alto desempe- nho, pela eletroforese, em especial por SDS-PAGE combinada com Transfe- rência Western, e pela espectroscopia de massa.

Para a medição, a amostra de fezes é obtida de um indivíduo. Uma alíquota da amostra de fezes pode ser usada diretamente. Uma alíquo- ta da amostra de fezes é de preferência processada para se obter uma a- mostra líquida. Uma amostra de fezes processada é uma amostra líquida obtida mediante a extração de uma amostra de fezes com um tampão de extração.

O processamento da amostra de fezes é levado a efeito por um tampão de extração que é otimizado para a tarefa. Ele deve preencher pelo menos três requisitos básicos: Deve liberar o análito de interesse da matriz das fezes. Deve estabilizar o análito livre. Deve minimizar a interferência da matriz das fezes na detecção subseqüente do análito. Uma vez que as com- binações do marcador podem manter o potencial de diagnóstico adicional, um tampão otimizado não deve ser aplicável somente para um biomarcador específico, mas para todos os análitos de interesse. O tampão de extração pode conter uréia para melhorar a homogeneização e a extração da amostra de fezes. Ca2+ pode ser incluído para a estabilização de uma proteína de ligação de Ca2+. Uma vez que as proteínas S100 são conhecidas como pro- teínas de ligação de Ca2+, o tampão de extração de preferência irá conter íons Ca2+ para estabilizar tais proteínas. Devem ser usados agentes de que- lação fracos que, por um lado, podem quebrar as pontes de íons entre as proteínas de ligação de Ca2+ e a matriz das fezes. No entanto, por outro la- do, estes agentes de complexação de Ca2+ têm que ligar íons Ca2+ suficien- temente fracos para evitar da separação dos íons Ca2+ da S100A12. De pre- ferência, o ácido ou nitrilo triacético ou um citrato são usados como agentes de quelação em um tampão de extração de fezes. Um tampão de extração otimizado e preferido contém uréia, íons Ca2+ e um agente de quelação. O agente de quelação é selecionado de preferência do grupo que consiste em ácido nitrilo triacético ou um citrato. Um tampão de extração otimizado, por exemplo, é usado no processamento de uma amostra de fezes tal como mostrado no Exemplo 4b.

É mais conveniente usar um tampão de extração otimizado em combinação com um dispositivo de amostragem de fezes feito sob medida. De uma maneira mais conveniente, um indivíduo coleta uma quantidade de- finida de amostra de fezes e transfere a mesma diretamente à coleção pre- viamente carregado com o tampão de extração de estabilização. Este modo conveniente de amostragem e de extração permite o transporte do espécime a um laboratório de diagnóstico sem degradação do análito. Uma vez que a extração da amostra de fezes pode ser obtida diretamente no dispositivo de amostragem, os procedimentos necessários de manipulação e de transfe- rência são reduzidos.

Diversos desenvolvimentos recentes foram focados nos disposi- tivos que facilitam a amostragem e a manipulação de uma amostra de fezes. O documento de patente EP 1 366 715 apresenta um tubo de coleta especial para a coleta de uma amostra de fezes. Este tubo de extração compreende essencialmente (a) um corpo do recipiente que é oco no interior, se abre no alto, e pode receber uma solução tampão, (b) uma tampa superior provida com uma haste pequena roscada para a coleta de amostras fecais, em que a dita haste pequena roscada se projeta axialmente para dentro do corpo do recipiente, quando a tampa superior é aplicada à extremidade superior do corpo do recipiente, e (c) uma divisória separadora disposta em uma posição intermediária, dentro do dito corpo do recipiente, de modo a separar uma câmara superior de uma câmara inferior dentro do dito corpo do recipiente, e a dita divisória separadora tem um furo axial apropriado para permitir a pas- sagem da dita haste pequena roscada, de modo a reter o excesso de fezes na dita câmara superior e permitir a passagem da parte roscada da haste pequena para a dita câmara inferior. Este tubo de extração também tem um corpo do recipiente que é aberto no fundo e provido com uma tampa inferior que pode ser aplicada de maneira móvel à extremidade inferior do corpo do recipiente, de modo que o dito tubo de extração possa ser usado diretamen- te como um tubo de amostragem primária a ser introduzido em uma placa de suporte de amostra de analisadores automáticos, depois da remoção da dita tampa inferior e da virada do dito corpo do recipiente. O dispositivo descrito no documento de patente EP 1 366 715 permite a manipulação conveniente de uma quantidade definida de uma amostra de fezes e tem a vantagem que depois que apropriado extração o tubo pode diretamente ser colocada no amostra-suporte de um analisador automático.

Um segundo exemplo de um dispositivo sofisticado de amostra- gem de fezes que é apropriado para uma amostragem conveniente e a ma- nipulação de uma amostra de fezes é descrito no pedido de patente WO 03/068398.

A amostra de fezes é de preferência usada ou processada dire- tamente depois da amostragem ou armazenada refrigerada ou então mais convenientemente armazenada congelada. As amostras de fezes congela- das podem ser processadas mediante o descongelamento, seguido pela di- luição em um tampão apropriado, pela misturação e pela centrifugação. Os sobrenadantes são usados como amostra líquida para a medição subse- qüente do marcador de S100A12.

Uma alíquota da amostra de fezes processada é incubada com o agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo de agente de ligação e S100A12. Tais condições não precisam ser especificadas, uma vez que o elemento versado na técnica sem nenhum esforço inventivo pode identificar com facilidade tais condições de incubação apropriadas.

Como uma etapa final de acordo com o método apresentado na presente invenção, a quantidade de complexo é medida e correlacionada com o diagnóstico do CRC. Tal como deve ser apreciado por um elemento versado na técnica, há numerosos métodos para medir a quantidade do complexo de agente de ligação específico e S100A12 descrito totalmenbte em detalhes nos livros de textos relevantes (tal como, por exemplo, Tijssen P., supra, ou Diamandis et al. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)).

S100A12 é de preferência detectada em um formato de ensaio do tipo sanduíche. Em tal ensaio, um primeiro agente de ligação específico é usado para capturar o S100A12 em um lado e um segundo agente de liga- ção específico, o qual é etiquetado para ser direta ou indiretamente detectá- vel, é usado no outro lado.

Os anticorpos para S100A12 também podem ser usados para a avaliação do CRC em outros procedimentos, por exemplo, para detectar cé- lulas de câncer coloretal in situ, em biópsias, ou em procedimentos de tingi- mentos imunohistológicos.

De preferência, um anticorpo para S100A12 é usado em um en- saio imunológico qualitativo (S100A12 presente ou ausente) ou quantitativo (a quantidade de S1OOA12 é determinada).

Tal como acima mencionado, foi verificado surpreendentemen- te que o S100A12 pode ser medida a partir de uma amostra de fezes obti- da de uma amostra individual. Nenhum tecido e nenhuma amostra de bióp- sia são requeridos para aplicar o marcador de S100A12 no diagnóstico do CRC.

Embora a aplicação de métodos proteômicos de rotina às amos- tras de tecido, por exemplo, ao comparar o tecido saudável e o tecido cance- roso, conduza à identificação de muitos marcadores candidatos potenciais para o tecido/doença selecionado, marcadores candidatos somente aciden- talmente e em casos raros são encontrados na circulação. Surpreendente- mente, os autores da presente invenção puderam detectar a proteína S100A12 em uma amostra de fezes. Eles puderam demonstrar que a pre- sença de S100A12 em tal amostra de fezes obtida de um indivíduo pode ser correlacionada com o diagnóstico do câncer coloretal.

Também foi verificado que a presença ou a ausência de S100A12 em tal amostra de fezes obtida de um indivíduo pode ser correla- cionada com a presença ou a ausência do câncer coloretal em um paciente. A presente invenção também refere-se a um método para excluir o câncer coloretal, o qual compreende as etapas de: a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo, b) processamento da dita amostra para obter uma amostra líquida processada, c) colocação da dita amostra líquida pro- cessada em contato com um agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e o S100A12, e d) uso a ausência de um complexo em (c) como um indicador para a ausência de câncer coloretal.

Tal como deve ser apreciado por um elemento versado na téc- nica, um resultado positivo para o S100A12 em uma amostra de fezes não deve necessariamente significar que o paciente tem CRC. No entanto, um valor positivo para o S100A12 em uma amostra de fezes deve ser conside- rado como um indicador bem definido para assegurar mais diagnósticos e mais sofisticados. Em uma realização preferida, um valor positivo para o S100A12 tal como medido a partir de uma amostra de fezes é usado como um indicador de que o paciente deve ser submetido a mais investigações, em especial uma colonografia tomográfica computadorizada virtual (VCTC) ou uma colonoscopia. De preferência, um valor positivo em uma amostra de fezes é usado como um indicador de que a colonoscopia como a etapa se- guinte no exame (diagnóstico) de um paciente é assegurada.

A medição do nível da proteína S100A12 provou ser muito van- tajosa no campo de CRC. Portanto, em uma realização preferida adicional, a presente invenção refere-se ao uso da proteína S100A12 como uma molécu- la demarcador no diagnóstico do câncer coloretal de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo.

O termo molécula de marcador é usado para indicar que a pre- sença de um nível aumentado do análito de S100A12 tal como medido de uma amostra de fezes processada obtida de um indivíduo marca a presença de CRC. É óbvio que o marcador de S100A12 pode ser medido por quais- quer meios apropriados como a presença ou o valor medido usado na avali- ação do CRC.

Tal como fica óbvio a um elemento versado na técnica, a pre- sente invenção não deve ser interpretada como sendo limitada à medição da proteína S100A12 de comprimento total da SEQ ID Ne: 1. Os fragmentos fisiológicos de S100A12 também podem ser medidos e usados como um marcador para o CRC enquanto for praticada a presente invenção. Os frag- mentos imunologicamente detectáveis compreendem de preferência pelo menos 6, 7, 8, 10, 12, 15 ou 20 aminoácidos contíguos do dito polipeptídeo marcador. Um elemento versado na técnica deve reconhecer que as proteí- nas que são liberadas por células ou estão presentes na matriz extracelular podem ser danificadas, por exemplo, durante a inflamação, e podem ser de- gradadas ou clivadas em tais fragmentos. Tal como deve ser apreciado por um elemento versado na técnica, o S100A12 ou os seus fragmentos também podem estar presentes como parte de um complexo. Tal complexo também pode ser usado como um marcador no sentido da presente invenção. Além disso, ou de modo alternativo, o polipeptídeo de S100A12 pode carregar uma modificação pós-translacional, e tal S100A12 modificado também pode servir como um marcador de CRC.

Fragmentos artificiais de S100A12 podem ser usados, por e- xemplo, como um controle positivo em um ensaio imunológico ou como um imunogênio. Os fragmentos artificiais englobam de preferência um peptídeo produzido sinteticamente ou pelas técnicas recombinantes que consiste em pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 12, ou pelo menos 15 aminoácidos contíguos tal como derivado da seqüência indicada na SEQ ID N°: 1. De preferência, tal fragmento artificial compreende pelo menos um epítopo de diagnóstico de interesse. Ainda preferivelmente, o fragmento artificial compreende pelo me- nos dois epítopos de interesse e é apropriado para ser usado como um con- trole positivo em um ensaio imunológido do tipo sanduíche.

É prefere-se usar o novo marcador de S100A12 no diagnóstico precoce do câncer coloretal. No entanto, tal como deve ser apreciado por um elemento versado na técnica, o S100A12, semelhante a outros marcadores, também será de grande vantagem no diagnóstico e no acompanhamento dos pacientes que já sofrem de CRC em estágios mais avançados da pro- gressão do tumor.

A concentração de S100A12 é correlacionada bastante próxima com a carga do tumor no CRC. Pottanto, o marcador também é apropriado para o acompanhamento de pacientes de CRC após o tratamento. Em uma realização preferida, o novo marcador de S100A12 é usado no acompanha- mento dos pacientes que sofrem de CRC. Com a medição do CRC regular- mente, por exemplo, a intervaloes de três meses, de seis meses ou anuais, a progressão do tumor e/ou conforme as circunstâncias, a recorrência do tumor, podem ser avaliados.

Um aumento ou um ressurgimento de S100A12 acima do valor de corte normal são considerados como indicativos para a progressão do tumor de CRC ou para a recorrência do tumor, respectivamente. Uma outra realização preferida refere-se, portanto, a um método de avaliar por meio de uma medição in vitro um paciente que sofre de câncer coloretal após a cirur- gia para a remoção da lesão cancerosa, em que o método compreende as etapas de a) emprego de uma amostra de fezes obtida do dito paciente, b) colocação da dita amostra em contato com um agente de ligação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente e o S100A12, c) determinação da quantidade de comple- xo formado na etapa (b), e d) correlação da quantidade de complexo deter- minada em (c) com uma recorrência ou a uma progressão de câncer colore- tal. A medição de S100A12 de uma amostra de fezes é especialmente útil, e em uma realização preferida é usada na detecção precoce de uma recorrên- cia do tumor de CRC dentro do trato gastrointestinal.

Tanto o cólon quanto o reto fazem ambos parte do trato gastro- intestinal. Agora que foi mostrado que o S100A12 deve ser muito provavel- mente útil na seleção dos pacientes para o câncer coloretal, é muito provável que a presença de S100A12 em uma amostra de fezes também possa ser usada como um auxiliar de diagnóstico na avaliação de outros tipos de cân- cer gastrointestinal. Em uma outra realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de S100A12 tal como medido de uma amostra de fezes na avaliação de um tumor gastrointestinal. O S100A12 tal como medido de uma amostra de fezes também é usado de preferência na avaliação de um tumor no estômago. A medição de S100A12 de uma amostra de fezes pode ser útil e representa, portanto, uma realização preferida de acordo com a presente invenção na detecção precoce de uma recorrência de tumor gastrointestinal dentro do trato gastrointestinal.

O uso da própria proteína S100A12 representa um progresso significativo ao campo desafiador de diagnóstico de CRC a partir das fezes. A combinação das medições de S100A12 com outros marcadores conheci- dos, tais como a hemoglobina ou o complexo de hemoglobina-haptoglobina, ou com outros marcadores de CRC a serem descobertos ainda, conduz e pode conduzir, respectivamente, a outras melhorias na avaliação de CRC. Portanto, em uma outra realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de S100A12 como uma molécula de marcador para o câncer colore- tal em combinação com uma ou mais outras moléculas de marcador para o câncer coloretal no diagnóstico do câncer coloretal a partir de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo. Outros marcadores de CRC selecionados preferidos com os quais a medição de S100A12 pode ser combinada inclu- em o TIMP-1, a calprotectina, a quinase de piruvato M2 de tumor (M2-PK), a hemoglobina e/ou o complexo de hemoglobina-haptoglobina.

Como uma outra realização preferida, a presente invenção a- presenta o uso da proteína S100A12 como uma molécula de marcador para o câncer coloretal em combinação com uma ou mais outras moléculas de marcador para o câncer coloretal selecionadas do grupo que consiste no complexo de hemoglobina/haptoglobina, a hemoglobina, o inibidor de tecido de metaloproteases 1 (TIMP-1), a calprotectina, e a quinase de piruvato M2 de tumor (M2-PK).

Em uma realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12 e TIMP-1 na avaliação do CRC, enquanto que ambos os marcado- res são medidos a partir de uma amostra de fezes.

Em uma realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12 e hemoglobina na avaliação do CRC, enquanto que ambos os marcadores são medidos a partir de uma amostra de fezes.

Em uma realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12 e o complexo de hemoglobina/haptoglobina na avaliação do CRC, enquanto que ambos os marcadores são medidos a partir de uma amostra de fezes.

Em uma realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12 e a quinase de piruvato M2 de tumor (M2-PK) na avaliação do CRC, enuanto que ambos os marcadores são medidos a partir de uma a- mostra de fezes.

Em ainda uma outra realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12, TIMP-1 e hemoglobina na avaliação do CRC, en- quanto que todos os três marcadores são medidos a partir de uma amostra de fezes.

Ainda em uma outra realização preferida, a presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de marcadores que compreende os marcadores S100A12, TIMP-1 e o complexo de hemoglobina/haptoglobina na avaliação do CRC, enquanto que todos os três marcadores são medidos a partir de uma amostra de fezes.

TIMP-1 (= activador de plasminogênio de tecido 1)

As metaloproteinases de matriz (MMP) desempenham um papel de pivô no crescimento e na propagação do câncer, contribuindo para a de- gradação enzimática da matriz extracelular. Os inibidores naturais de MMP são chamados de inibidores de tecido de MMPs ou TIMPs. Os TIMPs for- mam complexos estequiométricos 1:1 intensos com as formas ativadas de MMPs1 inibindo desse modo a atividade catalítica destas enzimas.

Uma série de ensaios imunológicos ligados por enzimas para a detecção de TIMP-1 (Kodama, S., et al., Matrix 9 (1989) 1-6; Cooksley, S., et ai-, Matrix 10 (1990) 285-291; Clark, I.M., et al., Matrix 11 (1991) 76-85) e TIMP-2 (Fujimoto, N., et al., Clin. Chim. Acta 220 (1993) 31-45) foi descrita. Estes ensaios foram aplicados aos fluidos do corpo, por exemplo, soro, plasma, fluido aminiótico, fluido cerebroespinhal e urina. Nenhum dado pode ser encontrado no estado da técnica demonstrando a presença de TIMP-1 em uma amostra de fezes. Nenhum dado é disponível no estado da técnica indicativo para o fato que a presença de TIMP-1 em uma amostra de fezes poderia ser de utilidade clínica.

Os reagentes de diagnóstico no campo de ensaios de ligação específicos, tais como ensaios imunológicos, são geralmente melhor provi- dos na forma de um kit, o qual compreende o agente de ligação específico e os reagentes auxiliares requeridos para executar o ensaio. A presente in- venção também refere-se, portanto, a um kit imunológico que compreende pelo menos um agente de ligação específico para S100A12 e reagentes au- xiliares para a medição de S100A12.

A precisão de um teste de diagnóstico é descrita freqüentemen- te por suas características de operação do receptor (ROC) (consultar espe- cialmente Zweig, Μ. H. e Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). O gráfico de ROC é uma curva de todos os pares de sensibilidade/ especifici- dade resultantes da variação contínua do limite da decisão por toda a faixa dos dados observados.

O desempenho clínico de um teste de laboratório depende de sua precisão de diagnóstico, ou da capacidade de classificar corretamente os indivíduos em subgrupos clinicamente relevantes. A precisão de diagnós- tico mede a capacidade do teste de distinguir corretamente duas condições diferentes dos indivíduos investigados. Tais condições são, por exemplo, a saúde e a doença ou doença benigna versus doença maligna.

Em cada caso, a curva de ROC ilustra a sobreposição entre as duas distribuições ao traçar a sensibilidade versus a 1 - especificidade para a faixa completa de limites da decisão. No eixo y está a sensibilidade, ou a fração verdadeiro-positiva [definida como (número de resultados de teste verdadeiro-positivo)/(número de resultados de teste verdadeiro-positivo + número de resultados de teste falso-negativos)]. Isto também foi indicado como positividade na presença de uma doença ou uma condição. É calcula- do unicamente do subgrupo afetado. No eixo χ está a fração falso-positiva, ou a 1 - especificidade [definida como (número de resultados de teste falso- positivo)/(número de resultados de teste verdadeiro-negativo + número de resultados de teste falso-positivos)]. É um índice da especificidade e é calcu- lado inteiramente do subgrupo não afetado. Devido ao fato que as frações verdadeiras e falso-positivas são calculadas totalmente separadamente, ao usar os resultados de teste de dois subgrupos diferentes, a curva de ROC é independente da predominância da doença na amostra. Cada ponto na cur- va de ROC representa um par de sensibilidade/1 - especificidade que cor- responde a um limite da decisão particular. Um teste com discriminação per- feita (nenhuma sobreposição nas duas distribuições dos resultados) tem uma curva de ROC que passa através do canto esquerdo superior, onde a fração verdadeiro-positiva é 1,0, ou 100% (sensibilidade perfeita), e a fração falso-positiva é O (especificidade perfeita). A curva teórica para um teste sem nenhuma discriminação (distribuições idênticas dos resultados para os dois grupos) é uma linha diagonal a 45 graus do canto esquerdo inferior ao canto direito superior. A maior partes das curvam se enquadra entre estes dois extremos. (Se a curva de ROC cair completamente abaixo da diagonal de 45 graus, isto é remediado facilmente ao inverter o critério para a "positividade" de "mais de" para "menos de", ou vice versa). Qualitativamente, quanto mais próxima a curva ficar do canto esquerdo superior, mais elevada a precisão total do teste.

Um objetivo conveniente para quantificar a precisão de diagnós- tico de um teste de laboratório é a expressão do seu desempenho por um único número. A medida global mais comum é a área sob a curva do gráfico de ROC. Por convenção, esta área é sempre > 0,5 (se não for, é possível inverter a régua da decisão para que seja assim). Os valores variam entre 1,0 (separação perfeita dos valores de teste dos dois grupos) e 0,5 (nenhu- ma diferença distribucional aparente entre os dois grupos de valores de tes- te). A área não depende somente de uma parte particular do gráfico, tal co- mo o ponto mais próximo à diagonal ou a sensibilidade a 90% de especifici- dade, mas de todo o gráfico. Esta é uma expressão quantitativa descritiva de quão próximo o AUC é do perfeito (área = 1,0).

A utilidade clínica do novo marcador de S100A12 foi avaliada em comparação e em combinação com o marcador de hemoglobina estabe- lecido ao usar uma análise das características do operador do receptor (ROC; Zweig, Μ. H. e Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). Esta análise foi baseada nas amostras derivadas de coortes de pacientes bem definidos tal como indicado na seção dos exemplos.

Foi verificado que o método diagnóstico de baseado na medição de S100A12 sozinho em comparação com o marcador de hemoglobina estabelecido sozinho tem uma precisão de diagnóstico pelo menos boa (per- fil de sensibilidade/especificidade) tal como demonstrado pela área sob a curva.

Os seguintes exemplos, figuras e listagem de seqüência são fornecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, cujo âmbito verdadeiro é indicado nas reivindicações anexas. Deve ser compreendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos indicados sem que se desvie do caráter da invenção. Descrição da Figura

Figura 1: Análise de Transferência Western Tecido de tumor e tecido normal de quatro pacientes de CRC fo- ram analisados por Transferência Western ao usar um anticorpo policlonal versus S100A12 humano. A proteína recombinant expressa em E. coli como proteína etiquetada com 6xHis foi usada como um controle positivo. A dife- rença no padrão de migração da proteína recombinante é causada pela eti- queta 6xHis nela presente. O tecido normal foi recuperado dos pacientes quando o tumor foi removido cirurgicamente. M: marcador de peso molecu- lar; r.p.: proteína recombinante; T: tecido do tumor; N: tecido normal. Figura 2: Gráfico de ROC

É fornecido o gráfico das características do operador do recep- tor (ROC) para a avaliação de 23 amostras obtidas de pacientes com CRC em comparação a 18 amostras obtidas de indivíduos saudáveis.

Figura 3: Gráficos de difusão das concentrações de S100A12 em pacientes de CRC

Efeito de íons Ca2+ na medição de S100A12 em extratos de fe- zes. Os extratos de fezes foram diluídos na ausência (figura 3a) ou na pre- sença (figura 3b) de íons Ca2+. As concentrações detectáveis são mais ele- vadas na presença de íons Ca2+ e são distribuídas em uma faixa dinâmica aumentada.

Abreviaturas

ABTS sal de diamônio de 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3-etilben- zotiazolina (6)]

BSA albumina de soro bovino DNA DNA complementar DMSO sulfóxido de dimetila DTT ditiotreitol EDTA ácido etileno diamina tetraacético ELISA ensaio de imunosorvente ligado por enzima ESI ionização por eletroaspersão Fcs soro fetal de vitela IAA iodoacetamida IgG imunoglobulina G Lc cromatografia de líquido MS espectroscopia de massa MES mesitil, 2,4,6-trimetil fenil PAGE eletroforese com gel de poliacrilamida PBS fosfato tamponado com solução salina Pl ponto isoelétrico POD peroxidase de raiz forte RTS sistema de translação rápida Sds sulfato de dodecila sódico

Exemplo 1

Identificação de S100A12 como um marcador de câncer coloretal potencial Fontes de tecido

A fim de identificar proteínas específicas de tumor como marca- dores de diagnóstico potenciais para o câncer coloretal, é feita análise de três tipos diferentes de tecido ao utilizar métodos proteômicos.

No total, o espécime de tecido de 10 pacientes que sofrem de câncer coloretal é analisado. De cada paciente, três tipos de tecidos diferen- tes são coletados de reseções terapêuticas: tecido do tumor (> 80% de tu- mor) (T), tecido saudável adjacente (N) e mucosa separada da mucosa sau- dável adjacente (M). Os dois últimos tipos de tecido servem como amostras de controle saudáveis combinadas. Os tecidos são imediatamente rompidos congelados após a reseção e armazenados a -80°C antes do processamen- to. Os tumores são diagnosticados por critérios histopatológicos.

Preparação do tecido

0,8 a 1,2 g de tecido congelado é colocado em um almofariz e congelado completamente por nitrogênio líquido. O tecido é pulverizado no almofariz, dissolvido em um volume de 10 vezes (peso/volume) do tampão de lise (40 mM de citrato de Na, 5 mM de MgCl2, 1% de Genapol X-080, 0,02% de Na-azida, sem EDTA Complete® [Roche Diasgnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Cat. N° 1 873 580]) e homogeneizado subseqüente- mente em um homogeneizador de vidro Wheaton® (encaixe frouxo de 20 x, encaixe apertado de 20 x). 3 ml do homogenato são sujeitados a uma centri- fugação de densidade de sacarose (10 a 60% de sacarose) por uma hora a 4.500 x g. Depois desta etapa de centrifugação, são obtidas três frações. A fração no alto do gradiente contém as proteínas solúveis e é usada para uma análise adicional.

Preparação da amostra para a análise LC-ESI-MSMS

A concentração de proteína da fração de proteína solúvel é de- terminada ao usar o ensaio de proteína Bio-Rad® (Cat. N9 500-0006; Bio- Rad Laboratories GmbH, München, Alemanha) ao seguir as instruções do manual do fornecedor. Até um volume que corresponde a 200 pg de proteí- na, 4 ml de um tampão de redução (9 M de uréia, 2 mM de DTT, 100 mM de KH2PO4, NaOH a um pH 8,2) são adicionados e incubados por uma hora. A solução é concentrada até 250 μΙ em um instrumento Amicon® Ultra de 10 kD (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemanha). Para a alquilação, os 250 μΙ são transferidos a 1 ml de tampão de alquilação (9 M de uréia, 4 mM de io- doacetamida, 100 mM de KH2PO4, NaOH a um pH 8,2), incubados por seis horas e concentrados subseqüentemente em um instrumento Amicon® Ultra de 10 kD até 250 μΙ. Para a lavagem, 1 ml de uréia 9 M é adicionado e con- centrado outra vez em um instrumento Amicon® Ultra de 10 kD até 250 μΙ. A lavagem é repetida três vezes.

Para a digestão da protease, a solução concentrada é diluída até 2,5 M de uréia e incubada com 4 μg de tripsina (grau de proteômicos, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A digestão é interrompida mediante a adição de 1 ml de ácido fórmico a 1%, e analisada.

Análise LC-ESI-MSMS

O material tríptico digerido (500 μΙ) é separado em um Nano- HPLC-System bidimensional (Ultimate, Famos, Switchos; Lc Packings, Idste- in, Alemanha) que consiste em uma coluna SCX e RP Pepmep C18 (LC Packings, Idstein, Alemanha). As 11 frações de SCX (eluição por etapas com 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1.500 mM de NH4Ac) foram ainda separadas sucessivamente na coluna RP com um gradiente de 90 mi- nutos (5 a 95% de acetonitrilo) e analisadas em linha ao usar varreduras de- pendentes de dados com um capturador de íons ESI-MS (LCQ deca XP; Thermo Electron, Massachusetts, EUA; vide a Tabela 2 quanto aos parâme- tros). Para cada amostra são executadas quatro corridas. Os dados brutos são processados com o software Bioworks 3.1 (Thermo Electron, Massachu- setts, EUA) ao usar os parâmetros listados na Tabela 2. As listas resultantes de peptídeos e de proteínas identificados de corridas replicadas foram com- binadas.

A proteína S100A12 é identificada por meio da ajuda das se- qüências parciais indicadas na Tabela 3.

Detecção de S100A12 como um marcador potencial para o câncer coloretal

Para cada paciente, as proteínas identificadas e o número de peptídeos correspondentes da amostra do tumor são comparados aos resul- tados concomitantes do tecido normal adjacente e do tecido de mucosa normal separado. Por este meio, é verificado que a proteína S100A12 é ex- pressa especificamente ou fortemente super-expressa no tecido do tumor e não detectável ou menos detectável ou expressa menos fortemente no teci- do de controle saudável. Portanto - dentre muitas outras proteínas - ela se qualifica como um marcador candidato para o uso no diagnóstico do câncer coloretal.

A proteína S100A12 foi super-representada fortemente no tecido do tumor dos pacientes que sofrem de câncer coloretal. As seguintes se- qüências de peptídeo da proteína S100A12 foram identificadas com Bio- works 3.1 de dados de LCQ-MS2 no tecido do tumor:

Tabela 2: Parâmetros de aquisição de dados MS/MS e busca Bioworks 3.1

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Tabela 3: Seqüências encontradas

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As duas seqüências de peptídeos acima foram identificadas como seqüências parciais de S100A12. A seqüência (i) representa as posi- ções dos aminoácidos do aminoácido 2 ao aminoácido 21 da SEQ ID N9: 1 e a seqüência (ii) representa as posições dos aminoácidos do aminoácido 23 ao aminoácido 34 da SEQ ID Ne: 1, respectivamente.

Exemplo 2

Geração de anticorpos para a proteína de marcador de câncer colorectal S100A12

O anticorpo policlonal para a proteína de marcador de câncer colorectal S100A12 é gerado para um uso adicional na medição de S100A12 no soro, plasma, sangue e em especial em uma amostra de fezes. Tais me- dições de S100A12 são, por exemplo, feitas por ensaios de imunodetecção, por exemplo, Transferência Western e ELISA.

Expressão de proteína recombinante em E. coli

A fim de gerar anticorpos para S100A12, a expressão recombi- nante da proteína é executado para se obter imunogênios. A expressão é feita ao aplicar uma combinação <io sistema de expressão de RTS 100 e E.coli. Em uma primeira etapa, a seqüência do DNA é analisada e as reco- mendações para variantes mutacionais silentes de cDNA de rendimento ele- vado e as seqüências respectivas de PCR-primer são obtidas ao usar o sis- tema "ProteoExpert RTS E.coli HY". Este é um serviço comercial baseado na web (www.proteoexpert.com). Ao utilizar os pares de primers recomen- dados, é empregado o sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set1 His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Cat. N9 3186237) para gerar moldes de PCR lineares a partir do cDNA e para a transcrição in vitro e a expressão da codificação da seqüência de nucleotí- deo para a proteína S100A12. Para a detecção de Transferência Western e a purificação posterior, a proteína expressa contém um His-Tag. A melhor variante de expressão é identificada. Todas as etapas de PCR para a ex- pressão e a detecção são executadas de acordo com as instruções do fabri- cante. O produto de PCR respectivo, contendo todas as regiões reguladoras T7 necessárias (promotor, sítio de ligação ribossomal e terminador T7), é clonado no vetor pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha, Cat Ns K 4300/01) ao seguir as instruções do fabricante. Para a expressão usando as seqüências reguladoras T7, o construto é transformado em BL 21 de E. coli (DE 3) (Studier, F.W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89) e as bac- térias transformadas são cultivadas em uma batelada de 1 litro para a ex- pressão da proteína.

A purificação da proteína de fusão His-Sl00A12 é feita ao se- guir os procedimentos padrão em uma coluna de Ni-quelato. Em resumo, 1 litro da cultura das bactérias que contém o vetor de expressão para a proteí- na de fusão His-Sl 00A12 é transformado em pelotas por meio de centrifu- gação. A pelota de células é resuspensa no tampão de lise, contendo 50 mM de Na-fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 1 mg/ml de Lysozyme, 2x Completo (sem EDTA) e dNase, seguido pelo rompimento da célula ao usar uma pren- sa francesa (modelo: IUL Basic Ζ). O material insolúvel é transformado em pelota por meio de centrifugação a alta velocidade e o sobrenadante é apli- cado à coluna cromatográfica de Ni-quelato. A coluna é lavada com vários volumes do leito do tampão de lavagem (50 mM de Na-fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol. Finalmente, o antígeno ligado é isolado ao usar um tampão de eluição que contém 50 mM de Na-fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCI com um gradiente linear de 20 a 500 mM de imidazol. Produção de anticorpos monoclonais contra a S100A12

a) Imunização de camundonaos

Camundongos A/J com 12 semanas de idade são inicialmente imunizados intraperitonealmente com 100 pg de S100A12. Isto é seguido seis semanas depois por mais duas imunizações intraperitoneais a intervalos mensais. Neste processo, a cada camundongo são administrados 100 pg de S100A12 adsorvidos em hidróxido de alumínio e 109 germes de Bordetella pertussis. Subseqüentemente, as duas últimas imunizações são levadas a efeito intravenosamente no terceiro e no segundo dias antes da fusão ao usar 100 pg de S100A12 no tampão de PBS para cada uma delas.

b) Fusão e clonagem

Células do baço dos camundongos imunizados de acordo com a) são fundidas com células de mieloma de acordo com Galfre, G., e Milste- in, C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46. Neste processo, cerca de 1 χ 108τ células do camundongo imunizado são misturadas com 2 χ 107 células de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) e centrifugadas (10 minutos a 300 χ g e a 4°C). As células são lavadas então uma vez com o meio RPMI 1640 sem soro fetal de vitela (FCS) e centrifugadas outra vez a 400 χ g em um tubo cônico de 50 ml. O sobrenadante é descartado, o sedimento da cé- lula é afrouxado suavemente por leves batidas, 1 ml de PEG (peso molecu- lar 4.000, Merck, Darmstadt) é adicionado e misturado através de pipeta- gem. Após um minuto em um banho de água a 37°C, 5 ml de RPMI 1640 sem FCS são adicionados em gotas à temperatura ambiente dentro de um período de quatro a cinco minutos. Em seguida, 5 ml de RPMI 1640 conten- do 10% de FCS são adicionados em gotas dentro de cerca de um minuto, misturados completamente, cheios até 50 ml com um meio (RPMI 1640 + 10% de FCS) e centrifugados subseqüentemente por dez minutos a 400 χ g e a 4°C. As células sedimentadas são extraídas em um meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e semeadas no meio de seleção de hipoxantina- azaserina (100 mmol/l de hipoxantina, 1 Mg/ml de azaserina em RPMI 1640 + 10% de FCS). Interleucina 6 a 100 U/ml é adicionada ao meio como um fator de crescimento.

Após cerca de dez dias, as culturas primárias são testadas quanto ao anticorpo específico. As culturas primárias S100A12-positivas são clonadas em placas de cultura de células de 96 cavidades por meio de um classificador de células ativado por fluorescência. Neste processo, a inter- leucina 6 a 100 U/ml é adicionada outra vez ao meio como um aditivo de crescimento.

c) Isolamento da imunoqlobulina dos sobrenadantes da cultura de células

As células de hibridoma obtidas são semeadas a uma densida- de de 1 χ 10^5 células por ml no meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e proliferadas por sete dias em um fermentador (Thermodux Co., Wertheim/ Main, modelo MCS-104XL, pedido N° 144-050). Às concentrações médias, 100 pg de anticorpo monoclonal por ml são obtidos no sobrenadante da cul- tura. A purificação deste anticorpo do sobrenadante da cultura é levada a efeito por métodos convencionais na química de proteína (por exemplo, de acordo com Bruck, C., et al., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-596). Geração de anticorpos policlonais

a) Imunização

Para a imunização, uma emulsão fresca da solução de proteína (100 µg/ml da proteína S100A12) e de adjuvante de Freund completo a uma relação de 1:1 é preparada. Cada coelho é imunizado com 1 ml da emulsão nos dias 1,7, 14 e 30, 60 e 90. O sangue é extraído e o soro anti-S100A12 resultante é usado para outras experiências tal como descrito nos Exemplos 3 e 4.

b) Purificação de IgG (imunoglobulina G) do soro de coelho pela precipitação seqüencial com ácido caprílico e sulfato de amônio

Um volume de soro do coelho é diluído com quatro volumes de tampão de acetato (60 mM, pH 4,0). O pH é ajustado em 4,5 com Tris-base 2 Μ. O ácido caprílico (25 μl/ml da amostra diluída) é adicionado em gotas sob agitação vigorosa. Após 30 minutos, a amostra é centrifugada (13.000 χ g, 30 minutos, 4°C), a pelota é descartada, e o sobrenadante é coletado. O pH do sobrenadante é ajustado em 7,5 por meio da adição de Tris-base 2 M e filtrado (0,2 μπι).

A imunoglobulina no sobrenadante é precipitada sob agitação vigorosa através da adição em gotas de uma solução de sulfato de amônio 4 Ma uma concentração final de 2 M. As imunoglobulinas precipitadas são coletadas por meio de centrifugação (8.000 χ g, 15 minutos, 4°C).

O sobrenadante é descartado. A pelota é dissolvida em 10 mM de NaH2POVNaOH, pH 7,5, 30 mM de NaCI e exaustivamente submetida à diálise. O composto dialisado é centrifugado (13.000 χ g, 15 minutos, 4°C) e filtrado (0,2 pm).

Biotinilacão de IgG de coelho policlonal

IgG de coelho policlonal é elevado para 10 mg/ml em 10 mM de NaH2POVNaOH, pH 7,5, 30 mM de NaCI. Por ml da solução de IgG, são adicionados 50 μΙ de biotina-N-hidróxi succinimida (3,6 mg/ml em DMSO). Após 30 minutos à temperatura ambiente, a amostra é submetida à croma- tografia em Superdex 200 (10 mM de NaH2PO4ZNaOH, pH 7,5, 30 mM de NaCI). A fração contendo IgG biotinilada é coletada. Os anticorpos monoclo- nais são biotinilados de acordo com o mesmo procedimento. Digoxigenilação de IqG de coelho policlonal

IgG de coelho policlonal é elevado para 10 mg/ml em 10 mM de NaH2POVNaOH, 30 mM de NaCI, pH 7,5. Por ml da solução de IgG, são adicionados 50 μΙ de éster de N-hidróxi succinimida de ácido digoxigenin-3- O-metilcarbonil-e-aminocapróico (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha, Cat. N5 1 333 054) (3,8 mg/ml em DMSO). Após 30 minutos à temperatura ambiente, a amostra é submetida à cromatografía em Superdex® 200 (10 mM de NaH2POVNaOH, pH 7,5, 30 mM de NaCI). As frações que contêm digoxigenilada são coletadas. Os anticorpos monoclonais são etiquetados com digoxigenina de acordo com o mesmo procedimento. Exemplo 3

Detecção de Transferência Western de S100A12 no câncer e no tecido sau- dável, respectivamente

Lisatos de tecido de amostras de tumor e de amostras de con- trole saudáveis são preparados tal como descritos no Exemplo 1, "Prepara- ção do tecido".

SDS-PAGE e Transferência Western são levadas a efeito ao usar reagentes e equipamento da Invitrogen, Karlsruhe1 Alemanha. Para ca- da amostra de tecido testada, 10 pg de Iisato do tecido são diluídos em tam- pão de amostra de NuPAGE® (Invitrogen) SDS e aquecidos por dez minutos a 95°C. As amostras são rodadas em géis de 4-12% de NuPAGE® (Tris- Glicina) no sistema de tampão rodando MES. Os polipeptídeos separados com gel são tingidos em membranas de nitrocelulose ao usar o Invitrogen XCeII II® Blot Module (Invitrogen) e o sistema de tampão de transferência NuPAGE®. As membranas são lavadas três vezes em PBS/0,05% de Twe- en-20 e bloqueadas com agente de bloqueio Roti®-Block (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha) por duas horas. O anticorpo primário, soro an- ti-S100A12 de coleho policlonal (geração descrita no Exemplo 2), é diluído 1:10,000 em tampão de bloqueio Roti®-Block e incubado com a membrana por uma hora. As membranas são lavadas seis vezes em PBS/0,05% de Tween-20. O anticorpo de coelho primário ligado especificamente é etique- tado com um anticorpo de IgG anti-coelho de carneiro policlonal conjugado com POD, e diluído até 10 mU/ml em 0,5 χ de tampão de bloqueio Roti®- Block. Após uma incubação por uma hora, as membranas são lavadas seis vezes em PBS/0,05% de Tween-20. Para a detecção do anticorpo anti- coelho conjugado com POD ligado, a membrana é incubada com o Substra- to de Transferência Western Lumi-Lightpujs (Pedido N9 2015196, Roche Di- agnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e é exposta a uma película autora- diográfica.

Quando o tumor e o tecido normal derivados de quatro indiví- duos diagnosticados com CRC são tingidos tal como descrito, a expressão elevada da proteína S100A12 é detectada no tecido de tumor, ao passo que nenhum ou menos S100A12, respectivamente, é encontrado no tecido nor- mal (Figura 1). Exemplo 4

Processamento de espécimes de fezes

a) Extração de detergente

Cerca de 1 g de fezes por amostra é coletado pelos pacientes em um dispositivo de amostragem especial da Sarstedt, Alemanha, Pedido N°80.623.022, congelado e armazenado a -70°C. Para a análise, as amos- tras de fezes são descongeladas, cerca de 100 mg da amostra de fezes são diluídos dez vezes com um tampão de fosfato, pH 7,4, suplementados com Mini Complete sem EDTA, um coquetel inibidor de protease da Roche, Ale- manha (pedido Ne: 11 873 580):

Na2HPO4 53,4 mM

KH2PO4 12,3 mM

NaN3 0,1%

Na2EDTA 1,07 mM

Albúmen de galinha 1,0%

Nonidet P-40 0,5%

As amostras são incubadas por uma hora à temperatura ambi- ente com agitação contínua, e por mais uma hora sem agitação a 4°C. De- pois de uma centrifugação por 15 minutos a 3.000 χ g, o sobrenadante é re- movido por meio de pipetagem e filtrado ao usar um filtro de membrana com um tamanho de poro de 5 μm. As amostras são divididas em alíquotas e ar- mazenadas a -70°C. Uma alíquota desta amostra de fezes processada é usada para a quantificação de S100A12 por meio de ELISA.

b) Extração de uréia

Para melhorar a medição de S100A12 e de outros marcadores de interesse em amostras de fezes, um "tampão de extração otimizado" é usado. Para o processamento das amostras de fezes, o tampão de extração é preparado fresco ao adicionar um coquetel inibidor de protease (Mini Complete sem EDTA, Roche, Alemanha) ao seguinte tampão:

TRIS 0,10 mol/l, pH β,0

Ácido citrico 0,10 mol/l

Uréia 1,0 mol/l CaCl2 0,01 mol/l

BSA 0,50%

As amostras de fezes são descongeladas e 50 - 100 mg de ca- da amostra são transferidos a um kit de preparação de amostra fecal (Cat. N° 10745804 Roche, Alemanha). O tampão de extração otimizado é adicio- nado de acordo com o peso das amostras de fezes para obter uma diluição de 50 vezes. As amostras são misturadas vigorosamente em um agitador orbital por trinta minutos, transferidas a um tubo de 10 ml (Sarstedt, Alema- nha) e centrifugadas a 1.200 g por dez minutos. O sobrenadante é filtrado ao usar um filtro de corte de 5 μηη (Ultrafree®-CL, Millipore, Alemanha), dividido em alíquotas e armazenado para análise adicional a -70°C. Estes extratos de fezes são apropriados para todos os biomarcadores de interesse neste estudo.

Exemplo 5

ELISA para a medição de S100A12 em espécime de fezes humanas

Um ensaio ELISA do tipo sanduíche é desenvolvido para a de- terminação de S100A12 de fezes. Os anticorpos do coelho de policlonais são produzidos através da imunização com a S100A12 de comprimento total recombinante expressa em E. coli. A fração purificada de IgG dos antisoros é biotinilada ou digoxigenilada para ser usada para estabelecer um ensaio ELISA do tipo sanduíche ao usar placas de estreptavidina de 96 cavidades (Streptawell, HighBind, Roche, Alemanha). Os extratos de fezes são diluídos 1:25 no tampão de diluição da amostra (100 mM de Tris, pH 8,0, 2 mM de CaCl2, 1,5% de KCl, 0,3% de Triton X-100, 0,2% de caseina, 2% de sacaro- se) e 50 μl da amostra ou do padrão são transferidos para cada cavidade. A formação do complexo de antígeno-anticorpo é iniciada subseqüentemente ao adicionar 50 μl de uma mistura de anticorpo que contém 0,5 μg/ml de an- ticorpo policlonal biotinilado PAB<S100A12>-Bi e 0,5 μg/ml de anticorpo po- Iiclonal digoxigenilado PAB<S100A12>-Dig no tampão do ensaio (PBS, pH 30 7,4, 0,1% de IgG de bovino, 0,9% de NaCl, 0,5% de Thesit, 1% de PEG 40.000, 0,1% de IgG de bovino, 0,025% de gama globulina acetilada de bo- vino). As placas são incubadas por 60 minutos, e lavadas três vezes com 350 μl de tampão de lavagem por cavidade (100 mM de PBS1 pH 7,4, 0,05% de Tween-20). A seguir, 100 μl do conjugado de MAB<Dig>-POD a 25 mU/ml (Roche Diagnostics, Alemanha) por cavidade são adicionados e incu- bados por outros 60 minutos. Após três vezes de lavagem com 350 μΙ de tampão de lavagem por cavidade, 100 μl de uma solução de ABTS (Roche Diagnostics, Alemanha) por cavidade são adicionados e as placas são incu- badas por 60 minutos. A absorvência é medida a 405/620 nm ao usar uma leitora de ELISA (SLT. Spectra II). A S100A12 de comprimento total recom- binante é usada para a calibração.

Exemplo 6

Estabilidade do análito no extrato de uréia

A S100A12 parece ser mais estável do que a hemoglobina nos extratos de fezes preparados ao usar o método de extração descrito em 4b. Quando os extratos de fezes são armazenados por um ou três dias à tempe- ratura ambiente, a recuperação média para a S100A12 é maior e parece mostrar menos dispersão do que a recuperação média da hemoglobina. Das vinte amostras usadas para avaliar a estabilidade, duas são hemoglobina negativas:

Tabela 4: Recuperação após o stress de temperatura

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Exemplo 7

Utilidade clínica de S100A12 no câncer coloretal

A utilidade clínica de S100A12 é avaliada ao analisar as amos- tras de fezes obtidas de coortes de pacientes bem-caracterizados. Para ca- da paciente, duas amostras de fezes do mesmo movimento do intestino são medidas, e as concentrações são analisadas. A correlação de ambas as concentrações é avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson que revela uma correlação próxima. Para melhorar a sensibilidade do ensaio, a concentração máxima medida em uma das duas amostras em pares é usada para uma análise adicional. O valor de diagnóstico de S100A12 é avaliado pela análise de ROC de acordo com Zweig et al (supra).

As amostras de fezes das duas primeiras populações do estudo são extraídas de acordo com o Exemplo 4a. Para a diluição, são usados so- lução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, 1,0 mM de CaCb, 1,2 mM de ácido nitrilo triacético, 0,1% de albumina de soro bovino. As amostras de fezes da terceira população do estudo são extraídas de acordo com o Exemplo 4b e diluídas com o tampão de diluição da amostra tal como indi- cado no Exemplo 5. Apesar dos procedimentos diferentes de extração, o procedimento de ELISA usado para a medição de S100A12 é idêntico para todas as populações de pacientes (tal como o Exemplo 5).

Primeira população do estudo:

São obtidas amostras de fezes de 18 pacientes sem CRC1 de 10 pacientes diagnosticados como adenoma positivos por meio de colonoscopi- a, e de 23 pacientes diagnosticados com CRC progredido classificados co- mo nos estágios de UICC Ill e IV. A S100A12 é medida tal como descrito acima em uma amostra de fezes obtida de cada um destes indivíduos.

A análise de ROC é feita de acordo com Zweig, M. H., e Camp- bell, supra. Foi verificado que a potência discriminatória para diferenciar pa- cientes no grupo do CRC de indivíduos saudáveis tal como medido pela área sob a curva é igual a 97% para o CRC versus os controles saudáveis (Figura 2), 85% para CRC + adenoma versus controles saudáveis, e 57% para o adenoma versus controles saudáveis, respectivamente.

O efeito positivo da presença de íons Ca2+ na determinação de S100A12 das fezes é ilustrado na Figura 3. Quando os extratos de fezes são diluídos em uma solução salina tamponada com fosfato a um pH 7,4, 0,1 de soro de albumina bovino na ausência de CaCl2 e de ácido nitrilo triacético, concentrações mais baixas de S100A12 são detectáveis (Figura 3a) em comparação às concentrações de S100A12 medidas na presença de CaCl2 e de ácido nitrilo triacético (Figura 3b). A faixa dinâmica menor de ELISA na ausência de Ca2+ também leva a um AUC reduzido da curva de ROC de 94% para o CRC versus controles saudáveis, ao passo que com o sistema de tampão incrementado é observado um AUC de 97%. Se CRC + adenoma versus controles saudáveis forem considerados, o AUC é de 81% sem Ca2+ e de 85% na presença de CaCI2 e de ácido nitrilo triacético, respecti- vãmente.

Segunda população do estudo ampliada:

São obtidas amostras de fezes de 10 pacientes diagnosticados como adenoma positivos através de colonoscopia, de 50 pacientes diagnos- ticados como CRC (9 classificados como no estágio I de UICC; 4 classifica- dos como no estágio Il de UICC; 21 classificados como no estágio Ill de UICC; 13 classificados como no estágio IV de UICC, 2 classificados como nos estágios I a Ill de UICC, isto é, não IV; e 1 CRC sem plataforma) e 50 controles (7 dos pacientes com uma outra doença gastro-intestinal, isto é, não CRC; 16 dos pacientes com diverticulose; 8 dos doadores classificados como saudáveis no trato gastro-intestinal; e 19 dos pacientes que sofrem de hemorróidas). A S100A12 é medida tal como descrito acima em uma amos- tra de fezes obtida de cada um destes indivíduos.

A análise de ROC é feita de acordo com Zweig, M. H., e Camp- bell, supra. Foi verificado que a potência discriminatória para diferenciar pa- cientes no grupo de CRC dos indivíduos saudáveis tal como medido pela área sob a curva é igual a 90% para CRC versus controles, 86% para CRC + adenoma versus controles saudáveis e 66% para adenoma versus controles saudáveis, respectivamente. Isto indica que até mesmo os primeiros está- gios de UICC são detectados se a S100A12 for medida a partir de uma a- mostra de fezes.

Terceira população do estudo:

A S100A12 é medida em uma terceiro população do estudo mais extensiva (para as características dos pacientes conforme a Tabela 5). Um número elevado de amostras de fezes clinicamente bem-caracterizadas é coletado de modo prospectivo na estrutura do estudo multi-central. Os pa- cientes (que são submetidos a uma colonoscopia) para o controle coletivo são recrutados em unidades de gastroenterologia e representam uma popu- lação de seleção de médio risco.¶ Os pacientes com doenças inflamatórias do intestino e com qualquer tipo de adenoma são excluídos do controle cole- tivo. Devido à baixa predominância de pacientes de câncer coloretal em uma população de seleção, as amostras dos pacientes de câncer são coletadas em unidades de cirurgia diferentes. O diagnóstico do câncer coloretal é con- firmado por um médico que também fornece a plataforma patológica para cada paciente de câncer. Para avaliar qualquer desequilíbrio que possa ser introduzido pela elaboração de diagnóstico comum dos pacientes por uma pré-seleção de FOBT baseada em guaiacina, uma sub-coleta sem FOBT baseado em guaiacina anterior também é coletado. Todos os pacientes que são detectados devido a um sangramento retal visível também são excluídos deste sub-coleta, porque isto deve introduzir um desequilíbrio para vantagem da hemoglobina.

As amostras de fezes são obtidas de 252 indivíduos de controle. Destes, 135 são confirmados por colonoscopia como saudáveis no trato gas- tro-intestinal, ao passo que as amostras de controle restantes cobrem várias doenças gastro-intestinais relevantes. A população de CRC inclui 186 amos- tras de CRC nos estágios de UICC I - IV (Tabela 6). Para 38 pacientes de CRC, a plataforma exata não é conhecida. Portanto, os pacientes de CRC com um estágio de UICC definido na Tabela 6 não somam um total de 186 pacientes. No total, 101 pacientes de CRC sem pré-seleção por FOBT são avaliados.

A S100A12 é medida tal como descrito acima em uma amostra de fezes obtida de cada um destes indivíduos. A análise de ROC é feita de acordo com Zweig, M. H., e Campbell, supra. Foi verificado que a potência discriminatória para diferenciar pacientes no grupo de CRC dos indivíduos de controle tal como medido pela área sob a curva (Tabela 6) é igual a 94% para CRC versus todos os controles e também a 94% para CRC sem pré- seleção de FOBT versus controles. O agrupamento dos pacientes de CRC 30 pelo estágio da doença revela uma área sob a curva de 90% para o estágio I de UICC e de 96 - 97% para os estágios Il - IV de UICC. Nenhuma evidên- cia para um desequilíbrio pela pré-seleção de FOBT é detectada, uma vez que a área sob a curva destes pacientes é idêntica à área sob a curva da população total de CRC.

Tabela 5: Características de pacientes da terceira população do estudo

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Tabela 6: Análise de ROC de uma terceira população do estudo

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Exemplo 8

Combinações de S100A12 com outros marcadores de fezes

As combinações de S100A12 com outros biomarcadores de ex- tratos de fezes são avaliadas. Os marcadores hemoglobina, o hetero- complexo de hemoglobina com haptoglobina, Calprotectina1 TIMP-1, M2- pPK e CEA são medidos ao usar ensaios ELISA comerciais. Os ensaios pa- ra a medição de hemoglobina, hemoglobina/haptoglobina e calprotectina são obtidos junto à R-Biopharm, Alemanha. O ensaio de Calpro Calprotectin E- LISA é manufaturado pela Calpro SA, Noruega, e é comercializado fora da Alemanha como teste PhiCal™. O ensaio para a medição de CEA é obtido junto à Roche Diagnostics, Alemanha. O ensaio para M2-PK é fornecido pela Schebo Biotech, Alemanha, e o ensaio para TIMP-1 por R&D Systems, EUA, respectivamente. Embora alguns dos ensaios sejam destinados a medições em extratos de fezes, para dois ensaios,, ou seja, CEA e TIMP-1, as fezes não constituem um material de amostra normalmente usado. Desse modo, os ensaios têm que ser ajustados à medição do análito correspondente em uma amostra que representa um espécime extraído das fezes. As amostras (extratos de fezes) são previamente diluídas vinte vezes para as determina- ções de CEA, mas o ensaio é levado a efeito de outra maneira de acordo com as recomendações dos fabricantes. De maneira análoga, as amostras são previamente diluídas três vezes para a medição de TIMP-1 sem mudar o procedimento do próprio ensaio.

Para testar se uma combinação de marcadores irá melhorar o diagnóstico do CRC, os marcadores são combinados pela Regressão Logís- tica de Bayes (BLR). No algoritmo da BLR para a avaliação de combinações de marcadores, uma curva de Gauss prévia é usada e implementada no BBR-Software de Alexander Genkin, David D. Lewis, e David Madigan (Re- gressão Logística de Bayes em larga escala para o categorização de texto. Technometrics). Os seguintes ajustes são usados: nenhuma seleção de ca- racterística automática, variação prévia fixada em 0,05, nenhum ajuste limite, e padronização de entrada por meio de normalização. Para o processo, nu- mérico os ajustes padrão com um limite de convergência de 0,0005, 1.000 iterações e um modo sem precisão são mantidos inalterados. Os resultados com o algoritmo básico foram avaliados por 100 rodadas em um desenho de validação cruzada Monte-Carlo. Em cada rodada, dois terços de todos os casos e os controles, respectivamente, são selecionados como conjunto de treinamento através da amostra de margem de função embutida Matlab® R2006a com um valor inicial 19022007 para o gerador de número aleatório padrão. O algoritmo básico é aplicado no conjunto de treinamento para gerar uma regra de diagnóstico. Um limite nas probabilidades de casos posteriores estimadas é determinado nos controles do conjunto de treinamento para ob- ter uma especificidade de 95% ou 98%, respectivamente. A regra de diag- nóstico é aplicada então ao outro terço dos dados para estimar a sensibili- dade e a especificidade no limite em questão.

Para evitar qualquer desequilíbrio para a hemoglobina ou a he- moglobina/haptoglobina, somente os 101 pacientes de CRC sem pré-sele- ção de FOBT são usados na avaliação. Para um ensaio de seleção não so- mente o AUC da curva ROC é relevante. Um requisito bastante crítico em um ajuste da seleção é uma sensibilidade suficientemente boa a uma espe- cificidade elevada. A especificidade elevada é crucial porque uma especifici- dade baixa irá causar um número elevado de resultados positivos falsos a- companhados por procedimentos de acompanhamento e aflição desneces- sários para os pacientes. A Tabela 7 resume os valores de AUC da avalia- ção bem como as sensibilidades a uma especificidade pré-ajustada de 95% e 98%, respectivamente. Quando alguns dos marcadores individuais medi- dos são combinados por BLR, os valores de AUC para o diagnóstico de CRC são muito similares dentro da faixa de +/-1%. Por outro lado, a sensibi- lidade total na detecção do CRC pode ser aumentada significativamente pela combinação de S100A12 com outros marcadores, em particular a um nível de especificidade de 98%. Embora a S100A12 sozinha tenha uma sensibili- dade de 67%, a combinação de marcadores incluindo os dois marcadores S100A12 e o complexo de hemoglobina-haptoglobina exibe uma sensibilida- de de 79% e a mais melhor combinação de marcadores, incluindo três mar- cadores, S100A12, complexo de hemoglobina-haptoglobina e TIMP-1, mos- tra um aumento adicional até 82% na sensibilidade ao mesmo nível elevado de especificidade. Estas combinações de marcadores são consideradas mui- to importantes a fim de detectar o CRC, em especial o CRC em estágios a- diantados. Tal como fica evidente na Tabela 7, em particular um câncer colo- retal no estágio I é detectado a uma taxa muito mais elevada pelo uso de uma combinação de marcadores. O uso do marcador S100A12 é crucial pa- ra o ROC maior obtido com estas combinações de marcadores. tabela 7

<table>table see original document page 47</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG <120> USO DE PROTEÍNA S100A12 COMO MARCADOR PARA O CÂNCER COLORETAL

<130> 23747 WO <150> EP 06010439 <151> 2006-05-19 <160> 1 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Thr Lys Leu Glu Glu His Leu Glu Gly Ile vai Asn Ile Phe His 1 5 10 15

Gln Tyr ser vai Arg Lys Gly His Phe Asp Thr Leu ser Lys Gly Clu 20 25 BO

Leu Lys Gln Leu Leu Thr Lys Glu Leu Ala Asn Thr Ile Lys Asn Ile 35 40 45

Lys Asp Lys Ala vai Ile Asp Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ala Asn

50 55 60

Gln Asp Glu Gln Val Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser Leu Val Ala Ile 65 70 75 80

Ala Leu Lys Ala Ala His Tyr His Thr His Lys Glu 85 90

Claims (9)

1. Método para o diagnóstico de câncer coloretal, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo, b) colocação da dita amostra em contato com um agente de li- gação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12, c) determinação da quantidade de complexo formado na etapa (b),e d) correlação da quantidade de complexo determinada em (c) com o diagnóstico de câncer coloretal.

2. Método para o diagnóstico de câncer coloretal, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) emprego de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo, b) colocação da dita amostra em contato com um agente de li- gação específico para S100A12 sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e S100A12, c) colocação da dita amostra em contato com um agente de li- gação específico para um segundo marcador selecionado do grupo que con- siste no complexo de hemoglobina/haptoglobina, na hemoglobina, no inibidor de tecido de metaloproteases 1 (TIMP-1), e na quinase de piruvato de M2 de tumor (M2-PK) sob condições apropriadas para a formação de um complexo entre o dito agente de ligação e o segundo marcador, d) detecção da quantidade de complexo formado nas etapas (b) e (c), e e) correlação da quantidade de complexo determinada na etapa (d) com o diagnóstico de câncer coloretal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito segundo marcador é a hemoglobina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito segundo marcador é o complexo de hemoglobina/ hapto- globina.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito segundo marcador é TIMP-1.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito segundo marcador é M2-PK.

7. Uso da proteína S100A12 como uma molécula de marcador, caracterizado pelo fato de servir no diagnóstico do câncer coloretal de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo.

8. Uso da proteína S100A12 como uma molécula de marcador, caracterizado pelo fato de servir no diagnóstico precoce de câncer coloretal de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo.

9. Uso da proteína S100A12 como uma molécula de marcador, caracterizado pelo fato de servir para o câncer coloretal em combinação com uma ou mais outras moléculas de marcador para o câncer coloretal selecio- nadas do grupo que consiste no complexo de hemoglobina/haptoglobina, na hemoglobin, no inibidor de tecido de metaloproteases 1 (TIMP-1), e na qui- nase de piruvato de M2 de tumor (M2-PK) no diagnóstico do câncer coloretal de uma amostra de fezes obtida de um indivíduo.