ES2271892T3 - Uso de la proteina masp como marcador para el cancer colorrectal. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico del cáncer colorrec- tal que incluya los pasos de: a) aportar una muestra líquida obtenida de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de unión específico para el precursor maspin (MASP) bajo condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de unión y MASP, y c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Description
Uso de la proteína MASP como marcador para el
cáncer colorrectal.
La presente invención está relacionada con el
diagnóstico del cáncer colorrectal. Revela el uso de la proteína
MASP (precursor maspin) en el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Además, está relacionada especialmente con un método para el
diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida,
obtenida de un individuo por medición de MASP en dicha muestra. La
medición de MASP puede, por ejemplo, ser utilizada en la detección o
diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.
El cáncer sigue siendo un gran reto para la
salud pública a pesar del progreso en su detección y terapia. Entre
los distintos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (CCR) es uno de
los cánceres más frecuentes en el mundo occidental.
Cuanto antes pueda ser detectado y diagnosticado
el cáncer, mejor es la tasa global de supervivencia. Esto es
especialmente cierto para el CCR. Los estadios avanzados del tumor
tienen un mal pronóstico. Más de un tercio de los pacientes morirán
por el progreso de la enfermedad durante los 5 años posteriores al
diagnóstico, que corresponden a una tasa de supervivencia de
aproximadamente un 40% para 5 años. El tratamiento habitual tan
sólo cura a una proporción pequeña de los pacientes y claramente
tiene los mejores efectos en aquellos pacientes diagnosticados en
estadios tempranos de la enfermedad.
Al considerar al CCR como un problema de salud
pública, es esencial que se desarrollen más medidas preventivas y de
cribado efectivas para el cáncer colorrectal.
Los procedimientos de detección precoz
disponibles actualmente para el cáncer colorrectal implican la
utilización de pruebas para la detección de sangre en heces o
procedimientos endoscópicos. Sin embargo, normalmente el tumor debe
tener un tamaño considerable del tumor antes de que se detecte
sangre fecal. La sensibilidad de las pruebas de detección de sangre
oculta en las heces (prueba del guayaco) es aproximadamente del 26%,
lo que significa que el 74% de los pacientes con lesiones malignas
no se detectarán (Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26
[1997] 41-55). La visualización de lesiones
precancerosas y cancerosas representa la mejor estrategia para la
detección precoz, pero la colonoscopia es invasiva y los costes, los
riesgos y las complicaciones son significativos (Silvis, S.E., et
al., JAMA 235 (1976) 928-930; Geenen,
J.E., et al., Am. J. Dig. Dis. 20 (1975)
231-235; Anderson, W.F., et al., J. Nati.
Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133).
En los últimos años se ha informado de la
existencia de una cantidad enorme de los llamados genes específicos
del colon o incluso los llamados genes específicos del cáncer
colorrectal. La inmensa mayoría de los correspondientes artículos
de investigación o solicitud de patentes están basados en los datos
obtenidos mediante análisis de pautas de expresión de RNA en tejido
de colon (canceroso) frente a un tejido diferente o un tejido
adyacente normal, respectivamente. Dichas estrategias se pueden
englobar dentro las técnicas de detección de mRNA diferencial.
La patente WO 01/96390 debe ser mencionada y
discutida como un ejemplo de los datos disponibles de técnicas de
detección de mRNA. Esta solicitud describe y reivindica más de
doscientos polinucleótidos aislados y los correspondientes
polipéptidos como tales, así como su uso en la detección del CCR.
Sin embargo, es de conocimiento general que las diferencias en las
concentraciones de mRNA no se reflejan en las concentraciones de la
correspondiente proteína. Un mRNA poco abundante puede codificar
una proteína que se encuentra en grandes cantidades y un mRNA
abundante puede codificar una proteína de detectar y encontrar. Esta
falta de correlación entre el nivel de mRNA y el nivel de proteína
se debe a motivos como: estabilidad del mRNA, eficiencia de
traducción, estabilidad de la proteína, etc.
Asimismo, existen estrategias actuales que
investigan diferencias en las pautas de expresión de proteínas
entre diferentes tejidos o entre tejidos sanos y enfermos para
identificar las moléculas marcadoras candidatas que se podrían
utilizar para el diagnóstico del CCR. Brünagel, G., et al.,
Cancer Research 62 (2002) 2437-2442 han
identificado siete proteínas de la matriz nuclear que parecen ser
más abundantes en tejido con CCR cuando se comparan con tejido
adyacente normal. No se ha informado de la existencia de datos
procedentes de muestras líquidas obtenidas de un solo individuo.
La patente WO 02/078636 informa sobre nueve
spots asociados a cáncer colorrectal detectados mediante
espectroscopía de desorción/ionización de láser
superficie-realzada (SELDI). Estos spots se observan
más frecuentemente en muestras de suero de pacientes con CCR cuando
se comparan con sueros obtenidos de controles sanos. No obstante,
se desconoce la identidad de la(s) molécula(s)
incluidas en ese spot, como p. ej., su secuencia.
A pesar de la larga y creciente lista de
marcadores de proteínas candidatas en el campo del CCR, hasta el
momento se desconoce la utilidad clínica y diagnóstica de estas
moléculas. Para que un nuevo marcador diagnóstico sea de utilidad
clínica como un marcador único como mínimo debe ser tan bueno como
el mejor marcador único ya conocido en su campo. O, un nuevo
marcador debería suponer una mejora de la sensibilidad o la
especificidad del diagnóstico ya sea utilizado solo o en
combinación con uno o más marcadores, respectivamente. La
sensibilidad o especificidad del diagnóstico de una prueba se
valora mejor por sus características de funcionamiento del
receptor, las cuales serán descritas en detalle a continuación.
En la actualidad, únicamente están disponibles
análisis de sangre basados en la detección de antígeno
carcinoembriónico (ACE), una glicoproteína asociada a tumores, para
ayudar al diagnóstico en el campo del CCR. El ACE se encuentra
elevado en el 95% de las muestras de tejidos obtenidas de pacientes
con cáncer colorrectal, gástrico, y pancreático; y en la mayoría de
carcinomas de pecho, pulmón, cabeza y cuello (Goldenberg, D.M.,
et al., J. Nati. Cancer Inst. (Bethesda) 57 (1976)
11-22). También se han detectados niveles elevados
de ACE en pacientes con enfermedad no cancerosa y muchos pacientes
con cáncer colorrectal tienen niveles normales de ACE en el suero,
especialmente, durante el estadio inicial de la enfermedad
(Carriquiry, L.A., and Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42 (1999)
921-929; Herrera, M.A., et al., Ann. Surg.
183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J., et al., N.
Engi. J. Med. 299 (1978) 448-451). Según se ha
informado, la utilidad de la medición del ACE en suero o plasma para
la detección de recurrencias es un tema polémico y todavía debe ser
aplicado ampliamente (Marteil, R. E., et al., mt. J. Biol.
Markers 13 (1998) 145-149; Moertel, C.G., et
al., JAMA 270 (1993) 943-947).
Si se consideran los datos disponibles, la
determinación en suero del ACE no posee sensibilidad ni
especificidad suficiente para permitir su uso como una prueba de
cribado para cáncer colorrectal en la población asintomática.
(Reynoso, G., et al., JAMA 220 (1972)
361-365; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48 (2002)
1151-1159).
La sangre total, el suero o el plasma son las
fuentes de muestras más ampliamente utilizadas en la práctica
clínica rutinaria. La identificación de un marcador de tumor de CCR
inicial que permitiese la detección fiable del cáncer o aportase
información sobre el pronóstico inicial podría significar el
desarrollo de una prueba diagnóstica que podría ayudar enormemente
en el diagnóstico y en el tratamiento de esta enfermedad. Por tanto,
existe una necesidad clínica urgente para mejorar el diagnóstico
del CCR a partir de las muestras de sangre. Es especialmente
importante mejorar el diagnóstico temprano del CCR, ya que las
posibilidades de sobrevivir son mucho mayores para aquellos
pacientes diagnosticados en los estadios iniciales de la enfermedad
que para los diagnosticados en estadios avanzados.
El objetivo de la presente invención era
investigar si se puede identificar un nuevo marcador y que éste
pueda ayudar en el diagnóstico del CCR.
Sorprendentemente, se ha averiguado que el uso
de la proteína MASP puede al menos superar parcialmente los
problemas conocidos hasta el momento.
La presente invención, por tanto, se refiere a
un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consta de
los siguientes pasos: a) aportar una muestra líquida obtenida de un
individuo; b) poner en contacto dicha muestra con un agente de
unión específico para MASP bajo las condiciones apropiadas para la
formación de un complejo entre dicho agente de unión y MASP; y c)
correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el
diagnóstico de cáncer colorrectal. Un método preferido utiliza una
muestra líquida obtenida de un individuo.
Otra realización preferida de la invención es un
método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consta de los
siguientes pasos: a) poner en contacto una muestra líquida obtenida
de un individuo con un agente de unión específico para MASP bajo
las condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre
dicho agente de unión y MASP; y b) correlacionar la cantidad de
complejo formado en a) con el diagnóstico de cáncer colorrectal.
Como el experto en la materia puede apreciar,
cualquier diagnóstico de este tipo se hace in vitro. La
muestra del paciente se descarta posteriormente. La muestra del
paciente únicamente se utiliza para el método de diagnóstico in
vitro de la invención y el material de la muestra del paciente
no se transfiere de nuevo al cuerpo del paciente. Normalmente, la
muestra es líquida.
La proteína MASP (precursor maspin;
Swiss-PROT: P36952) se caracteriza por la secuencia
dada en SEQ ID NO: 1. El cDNA maspin humano clonado codifica una
proteína de 42 kDa que homóloga a la superfamilia serpin de
inhibidores de proteasa. Estudios de inmunotinción demuestran que
maspin se encuentra en la matriz extracelular y en la membrana
plasmática (Zou, Z., et al., Science 263 (1994)
526-529).
El gen MASP humano (SERPINB5 de PI5) se aisló
originalmente del epitelio mamario normal mediante hibridación
sustractiva en base a su expresión a nivel de mRNA (Zou et
al., supra). Maspin se expresaba en células epiteliales
mamarias normales pero no en la mayoría de líneas celulares de
carcinoma mamario. Zou et al. (supra) mostró que su
expresión reduce la capacidad de las células transformadas de
inducir la formación de tumores y metástasis, sugiriendo que el gen
maspin codifica un supresor tumoral.
Bass, R., et al. (J. Biol. Chem. 277
(2002) 46845-46848) caracterizó el maspin
eucariótico y descubrió que no presentaba un efecto inhibidor de
proteasa frente a ninguno de los sistemas proteolíticos analizados.
Sin embargo, inhibió la migración tanto de tumores como de células
del músculo liso vascular.
Song, S.Y., et al. (Digestive Diseases
and Sciences 47 (2002) 1831-1835) estudió la
expresión de maspin en cánceres de colon mediante tinción
inmunohistoquímica de secciones de tejido de adenomas,
adenocarcinomas y adenocarcinomas metastáticos. La
inmunorreactividad de maspin descubierta por Song et al.
(supra) era citoplasmática, con algo de tinción nuclear. Más
del 90% de cortes histológicos de tejidos de adenomas, el 75% de
adenocarcinomas y el 47% de carcinomas metastáticos presentaron
tinción positiva para maspin. Este estudio presentaba la limitación
de no utilizar ningún sistema de ensayo cuantitativo, como el
análisis de transferencia western (western blot). No se valoró el
nivel de expresión en comparación con tejido de colon normal
adyacente.
Como es obvio para el experto en la materia, la
presente invención no se debe considerarse limitada a la longitud
completa de la proteína MASP de SEQ ID NO: 1. La presente invención
también abarca fragmentos de MASP fisiológicos o artificiales,
modificaciones secundarias de MASP, así como variantes alélicas de
MASP. Los fragmentos artificiales preferentemente abarcan un
péptido producido sintéticamente o por técnicas recombinantes, que
constan de al menos un epítopo de interés diagnóstico consistente en
al menos 6 aminoácidos contiguos que se obtienen de la secuencia
presentada en SEQ ID NO: 1. Tal fragmento puede ser utilizado
ventajosamente para la generación de anticuerpos o como un estándar
en un inmunoensayo. Es aún más preferible que el fragmento
artificial conste de al menos dos epítopos de interés apropiados
para diseñar un inmunoensayo de tipo sándwich.
En realizaciones preferidas, el marcador
novedoso MASP se puede utilizar para monitorizar así como para el
cribado.
Cuando el método diagnóstico de acuerdo con la
presente invención se utiliza en monitorización de pacientes puede
ayudar a valorar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la
recurrencia del tumor en el seguimiento de los pacientes. Niveles
elevados de MASP están directamente relacionados con la carga
tumoral. Después de la quimioterapia un incremento de MASP a corto
plazo (desde unas pocas horas hasta 14 días) puede servir como un
indicador de la muerte de las células tumorales. En el seguimiento
de los pacientes (desde 3 meses hasta 10 años) se puede utilizar un
incremento de MASP como indicador de recurrencia tumoral.
En una realización preferida el método de
diagnóstico de acuerdo con la presente invención se utiliza para la
realización de cribados. P. ej. se utiliza para evaluar individuos
sin un diagnóstico previo de CCR mediante la medición del nivel de
MASP y la correlación del nivel medido con la presencia o ausencia
de CCR.
El cáncer colorrectal con mucha frecuencia
evoluciona de adenomas (pólipos) a carcinomas malignos. Los
diferentes estadios del CCR normalmente se clasificaban de acuerdo
con la clasificación de Duke de los estadios A a D.
El estadiaje del cáncer consiste en la
clasificación de la enfermedad en función de la extensión, la
progresión y la gravedad. Agrupa a los pacientes con cáncer de
manera que se pueden hacer generalizaciones sobre el pronóstico y la
selección del tratamiento.
Actualmente, el sistema TNM es la clasificación
más ampliamente utilizada de la extensión anatómica de cáncer.
Representa un sistema uniforme de estadiaje aceptado
internacionalmente. Hay tres variables básicas: T (la extensión del
tumor primario), N (el estado de los nódulos linfáticos regionales)
y M (presencia o ausencia de metástasis distantes). Los criterios
TNM están publicados por la UICC (Unión Internacional Contra el
Cáncer), Sobin, LH., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of
Malignant Tumours, fifth edition, 1997).
Lo realmente importante es que el diagnóstico
precoz del CCR supone un pronóstico mucho mejor. Los tumores
malignos colorrectales surgen de tumores benignos, p. ej. de
adenomas. Por tanto, el mejor pronóstico lo tienen aquellos
pacientes diagnosticados en el estadio de adenoma. Los pacientes
diagnosticados en estadios tan iniciales como T_{is}, N0, M0 o
Tl-3; N0; M0, si se tratan apropiadamente tienen más
del 90% de probabilidad de supervivencia 5 años después del
diagnóstico en comparación con la tasa de supervivencia a 5 años de
sólo el 10% para los pacientes diagnosticados cuando las metástasis
distantes ya están presentes.
En el sentido de la presente invención el
diagnóstico precoz del CCR se refiere al diagnóstico en un estadio
pre-maligno (adenoma) o en un estadio tumoral en el
que no hay ninguna metástasis (ni proximal ni distal), p. ej.,
adenoma, T_{is}, NO, MO o T1-4; NO; MO están
presentes. T_{is} indica carcinoma in situ.
En una realización preferida la detección de
MASP se utiliza para diagnosticar el CCR tan temprano como en el
estadio de adenoma.
Es aún más preferido que el CCR se diagnostique
cuando todavía no ha crecido completamente a través de la pared
intestinal y de este modo ni el peritoneo visceral está perforado ni
otros órganos o estructuras son invadidos, p. ej., que el
diagnóstico se haga en cualquier estadio desde T_{is}; NO; MO a
T3; NO; MO (=T_{is}-3; NO; MO).
El método de diagnóstico de acuerdo con la
presente invención se basa en una muestra líquida que se ha obtenido
de un individuo. A diferencia de los métodos conocidos en este
ámbito, MASP se mide específicamente en esta muestra líquida
mediante el uso de un agente de unión específico.
Un agente de unión específico es, p. ej., un
receptor para MASP, una lectina unida a MASP o un anticuerpo unido
a MASP. Un agente de unión específico debe tener al menos una
afinidad de 10^{7} l/mol por su correspondiente molécula diana.
El agente de unión específico preferiblemente tiene una afinidad de
10^{8} l/mol o, es incluso más preferible, 10^{9} l/mol por su
molécula diana. Como el experto en la materia apreciará, el término
específico se utiliza para indicar que otras biomoléculas presentes
en la muestra no se unirán de manera significativa con el agente de
unión específico para MASP. Preferiblemente, el nivel de unión a una
biomolécula diferente a la molécula diana da como resultado una
afinidad de unión de solo un 10%, más preferiblemente el 5% de la
afinidad de la molécula diana o menos. Un agente de unión específico
más preferido cumplirá los dos criterios mínimos anteriores para la
afinidad así como para la especificidad.
Un agente de unión específico es preferiblemente
un anticuerpo reactivo con MASP. El término anticuerpo se refiere a
un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de
dichos anticuerpos, así como a construcciones genéticas que consten
del dominio de unión de un anticuerpo.
El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo
policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de dichos
anticuerpos, así como a construcciones genéticas que consten del
dominio de unión de un anticuerpo. Se puede utilizar cualquier
fragmento de anticuerpo que cumpla los criterios anteriores de un
agente de unión específico. Los anticuerpos se generan por
procedimientos novedosos en el ámbito, p. ej., como se describe en
Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11
(1990) el libro completo, sobretodo las páginas
43-78; Elsevier, Amsterdam). Además, el experto en
la materia es bien consciente de que los métodos basados en
inmunosorbentes pueden ser utilizados para el aislamiento específico
de anticuerpos. De esa manera, la calidad de los anticuerpos
policlonales y, por tanto, su función en inmunoensayos puede
mejorarse. (Tijssen, P., supra, págs.
108-115).
Para los logros que se presentan en la presente
invención se utilizaron anticuerpos policlonales producidos en
conejos. Sin embargo, claramente se pueden utilizar también los
anticuerpos policlonales de diferentes especies, p. ej. ratas o
cobayas, así como anticuerpos monoclonales. Dado que los anticuerpos
monoclonales se pueden obtener en cualquier cantidad que se necesite
con propiedades constantes, representan las herramientas ideales
para el desarrollo de un ensayo clínico rutinario. La producción y
el uso de anticuerpos monoclonales para MASP en un método de acuerdo
con la presente invención es otra realización preferida más.
Como el experto en la materia apreciará ahora
que MASP ha sido identificada como un marcador útil en el
diagnóstico de CCR, se pueden utilizar maneras alternativas para
conseguir un resultado comparable a los logros de la presente
invención. Por ejemplo, se pueden utilizar estrategias alternativas
para generar anticuerpos. Dichas estrategias incluyen, entre otras,
el uso de péptidos sintéticos que representen un epítopo de MASP
para la inmunización. Alternativamente, se puede utilizar la
inmunización genética también conocida como vacuna de DNA.
Para la medición, la muestra líquida obtenida de
un individuo se incuba con el agente específico de unión a MASP
bajo las condiciones apropiadas para la formación del complejo
MASP-agente de unión. Tales condiciones no necesitan
ser especificadas, ya que el experto en la materia sin ningún
esfuerzo imaginativo puede identificar fácilmente dichas condiciones
apropiadas de incubación.
Como paso final, de acuerdo con el método
presentado en la presente invención, la cantidad de complejo se mide
y correlaciona con el diagnóstico de CCR. Como el experto en la
materia apreciará hay numerosos métodos para medir la cantidad de
complejo MASP-agente específico de unión todos
descritos en detalle en libros de texto relevantes (cf., p. ej.,
Tijssen P., supra, or Diamandis, et al., eds. (1996)
Immunoassay, Academic Press, Boston).
Preferiblemente, MASP se detecta con un ensayo
tipo sándwich. En dicho ensayo, un primer agente de unión específico
se utiliza para capturar MASP por un lado y un segundo agente de
unión específico, que está marcado para ser detectado directa o
indirectamente, se utiliza por el otro lado.
Como se menciona anteriormente,
sorprendentemente se ha descubierto que se puede medir MASP a partir
de una muestra líquida obtenida de una muestra individual. Para la
aplicación del marcador MASP en el diagnóstico del CCR, no son
necesarias muestras de tejido ni biopsia.
En una realización preferida el método de
acuerdo con la presente invención se pone en práctica con suero como
muestra líquida.
En una realización más preferida el método de
acuerdo con la presente invención se pone en práctica con plasma
como muestra líquida.
En una realización aún más preferida el método
de acuerdo con la presente invención se pone en práctica con sangre
total como muestra líquida.
Además las deposiciones pueden prepararse de
varias maneras conocidas por el experto en la materia para dar como
resultado también una muestra líquida. Dicha muestra líquida
derivada de las deposiciones también representa una realización
preferida de acuerdo con la presente invención.
Mientras que la aplicación de métodos
proteómicos rutinarios a las muestras de tejido conduce a la
identificación de muchos candidatos marcadores potenciales para el
tejido seleccionado, los creadores de la presente invención han
sido capaces, sorprendentemente, de detectar proteína MASP en una
muestra de fluido corporal. Es incluso más sorprendentemente el
hecho de que ellos han sido capaces de demostrar que la presencia de
MASP en dicha muestra líquida obtenida de un individuo puede ser
correlacionada con el diagnóstico de cáncer colorrectal.
Se pueden utilizar, con enormes ventajas,
anticuerpos para MASP en procedimientos establecidos, p. ej., para
la detección de células de cáncer colorrectal in situ, en
biopsias o en procedimientos inmunohistológicos.
Preferiblemente, un anticuerpo para MASP se
utiliza en un inmunoensayo cualitativo (presencia o ausencia de
MASP) o cuantitativo (cantidad de MASP determinada).
Se ha demostrado que la medición del nivel de
proteína MASP es muy ventajosa para el campo del CCR. Por tanto, en
una realización más preferida, la presente invención se refiere al
uso de la proteína MASP como una molécula marcadora en el
diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida
obtenida de un individuo.
El término molécula marcadora se utiliza para
indicar que un nivel elevado del analito MASP, cuando se mide en el
fluido corporal de un individuo, marca la presencia de CCR.
Es especialmente preferido utilizar el marcador
novedoso MASP en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.
El uso de MASP en sí mismo representa un
progreso significativo en el desafiante campo del diagnóstico del
CCR. Combinar la medida de MASP con otros marcadores conocidos,
como ACE, o con otros marcadores de CCR todavía por descubrir,
lleva a más mejoras. Por tanto, en una realización más preferida la
presente invención se refiere al uso de MASP como una molécula
marcadora para cáncer colorrectal en combinación con una o más
moléculas marcadores para cáncer colorrectal en el diagnóstico de
esta enfermedad a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo. En ese sentido, la expresión "una o más" indica de 1
a 10, preferiblemente de 1 a 5, más preferiblemente 3. Otros
marcadores preferidos de CCR seleccionados con los cuales se puede
combinar la medida de MASP son ACE, CA 19-9, CA
72-4 y CA 242. De este modo, una realización mucho
más preferida de la presente invención es el uso de la proteína
MASP como una molécula marcadora para el cáncer colorrectal en
combinación con una o más moléculas marcadoras para el cáncer
colorrectal en el diagnóstico de cáncer colorrectal a partir de una
muestra líquida obtenida de un individuo, en la que al menos la otra
molécula marcadora se selecciona del grupo compuesto por ACE, CA
19-9, CA 72-4, y CA 242.
Los reactivos para el diagnóstico en el campo de
los ensayos de unión específica, como los inmunoensayos, normalmente
se proporcionan mejor en forma de kit, el cual consta del agente de
unión específico y los reactivos auxiliares necesarios para
realizar el ensayo. La presente invención, por tanto, también hace
referencia a un equipo inmunológico que consta de al menos un agente
de unión específico para MASP y reactivos auxiliares para la medida
de MASP.
La exactitud de una prueba se describe mejor por
las características de su curva ROC (del inglés,
receiver-operating characteristics) (ver
especialmente Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577).
El gráfico ROC es un diagrama de todos los pares
de sensibilidad/especificidad resultantes de variar continuamente el
umbral de decisión a lo largo de todo el rango de datos
observados.
La utilidad clínica de una prueba analítica
depende de su precisión en el diagnóstico o de su capacidad para
clasificar correctamente a los individuos en subgrupos clínicos
relevantes. La precisión en el diagnóstico mide la capacidad de la
prueba para distinguir correctamente dos condiciones diferentes de
los sujetos investigados. Tales condiciones son, por ejemplo, la
salud frente a la enfermedad o la enfermedad benigna frente a la
maligna.
En cada caso, la curva ROC representa la
superposición entre las dos distribuciones mediante la
representación de la sensibilidad frente a 1 - especificidad para el
rango completo del umbral de decisión. En el eje Y se observa la
sensibilidad, o la fracción verdadero-positivo
[definida como (número de resultados de prueba
verdadero-positivo)/(número de resultados de prueba
verdadero-positivo + número de resultados de prueba
falso-negativo)]. Esto también puede expresarse como
positividad en presencia de una enfermedad o condición. Se calcula
únicamente para el subgrupo afectado. En el eje X está la fracción
falso-positivo, o 1 - especificidad [definida como
(número de resultados falso-positivo)/ (número de
verdadero-negativo + número de resultados
falso-positivo)]. Se trata de un índice de
especificidad y se calcula únicamente a partir del subgrupo no
afectado. Dado que las fracciones
verdadero-positivo y falso-positivo
se calculan totalmente por separado mediante la utilización de
resultados de pruebas de dos subgrupos diferentes, la curva ROC es
independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra.
Cada punto en la curva ROC representa un par de
sensibilidad/especificidad correspondiente a un umbral de decisión
concreto. Una prueba con discriminación perfecta (no superposición
en las dos distribuciones de resultados) presenta una curva ROC que
pasa por la esquina superior izquierda, donde la fracción verdadero
positivo es 1,0 o 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción falso
positivo es 0 (especificidad perfecta). El diagrama teórico para una
prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de los
resultados para los dos grupos) es una línea en diagonal de 45º que
discurre desde la esquina inferior izquierda hasta la esquina
superior derecha. La mayoría de trazos se encuentran entre estos dos
extremos. (Si el trazo ROC cae completamente por debajo de la
diagonal de 45º, se puede resolver fácilmente por reversión del
criterio para "positividad" de "mayor que" a "menor
que" o viceversa.) Cualitativamente, cuanto más cerca está el
trazo de la esquina superior izquierda, más elevada será la
precisión de la prueba.
Para cuantificar la precisión del diagnóstico de
una prueba analítica, es una meta oportuna la expresión de sus
resultados mediante un único número. La medida global más común es
el área bajo la curva ROC. Por convenio, esta área es siempre \geq
0,5 (si no lo es, se puede revertir la regla de decisión para que lo
sea). Los valores oscilan entre 1,0 (separación perfecta de los
valores de las pruebas de los dos grupos) y 0,5 (no hay diferencia
de distribución aparente entre los valores de las pruebas de los dos
grupos). El área no depende de una parte concreta del trazo
únicamente como el punto más cercano a la diagonal o la sensibilidad
al 90% de especificidad, sino del trazo completo. Esto es una
expresión cuantitativa y descriptiva de como es de cercano la curva
ROC al trazo perfecto (área=1,0).
Se ha evaluado la utilidad clínica del marcador
novedoso MASP en comparación con el marcador establecido ACE y en
combinación con él utilizando un análisis de la curva ROC (ROC;
Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577). Este análisis se ha basado en
cohortes de pacientes bien definidas consistentes en 50 muestras
cada una de pacientes Tl-3; N0; M0, tumores más
avanzados, p. ej., T4 y/o metástasis de diversa gravedad (N+ y/o
M+), y controles sanos, respectivamente.
El método de diagnóstico basado en la medida de
MASP solo en comparación con el marcador establecido ACE ha
resultado tener al menos una precisión de diagnóstico tan buena
(perfil de sensibilidad/especificidad) como se ha demostrado
mediante el área bajo la curva.
Se presentan los siguientes ejemplos,
referencias, listado de secuencias y figuras para ayudar a la
comprensión de la presente invención, el verdadero ámbito de
aplicación de la cual se establece posteriormente en las
reivindicaciones adjuntas. Se entiende que las modificaciones se
pueden realizar en los procedimientos establecidos posteriormente
sin desviarse del espíritu de la invención.
La figura 1 muestra un ejemplo típico de gel en
2D, cargado con una muestra de tumor (lado izquierdo), y un gel,
cargado con una muestra control emparejada (lado derecho) obtenida
de mucosa sana adyacente. El peso molecular aparente y el punto
isoeléctrico de MASP corresponden a los valores teóricos aproximados
de 40 kDa y 5,98, respectivamente. El círculo en la sección
engrandecida de estos geles indica la posición para la proteína
MASP. Esta proteína no se detectó mediante el mismo método en mucosa
sana.
La figura 2 muestra un ejemplo típico de
transferencia Western. El gel se cargó con lisados de tejido de
tumor colorrectal y tejido control sano adyacente de 4 pacientes
(sujeto 36: carcinoma de recto, Dukes B; sujeto 37: carcinoma de
recto, Dukes A; sujeto 39: carcinoma de colon, Dukes A; y sujeto 40:
carcinoma de colon, Dukes B). La presencia de MASP en las muestras
se analizó utilizando un suero anti-MASP policlonal
de conejo. Los carriles que contienen lisados de tumor se indican
como "T", los carriles que contienen tejido control normal se
indican como "N". El carril marcador que contiene un estándar
de pesos moleculares de proteína se indica como "Ma". Los
carriles que contienen MASP recombinante a diferentes
concentraciones se indican como "300", "1000" y
"3000". La flecha indica la posición en el gel de la banda
MASP. Todas las muestras de tumor dan como resultado una fuerte
señal en la posición de MASP, mientras que sólo se detecta una señal
débil en los lisados de tejido control normal adyacente. Esta
sobrexpresión tan fuerte de MASP en tejido tumoral de pacientes con
cáncer colorrectal se encuentra en 13 de los 13 sujetos
examinados.
- ABTS
- sal de diamonio 2,2’-Azino-di-[3-etilbenztiazolina sulfonato(6)]
- BSA
- albúmina sérica bovina
- cDNA
- DNA complementario
- CHAPS
- (3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propan-sulfonato)
- DMSO
- dimetil sulfóxido
- DO
- densidad óptica
- DTT
- ditiotreitol
- EDTA
- ácido etileno diamino tetracético
- ELISA
- inmunoensayo enzimático sobre fase sólida
- HRP
- peroxidasa de rábano picante
- IAA
- iodacetamida
- IgG
- inmunoglobulina G
- IEF
- enfoque isoeléctrico
- IPG
- gradiente de pH inmovilizado
- LDS
- dodecil sulfato de litio
- MALDI-TOF
- espectrometría de masas mediante ionización-desorción por láser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo
- MES
- mesitil,2,4,6-trimetilfenil
- PAGE
- electroforesis en gel de poliacrilamida
- PBS
- tampón fosfato salino
- PI
- punto isoeléctrico
- RTS
- sistema rápido de traducción
- SDS
- dodecil sulfato sódico
Para identificar las proteínas específicas de
tumores como marcadores diagnósticos potenciales para el cáncer
colorrectal, se realiza el análisis de tres tipos diferentes de
tejido utilizando métodos proteómicos.
En total, se analizan muestras de tejido de 10
pacientes que padecen cáncer colorrectal. De cada paciente se
recogen tres tipos de tejido diferentes de resecciones terapéuticas:
tejido tumoral (>80% de tumor) (T), tejido sano adyacente (N) y
mucosa extraída de zonas sanas adyacentes (M). Los dos últimos tipos
de tejido sirven como muestras control sanas emparejadas. Los
tejidos son inmediatamente congelados de forma rápida después de la
resección y almacenados a -80ºC antes del procesamiento. Los
tumores se diagnostican mediante criterios histopatológicos.
Se ponen en un mortero 0,8-1,2 g
de tejido congelado y se congelan completamente con nitrógeno
líquido. El tejido se pulveriza en el mortero, se disuelve 10 veces
en un volumen (p/v) de tampón de lisis (40 mM
Na-citrato, 5 mM MgCl_{2}, 1% Genapol
X-080, 0,02% Na-azida, Complete®
EDTA-free [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, Núm. Cat. 1 873 580]) y posteriormente se homogeneiza en
un homogeneizador de vidrio Wheaton® (20 x ajuste amplio, 20 ajuste
estrecho). Se someten 3 ml del homogeneizado a una centrifugación en
gradiente de densidad de sacarosa (10-60% sacarosa)
durante 1 hora a 4.500 x g. Después de esta centrifugación se
obtienen tres fracciones. La fracción superior del gradiente
contiene las proteínas solubles y se utiliza para análisis
posteriores.
Para IEF, se mezclan 3 ml de la suspensión con
12 ml de tampón de muestra (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 0,4%
tampón IPG pH 4-7, 0,5% DTT) y se incuban durante 1
hora. Las muestras se concentran en un dispositivo Amicon®
Ultra-15 (Miffipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y la
concentración de proteína se determina utilizando el ensayo de
proteínas BioRad® (Núm. Cat. 500-0006;
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Alemania)
siguiendo las instrucciones del manual del distribuidor. Se añade
tampón a un volumen correspondiente a 1,5 mg de muestra de proteína
hasta un volumen final de 350 \mul. Esta solución se utiliza para
rehidratar las tiras IPG a pH 4-7 (Amersham
Biosciences, Freiburg, Alemania) durante toda la noche. La IEF se
realiza utilizando el siguiente protocolo de gradiente: 1.) 1
minuto a 500 V; 2.) 2 horas a 3.500 V; 3.) 22 horas a 3.500 V
constantes hasta llegar a 82 kVh. Después de la IEF, las tiras se
almacenan a -80ºC o se utilizan directamente para la
SDS-PAGE.
Antes del SDS-PAGE, se incuban
las tiras en tampón de equilibrio (6 M urea, 50 mM Tris/HCl, pH 8,8,
30% glicerol, 2% SDS), para reducción se añade DTT (15 minutos, + 50
mg DTT/10 ml), y para alquilación se añade IAA (15 minutos, + 235
mg iodacetamida/10 ml). Las tiras se introducen en un gel de
poliacrilamida al 12,5% y se someten a electroforesis a 1 W/gel
durante 1 hora y entonces a 17 W/gel. Posteriormente, los geles se
fijan (50% metanol, 10% acetato) y se tiñen durante la noche con un
kit Novex^{TM} Coloidal Blue Staming (Invitrogen, Karlsruhe,
Alemania, Núm. Cat. LC6025, 45-15 7101).
Cada paciente se analiza por separado por
análisis de imagen con el software ProteomeWeaver® (Definiens AG,
Alemania, München). Además, todas las bandas del gel se extraen con
un robot que las selecciona y las proteínas presentes en las bandas
se identifican mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF (Ultraflex Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH,
Bremen, Alemania). Para cada paciente, se comparan 4 geles de la
muestra de tumor con 4 geles cada uno de tejido adyacente normal y
tejido extraído de mucosa y se analizan para distintas bandas
correspondientes a proteínas expresadas de manera distinta. Con
esto, quiere decir que se ha descubierto que la proteína MASP se
expresa específicamente o se sobrexpresa fuertemente en tejido
tumoral y no se detecta o se expresa en menor medida en tejido
control sano. Por tanto - entre muchas otras proteínas - se
considera como un marcador candidato para su uso en el diagnóstico
del cáncer colorrectal.
El anticuerpo policlonal para la proteína
marcadora en cáncer colorrectal MASP se genera para el uso posterior
del anticuerpo en la medida de niveles de MASP en suero y plasma y
sangre mediante ensayos de inmunodetección, p. ej. Western Blotting
y ELISA.
Para generar anticuerpos para MASP, la expresión
recombinante de la proteína tiene lugar para obtener inmunogenes. La
expresión se realiza aplicando una combinación del sistema de
expresión RTS 100 y E. coli. En un primer paso, se analiza
la secuencia de DNA y se obtienen recomendaciones para producir de
manera elevada variantes de mutaciones silenciosas de cDNA y las
respectivas secuencias PCR-cebador utilizando el
sistema "ProteoExpert RTS E. coli HY". Esto es un
servicio basado en una web comercial (www.proteoexpert.com).
Utilizando los primeros pares recomendados, el sistema "RTS 100
E. coli Linear Template Generation Set,
His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, Cat. No. 3186237) para generar moldes lineales para PCR a
partir del cDNA y se utiliza para la transcripción in vitro y
la expresión de la secuencia codificante del nucleótido para la
proteína MASP. Para la detección Western-blot y
posterior purificación, la proteína expresada contiene una etiqueta
de His. La mejor variante de expresión se identifica. Todos los
pasos desde la PCR hasta la expresión y detección tienen lugar de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El respectivo producto
de PCR, que contiene todas las regiones reguladoras T7 necesarias
(promotor, sitio de unión ribosomal y terminador T7) se clona en el
vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, CaL No. K
4300/01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la
expresión utilizando las secuencias reguladoras T7, la construcción
se transforma en E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W., et
al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89) y las
bacterias transformadas se cultivan en un fermentador de 1 l para la
expresión de
proteínas.
proteínas.
La purificación de la proteína de fusión
His-MASP se realiza siguiendo procedimientos
estándar en una columna de Ni-quelante. En resumen,
1 l de cultivo de bacterias que contienen el vector de expresión
para la proteína de fusión His-MASP es sedimentado
por centrifugación. El sedimento celular se resuspende en tampón de
lisis, conteniendo fosfato, pH 8,0, cloruro de guanidio 7 M,
imidazol y tioglicerol, seguido de homogeneización utilizando un
UltraTurrax®. El material insoluble se sedimenta por centrifugación
de alta velocidad y el sobrenadante se introduce en una columna
cromatográfica de Ni-quelante. La columna se lava
con varios volúmenes de tampón de lisis seguido por lavados con
tampón, que contiene fosfato, pH 8,0 y Urea. Finalmente, el antígeno
unido se diluye utilizando un tampón de fosfato que contiene SDS
bajo condiciones ácidas.
Ratones A/J de 12 semanas de edad son
inicialmente inmunizados intraperitonealmente con 100 \mug de
MASP. Al cabo de 6 semanas se hacen dos inmunizaciones
intraperitoneales más en intervalos mensuales. En este proceso a
cada ratón se le administran 100 \mug de MASP adsorbida a
hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de Bordetella
pertussis. Posteriormente las dos últimas inmunizaciones se
realizan por vía intravenosa en el 3º y 2º día antes de la fusión
utilizando 100 \mug de MASP en tampón PBS para cada una.
Las células esplénicas de los ratones
inmunizados de acuerdo con a) se funden con células de mieloma de
acuerdo con Gaifre, G., and Milstein, C., Methods in Enzymology 73
(1981) 3-46. En este proceso alrededor de 1*10^{8}
células esplénicas del ratón inmunizado se mezclan con 2x10^{7}
células de mieloma (P3X63-Ag8-653,
ATCC CR11580) y se centrifugan (10 minutos a 300 g y 4ºC). Entonces
las células se lavan una vez con medio RPMI 1640 sin suero fetal
bovino (FCS) y se centrifugan de nuevo a 400 g en un tubo cónico de
50 ml. El sobrenadante se descarta, el sedimento de células se
libera con cuidado mediante golpes suaves, se añade 1 ml de PEG
(peso molecular 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla mediante
pipeteo. Después de 1 minuto en un baño de agua a 37ºC, se añaden
gota a gota 5 ml de RPMI 1640 sin FCS a temperatura ambiente durante
un período de 4-5 minutos. Posteriormente se añaden
gota a gota 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10% de FCS durante
alrededor de 1 minuto, se mezcla generosamente, se llena hasta 50
ml con medio (RPMI 1640 + 10% FCS) y posteriormente se centrifuga
durante 10 minutos a 400 x g y 4ºC. Las células sedimentadas se
recogen en medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se siembran
en un medio de selección hipoxantina-azaserina (100
mmol/l hipoxantina, 1 \mug/ml azaserina en RPMI 1640 + 10% FCS).
Se añade interleucina 6 a 100 U/ml al medio como factor de
crecimiento.
Después de alrededor de 10 días los cultivos
primarios se analizan para anticuerpos específicos. Los cultivos
primarios positivos de MASP se clonan en placas de cultivo de
células de 96 pocillos por medio de un clasificador de células
activado por fluorescencia. En este proceso de nuevo se añade
interleucina 6 a 100 U/ml al medio como un aditivo de
crecimiento.
Las células de hibridoma obtenidas se siembran
en una densidad de 1x10^{5} células por ml en medio RPMI 1640 que
contiene 10% de FCS y proliferaron durante 7 días en un fermentador.
(Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL,
Order No. 144-050). A concentraciones promedio de
100 \mug por ml se obtienen anticuerpos monoclonales en el
sobrenadante del cultivo. La purificación de estos anticuerpos del
sobrenadante del cultivo se lleva a cabo mediante métodos
convencionales en química de proteínas (p. ej. de acuerdo con Bruck,
C., et al., Methods in Enzymology 121 (1986)
587-695).
Para la inmunización, se prepara una emulsión
fresca de la solución de proteínas (100 \mug/ml de proteína MASP)
y el adyuvante de Freund completo a la proporción de 1:1. Cada
conejo se inmuniza con 1 ml de la emulsión los días 1,7, 14 y 30,
60 y 90. Se extrae sangre y el suero anti-MASP
resultante se utiliza para posteriores experimentos como se describe
en los ejemplos 3 y 4.
Un volumen de suero de conejo se diluye con 4
volúmenes de tampón de acetato (60 mM, pH 4,0). Se ajusta el pH a
4,5 con 2 M de Tris base. Se añade ácido caprílico gota a gota (25
\mul/ml de muestra diluida) bajo agitación vigorosa. Después de 30
minutos la muestra se centrifuga (13.000 x g, 30 minutos, 4ºC), el
sedimento se descarta y se recoge el sobrenadante. El pH del
sobrenadante se ajusta a 7,5 mediante la adición de 2 M de Tris base
y se filtra (0,2 \mum).
La inmunoglobulina en el sobrenadante se
precipita bajo agitación vigorosa mediante la adición gota a gota de
una solución de sulfato de amonio 4 M hasta una concentración final
de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogen mediante
centrifugación (8.000 x g, 15 minutos, 4ºC).
Se descarta el sobrenadante. El sedimento se
disuelve en 10 mM de NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl y se
dializa exhaustivamente. El dializado se centrifuga (13.000 x g, 15
minutos, 4ºC) y se filtra (0,2 \mum).
La IgG policlonal de conejo se lleva a 10 mg/ml
en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl. Por cada ml de
solución de IgG se añaden 50 \mul de
Biotin-N-hidroxisuccinimida (3,6
mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la
muestra se cromatografía en Superdex 200 (10 mM
NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). La fracción que
contiene las IgG biotiniladas se recoge. Los anticuerpos
monoclonales se biotinilan de acuerdo con el mismo
procedimiento.
La IgG policlonal de conejo se lleva a 10 mg/ml
en 10 mM NaH_{2}PO_{4}/NaOH, 30 mM NaCl, pH 7,5. Por ml de
solución de IgG se añaden 50 \mul de éster
N-hidroxisuccinimida de ácido
digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, Cat. No. 1 333 054) (3,8
mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la
muestra se cromatografía en Superdex® 200 (10 mM
NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, 30 mM NaCl). Se recogen las
fracciones que contienen IgG digoxigeniladas. Los anticuerpos
monoclonales se marcan con digoxigenina de acuerdo con el mismo
procedimiento.
Los lisados de tejido de muestras de tumor y
muestras control sanas se preparan como se describe en el Ejemplo 1,
"Preparación del Tejido".
SDS-PAGE y
Western-Blotting se llevan a cabo utilizando
reactivos y equipamiento de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Para
cada muestra de tejido analizada, se diluyen 10 \mug de lisado de
tejido en el NuPAGE® reductor (Invitrogen) tampón de muestra SDS y
se calienta durante 10 minutos a 95ºC. Las muestras se desplazan en
un gel 4-12% NuPAGE® (Tris-Glicina)
en el sistema tampón de desplazamiento MES. La mezcla de proteínas
separadas en el gel se transfieren a membranas de nitrocelulosa
utilizando el Invitrogen XCell II Blot Module (Invitrogen) y el
sistema tampón de transferencia NuPAGE®. Las membranas se lavan 3
veces en PBS/O,05% Tween-20 y se bloquean con
tampón de bloqueo Roti®-Block (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Alemania) durante 2 horas. El anticuerpo primario, suero
anti-MASP policlonal de conejo (generación descrita
en el Ejemplo 2), se diluye a 1:10.000 en tampón de bloqueo
Roti®-Block y se incuban durante 1 hora con la membrana. Las
membranas se lavan 6 veces en PBS/O,05% Tween-20.
El anticuerpo primario de conejo unido de manera específica se marca
con un anticuerpo policlonal de oveja POD-conjugado
anti IgG de conejo, se diluye a 10 mU/ml en 0,5 x tampón de bloqueo
Roti®-Block. Después de la incubación durante 1 hora, las membranas
se lavan 6 veces en PBS/O,05% Tween 20. Para la detección del
anticuerpo POD-conjugado anti conejo unido, la
membrana se incuba con el sustrato de
Western-Blotting Lumi-Light^{PLUS}
(Núm. orden 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y
se expone a una capa autoradiográfica.
Para la detección de MASP en suero y plasma
humanos, se desarrolla una técnica ELISA en sándwich. Para la
captura y detección del antígeno, se conjugan alícuotas de
anticuerpo anti-MASP (ver Ejemplo 2) con biotina y
digoxigenina, respectivamente.
Las placas de 96 pocillos cubiertas de
estreptavidina se incuban con 100 \mul de anticuerpo policlonal
anti-MASP biotinilado durante 60 minutos a 10
\mug/ml en 10 mM fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1%
Tween-20. Después de la incubación, las placas se
lavan tres veces con 0,9% NaCl, 0,1% Tween-20. Los
pocillos se incuban entonces durante 2 horas o bien con una
dilución en serie de la proteína recombinante (ver Ejemplo 2) como
antígeno estándar o con muestras de plasma diluido de los
pacientes. Después de la unión de MASP, las placas se lavan tres
veces con 0,9% NaCl, 0,1% Tween-20. Para la
detección específica de MASP unido, los pocillos se incuban con 100
\mul de anticuerpo policlonal anti MASP digoxigenilado durante 60
minutos a 10 \mug/ml en 10 mM fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl
y 0,1% Tween-20. Entonces, las placas se lavan tres
veces para eliminar al anticuerpo no unido. En un paso posterior,
los pocillos se incuban con 20 mU/ml de conjugados POD
anti-digoxigenina (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania, Catalog No. 1633716) durante 60 minutos en 10 mM
fosfato, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween-20.
Las placas son posteriormente lavadas tres veces con el mismo
tampón. Para la detección de los complejos
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incuban con 100
\mul de solución ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania,
Catalog No. 1 1685767) y DO se mide después de 30-60
minutos con un lector ELISA.
La precisión se evalúa mediante el análisis de
las muestras líquidas individuales obtenidas de cohortes de
pacientes bien caracterizados, p. ej., 50 pacientes a los que se les
ha realizado una colonoscopia y han resultado no tener adenoma o
CCR, 50 pacientes diagnosticados y clasificados en el estadio
T_{is}-3, N0, M0 de CCR, y 50 pacientes
diagnosticados con CCR avanzado, teniendo al menos infiltraciones
del tumor en al menos un nódulo linfático proximal o formas más
severas de metástasis, respectivamente. CEA medida mediante un
ensayo disponible comercialmente (Roche Diagnostics,
CEA-assay (Cat. No. 1 173 1629 for Elecsys® Systems
immunoassay analyzer) y medida MASP como se describe anteriormente
se cuantifican en un suero obtenido de cada uno de esos individuos.
El análisis ROC tiene lugar de acuerdo con Zweig, M. H., y
Campbell, supra. El poder discriminatorio para diferenciar
los pacientes en el grupo T_{is}-3, N0, M0 de los
individuos sanos como se ha medido por el área bajo la curva ha
resultado ser tan bueno para MASP como en comparación con el
marcador establecido CEA.
Los datos preliminares indican que MASP puede
también ser de gran ayuda en el seguimiento de los pacientes después
de la cirugía.
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marcador para el cáncer colorrectal
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<170> Versión de Patente 3,2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> precursor maspin;
Swiss-PROT: P36952
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (10)
1. Un método para el diagnóstico del cáncer
colorrectal que incluya los pasos de:
a) aportar una muestra líquida obtenida de un
individuo,
b) poner en contacto dicha muestra con un agente
de unión específico para el precursor maspin (MASP) bajo condiciones
apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de
unión y MASP, y
c) correlacionar la cantidad de complejo formado
en (b) con el diagnóstico del cáncer colorrectal.
2. El método de la reivindicación 1,
caracterizado además porque esa muestra es suero.
3. El método de la reivindicación 1,
caracterizado además porque esa muestra es plasma.
4. El método de la reivindicación 1,
caracterizado además porque esa muestra es sangre total.
5. El uso de la proteína MASP como molécula
marcadora en el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una
muestra líquida obtenida de un individuo.
6. El uso de la proteína MASP como molécula
marcadora en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal a partir
de una muestra líquida obtenida de un individuo.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
la que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra obtenida de
pacientes con CCR en el estadio de adenoma.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
la que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra obtenida de
pacientes con CCR en el estadio T_{is}-3; N0;
M0.
9. El uso de la proteína MASP como molécula
marcadora para cáncer colorrectal en combinación con otra molécula
marcadora para cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer
colorrectal a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
10. Un equipo inmunológico que incluya al menos
un agente de unión específico para MASP y reactivos auxiliares para
la medida de MASP.
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