ES2627061T3

ES2627061T3 - Folato receptor alfa como diagnóstico y pronóstico para el folato marcador receptor de los cánceres expresores de alfa

Info

Publication number: ES2627061T3
Application number: ES11785862.1T
Authority: ES
Inventors: Daniel J. O'shannessy; Luigi Grasso; Shanhong Wan; Qimin Chao; Elizabeth Brooke Somers
Original assignee: Morphotek Inc
Current assignee: Morphotek Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: RU2017129266A; AU2016203408A1; KR20180137587A; SG10201701933XA; JP2013544354A; SG189957A1; KR102057438B1; WO2012061759A2; BR112013011072A2; EP2635304A2; AU2011323124A1; RU2017129266A3; IL260590B; CA2816991C; SG10201509145XA; JP6224456B2; IL225871A0; KR20140024838A; CN103687618A; MX2013005067A

Abstract

Un método de evaluación de si un sujeto está afectado con una Cáncer que expresa FRα , comprendiendo el método la determinación del nivel de receptor de folato alfa (Frα) que no está unido a una célula, en una muestra de orina derivada de dicho sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Frα) que no está unido a una célula con el nivel de FRα en una muestra de control, en la que una diferencia entre el nivel de FRα en la muestra de orina derivada de dicho sujeto y el nivel de FRα en la muestra de control es una indicación de que el sujeto está afectado con un cáncer que expresa FRα ; en el que el nivel de FRα que no está unido a una célula en la muestra de orina derivada de dicho sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRα .

Description

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folato receptor alfa como diagnostico y pronostico para el folato marcador receptor de los canceres expresores de alfa

Descripcion

APLICACIONES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentacion de la solicitud provisional de EE.UU. N° 61/410.497, presentada el 5 de noviembre de 2010 y la solicitud provisional US n° 61/508.444, presentada el 15 de julio, 2011.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] En los seres humanos, el receptor de alta afinidad para el folato viene en tres isoformas: alfa, beta y gamma. Las formas alfa y beta son tipicamente unidas a las membranas de las celulas por un anclaje de fosfatidilinositol de glicosilo (GPI). Reciclan entre compartimentos extracelulares y endocfticos y son capaces de transportar el folato dentro de la celula. Las formas solubles de FRa se pueden derivar por la accion de proteasas o fosfolipasa en los receptores de folato anclados a membranas.

[0003] Receptor de folato alfa (tambien referido como FRa , FR-alfa, FOLR1 o FOLR1) se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, incluyendo los del plexo coroideo, pulmon, tiroides, rinon, utero, mama, trompa de Falopio, epididimis, y las glandulas salivales. Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401-(1992); Weitman S.D. et al., Cancer Res 52: 6708-6711. La sobreexpresion de FRa se ha observado en varios tipos de cancer, incluyendo el cancer de pulmon (por ejemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores de carcinoides, y cancer de pulmon de celulas no pequenas, tales como adenocarcinomas); mesotelioma; cancer de ovarios; cancer renal; cancer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplasico, cerebelosa astrocitoma pilocftico juvenil, y las metastasis cerebrales); cancer de cuello uterino; cancer nasofarmgeo; tumor derivado mesodermalmente; carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello; cancer endometrial; adenocarcinomas endometrioides del ovario, cistoadenocarcinomas serosos, cancer de mama; cancer de vejiga; cancer de pancreas; cancer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); cancer de pituitaria (por ejemplo, adenomas de la pituitaria); cancer colorrectal y cancer medular de tiroides. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 7.754.698; Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 12-1 -(2): 225-233-(2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Fisher R.E. J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95-(1994); Hartman LC et al. Int J Cancer 12 1: 938-942-(2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15-(3): 889-899; Parker N. et al. Analytical Biochemistry, 338: 284-293- (2005); Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401-(1992); Saba NF et al. Head Neck, 31-(4): 475- 481-(2009); Yang R+ y col. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). En algunos tipos de canceres (por ejemplo., Carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello), un mayor nivel de expresion FRa esta asociado con un peor pronostico, mientras que en otros tipos de canceres (por ejemplo., cancer de pulmon de celulas no pequenas), un mayor nivel de expresion FRa se asocia con un mejor pronostico. Vease, por ejemplo, Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15-(3): 889-899; Saba Nf et al. Head Neck, 31-(4): 475-481-(2009).

[0004] Mantovani et al. 1994 evalua la distribucion del receptor de folato alfa en fluidos biologicos, concluyendo en ultima instancia que no hay diferencia estadfsticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa en la orina de sujetos con cancer de ovario en comparacion con el de sujetos sanos.

[0005] La deteccion temprana del cancer mejora las velocidades de supervivencia y calidad de vida. Para mejorar la probabilidad de deteccion y tratamiento tempranos, existe una necesidad apremiante para los metodos no invasivos para el diagnostico de cancer, para la determinacion del nivel de riesgo de desarrollar cancer, y para predecir la progresion del cancer. La presente invencion satisface estas necesidades de canceres de expresion de FRa.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0006] La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier objeto identificado en la solicitud como "invencion", "realizacion", "aspecto", etc., que excede el alcance de la invencion tal como se representa mediante las reivindicaciones, no forma parte de la invencion reivindicada, sino que solo sirve como informacion de fondo para comprender mejor la invencion.

[0007] La presente invencion proporciona metodos de evaluacion de si un sujeto esta afectado con canceres FRa que expresan como el pulmon o el cancer de ovario, metodos de evaluacion de la progresion de la Canceres que expresan FRa como el de cancer de pulmon o de ovario en un sujeto

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aquejado de canceres que expresan FRa, los metodos de la estratificacion de un sujeto con cancer de expresion de FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cancer, los metodos de evaluacion de la eficacia del tratamiento MORAB-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon y kits para evaluar si una sujeto esta afectado con canceres FRa que expresan tales como cancer de pulmon o de ovario o para evaluar la progresion de canceres que expresan FRa como el de cancer de pulmon o de ovario en un sujeto.

Metodos para evaluar si un sujeto esta afectado por un cancer que express FRa

[0008] En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado con una FRa que expresan el cancer, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto sufre de un cancer que expresa FRa; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que une FRa. En una realizacion particular, la muestra es orina, suero, plasma o ascitis.

[0009] En otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a un metodo de evaluacion de si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula de una muestra de orina derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa. En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de suero derivada Del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa.

[0010] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, el Cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer de cerebro, cancer cervical, cancer nasofaringeal, Carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer de endometrio, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de pituitaria, cancer colorrectal y cancer medular de tiroides. En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon no microcftico, tal como un adenocarcinoma.

[0011] En otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a metodos para evaluar si un sujeto padece cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, donde la presencia de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0012] En varios aspectos de los aspectos anteriores de la invencion, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente

10.000 pg/ml, de aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, aproximadamente

14.000 pg/ml, aproximadamente 15.000 pg/ml, aproximadamente 16.000 pg/ml, aproximadamente

17.000 pg/ml, aproximadamente 18.000 pg/ml, aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente

20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto padece cancer de ovario.

[0013] En varios aspectos, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epttopo que el anticuerpo MORAB-003;

(b) un anticuerpo que comprende la SEQ iD nO:-1 (GF TFsGyGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epttopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

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(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 55 (GYfMn) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(m) un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 39 (HPYM-H+) como CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 41-(EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 35-(RASESVDTYGNNFIH) SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende SEQ ID nO: 31 (SGYyWn) como CDRH1, SEQ ID NO: 32- (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRHH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(s) un anticuerpo que comprende SEQ ID No: 47 (SYaMs) como CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 45- (QHFSKLPWT) como CDRL3;

(t) el anticuerpo 24F12;

(u) un anticuerpo que comprende una cadena ligera de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); Y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

(v) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); Y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);

(w) un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

(x) un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); y

(y) un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0014] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAB- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTFSgYgLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); Y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); Y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la region variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la cadena pesada de la region variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y el cha luz en la region variable de LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); O la region variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0015] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y MORAB marcado -003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 24F12 marcado; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado sobre un soporte solido y anticuerpo 19D4 marcado; y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 26B3 marcado.

[0016] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanobody, y un dominio de anticuerpos. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo,

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con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en un marcador radio, un marcador biotina, un marcador cromoforo, un marcador fluoroforo o un marcador enzimatico.

[0017] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) Y ensayo ELISA.

[0018] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

[0019] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

[0020] En aun otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a un metodo de evaluacion de si un sujeto esta afectado por cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula i Nav muestra derivada Del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada del sujeto y En la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afligido con cancer de ovario; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua mediante contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado en un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAB-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 19D4 marcado, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 26B3 marcado. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Metodos de evaluacion de la progresion de un cancer que express FRa en un sujeto

[0021] En un aspecto adicional, la presente invencion esta dirigida a un metodo de evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa rapidamente; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa lentamente o retrocedera, evaluando de ese modo la progresion de la cancer que expresa FRa en el sujeto; en el que el nivel de FRa que no esta unido a una celula en la muestra derivada del sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. En una realizacion particular, la muestra es orina, suero, plasma o ascitis.

[0022] En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar el progreso de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparar el nivel de folato receptor alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en el muestra de orina derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa rapidamente; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa lentamente o retrocedera, evaluando de ese modo la progresion de la FRa que expresa cancer en el sujeto.

[0023] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona metodos de evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en la muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer avanza rapidamente; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa lentamente o retrocedera, evaluando de esta manera el progreso de la FRa que expresa cancer en el sujeto.

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[0024] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, el cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, el sujetador en el cancer, cancer cervical, cancer nasofaringeal, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer de endometrio, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de pituitaria, cancer colorrectal y cancer medular de tiroides. En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon no microdtico, tal como un adenocarcinoma.

[0025] En otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a metodos para evaluar si un sujeto padece de cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que la presencia de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0026] En varios aspectos de los aspectos anteriores de la invencion, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente

20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto padece cancer de ovario.

[0027] En varios aspectos, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAB-003;

(b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID nO: 1 (GF TFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende SEQ ID No: 55-(GYfMn) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51-(RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende SeQ ID nO: 31-(SGYyWn) como CDRH1, SEQ ID NO: 32- (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRHH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

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(x) un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID

NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); y

(y) un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID

NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEC ID N° 16).

[0028] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAB- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTFSgYgLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); Y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); Y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la region variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); o la region variable de cadena pesada LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0029] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAB- 003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 24F12 marcado; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado sobre un soporte solido y anticuerpo 19D4 marcado; y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y anticuerpo 26B3 marcado.

[0030] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanocuerpo, y un dominio de anticuerpos. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en un marcador radio, un marcador biotina, un marcador cromoforo, un marcador fluoroforo o un marcador enzimatico.

[0031] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, la inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) Y ensayo ELISA.

[0032] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano. En otra realizacion, la muestra de control es una muestra previamente obtenida del sujeto.

[0033] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

[0034] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona metodos de como evaluar la progresion del cancer de ovario en un sujeto que padece cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer de ovario progresara rapidamente; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer de ovario progresara lentamente o retrocedera, evaluando con ello la progresion de cancer de ovario cancer en el sujeto; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua mediante contacto de la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAB-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado en un soporte solido y etiquetado anticuerpo 19D4, y (d) anticuerpo 9F3 inmovilizado en un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

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Metodos de estratificar un cancer que express FRa en Grupos de terapia del cancer

[0035] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de estratificar un sujeto aquejado de un cancer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cancer mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no se une a una celula, en una muestra derivada del sujeto; y estratificar el sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cancer basado en el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula; en donde el nivel de FRa que no esta unido a una celula en la muestra derivada del sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, la muestra se selecciona del grupo que consiste en orina, suero, plasma o ascitis.

[0036] En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de estratificar un sujeto aquejado de un cancer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cancer mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no es unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto; y estratificar el sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cancer basado en el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra. En un aspecto adicional, la presente invencion se dirige a metodos de estratificacion de un sujeto aquejado de FRa que expresa cancer en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cancer mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (FRa ) que no esta unido a una celula en una muestra de suero derivada del sujeto; y estratificar el sujeto en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cancer basado en el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de suero.

[0037] En diversas realizaciones de los anteriores aspectos de la invencion, el cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer cerebral, cancer cervical, cancer de nasofaringeal, carcinoma celular escamoso de la cabeza y cuello, cancer endometrial, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer pancreatica, cancer del hueso, cancer pituitario, colorrectal cancer y cancer medular tiroideo. En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el FRa que expresa cancer es el cancer de pulmon no microcftico, tal como un adenocarcinoma.

[0038] En otro aspecto, la presente invencion se dirige a metodos para evaluar si un sujeto esta afectado por cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, en donde la presencia de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto padece de cancer de ovario.

[0039] En varios aspectos de los aspectos anteriores de la invencion, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente

10.000 pg/ml, de aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, de aproximadamente 13.000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, de aproximadamente 15.000 pg/ml, de aproximadamente 16.000 pg/ml, de aproximadamente 17.000 pg/ml, de aproximadamente 18.000 pg/ml, de aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0040] En varios aspectos, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAB-003;

(b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID nO: 1 (GFT FSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2

(MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ

ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO:

6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548.908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548.908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 55-(GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56

(RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID

NO: 51-(RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53

(QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

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(m) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 39 (HPYM-H+) como CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 41-(EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 35-(RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epttopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende la sEq ID NO: 31-(SGYyWn) como CDRH1, SEQ ID NO: 32- (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRHH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epttopo que el anticuerpo 24F12;

(s) un anticuerpo que comprende la SeQ ID NO: 47 (SyAmS) como CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 45-(QHFSKLPWT) como CDRL3;

(t) el anticuerpo 24F12;

(u) un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

(v) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);

(w) un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

(x) un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); y

(y) un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0041] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAB- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SEQ ID NO: 1 (GFTFSgYgLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la cadena pesada de la region variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la cadena ligera de region variable LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); o la cadena pesada de la region variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0042] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAB- 003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 de anticuerpo;

(c)anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4; y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizadodo a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3.

[0043] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanoanticuerpo, y un anticuerpo de dominio. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de una etiqueta radiactivo, una etiqueta de biotina, una etiqueta cromoforo, una etiqueta fluoroforo, o una etiqueta de enzima.

[0044] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, la inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y el ensayo ELISA.

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[0045] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

[0046] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

[0047] En una realizacion particular, el sujeto es estratificado en la etapa I, etapa II, etapa III o cancer de ovario en etapa IV.

[0048] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de estratificar un sujeto de cancer ovario en uno de al menos cuatro grupos de terapia del cancer por determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; y estratificar el sujeto en uno de al menos cuatro de terapia del cancer de grupos basados en el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua mediante contacto de la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAB-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 24F12, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 19D4, y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

Metodos de monitorizar la eficacia de tratamiento MORAb-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon

[0049] En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de monitorizacion de la eficacia de tratamiento MORAb-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon en un sujeto que padece de cancer de ovario o cancer de pulmon, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra derivada del sujeto, donde al sujeto ha sido previamente administrada MORAb-003; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 es eficaz. En realizaciones particulares, el nivel de FRa que no esta unido a una celula en la muestra derivada del sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

[0050] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de monitorizacion de la eficacia del tratamiento MORAb-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon en un sujeto que padece de cancer de ovario o cancer de pulmon, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que al sujeto ha sido previamente administrada MORAb-003; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de orina derivado de la materia con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 es eficaz.

[0051] En aun otro aspecto, la presente invencion esta dirigida a un metodo de monitorizacion de la eficacia del tratamiento MORAb-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon en un sujeto que padece de cancer de ovario o cancer de pulmon, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de suero derivada del sujeto, en el que al sujeto ha sido previamente administrada MORAb-003; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en el muestra de suero derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminucion en el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 es eficaz.

[0052] En varios aspectos, el nivel de FRa se determina por el contacto de la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epttopo que el anticuerpo MORAb-003;

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(b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOVl8;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548.908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548.908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 55-(GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51-(RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(p) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 31 (SGYyWn) como CDRH1, SEQ ID NO: 32- (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRHH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

[0053] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la cadena pesada de la region variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la cadena pesada de la region variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKP W, Y (SEQ ID NO: 16); o la cadena pesada de la region variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0054] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que

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consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAb- 003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 de anticuerpo; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4; y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3.

[0055] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un humano anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanoanticuerpo, y un anticuerpo de dominio. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, un marcador de biotina, una etiqueta cromoforo, un marcador fluoroforo, o una etiqueta de enzima.

[0056] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, la inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y el ensayo de ELISA.

[0057] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano. En otra realizacion, la muestra de control es una muestra previamente obtenida a partir de la materia.

[0058] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

Metodos de prediction de si un sujeto respondera a tratamiento MORAb-003

[0059] En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un sujeto que

padece de un cancer que expresa FRa, como el cancer de ovario o cancer de pulmon, respondera al

tratamiento con MORAb-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003.

[0060] En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un sujeto que

padece de cancer que expresa FRa, como el cancer de ovario o cancer de pulmon, respondera al

tratamiento con MORAb-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparar el nivel o receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003.

[0061] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un sujeto que padece de un cancer que expresa FRa, como cancer de ovario o cancer de pulmon, respondera al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta vinculado a una celula en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es un indicio de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003.

[0062] En realizaciones adicionales, el cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer cerebral, cancer de cuello uterino, cancer asofaringeo, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer endometrial, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de hipofisis, cancer colorrectal y cancer de tiroides medular. En una realizacion particular, el Cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el cancer que expresa FRa de pulmon es el cancer de pulmon de celulas no pequenas, tales como adenocarcinoma.

[0063] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona metodos para predecir si un sujeto que padece cancer de ovario respondera al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a celulas en una muestra de orina derivada

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del sujeto, en el que la presencia de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-0o3.

[0064] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente

10.000 pg/ml, de aproximadamente 11.000 pg/ml, aproximadamente 12.000 pg/ml, de aproximadamente 13.000 pg/ml, de aproximadamente 14.000 pg/ml, de aproximadamente 15.000 pg/ml, de aproximadamente 16.000 pg/ml, de aproximadamente 17.000 pg/ml, de aproximadamente

18.000 pg/ml, de aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0065] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 55 (GyFmN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51-(RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

[0066] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SeQ ID NO: 1 (GFTfSgYGlS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3,

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SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la cadena pesada de la region variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la cadena ligera de la region variable LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); o la cadena pesada de la region variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0067] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada f rom dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAb- 003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 de anticuerpo; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4; y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3.

[0068] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un humano anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanoanticuerpo, y un anticuerpo de dominio. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, un marcador de biotina, una etiqueta cromoforo, un marcador fluoroforo, o una etiqueta de enzima.

[0069] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, la inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, electroquimioluminiscencia inmunoensayo (ECLIA) y el ensayo de ELISA.

[0070] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

[0071] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

[0072] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un sujeto que padece de un cancer que expresa FRa, como el cancer de ovario o cancer de pulmon, respondera al tratamiento con MOR Ab-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada del sujeto y en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada de la materia se evalua poniendo en contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 anticuerpo, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4, y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizadodo a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

[0073] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la MORAb-003 para el tratamiento es (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8; (b) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003; o (c) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (gFtFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GT- SNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

Metodos de tratamiento de un sujeto que tiene cancer de ovario o cancer de pulmon

[0074] En otro aspecto, la presente invencion proporciona metodos de tratamiento de un sujeto que tiene cancer de ovario o cancer de pulmon mediante la determinacion del nivel de receptor de folato

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alfa (Fra), que esta no unido a una celula, en una muestra derivada de dicho sujeto (por ejemplo, orina, suero, plasma o ascitis); y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario o cancer de pulmon; y administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

[0075] En otro aspecto, la presente invencion proporciona metodos de tratamiento de un sujeto que tiene cancer de ovario o cancer de pulmon mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra de orina derivada de dicho sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivado de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario o cancer de pulmon; y administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de MORAb- 003 a dicho sujeto.

[0076] En otro aspecto, la presente invencion proporciona metodos de tratamiento de un sujeto que tiene cancer de ovario o cancer de pulmon mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra de suero derivadas de dicho sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero e derivado de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario o cancer de pulmon; y administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

[0077] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona metodos para tratar un sujeto que padece cancer de ovario mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, en donde la presencia de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003; y administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de MORAb-003 a dicho sujeto.

[0078] En realizaciones particulares, el nivel de FRa que no esta unido a una celula en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa.

[0079] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente

13.000 pg/ml, de aproximadamente 14.000 pg/ml, de aproximadamente 15.000 pg/ml, de aproximadamente 16.000 pg/ml, de aproximadamente 17.000 pg/ml, de aproximadamente 18.000 pg/ml, de aproximadamente 19.000 pg/ml, o aproximadamente 20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0080] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, el nivel de FRa se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Por ejemplo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(j) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 55 (GyFmN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHh2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

(k) el anticuerpo 26B3;

(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(m) un anticuerpo que comprende la SeQ ID NO: 39 (HPYM-H+) como CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRHh2, SEQ ID NO: 41-(EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID

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NO: 35-(RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

[0081] En una realizacion particular, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb- 003. En otra realizacion, el anticuerpo incluye SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En otra realizacion, el anticuerpo es el anticuerpo MOV18. En aun otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18. En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente o en combinacion, el anticuerpo incluye una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye (i) la region de cadena pesada variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, y (SEQ ID NO: 16); la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la cadena ligera de la region variable LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); o la cadena pesada de la region variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).

[0082] En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en (a) anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo MORAb- 003; (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 de anticuerpo; (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4; y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado anticuerpo 26B3.

[0083] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanoanticuerpo, y un anticuerpo de dominio. Alternativamente, o en combinacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, un marcador de biotina, una etiqueta cromoforo, un marcador fluoroforo, o una etiqueta de enzima.

[0084] En ciertas realizaciones, el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, dialisis de equilibrio, la inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y el ensayo de ELISA.

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[0085] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la muestra de control es un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.

[0086] En ciertas realizaciones, la muestra se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente o en combinacion, la muestra se diluye antes de determinar el nivel de FRa en la muestra. Alternativamente, o en combinacion, la muestra se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra.

[0087] En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para tratar a un sujeto que padece de cancer de ovario o cancer de pulmon, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (FRa) que no esta unido a una celula en la muestra con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles de FRa en la muestra derivada de la subj ect y en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003; en el que el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua mediante contacto la muestra con (a) anticuerpo MOV18 inmovilizada a un solido su pport y etiquetado anticuerpo MORAb-003, (b) anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y etiquetado 24F12 de anticuerpo, (c) anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el marcado anticuerpo 19D4, y (d) el anticuerpo 9F3 inmovilizadodo a un soporte solido y etiquetados anticuerpo 26B3. Por ejemplo, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis.

[0088] En diversas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, la MORAb-003 para el tratamiento es (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8; (b) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003; o (c) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (gFtFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GT- SNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

Kits de la invencion

[0089] En un aspecto, la presente invencion proporciona un kit para la evaluacion de si un sujeto padece de un cancer que expresa FRa o para la evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto, el kit incluye medios para determinar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada del sujeto; e instrucciones para uso del kit para evaluar si el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa o para evaluar la progresion de un cancer que expresa FRa. Por ejemplo, el FRa que expresa cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer cerebral, cancer cervical, cancer de la nasofaringe, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer de endometrio, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de hipofisis, cancer colorrectal y cancer de tiroides medular. En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En aun otra realizacion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon de celulas no pequenas, por ejemplo, adenocarcinoma. En una realizacion adicional, la muestra es o bien orina, suero, plasma o ascitis.

[0090] En otra realizacion, los medios incluyen un agente de union de receptor de folato alfa (Fra), por ejemplo, un anticuerpo. En una realizacion adicional, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en

(a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003;

(b) una anticuerpo que comprende la sEq ID NO: 1 (GFTFsGyGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

(c) el anticuerpo MOV18;

(d) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

(e) el anticuerpo 548.908;

(f) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548.908;

(g) el anticuerpo 6D398;

(h) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

(i) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

(k) el anticuerpo 26B3;

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(l) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

(n) el anticuerpo 19D4;

(o) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

(q) el anticuerpo 9F3;

(r) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

(t) el anticuerpo 24F12;

[0091] En ciertas realizaciones, el anticuerpo esta marcado, incluyendo, pero no limitado a, un marcador radiactivo, un marcador de biotina, una etiqueta de cromoforo, un marcador fluoroforo, o una etiqueta de enzima.

[0092] En aun otra realizacion, el kit incluye un medio para obtener una muestra del sujeto.

[0093] La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante la siguiente descripcion detallada y los dibujos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0094]

La Figura 1 es una representacion esquematica de un metodo de inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) para evaluar la FRa en la orina como se describe en los Ejemplos. El anticuerpo MOV18 unido a soportes solidos unidos FRa en la orina. La FRa se detecto posteriormente por union a anticuerpo MORAb-003 marcado con Ru.

La Figura 2 muestra la distribucion de niveles de FRa en la orina de sujetos con cancer ovarico y sujetos de control normales, medidos por ECLIA (vease el Ejemplo 1).

La Figura 3 representa la deteccion de FRa en la orina de pacientes con cancer de ovario (banda palida en el carril 1, banda clara en el carril 2) usando inmunotransferencia (vease el Ejemplo 5).

La Figura 4 muestra la distribucion de niveles de FRa en la orina de los sujetos con cancer de ovario y los sujetos de control normales, medidos por ECLIA despues de tratarse la orina con guanidina, tal como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 5 representa una curva ROC que muestra la sensibilidad y especificidad de la medicion ECLIA de niveles FRa en orina despues de que la orina se trato con guanidina, tal como se describe en el Ejemplo 7. El area bajo la curva (AUC) mide la exactitud de la prueba en separacion de cancer de ovario de los sujetos control. Un valor de corte (por encima del que se considero los resultados de la prueba anormales) de 9100 pg/mL.

La Figura 6 muestra la distribucion de niveles FRa en cancer de ovario (OC) y sujetos de control normales despues de la correccion de niveles de creatinina. Hay una diferencia estadfsticamente significativa entre los pacientes de cancer de ovario y los controles en los niveles de creatinina corregidos de FRa (p=0,007)-(vease el Ejemplo 8).

La Figura 7 representa un analisis ROC de niveles FRa corregidos por creatinina determinados usando ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) de muestras de orina tratadas con guanidina (vease el Ejemplo 8).

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La Figura 8 es una representacion esquematica del metodo de inmunoensayo enzimatico (EIA) utilizado para evaluar el nivel de FRa (es decir, FRa) en muestras, como se describe en el Ejemplo 9. MOV-18 sirvio como el anticuerpo de captura, que se unio FRa a partir de fluidos biologicos. La FRa se detecto mediante la union a MORAb-003 biotinilado, que fue detectada usando avidina conjugada con peroxidasa de rabano picante (avidina-HRP).

La Figura 9 representa los resultados obtenidos para la medicion de FRa en suero utilizando de uno y de dos pasos de incubacion procedimientos, como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 10 es una representacion esquematica de las tres combinaciones diferentes de anticuerpos de captura y de detector que se utilizaron con el metodo de inmunoensayo (EIA) para evaluar el nivel de FRa en el plasma humano, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 11 muestra las concentraciones plasmaticas de FRa (pg/ml) para los sujetos individuales se determinaron utilizando EIA con tres combinaciones de anticuerpos de captura y el detector, como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 12 representa la relacion entre los valores de DO y FRa concentraciones (vease el Ejemplo 11).

La Figura 13 muestra la distribucion de concentraciones de plasma FRa en sujetos con cancer de ovario y los sujetos de control normales determinados mediante EIA (vease el Ejemplo 12).

La Figura 14 representa la correlacion entre concentraciones plasmaticas FRa determinadas utilizando EIA y ECLIA (vease el Ejemplo 12).

La Figura 15 muestra las correlaciones entre las medidas ECLIA de niveles FRa en suero y orina. La correlacion para pacientes con cancer era de r=0,24 (panel superior) y la correlacion para los pacientes con cancer de ovario era de r=-0,76 (panel inferior) (vease el Ejemplo 13).

La Figura 16 muestra la correlacion de suero frente a niveles de plasma FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 (vease el Ejemplo 16).

La Figura 17 muestra la correlacion de suero frente a niveles de plasma FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 2 (vease el Ejemplo 16).

La Figura 18 muestra la correlacion de niveles suero FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente a par 2 (vease el Ejemplo 16).

La Figura 19 muestra la correlacion de niveles de plasma FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 1 frente a par 2 (vease el Ejemplo 16).

La Figura 20 muestra la correlacion intradfa de niveles suero FRa para los ensayos llevados a cabo usando el par 2 (Ejemplo 16).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0095] La presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el receptor de folato alfa (Fra), no unido a una celula, se encuentra en niveles elevados en los fluidos corporales, por ejemplo, orina o suero, de un sujeto que tiene un cancer que expresa FRa tal como de cancer de pulmon o de ovario en comparacion con una muestra de control. Ademas, la presente invencion se basa, al menos en parte, en la identificacion de un ensayo inmunologico que exhibe la sensibilidad necesaria para la evaluacion de niveles FRa en muestras, habiendose fallido repetidamente con caracter anterior. Como resultado, la presente invencion proporciona metodos para diagnosticar un cancer que expresa FRa mediante la evaluacion de los niveles de una FRa no unido a una celula en muestras derivadas del sujeto. De hecho, la presente invencion supera los retos observados durante los intentos previos para desarrollar un ensayo de diagnostico a base de FRa para canceres que expresan FRa tales como el cancer de ovario, proporcionando un ensayo inmunologico capaz de evaluar con precision los niveles de FRa no unidos a una de las celulas en las muestras.

[0096] Por consiguiente, se proporcionan los metodos y kits para evaluar si un sujeto tiene o esta en riesgo de desarrollar un cancer que expresa FRa y, ademas, para evaluar la progresion de la FRa que expresa cancer. En diversas realizaciones, los metodos implican ° comparacion e de niveles de FRa no unido a una celula en muestras, por ejemplo, orina y suero, en comparacion con los niveles de control, en la evaluacion de la presencia, el grado o el riesgo de desarrollo de cancer de ovario en el sujeto. En realizaciones particulares, los metodos implican el uso del anticuerpo MORAb-003, los anticuerpos que se unen al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003 o anticuerpos que tienen SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3, en la evaluacion de los niveles de FRa no unidos a una celula en una muestra, por ejemplo., orina o suero. Alternativamente, o ademas, el anticuerpo MOV18 o un anticuerpo que se une al mismo epftopo del anticuerpo MOV18, el anticuerpo 548.908, un anticuerpo que se une al mismo epftopo del anticuerpo 548.908, el anticuerpo 6D398 o un anticuerpo que se une al mismo epftopo de la 548908 anticuerpo puede utilizarse de acuerdo con los metodos de la presente invencion.

[0097] Se describen varios aspectos de la invencion con mas detalle en las siguientes subsecciones:

I. Definiciones

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[0098] Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes terminos tiene el significado asociado en esta seccion.

[0099] Los artmulos "un" y "una" se usa aqrn para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o mas de un elemento.

[0100] Tal como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a animales no humanos y humanos, incluyendo sujetos veterinarios. El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo., Mairnferos y no marnfferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perro, gato, caballo, vaca, pollos, anfibios, y reptiles. En una realizacion preferida, el sujeto es un humano.

[0101] Los terminos "cancer" o "tumor" son bien conocidos en la tecnica y se refieren a la presencia, por ejemplo, en un sujeto, de celulas que poseen caractensticas tfpicas de celulas causantes de cancer, tales como la proliferacion incontrolada, inmortalidad, potencial metastasico, rapido crecimiento y velocidad de proliferacion, y ciertas caractensticas morfologicas caractensticas. Las celulas cancerosas son a menudo en la forma de un tumor, pero dichas celulas pueden existir solas dentro de un sujeto, o pueden ser celulas cancerosas no tumorigenicas, tales como celulas de leucemia. Tal como se utiliza aqrn, el termino "cancer" incluye los canceres pre-malignos, asf como canceres malignos.

[0102] Tal como se usa en este documento, un "cancer que expresa FRa" incluye cualquier tipo de cancer caracterizado porque las celulas cancerosas expresan FRa. En realizaciones concretas, el cancer que expresa FRa incluye condiciones cancerosas, caracterizadas porque las celulas cancerosas son capaces de secretar, derramar, exportar o liberar FRa de tal manera que niveles elevados de FRa son detectables en una biologica del sujeto. Canceres que expresan FRa incluyen, pero no se limitan a, cancer de pulmon (por ejemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinoides, y cancer de pulmon de celulas no pequenas, tales como adenocarcinomas); mesotelioma; cancer de ovarios; cancer renal; cancer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplasico y cerebelosa astrocitoma pilocftica juvenil); cancer de cuello uterino; cancer de la nasofaringe; tumor derivado de mesodermo; carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello; cancer endometrial; adenocarcinomas de endometrio del ovario, cistadenocarcinomas serosos, cancer de mama; cancer de vejiga; cancer de pancreas; cancer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); cancer de pituitaria (por ejemplo, adenoma de la pituitaria). Vease por ejemplo, Patente de EE.UU. N° 7.754.698; Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J de Cirugfa Toracica y Cardiovascular, 12-1 -(2): 225-233-(2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Franklin, W.A. et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95-(1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942-(2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15-(3): 889-899; Weitman, S.D. et al. Cancer Res 52: 3396 a 3.401-(1992); Saba NF et al. Head Neck, 31-(4): 475-481-(2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon tal como cancer de pulmon de celulas no pequenas. En otras realizaciones, el cancer que expresa FRa es cancer colorrectal y cancer de tiroides medular.

[0103] Tal como se usa en la presente memoria, un sujeto que "padece de un cancer que expresa FRa" es uno que esta clmicamente diagnosticado con un cancer tal por un medico cualificado (por ejemplo, por los metodos de la presente invencion), o uno que exhibe uno o mas signos o smtomas (por ejemplo, niveles elevados de FRa en fluidos biologicos) de un cancer, y posteriormente clmicamente diagnosticado con un cancer tal por un medico cualificado (por ejemplo, por los metodos de la presente invencion). Un sujeto no humano que sirve como un modelo animal de FRa que expresa cancer tambien puede caer dentro del alcance de la expresion de un sujeto "que padece de un cancer que expresa FRa".

[0104] El termino "cancer de ovario" se refiere a la enfermedad reconocida en la tecnica e incluye cada uno de cancer de ovario epitelial (EOC; >90% de cancer de ovario en los pafses occidentales), tumores de celulas germinales (circa 2-3% de cancer de ovario), y el cancer de ovario del estroma. El cancer de ovario se estratifica en diferentes grupos basados en la diferenciacion del tejido tumoral. En el grado I, el tejido tumoral es bien diferenciado. En el grado II, el tejido tumoral esta moderadamente bien diferenciado. En el grado III, el tejido tumoral es pobremente diferenciado. Este grado se correlaciona con un pronostico menos favorable que los grados I y II.

[0105] El cancer de ovario se estratifico en diferentes etapas en base a la propagacion del cancer. La etapa I se limita generalmente dentro de la capsula que rodea uno (etapa 1A) o ambos (ovarios 1B) ovarios, aunque en algunos canceres de etapa I (es decir, etapa CI), las celulas malignas pueden ser detectadas en la ascitis, en el lfquido de enjuague peritoneal, o en la superficie de los ovarios. La etapa

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II implica la extension o metastasis del tumor a partir de uno o ambos ovarios a otras estructuras pelvicas. En la etapa IIA, el tumor se extiende o se ha hecho metastasis al utero, las trompas de Falopio, o ambos. La etapa IIB implica extension del tumor a la pelvis. La etapa IIC es la etapa iIa o IIB en la que las celulas malignas pueden ser detectadas en la ascitis, en el lfquido de enjuague peritoneal,

0 en la superficie de los ovarios. En la etapa III, el tumor comprende al menos una extension maligna al intestino delgado o el epiplon, se ha formado implantes peritoneales extrapelvicos de tamano microscopico (etapa IIIA) o macroscopico (<2 cm de diametro, etapa IIIB;> 2 cm de diametro, etapa

1 IIC), o se ha metastatizado a un ganglio linfatico inguinal o retroperitoneal (un indicador alternativo de la etapa IIIC). En la etapa IV, metastasis distante (es decir, no-peritoneal) del tumor puede detectarse.

[0106] Las duraciones de las diversas etapas del cancer de ovario no se conocen actualmente, pero se cree que son al menos aproximadamente un ano cada uno (Richart et al., 1969, Am J. Obstet Gynecol 105: 386). El pronostico disminuye con designacion de etapa incremental. Por ejemplo, las velocidades de supervivencia a 5 anos para sujetos humanos diagnosticados con etapa I, II, III, y cancer de ovario IV son 80%, 57%, 25% y 8%, respectivamente.

[0107] Cada uno de los tipos anteriores, los grupos y las etapas del cancer de ovario estan abarcados por el termino "cancer de ovario" como se usa en el presente documento.

[0108] Tal como se utiliza aqrn, el termino "cancer de pulmon" se refiere a una enfermedad en los tejidos del pulmon que implica un crecimiento celular incontrolado, que, en algunos casos, conduce a la metastasis. El cancer de pulmon es la causa mas comun de muerte por cancer en hombres y mujeres. La mayona de los canceres primarios de pulmon son carcinomas de pulmon, derivados a partir de celulas epiteliales. Los principales tipos de cancer de pulmon son el carcinoma de pulmon de celulas pequenas (SCLC) y carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC). En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es un cancer no microcftico de pulmon de celulas.

[0109] Celulas pequenas de cancer de pulmon o carcinoma de pulmon de celulas pequenas (SCLC) es un cancer maligno del pulmon, en el que las celulas cancerosas tienen una forma plana y citoplasma escaso; por lo tanto, SCLC es a veces llamado "carcinoma de celulas de avena." SCLC es generalmente mas metastasico de NSCLC y, a veces se ve en combinacion con carcinomas de celulas escamosas.

[0110] Tal como se utiliza aqrn, el termino "celulas no pequenas de cancer de pulmon", tambien conocido como carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), se refiere a cancer de pulmon epitelial distinto de carcinoma de pulmon de celulas pequenas (SCLC). Hay tres subtipos principales: adenocarcinoma, carcinoma de pulmon de celulas escamosas y carcinoma de pulmon de celulas grandes. Otros tipos menos comunes de cancer de pulmon de celulas no pequenas incluyen pleomorfico, tumor carcinoide, carcinoma de glandula salival, y carcinoma no clasificado. Adenocarcinomas representan aproximadamente el 40% de los canceres de pulmon, y son el tipo mas comun de cancer de pulmon en personas que nunca han fumado. Carcinomas de celulas escamosas representan aproximadamente el 25% de los canceres de pulmon. El carcinoma de celulas escamosas del pulmon es mas comun en hombres que en mujeres y es aun mas altamente correlacionado con antecedentes de consumo de tabaco que son otros tipos de carcinoma de pulmon. Hay al menos cuatro variantes (papilar, de celulas pequenas, de celulas claras, y basaloide) de carcinoma de celulas escamosas de pulmon. Grandes carcinomas de pulmon de celulas son un grupo heterogeneo de neoplasmas malignos que se originan a partir de celulas epiteliales transformadas en el pulmon. Grandes carcinomas de pulmon de celulas son carcinomas que carecen de caractensticas microscopicas ligeras de carcinoma de celulas pequenas, carcinoma de celulas escamosas, o adenocarcinoma.

[0111] Los diferentes sistemas de clasificacion se utilizan para SCLC y NSCLC. SCLC se clasifica como enfermedad limitada al hemitorax ipsilateral o enfermedad tan extensa con metastasis mas alla de la hemitorax ipsilateral.

[0112] NSCLC puede clasificarse utilizando el sistema de estadificacion de tumor-nodos-metastasis (TNM). Vease Spira J & Ettinger, D.S. Multidisciplinary management of lung cancer, N Engl J Med, 350: 382 (2004) (en adelante Spira); Greene FL, Page DL, Fleming ID, Fritz AG, Balch CM, Haller DG, et al (eds). AJCC Cancer Staging Manual. 6a edicion. Nueva York: Springer-Verlag, 2002: 167-77 (en lo sucesivo Greene); Sobin LH, Wittekind CH (eds). Internacional Union Against Cancer. TNM classificacion of malignant tumors. 6a edicion. Nueva York: Wiley-Liss (2002) (en adelante Sobin). Ademas, NSCLC se trata tfpicamente de acuerdo con la etapa del cancer determinado por el siguiente esquema de clasificacion (vease http: //
www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-cell- lung/Patient/page2#Keypoint10).

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[0113] En la etapa oculta (escondida), las celulas cancerosas se encuentran en el esputo (moco expulsado de los pulmones), pero ningun tumor se puede encontrar en el pulmon mediante formacion de imagenes o broncoscopia, o el tumor es demasiado pequeno para ser revisado.

[0114] En la etapa 0 (carcinoma in situ), se encuentran celulas anormales en el revestimiento de las vfas respiratorias. Estas celulas anormales se pueden volver cancerosas y diseminarse hasta el tejido cercano normal. la etapa 0 tambien se llama carcinoma in situ.

[0115] Etapa I, en la que se ha formado el cancer, se divide en las etaps IA y IB.

[0116] En la Etapa IA, el tumor es solo en el pulmon y es de 3 centimetres o menos.

[0117] En la Etapa IB, el cancer no se ha extendido a los ganglios linfaticos y uno o mas de lo siguiente es cierto: (i) El tumor es mayor de 3 centimetres, pero no mas de 5 centimetres; (ii) el cancer se ha diseminado al bronquio principal y es al menos 2 centimetres por debajo de donde la traquea se une con el bronquio; (iii) el cancer se ha extendido a la capa mas interna de la membrana que cubre el pulmon; (iv) una parte del pulmon se colapsa o neumonitis (inflamacion del pulmon) en el area donde la traquea se une con el bronquio.

[0118] En la Etapa IIA, el cancer se ha extendido a ciertos ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho que el tumor primario; el cancer es (a) de 5 cm o mas pequeno, (b) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (c) se ha extendido a la capa mas interna del revestimiento del pulmon. O, el cancer no se ha diseminado a los ganglios linfaticos; el cancer es (d) mayor de 5 cm, pero no de 7 cm, (e) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (f) se ha extendido a la capa mas interna del revestimiento del pulmon. Parte del pulmon puede haberse hundido o inflamado. La etapa IIA se divide en dos secciones, dependiendo del tamano del tumor, donde se encuentra el tumor, y si existe cancer en los ganglios linfaticos. En la primera seccion, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho como el tumor. Los ganglios linfaticos con cancer estan dentro del pulmon o cerca del bronquio. Ademas, uno o mas de lo siguiente es cierto: (i) el tumor es no mas de 5 centimetres, (ii) el cancer se ha diseminado al bronquio principal y es al menos 2 centimetres por debajo de donde la traquea se une con el bronquio, (iii) el cancer se ha extendido a la capa mas interna de la membrana que cubre el pulmon, (iv) una parte del pulmon se colapsa o desarrolla neumonitis (inflamacion del pulmon) en el area donde la traquea se une con el bronquio. En la segunda seccion, el cancer no se ha diseminado a los ganglios linfaticos y una o mas de las siguientes situaciones: (i) el tumor es mayor de 5 centimetres, pero no de 7 centimetres, (ii) el cancer se ha diseminado al bronquio principal y es al menos 2 centimetres por debajo de donde la traquea se une con el bronquio, (iii) el cancer se ha extendido a la capa mas interna de la membrana que cubre el pulmon, (iv) una parte del pulmon se colapsa o neumonitis (inflamacion del pulmon) en la zona donde la traquea se une con el bronquio.

[0119] En la Etapa IIB, el cancer se ha extendido a ciertos ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho que el tumor primario; el cancer es (a) mayor de 5 cm, pero no de 7 cm, (b) se ha extendido hasta el bronquio principal, y/o (c) se ha extendido a la capa mas interna del revestimiento del pulmon. Parte del pulmon puede haberse hundido o inflamado. Alternativamente, (d) el cancer es mayor de 7 cm; (e) se ha extendido hasta el bronquio principal, (f) el diafragma, (g) la pared toracica o el revestimiento de la pared toracica; y/o (h) se ha extendido a la membrana que rodea el corazon. Puede haber uno o mas tumores separados en el mismo lobulo del pulmon; cancer puede haberse diseminado en el nervio que controla el diafragma; todo el pulmon puede haberse hundido o inflamado. La etapa IIB se divide en dos secciones, dependiendo del tamano del tumor, donde se encuentra el tumor, y si existe cancer en los ganglios linfaticos. En la primera seccion, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos cercanos en el mismo lado del pecho como el tumor. Los ganglios linfaticos con cancer estan dentro del pulmon o cerca del bronquio. Ademas, uno o mas de lo siguiente es cierto: (i) el tumor es mayor de 5 centimetres, pero no de 7 centimetres, (ii) el cancer se ha diseminado al bronquio principal y es al menos 2 centimetres por debajo de donde la traquea se une a la bronquios, (iii) el cancer se ha extendido a la capa mas interna de la membrana que cubre el pulmon, (iv) una parte del pulmon se colapsa o neumonitis (inflamacion del pulmon) en el area donde la traquea se une con el bronquio. En la segunda seccion, el cancer no se ha diseminado a los ganglios linfaticos y una o mas de las siguientes situaciones: (i) el tumor es mayor que 7 centimetres, (ii) el cancer se ha diseminado al bronquio principal (y es menos de 2 centimetres por debajo de donde la traquea se une con el bronquio), la pared toracica, el diafragma, o el nervio que controla el diafragma, (iii) el cancer se ha extendido a la membrana que rodea el corazon o el revestimiento de la pared del pecho, (iv) todo el pulmon se colapsa o neumonitis desarrollado (inflamacion del pulmon), (v) hay uno o mas tumores separados en el mismo lobulo del pulmon.

[0120] Etapa IIIA se divide en tres secciones, dependiendo del tamano del tumor, donde se encuentra el tumor, y que los ganglios linfaticos tienen cancer (si existe). En la primera seccion de la Etapa IIIA, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho que el tumor. Los ganglios

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linfaticos con cancer estan cerca del esternon (hueso del pecho) o cuando el bronquio entra en el pulmon. Tambien, el tumor puede ser de cualquier tamano; parte del pulmon (donde la traquea se une con el bronquio) o todo el pulmon puede haber colapsado o neumonitis (inflamacion del pulmon); puede haber uno o mas tumores separados en el mismo lobulo del pulmon; y el cancer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, pero no el area donde la traquea se une con el bronquio, (ii) de la pared toracica, (iii) de diafragma y el nervio que lo controla, (iv) membrana alrededor del pulmon o el revestimiento de la pared del pecho, (iv) la membrana alrededor del corazon. En la segunda seccion de la Etapa IIIA, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho como el tumor. Los ganglios linfaticos con cancer estan dentro del pulmon o cerca del bronquio. Tambien, el tumor puede ser de cualquier tamano; todo el pulmon puede haber colapsado o neumonitis (inflamacion del pulmon); puede haber uno o mas tumores separados en cualquiera de los lobulos del pulmon con cancer; y el cancer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, pero no el area donde la traquea se une con el bronquio, (ii) de la pared toracica, (iii) de diafragma y el nervio que lo controla, (iv) membrana alrededor del pulmon o el revestimiento de la pared del pecho, (v) del corazon o de la membrana alrededor de ella, (vi) los vasos sangumeos principales que conducen a o desde el corazon, (vi) traquea, (vii) esofago, (viii) nervio que controla la laringe (caja de voz), (ix) esternon (hueso del pecho) o columna vertebral, (x) carina (donde la traquea se une con los bronquios). En la tercera seccion de la Etapa IIIA, el cancer no se ha diseminado a los ganglios linfaticos y el tumor puede ser de cualquier tamano, y el cancer se ha diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) el corazon, (ii) los principales vasos sangumeos que conducen hacia o desde el corazon, (iii) la traquea, (iv) el esofago, (v) el nervio que controla el laringe (caja de voz), (vi) el esternon (hueso del pecho) o la columna vertebral, (vi) carina (donde la traquea se une con los bronquios).

[0121] Etapa IIIB se divide en dos secciones, dependiendo del tamano del tumor, donde se encuentra el tumor, y que los ganglios linfaticos tienen cancer. En la primera seccion, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos encima de la clavmula o en los ganglios linfaticos en el lado opuesto del pecho que el tumor; el tumor puede ser de cualquier tamano; parte del pulmon (donde la traquea se une con el bronquio) o todo el pulmon puede haber colapsado o neumonitis (inflamacion del pulmon); puede haber uno o mas tumores separados en cualquiera de los lobulos del pulmon con cancer; y el cancer puede haberse diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) bronquio principal, (ii) de la pared toracica, (iii) de diafragma y el nervio que lo controla, (iv) la membrana alrededor del pulmon o el revestimiento de la pared del pecho, (iv) corazon o la membrana alrededor de el, (v) los vasos sangumeos principales que conducen a o desde el corazon, (vi) traquea, (vii) esofago, (viii) del nervio que controla el laringe (caja de voz), (ix) esternon (pecho hueso) o columna vertebral, (x) carina (donde la traquea se une con los bronquios). En la segunda seccion de la Etapa IIIB, el cancer se ha diseminado a los ganglios linfaticos en el mismo lado del pecho que el tumor; los ganglios linfaticos con cancer estan cerca del esternon (hueso del pecho) o cuando el bronquio entra en el pulmon; el tumor puede ser de cualquier tamano; puede haber tumores separados en diferentes lobulos del mismo pulmon; y el cancer se ha diseminado a cualquiera de los siguientes: (i) el corazon, (ii) los principales vasos sangumeos que van hacia o desde el corazon, (iii) la traquea, (iv) el esofago, (v) del nervio que controla la laringe (caja de la voz), (vi) esternon (hueso del pecho) o espina dorsal, (vii) carina (donde la traquea se une con los bronquios).

[0122] En la etapa IV, el tumor puede ser de cualquier tamano y el cancer puede haberse diseminado a los ganglios linfaticos. Uno o mas de los siguientes es cierto: hay uno o mas tumores en ambos pulmones; el cancer se encuentra en el lfquido alrededor de los pulmones o el corazon; el cancer se ha extendido a otras partes del cuerpo, como el cerebro, el tngado, las glandulas suprarrenales, los rinones, o el hueso.

[0123] Por consiguiente, en diversas realizaciones de la invencion anterior, el cancer de pulmon puede ser estratificado en cualquiera de las etapas anteriores (por ejemplo, oculto, la etapa 0, etapa IA, etapa IB, etapa IIA, etapa IIB, etapa IIIA, etapa IIIB o etapa IV) sobre la base de la evaluacion de los niveles de FRa no unidos a una celula, como una celula normal o cancerosa, en una muestra (por ejemplo, orina o suero) de un sujeto.

[0124] Tal como se utiliza aqrn, el termino "receptor de folato alfa" (tambien referido como FRa, FR-alfa, FOLR-1 o FOLR1) se refiere a la isoforma alfa del receptor de alta afinidad para el folato. FRa unida a la membrana esta unida a la superficie celular mediante un anclaje de glicosilo fosfatidilinositol (GPI)), se recicla entre los compartimentos extracelulares y endocfticos y es capaz de transportar folato en la celula. FRa se expresa en una variedad de tejidos epiteliales, incluyendo las del tracto reproductivo feminino, placenta, mama, tubulos proximales de rinon, el plexo coroideo, pulmon y glandulas salivales. Las formas solubles de FRa se pueden derivar por la accion de proteasas o fosfolipasa en los receptores de folato anclado a membrana.

[0125] El consenso de nucleotidos y secuencias de aminoacidos para FRa humanos se exponen en el presente documento como SEQ ID NOs: 24 y 25, respectivamente. Las variantes, por ejemplo,

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variantes alelicas naturales o secuencias que contienen al menos una sustitucion de aminoacidos, estan abarcadas por los terminos tal como se usa en el presente documento.

[0126] Tal como se utiliza aqrn, el termino "no unido a una celula" se refiere a FRa que no esta unido a la membrana celular de una celula, tal como una celula cancerosa. En una realizacion particular, el FRa no unido a una celula es no unido a cualquier celula y es libremente flotante o solubilizado en fluidos biologicos, por ejemplo, orina o suero. Por ejemplo, el FRa puede ser derramado, secretado o exportado de celulas normales o cancerosas, por ejemplo, a partir de la superficie de celulas cancerosas, en fluidos biologicos.

[0127] El "nivel" del receptor de folato alfa no unido a una celula, como se usa en el presente documento, se refiere al nivel de la protema del receptor de folato alfa como se determina usando cualquier metodo conocido en la tecnica para la medicion de los niveles de protema. Tales metodos incluyen, por ejemplo, electroforesis, electroforesis capilar, cromatograffa ffquida de alto rendimiento (HPLC), cromatograffa en capa fina (TLC), cromatograffa de hiperdifusion, reacciones de precipitina de fluido o gel, la espectroscopia de absorcion, a ensayos colorimetricos, ensayos espectrofotometricos, citometffa de flujo, inmunodifusion (simple o doble), ensayo de solucion de fasa, inmunoelectroforesis, transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia, y inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ejemplificado mas abajo), y similares. En una realizacion preferida, el nivel se determina usando tecnicas basadas en anticuerpos, como se describe en mas detalle en el presente documento.

[0128] En general, es preferible inmovilizar o bien un anticuerpo o protema de union espedfica para FRa no unido a una celula en un soporte solido para las transferencias Western y tecnicas de inmunofluorescencia. Soportes de fasa solida adecuados o vehmulos incluyen un apoyo capaz de unirse a un anffgeno o un anticuerpo. Los soportes o vehmulos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietiloeno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita.

[0129] Un experto en la tecnica conocera muchos otros vehmulos adecuados para el anticuerpo o la union al anffgeno, y sera capaz de adaptar tal soporte para uso con la presente invencion. Por ejemplo, la protema aislada de una muestra de sujeto (por ejemplo., Orina o suero) se pueden ejecutar en una electroforesis en gel de poliacrilamida y se inmovilizan sobre un soporte en fasa solida tal como nitrocelulosa. El soporte se puede lavar con tampones adecuados seguido por tratamiento con el anticuerpo marcado. El soporte de fasa solida se puede lavar con el tampon una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre el soporte solido puede detectarse entonces por medios convencionales. Los medios para detectar protemas usando tecnicas electroforeticas son bien conocidas por los expertos en la tecnica (vease, en general, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, NY; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., Nueva York).

[0130] Otros metodos estandar incluyen tecnicas de inmunoensayo que son bien conocidos para un experto normal en la tecnica y se pueden encontrar en Principios y Practica de Inmunoensayo, segunda edicion, Price y Newman, eds., MacMillan (1997) y anticuerpos, A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, cap. 9 (1988).

[0131] Los anticuerpos utilizados en inmunoensayos para determinar el nivel de expresion de receptor de folato alfa se pueden marcar con un marcador detectable. El termino "marcado", con respecto al agente o anticuerpo de union, se pretende que abarque el marcaje directo del agente o anticuerpo de union por acoplamiento (es decir, ffsicamente vincular) de una sustancia detectable al agente o anticuerpo de union, asf como el marcaje indirecto del agente de union o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esta marcado directamente. Un ejemplo de marcado indirecto incluye la deteccion de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. En una realizacion, el anticuerpo esta marcado, por ejemplo, radio-etiquetado, marcado con cromoforo, marcado con fluoroforo, o marcado con enzima. En otra realizacion, el anticuerpo es un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la protema o ligando de un par de protemas-ligando (por ejemplo, biotina-estreptavidina), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de cadena unica, un aislado contra dominio hipervariable del cuerpo) que se une espedficamente con FRa no unido a una celula.

[0132] En una realizacion de la invencion, los metodos proteomicos, por ejemplo., espectrometffa de masas, se utilizan. espectrometffa de masas es una tecnica analftica que consiste en compuestos qmmicos ionizantes para generar moleculas cargadas (o fragmentos del mismo) y la medicion de sus relaciones de masa a carga. En un procedimiento ffpico de espectrometffa de masas, se obtiene una muestra de un sujeto, se cargo en la espectrometffa de masas, y sus componentes (por ejemplo, FRa) se ionizan por diferentes metodos (por ejemplo, mediante el impacto con un haz de electrones), resultando en la formacion de parffculas cargadas (iones). La relacion de carga de masa de las

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partfculas se calcula entonces a partir del movimiento de los iones cuando se mueven a traves de campos electromagneticos.

[0133] Por ejemplo, espectrometna de masas de tiempo de vuelo asociada a la matriz de desorcion/ionizacion por laser (MALDI-TOF MS) o espectrometna de masas de tiempo de vuelo de desorcion/ionizacion de laser mejorada por superficie (SELDI-TOF MS), que implica la aplicacion de una muestra, tal como la orina o suero, a un chip de union a protemas (Wright, GL, Jr., et al (2002) Experto Rev Mol Diagn 2: 549; Li, J., et al (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al (2003) Dis Markers. 19: 229; Petricoin, EF, et al. (2002) 359: 572; Adam, BL, et al (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al (2004) Lab Invest. 84: 845; Xiao, Z., et al (2001) Cancer Res 61: 6029) se puede utilizar para determinar el nivel de FRa.

[0134] Por otra parte, tecnicas in vivo para la determinacion del nivel de FRa no unido a una celula incluyen introducir en un sujeto un marcado anticuerpo dirigido contra FRa, que se une a y transforma FRa en una molecula detectable. La presencia, nivel, o ubicacion de los FRa detectables no unidos a una celula en un sujeto pueden determinarse usando tecnicas de imagen estandar.

[0135] El termino "muestra" tal como se utiliza aqrn se refiere a una coleccion de fluidos similares, celulas, o tejidos aislados de un sujeto, asf como fluidos, celulas, o tejidos presentes dentro de un sujeto. En realizaciones preferidas, la muestra es un fluido biologico que contiene FRa no unidos a una celula cancerosa. Los fluidos biologicos son tipicamente lfquidos a temperaturas fisiologicas y pueden incluir fluidos de origen natural presentes en, retirados de, expresados o extraidos de otro modo desde una fuente de materia o biologica. Ciertos fluidos biologicos se derivan de determinados tejidos, organos o regiones localizadas y ciertos otros fluidos biologicos pueden ser mas globales o sistemicamente situados en un sujeto fuente o biologico. Los ejemplos de fluidos biologicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, lfquido cefalorraqrndeo, saliva, fluidos oculares, lfquido qrnstico, gotas de lagrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos secretores y organos, secreciones vaginales, fluidos ginecologicos, fluidos ascfticos, tales como los asociados con tumores no solidos, fluidos de la pleural, pericardico, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales, los fluidos recogidos por lavado bronquial y similares. En una realizacion particular, la muestra es orina o suero. En otra realizacion, la muestra no incluye ascitis o no es una muestra de ascitis. En otra realizacion, la muestra no incluye fluido peritoneal o no es fluido peritoneal.

[0136] En una realizacion, la muestra se retira del sujeto. En otra realizacion, la muestra esta presente dentro del sujeto. Los fluidos biologicos tambien pueden incluir soluciones hquidas en contacto con un sujeto o fuente biologica, por ejemplo, celula y organo medio de cultivo, incluyendo celulas o medio de organos acondicionados, fluidos de lavado y similares.

[0137] En algunas realizaciones, solo una parte de la muestra se somete a un ensayo para determinar el nivel de FRa no unido a una celula, o diversas partes de la muestra sometidas a diversos ensayos para determinar el nivel de FRa no unido a una celula. Ademas, en muchas realizaciones, la muestra puede ser pre-tratada por medios ffsicos o qrnmicos antes del ensayo. Por ejemplo, en formas de realizacion descritas con mas detalle en la seccion de Ejemplos, las muestras, por ejemplo, muestras de orina, se sometieron a centrifugacion, la dilucion y/o el tratamiento con una sustancia solubilizante (por ejemplo., El tratamiento de guanidina) antes de ensayar las muestras para FRa no unido a una celula. Tales tecnicas sirven para mejorar la precision, la fiabilidad y reproducibilidad de los ensayos de la presente invencion.

[0138] El termino "muestra de control", como se usa aqrn, se refiere a cualquier muestra de control clmicamente relevante, incluyendo, por ejemplo, una muestra de un sujeto sano no afectado por cancer de ovario, una muestra de un sujeto que tiene una menos grave o mas lento progresando cancer de ovario que el sujeto a ser evaluado, una muestra de un sujeto que tiene algun otro tipo de cancer o enfermedad, y similares. Una muestra de control puede incluir una muestra derivada de uno o mas sujetos. Una muestra de control tambien puede ser una muestra hecha en un punto de tiempo anterior a partir del sujeto a ser evaluado. Por ejemplo, la muestra de control podna ser una muestra tomada del sujeto a ser evaluado antes de la aparicion de la cancer que expresa FRa como el pulmon o el cancer de ovario, en una fasa anterior de la enfermedad, o antes de la administracion del tratamiento o de una parte de tratamiento. La muestra de control tambien puede ser una muestra de un un modelo animal, o de un tejido o lmeas de celula derivadas del modelo animal, de los canceres que expresa FRa tales como cancer de pulmon o de ovario. El nivel de FRa no unido a una celula en una muestra de control que consiste en un grupo de mediciones puede determinarse en base en cualquier medida estadfstica adecuada, tales como, por ejemplo, medidas de tendencia central incluyendo valores de media, mediana, o modales.

[0139] El termino "nivel de control" se refiere a un nivel aceptado o pre-determinado de FRa que se utiliza para comparar con el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto. En una realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en la muestra de un sujeto

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que tiene progresion de la enfermedad lenta. En otra realizacion, el nivel de control de FRa no unido a una celula se basa en el nivel en una muestra de un sujeto que tiene la progresion rapida de la enfermedad. En otra realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra a partir de un sujto no afectado, es decir, no enfermo, es decir, un sujeto que no tiene un cancer que expresa FRa tales como cancer de pulmon o ovario. En aun otra realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra de un sujeto antes de la administracion de una terapia para el cancer de ovario. En otra realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra de un sujeto que tiene un cancer que expresa FRa como el cancer de pulmon o de ovario que no contacta con un compuesto de ensayo. En otra realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra de un sujeto que no tiene un cancer que expresa FRa como el cancer de pulmon o de ovario que esta en contacto con un compuesto de ensayo. En una realizacion, el nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra a partir de un modelo animal de un cancer que expresa FRa como el pulmon o el cancer de ovario, una celula, o una lmea celular derivada del modelo animal de un cancer que expresa FRa tales como cancer de pulmon o de ovario.

[0140] En una realizacion, el control es un control normalizado, tal como, por ejemplo, un control que esta predeterminado utilizando un promedio de los niveles de FRa no unidos a una celula de una poblacion de sujetos que no tienen cancer que expresa FRa tal como cancer de pulmon o cancer de ovario. En todavfa otras realizaciones de la invencion, un nivel de control de FRa se basa en el nivel de FRa no unido a una celula en una muestra no cancerosa derivada del sujeto que tienen un cancer que expresa FRa como el de pulmon o de ovario. Por ejemplo, cuando una laparotoirna u otro procedimiento medico revela la presencia de cancer de ovario en una porcion de los ovarios, el nivel de control de FRa puede determinarse utilizando la parte no afectada del ovario, y este nivel de control puede ser comparado con el nivel de FRa en una parte afectada de los ovarios. Del mismo modo, cuando una biopsia u otro procedimiento medico revela la presencia de un cancer de pulmon en una porcion de los pulmones, el nivel de control de FRa puede determinarse utilizando la parte no afectada de los pulmones, y este nivel de control puede ser comparado con el nivel de FRa en una parte afectada de los pulmones.

[0141] Como se usa en este documento, "una diferencia" entre el nivel de receptor de folato alfa no unido a una celula en una muestra de un sujeto (es decir, una muestra de ensayo) y el nivel de receptor de folato alfa no unido a una celula en una muestra de control se refiere ampliamente a cualquier diferencia clmicamente relevante y/o estadfsticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa en las dos muestras. En una realizacion ejemplar, la diferencia se selecciona basandose en un valor de corte determinado usando un receptor de funcionamiento de analisis caractenstico (ROC), un ejemplo del cual se presenta en el Ejemplo 6.

[0142] En otras realizaciones, la diferencia debe ser mayor que los lfmites de deteccion del metodo para determinar el nivel de FRa no unido a una celula. Se prefiere que la diferencia sea de al menos mayor que el error estandar del metodo de evaluacion, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estandar del metodo de evaluacion. La diferencia puede ser evaluada por cualquier comparacion apropiada, incluyendo cualquier estadfstica descriptiva parametrica o no parametrica apropiada o comparacion. Por ejemplo, "un aumento" en el nivel de FRa no unido a una celula puede referirse a un nivel en una muestra de prueba que es aproximadamente dos, y mas preferiblemente de aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, aproximadamente siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, diez o mas veces mas que el nivel de FRa en la muestra de control. Un aumento tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, cinco o mas desviaciones estandar por encima del nivel medio de FRa en la muestra de control. Del mismo modo, "una disminucion" en el nivel de FRa no unido a una celula puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente dos, y mas preferiblemente de aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, aproximadamente siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, diez o mas veces menores que el nivel de FRa en la muestra de control. Una disminucion tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, cinco o mas desviaciones estandar por debajo del nivel de edad de FRa en la muestra de control.

[0143] Tal como se utiliza aqrn, el termino "poner en contacto la muestra" con un agente de union FRa, por ejemplo, un anticuerpo FR-a, incluye exponer la muestra, o cualquier porcion del mismo con el agente o anticuerpo, tal que al menos una porcion de la muestra entra en contacto con el agente o

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anticuerpo. La muestra o porcion de los mismos pueden alterarse de alguna manera, tal como sometiendolo a tratamientos ffsicos o qmmicos (por ejemplo, dilucion o tratamiento de guanidina), antes del acto de ponerse en contacto con el agente o anticuerpo.

[0144] El termino "anticuerpo" como se usa en el presente documento, comprende cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, asf como cualquier fragmento funcional (es decir, de union a antfgeno), mutante, variante, o derivacion del mismo, que conserva las caractensticas de union al epftopo esenciales de una molecula de Ig. Tal mutante, variante, o formatos de derivado de anticuerpo son conocidos en la tecnica, e incluyen moleculas tales como fragmentos Fab, los fragmentos Fab', fragmentos Fab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticuerpos sc (anticuerpos de cadena sencilla), diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quimericas entre cadenas de anticuerpos y similares. Moleculas de inmunoglobulinas en moles pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase.

[0145] Cada cadena pesada esta compuesta de una region variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta compuesta de tres dominios, CH1, CHH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta de una region variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones mas conservadas denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL esta compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, cDr2, FR3, CDR3, FR4. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[0146] Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de union que interacciona con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a tejidos del huesped o factores, incluyendo varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo., celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico.

[0147] El termino "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse espedficamente a un antfgeno (por ejemplo, FRa no unido a una celula). Se ha demostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union incluidos dentro del termino "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios de Vh y CH1 y; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un dAb incluyendo dominios Vh y Vl; (vi) un fragmento dAb (Ward et al (1989) Nature 341, 544-546.), que consta de un dominio de Vh; (vii) un dAb que consiste en un dominio Vh o un Vl; y (viii) una region determinante de complementariedad aislada (CDR) o (ix) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un enlazador sintetico. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un enlazador sintetico que les permite hacerse como una sola cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena unica (scFv); vease por ejemplo, Bird et al (1988) Science 242, 423426; y Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 85, 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena unica tambien estan destinados a ser abarcados dentro del termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se criban para la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Porciones de union a antfgeno pueden producirse por tecnicas de ADN recombinante, o por escision enzimatica o qdmica de inmunoglobulinas intactas.

[0148] El termino "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos murinos, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos humanos, y los que se producen de forma natural o se producen recombinantemente de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica.

[0149] En una realizacion, un anticuerpo para su uso en los metodos de la invencion es un anticuerpo biespedfico. Un "anticuerpo biespedfico" es un anticuerpo de dbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespedficos pueden producirse mediante una variedad de metodos que incluyen fusion de hibricupulas o union de

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fragmentos Fab’. Vease, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553.

[0150] En otra realizacion, un anticuerpo para uso en los metodos de la invencion es un anticuerpo camelido como se describe en, por ejemplo, la publicacion PCT WO 94/04678.

[0151] Una region del anticuerpo de camelido que es el dominio de variable pequeno y unico identificado como Vhh se puede obtener por ingeniena genetica para producir una protema pequena que tiene una alta afinidad por una diana, lo que resulta en un bajo peso molecular, el anticuerpo de protema derivada conocida como un "nanoanticuerpo camelido". Vease la patente de los Estados Unidos. N° 5.759.808; vease tambien Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261;. Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003, Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez- Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;. y Lauwereys et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Bibliotecas de ingeniena de anticuerpos de camelidos y fragmentos de anticuerpos estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Ablynx, Gante, Belgica. Por consiguiente, una caractenstica de la presente invencion es un nanocuerpo de camelido que tiene una alta afinidad por FRa.

[0152] En otras realizaciones de la invencion, un anticuerpo para uso en los metodos de la invencion es un diacuerpo, un diacuerpo de cadena unica, o un di-diacuerpo.

[0153] Los diacuerpos son moleculas bivalentes, biespedficos en los dominios Vh y Vl se expresan en una cadena polipeptfdica unica, conectada por un enlazador que es demasiado corta para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios Vh y Vl se emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando de ese modo dos sitios de union de antfgeno (vease por ejemplo, Holliger et al., 1993 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 90: 6.444-6.448; Poljak et al. 1994 Structure 2: 11 21-1123). Los diacuerpos pueden ser producidos mediante la expresion de dos cadenas de polipeptidos, ya sea con la estructura Vha-Vlb y Vhb-Vla (configuracion Vh-Vl), o Vla-Vhb y Vlb-Vha (configuracion Vl-Vh) dentro de la misma celula. La mayona de ellos se puede expresar en forma soluble en bacterias.

[0154] diacuerpos de cadena unica (SCDB) se producen mediante la conexion de las dos cadenas polipeptfdicas de formacion de diacuerpo-con enlazador de aproximadamente 15 residuos de aminoacidos (vease Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol Immunother, 45-(3-4): 12 8. 30; Wu et al., 1996 Immunotachnology, 2-(1): 21-36). SCDB puede expresarse en bacterias en forma monomerica soluble, activo (vease Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol Immunother, 45-(34): 12 8-30; Wu et al., 1996 inmu- notachnology, 2-(1): 21 -36; Pluckthun and pack, 1997 Immunotachnology, 3-(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng, 9 (7): 617-21).

[0155] Un diacuerpo puede fusionarse a Fc para generar un "di-diacuerpo" (vease Lu et al., 2004 J. Biol Chem, 279 (4): 2856-65).

[0156] Moleculas de union FRa que exhiben propiedades funcionales de los anticuerpos pero derivan su marco y las porciones de antfgeno de otros polipeptidos de union (por ejemplo, polipeptidos distintos de los codificados por genes de anticuerpo o generados por la recombinacion de genes de anticuerpos in vivo) tambien se pueden utilizar en los metodos de la presente invencion. Los dominios de union a antfgeno (por ejemplo., dominios de union a FRa) de estas moleculas de union se generan a traves de un proceso de evolucion dirigida. Vease la patente de los Estados Unidos. N° 7.115.396. Las moleculas que tienen un pliegue global similar a la de un dominio variable de un anticuerpo (un pliegue "inmunoglobulina") son protemas de andamiaje adecuadas. Protemas de andamiaje adecuadas para derivar moleculas de union a antfgeno incluyen fibronectina o un dfmero de fibronectina, tenascina, N- cadherina, E-cadherina, ICAM, titina, receptor GCSF, receptor de citoquina, inhibidor de glicosidasa, cromoprotema antibiotica, molecula de adhesion a membrana de mielina P0, CD8, CD4, CD2, MHC de clase I, receptor de antfgeno de celulas T, dominios de conjunto CD1, C2 e I, VCAM-1, dominio de inmunoglobulina de conjunto I de la protema de union a miosina C, dominio de inmunoglobulina de conjunto C de la protema vinculante a miosina H, dominio de inmunoglobulina de conjunto I de teloquina, NCAM, twitchina, neuroglia, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de la eritropoyetina, el receptor de la prolactina, receptor de interferon-gamma, p- galactosidasa/glucuronidasa, p-glucuronidasa, transglutaminasa, receptor de antfgeno de celulas T, dismutasa de superoxido, el dominio del factor tisular, el citocromo F, protema verde fluorescente, GroEL, y taumatina.

[0157] "Union espedfica" cuando se usa en el contexto de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, representa la union a traves de los dominios codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o mas epftopos de una protema de interes, pero que no reconocen sustancialmente y se unen a otras moleculas en una muestra que contiene una poblacion mixta de moleculas antigenicas. Tfpicamente, un anticuerpo se une a un antfgeno relacionado con una Kd de

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menos de aproximadamente 1x10-8 M, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmon de superficie o un ensayo de union celular.

[0158] Como se usa en este documento, un "agente de union" de receptor de folato alfa incluye un anticuerpo que se une FRa no unido a una celula asf como agentes de union no anticuerpos. Para generar agentes de union no de anticuerpos o moleculas de union, se puede crear una biblioteca de clones en cuyas secuencias las regiones de la protema de armazon que forman las superficies de union a antfgeno (por ejemplo, las regiones analogas en posicion y estructura a las CDR de un dominio variable de anticuerpo plegado de la inmunoglobulina) se asignaron al azar. Clones de biblioteca se ensayaron para la union espedfica al antfgeno de interes (por ejemplo, FRa) y para otras funciones (por ejemplo, inhibicion de la actividad biologica de FRa). Los clones seleccionados se pueden utilizar como la base para seguir la aleatorizacion y seleccion para producir derivados de mayor afinidad por el antfgeno.

[0159] Las moleculas de union de alta afinidad se generan, por ejemplo, usando el decimo modulo de fibronectina III (10Fn3) como el armazon, que se describe en la patente de los Estados Unidos. Nos 6.818.418 y 7.115.396.; Roberts y Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 94: 12297; Patente de EE.UU.. N° 6.261.804; Patente de EE.UU.. N° 6.258.558; y Szostak et al. (WO98/31700).

[0160] Las moleculas de union que no son anticuerpos pueden ser producidas como dfmeros o multfmeros para aumentar la avidez por el antfgeno diana. Por ejemplo, el dominio de union a antfgeno se expresa como una fusion con una region constante (Fc) de un anticuerpo que forma dfmeros Fc-Fc. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos. N° 7.115.396.

[0161] Un "antigeno" es una molecula reconocida por el sistema inmune; el termino vino originalmente de "generador de anticuerpo" e incluye una molecula que se une espedficamente a un anticuerpo. A nivel molecular, un antfgeno se caracteriza por su capacidad de unirse en el sitio de union al antfgeno de un anticuerpo. En la presente invencion, el antfgeno es FRa, tal como FRa que no esta unido a una molecula FRa o una porcion del mismo.

[0162] Tal como se utiliza aqrn, el termino "epftopo" se refiere a las caractensticas de la superficie molecular de un antfgeno, por ejemplo, FRa, capaz de ser unida por un anticuerpo. Moleculas antigenicas, normalmente “grandes" poftmeros biologicos, por lo general presentan varias caractensticas de la superficie que pueden actuar como puntos de interaccion para anticuerpos espedficos. Cualquier caractenstica molecular distinta constituye un epftopo. Por lo tanto, la mayona de los antfgenos tienen el potencial de ser accionados por varios anticuerpos distintos, cada uno de los cuales es tfpicamente espedfico para un epftopo particular. En una realizacion de la presente invencion, un agente de union, por ejemplo, anticuerpo, se une a un epftopo en FRa que esta disponible en la forma del receptor que no esta unido a una celula pero no en la forma unida a membrana del receptor. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al mismo epftopo en FRa a que MORAb-003 se une.

[0163] Como se usa en este documento, la frase "progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa" incluye la progresion de un cancer de este tipo de un estado menos severo a un estado mas grave. Esto podna incluir un aumento en el numero o la gravedad de los tumores, el grado de metastasis, la velocidad con la que el cancer esta creciendo y la difusion, y similares. Por ejemplo, "la progresion de cancer de ovario" incluye la progresion de un cancer de este tipo de un estado menos severo a uno mas grave, tal como la progresion desde la fasa I a la fasa II, de la etapa II a la fasa III, etc. Alternativamente, la frase "progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa" puede referirse a la regresion de un cancer que expresa FRa a partir de un estado mas grave a un estado menos grave. Por ejemplo, en una realizacion, "la progresion de cancer de ovario" se refiere a la regresion de la Etapa IV a la fasa III, de la fasa III a la Etapa II, etc. En otras realizaciones, la "progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto aquejado de un cancer que expresa FRa" puede referirse a la velocidad de supervivencia determinada a partir del comienzo de los smtomas del cancer que expresa FRa, o a la velocidad de supervivencia desde el momento del diagnostico del cancer que expresa FRa.

[0164] Tal como se utiliza aqrn, el termino "estratificar" se refiere a la caracterizacion de un cancer que expresa FRa, por ejemplo, cancer de ovario o de pulmon, en una etapa apropiada basada, por ejemplo, del grado de la propagacion del cancer, como estratificaciones bien aceptadas en la tecnica. Por ejemplo, estratificacion incluye la caracterizacion del cancer que expresa FRa en la etapa I, etapa II, etapa III o etapa IV. En ciertas realizaciones, la etapa I se refiere a los canceres que se localizan en una parte del cuerpo. En ciertas realizaciones, las etapas II y III se refieren a canceres que son localmente avanzados, en los que una distincion entre las fases es a menudo espedfica del cancer particular. Por ultimo, la etapa IV se refiere a los canceres que han hecho metastasis o propagacion a otros organos o partes del cuerpo.

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[0165] Tal como se utiliza aqm, el termino "supervivencia" se refiere a la continuacion de la vida de un sujeto que ha sido tratado por cancer. En una realizacion, la supervivencia se refiere a la no repeticion de un tumor. Tal como se utiliza aqm, el termino "vuelva a ocurrir" se refiere a la regeneracion de las celulas tumorales o cancerosas en un sujeto en el que se ha administrado el tratamiento primario para el tumor. El tumor puede reaparecer en el sitio original o en otra parte del cuerpo. En una realizacion, un tumor que se repite es del mismo tipo que el tumor original para el que se trato el sujeto. Por ejemplo, si un sujeto tema un tumor de cancer de ovario, se trato y posteriormente se desarrollo otro tumor de cancer de ovario, el tumor ha recidivado. Ademas, un cancer puede reaparecer en un organo o tejido diferente que el en donde ocurrio originalmente.

II. Metodos y kits de la invencion

[0166] La presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el receptor de folato alfa (Fra), no unido a una celula, se encuentra en niveles elevados en los fluidos corporales, por ejemplo, orina o suero, de un sujeto que tiene un cancer que expresa FRa en comparacion con una muestra de control. Ademas, la presente invencion se basa, al menos en parte, en la identificacion de un ensayo inmunologico que exhibe la sensibilidad necesaria para evaluar los niveles de FRa no unido a una celulas en muestras, donde intentos anteriores habfan fracasado repetidamente. De hecho, la presente invencion supera los retos observados durante los intentos anteriores para desarrollar un FRa basado en ensayo de diagnostico para cancer que expresa FRa tal como cancer de pulmon o de ovario, proporcionando un ensayo inmunologico capaz de evaluar con precision los niveles de FRa no unidos a una celula en una muestra, por ejemplo, orina o suero.

[0167] Por consiguiente, se proporcionan metodos y kits para evaluar si un sujeto tiene o esta en riesgo de desarrollar un cancer que expresa FRa y, ademas, para evaluar la progresion de un cancer que expresa FRa. En diversas realizaciones, los metodos implican la comparacion de los niveles de FRa no unido a una celula en muestras, por ejemplo, orina y suero, en comparacion con los niveles de control, en la evaluacion de la presencia, el grado o el riesgo de desarrollo de cancer de ovario en el sujeto.

A. Metodos de diagnostico, metodos de pronostico. metodos de evaluacion de riesao. y metodos de estratificacion

[0168] Espedficamente, la presente invencion proporciona metodos de diagnostico para la evaluacion de si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, tales como cancer de pulmon o cancer de ovario, los metodos de pronostico para la prediccion de la progresion de un cancer que expresa FRa tal como cancer de pulmon o cancer de ovario, y los metodos de evaluacion de riesgos para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle cancer que expresa FRa. Ademas, la invencion proporciona metodos de estratificacion para estratificar un cancer que expresa FRa tal como cancer de pulmon o cancer de ovario de sujetos en los grupos de terapia de cancer. Los diversos aspectos y realizaciones de la invencion aqm descritos no pretenden ser limitativos ni abarcar todas las posibles combinaciones de las realizaciones espedficas mencionadas, que pueden aplicarse a cualquiera de los metodos y kits discutidos en este documento o se reivindican a continuacion.

[0169] Los metodos de la presente invencion se pueden practicar en combinacion con cualquier otro metodo utilizado por el experto en la materia para diagnosticar un cancer que expresa FRa, predecir la progresion de un cancer que expresa FRa, o para evaluar el nivel de riesgo que un sujeto desarrollara un cancer que expresa FRa.

[0170] En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra (tal como la orina o suero) derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa. En una realizacion particular, el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa no unidos a una celula y se selecciona del grupo que consiste en (a) un anticuerpo que se une el mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003; y (b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. En una realizacion, la muestra se selecciona del grupo que consiste en orina y suero.

[0171] En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, como cancer de pulmon o cancer de ovario, comprendiendo el metodo la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) no unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) en la muestra

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de orina derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada del sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta aquejado de un cancer que expresa FRa.

[0172] En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) no unido a una celula en una muestra de suero derivada del sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) en la muestra de suero derivada del sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de suero derivada del sujeto y la nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa. En realizaciones particulares, el sujeto no ha sido tratada con un agente, tal como un esteroide, que mejora las Leve ls de FRa en el suero. En una realizacion espedfica, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario y el sujeto no ha sido tratada con un agente, tal como un esteroide, que mejora los niveles de FRa en el suero.

[0173] En los metodos y kits de la presente invencion, canceres que expresan FRa incluyen canceres caracterizados en que las celulas cancerosas expresan FRa. En realizaciones particulares, la FRa se libera de las celulas de cancer, por ejemplo, desde la superficie de la celula cancerosa, y en los fluidos biologicos de la sujeto. Canceres que expresan FRa incluyen cancer de pulmon (por ejemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinoides, y cancer de pulmon de celulas no pequenas, tales como adenocarcinomas); mesotelioma; cancer de ovarios; cancer renal; cancer de cerebro (por ejemplo, ependimoma anaplasico y astrocitoma pilodtico juvenil cerebelar); cancer de cuello uterino; cancer de la nasofaringe; tumor derivado del mesodermo; carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello; cancer endometrial; adenocarcinomas de endometrio del ovario, cistoadenocarcinomas serosas, el cancer de mama; cancer de vejiga; cancer de pancreas; cancer de hueso (por ejemplo, osteosarcoma de alto grado); y el cancer de pituitaria (por ejemplo, adenoma de la pituitaria). En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario.

[0174] En ciertas realizaciones de los metodos y kits de la presente invencion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon. En realizaciones mas espedficas, el cancer de pulmon es el carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC). En una tal realizacion, el NSCLC se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma, carcinoma de pulmon de celulas escamosas, gran carcinoma de pulmon de celulas, pleomorfico NSCLC, tumor carcinoide, carcinoma de glandula salival, y carcinoma no clasificado. En una realizacion preferida, el NSCLC es adenocarcinoma. En realizaciones alternativas, el cancer de pulmon es el carcinoma de pulmon de celulas pequenas (SCLC). En otra realizacion, el cancer de pulmon es el carcinoma bronquioalveolar. En aun otra realizacion, el cancer de pulmon es un tumor carcinoide de pulmon.

[0175] La presente invencion tambien proporciona metodos para evaluar si un sujeto esta afectado por

cancer de ovario mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) no unido a una celula en una muestra de orina derivada del sujeto, en la que la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 3000 UA/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario. En realizaciones particulares, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 4000 UA/ml, aproximadamente 5000 UA/ml, aproximadamente 6000 UA/ml, aproximadamente 7000 UA/ml, aproximadamente 8000 UA/ml,

aproximadamente 9000 au/ml, aproximadamente 10000 au/ml, aproximadamente 11000 au/ml, aproximadamente 12000 au/ml, aproximadamente 13000 au/ml, aproximadamente 14000 au/ml,

aproximadamente 15000 au/ml, aproximadamente 16000 au/ml, aproximadamente 17000 au/ml,

aproximadamente 18000 au/ml, aproximadamente 19000 au/ml, aproximadamente 20000 au/ml,

aproximadamente 21000 au/ml, aproximadamente 22000 au/ml, aproximadamente 23000 au/ml,

aproximadamente 24 000 au/ml, aproximadamente 25000 au/ml, aproximadamente 26000 au/ml, aproximadamente 27000 au/ml, aproximadamente 28000 au/ml, aproximadamente 29000 au/ml o aproximadamente 30000 UA/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0176] En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar si un sujeto esta afectado por cancer de ovario, determinando el nivel de receptor de folato alfa (Fra) en una muestra de orina derivada del sujeto, en el que la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario o en el que una concentracion de menos de ab cabo 9100 pg/ml es una indicacion de que el sujeto no esta afligido con cancer de ovario. Por ejemplo, la presencia de FRa en la muestra de orina a una concentracion de mas de aproximadamente 9500 pg/ml, de aproximadamente 10 000 pg/ml, de aproximadamente 11.000 pg/ml, de aproximadamente 12000 pg/ml, aproximadamente 13 000 pg/ml, aproximadamente 14.000 pg/ml, de aproximadamente 15000 pg/ml, de aproximadamente 16000 pg/ml, de aproximadamente 17.000 pg/ml, de aproximadamente 18000 pg/ml, de aproximadamente 19000 pg/ml, de aproximadamente 20000 pg/ml, de aproximadamente 21000 pg/ml, aproximadamente 22000 pg/ml, aproximadamente 23000 pg/ml, aproximadamente 24000 pg/ml, aproximadamente 25000 pg/ml, aproximadamente 26000 pg/ml, aproximadamente 27000 pg/ml,

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aproximadamente 28000 pg/ml, aproximadamente 29000 pg/ml, aproximadamente 30000 pg/ml, aproximadamente 40000 pg/ml, de aproximadamente 50000 pg/ml, de aproximadamente 60000 pg/ml, de aproximadamente 70000 pg/ml, de aproximadamente 80000 pg/ml, aproximadamente 90000 pg/ml, aproximadamente 10 0000 pg/ml o aproximadamente 150,00 0 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.

[0177] En ciertas realizaciones de los aspectos anteriores de la invencion, los niveles de FRa no unido a una celula en una muestra (por ejemplo, una muestra tal como una muestra de orina o una muestra de suero) d erived de un sujeto se comparan con el niveles de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre los niveles es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa tal como cancer de cancer de pulmon o de ovario. En una realizacion particular, la diferencia constituye un aumento en el nivel de FRa no unido a una celula en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control, en el que este aumento es indicativo de la presencia o crecimiento de cancer que expresa FRa. Alternativamente, la diferencia constituye una disminucion en el nivel de FRa, en el que la disminucion es indicativo de la ausencia o regresion de cancer que expresa FRa. Tal como se usa en este documento, "una diferencia" entre el nivel de receptor de folato alfa no unido en un celula en una muestra de un sujeto (es decir, una muestra de ensayo) y el nivel de receptor de folato alfa en una muestra de control se refiere ampliamente a cualquier clmicamente relevante cambio (incluyendo un aumento o una disminucion) y/o diferencia estadfsticamente significativa en el nivel de receptor de folato alfa en las dos muestras. En una realizacion ejemplar, la diferencia se selecciona basandose en un valor de corte determinado usando un receptor de funcionamiento analisis caractenstico (ROC), un ejemplo del cual se presenta en el Ejemplo 6. El optimo valor de corte puede variar dependiendo de los metodos y condiciones de ensayo empleadas. En otras realizaciones, la diferencia debe ser mayor que los lfmites de deteccion del metodo para determinar el nivel de FRa no unido a una celula. Se prefiere que la diferencia sea al menos mayor que el error estandar del metodo de evaluacion, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7-, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estandar del metodo de evaluacion. La diferencia puede ser evaluada por cualquier comparacion apropiada, incluyendo cualquier estadfstica descriptiva parametrica o no parametrica apropiada o comparacion. Por ejemplo, "un aumento" en el nivel de FRa puede referirse a un nivel que excede de un valor de corte determinado usando un analisis ROC. Tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es de dos, y mas preferiblemente de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 10 0%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 300%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 500%, aproximadamente el 600%, aproximadamente el 700%, aproximadamente 800 %, aproximadamente 900% o aproximadamente 10 00% mas que el nivel de FRa en la muestra de control. Un aumento n tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, cinco o mas desviaciones estandar por encima del nivel medio de FRa en la muestra de control. Del mismo modo, "una disminucion" en el nivel de FRa no unido a una celula puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que no exceda de un valor de corte determinado usando un analisis ROC. Tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, o aproximadamente el 90% menor que el nivel de FRa en la muestra de control. Una disminucion tambien puede referirse a un nivel en una muestra de ensayo que es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, cinco o mas desviaciones estandar por debajo del nivel medio de FRa en la muestra de control.

[0178] Las muestras utiles en los metodos y kits de la invencion incluyen cualquier tejido, celula, biopsia, o fluido corporal que puede contener niveles detectables de FRa no unido a una celula. En una realizacion, una muestra puede ser un tejido, una celula, sangre entera, plasma, rascado bucal, saliva, lfquido cefalorraqrndeo, heces, o lavado broncoalveolar. En algunas realizaciones, la muestra es FRa que expresan muestra de tumor o una muestra de tejidos o celulas, donde FRa que expresa cancer pueden ser encontrados. En realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de orina o suero.

[0179] Muestras corporales pueden obtenerse a partir de un sujeto por una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, por el uso de una biopsia o raspando o frotando un area o mediante el uso de una aguja para aspirar fluidos corporales. Los metodos para la recogida de diversas muestras corporales son bien conocidos en la tecnica.

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[0180] Las muestras adecuadas para la deteccion y la cuantificacion de la FRa nivel de protemas pueden ser frescas, congeladas o fijas de acuerdo con metodos conocidos por un experto en la tecnica. Muestras de tejidos adecuados se seccionaron preferentemente y se colocaron en un portaobjetos de microscopio para otros analisis. Las muestras solidas, es decir, muestras de tejido, pueden ser solubles y/o se homogeneizadas y posteriormente se analizaron como extractos solubles. Las muestras lfquidas tambien pueden ser sometidas a tratamientos ffsicos o qmmicos. En algunas realizaciones, las muestras de orina son tratadas por centrifugacion, agitacion en vortex, la dilucion y/o el tratamiento con una sustancia solubilizante (tal como, por ejemplo, el tratamiento de guanidina).

[0181] En una realizacion, una muestra de biopsia recien obtenida se congela usando, por ejemplo, nitrogeno lfquido o difluorodiclorometano. La muestra congelada se monta para seccionarse utilizando, por ejemplo, OCT, y se secciona en serie en un criostato. Las secciones seriadas se recogen sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Para la tincion inmunohistoqmmica de los portaobjetos se pueden recubrir, por ejemplo, con cromo-alumbre, gelatina o poli-L-lisina para asegurar que las secciones se adhieran a los portaobjetos. En otra realizacion, las muestras se fijaron y se embebieron antes de seccionarse. Por ejemplo, una muestra de tejido puede fijarse en, por ejemplo, formalina, en serie deshidratados e incluidos en, por ejemplo, parafina.

[0182] Una vez que la muestra se obtiene, cualquier metodo conocido en la tecnica por ser adecuado para detectar y cuantificar FRa no unido a una celula se puede utilizar (ya sea en el acido nucleico o, preferiblemente, a nivel de protema), como se describe en la seccion (b) a continuacion. Los metodos ejemplares se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a transferencias Western, transferencias Northern, transferencias Southern, inmunohistoqmmica, ensayo de fasa de solucion, ELISA, por ejemplo, amplificadas ELISA, inmunoprecipitacion, inmunofluorescencia, citometna de flujo, inmunocitoqmmica, analisis espectrometrometrica de masa, por ejemplo, MALDI-TOF y SELDI-TOF, tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos, metodos de transcripcion inversa de acidos nucleicos, y metodos de amplificacion de acido nucleico.

[0183] En muchas realizaciones, el nivel de FRa no unido a una celula en la muestra (tal como, por ejemplo, orina o suero) se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa. Anticuerpos que se unen FRa son conocidos en la tecnica e incluyen (i) el anticuerpo monoclonal murino LK26 (las cadenas pesadas y ligeras de los mismos se presentan en el presente documento como SEQ ID NOs: 22 y 23), como se describe en la Solicitud de Patente Europea N° 86104170,5 (Rettig); (ii) el anticuerpo MORAb-003, como se describe en la Publicacion Internacional N° WO2004/113388 y en la Patente de EE.UU. N° 5.646.253.

[0184] Los anticuerpos monoclonales MOV18 y MOv19 tambien se unen diferentes epttopos en la molecula FRa (anteriormente conocida como GP38/FBP). Miotti, S. et al. Int J Cancer, 38: 297-303 (1987). Por ejemplo, el anticuerpo MOV18 se une al epftopo expuesto en el presente documento como SEQ ID NO: 26 (TELLNVXMNAK * XKEKPXPX * KLXXQX) (notese que en la posicion 12, un residuo de triptofano o histidina es posible, y en la posicion 21, un acido aspartico o residuo de acido glutamico es posible), como se ensena en Coney et al. Cancer Res, 51: 612 5-6132-(1991).

[0185] Tal como se utiliza aqm, el termino "MORAb-003" se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente FRa y que comprende la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada madura como se expone en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de cadena ligera madura de la SEQ ID NO: 8. Las correspondientes secuencias de aminoacidos pre-protema para MORAb-003 se exponen en SEQ ID NOs: 9 (cadena pesada) y 10 (cadena ligera). El anticuerpo MORAb-003 comprende los siguientes CDRs: SEQ ID NO:-1-como CDRH1, SEQ ID NO: 2 como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 como CDRH3, SEQ ID NO: 4 como CDRL1, SEQ ID NO: 5 como CDRL2, y SEQ ID NO: 6 como CDRL3. Celulas productoras de anticuerpos MORAb-003 han sido des planteado con la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 24 de abril de 2006 y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-7552.

[0186] Otros anticuerpos que se unen FRa y para uso en los metodos de la presente invencion incluyen 9f3.H9.H3.H3.B5.G2 (tambien denominado 9F3), 19D4.B7 (tambien referidos como 19D4), 24F12.B1 (tambien denominado 24F12), y 26B3.F2 (tambien denominado 26B3). Las secuencias de aminoacidos de estos anticuerpos, sus cDr, y sus dominios variables de cadena pesada y ligera, asf como secuencias de polinucleotidos que pueden codificar ellos, se proporcionan en la Tabla 33. En algunas realizaciones, estos anticuerpos son IgG murina, o derivados de los mismos. En otras realizaciones, los anticuerpos son humanos, humanizados, o quimericos.

9F3

[0187] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que incluye una CDR1 secuencia de aminoacidos de cadena ligera sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa

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incluye una secuencia de aminoacidos CDR2de cadena ligera sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos CDR3 de cadena ligera sustancialmente la misma que, o identica a, la SEQ ID NO 29. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos de CDR1 de cadena pesada sustancialmente la misma que, o identica a, la SEQ ID NO 31. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una CDR2-amino CA cadena pesada secuencia ID sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos de CDR3 de cadena pesada sustancialmente de la misma una s, o identica a, SEQ ID NO: 33. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 27; una secuencia de aminoacidos de CDR2 de sustancialmente el mismo que, o identica a, la SEQ I D NO: 28; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 29. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 31; una secuencia de aminoacidos CDR2 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 32; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 33. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 subst antially el mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 27; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente el mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 28; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 29, y tambien tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 31; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente el mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 32; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente la misma que, o identica a, la SEQ ID NO: 33.

[0188] El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 30. El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 34. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una luz y una cadena pesada de los dominios variables, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos substanti aliado el mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 30, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es el 9F3.H9.H3.H3.B5.G2-(9F3) un ntibody o un fragmento de union a antfgeno del mismo, capaz de unirse ya sea una forma nativa o no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una region constante IgG2a murino.

[0189] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo que se produce por las celulas productoras de anticuerpos depositados en el American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 hasta 2.209) el 19 de mayo de 2011 y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-11887. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende una o mas de las CDR de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende las regiones de luz y variable de cadena pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados.

19D4

[0190] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que incluye una CDR1 secuencia de aminoacidos de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos CDR2de cadena ligera sustancialmente la misma que, o identica a, SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una CDR3 de cadena ligera la secuencia de aminoacidos sustancialmente la mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR1 de aminoacidos sustancialmente el mismo que, o identica a, SEQ ID NO: 39. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada CDR3 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 41. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 35; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 36; y una amin CDR3 o secuencia de acido sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 37. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 39; una secuencia de aminoacidos de CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 40; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 41. El anticuerpo que se

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une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 35; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 36; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 37, y tambien tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 39; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 40; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 41.

[0191] El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 38. El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye un una secuencia de aminoacido sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 42. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera o pesada de los dominios variables, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 38, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es el (19D4) anticuerpo 19D4.B7 o un fragmentos de union a antfgeno del mismo, capaz de unirse ya sea una forma nativa o no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una region constante de IgG2a murino.

[0192] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo que se produce por las celulas productoras de anticuerpos depositados en el American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 a 2209) el 19 de mayo, 2 011 y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-11884. En algunos realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende una o mas de las cadenas ligeras y pesadas CDR de de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados.

24F12

[0193] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que incluye una CDR1 secuencia de cadena ligera de aminoacidos sustancialmente igual, o identica a, SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos CDR2de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos CDR3 de la cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR1 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 47. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 48. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una cadena pesada CDR3 la secuencia de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 49. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 43; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 44; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 45. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 47; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 48; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 49. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene un aminoacido CDR1 secuencia sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 43; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 44; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 45, y tambien tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 47; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 48; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o ide ntical a, SEQ ID NO: 49.

[0194] El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 46. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una region variable de cadena pesada capaz que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 50. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una region variable de cadena ligera o pesada, en la que el dominio variable de cadena ligera incluye un aminoacido se cuencia sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 46, y el dominio variable de cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 50. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es el anticuerpo 24F12.B1-(24F12) o un fragmento de union a antfgeno del mismo, capaz de unirse ya sea una forma

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nativa o no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una region constante de IgG1 murina.

[0195] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo que es producido por las celulas productoras de anticuerpos depositados en el American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 a 2209) el 19 de mayo, 2011 y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-11886. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende una o mas de las CDR de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados.

26B3

[0196] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que incluye una secuencia de aminoacidos CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 51. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de aminoacidos CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 52. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una CDR3 de cadena ligera la secuencia de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR1 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 55. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa incluye una secuencia de cadena pesada CDR3 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 57. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 51; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoacido CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 53. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 55; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 56; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 57. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 51; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 53, y tambien tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 55; una secuencia de CDR2 de aminoacidos sustancialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 56; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 Sustancia cialmente igual que, o identica a, SEQ ID NO: 57.

[0197] El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 54. El anticuerpo que se une FRa puede incluir un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 58. El anticuerpo que se une FRa puede incluir una luz y una cadena pesada de los dominios variables, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 54, y la cadena pesada del dominio variable incluye una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual a, o identica a, SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es el (26B3) anticuerpo 26B3.F2 o un fragmento de union a antfgeno del mismo, capaz de unirse ya sea una forma nativa o no reducida de FRa. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una region constante de IgG1 murina.

[0198] En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa es un anticuerpo que se produce por las celulas productoras de anticuerpos depositados en el American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110 hasta 2.209) el 19 de mayo de 2011 y se les ha asignado el N° de Acceso PTA-11885. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende una o mas de las CDR de cadena ligera y pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une FRa comprende las regiones de luz y variable de cadena pesada de los anticuerpos producidos por las celulas productoras de anticuerpos depositados.

[0199] Disposiciones de union al antfgeno de CDR pueden disenarse usando protemas similares a anticuerpos como andamios CDR. Protemas de union a antfgeno disenadas se incluyen dentro del alcance de anticuerpos que se unen FRa.

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[0200] Otros anticuerpos reactivos que se unen FRa son conocidos en la tecnica, y en la actualidad, multiples tales anticuerpos reactivos estan disponibles comercialmente (en base a la busqueda de anticuerpos anti-FRa en
http://www.biocompare.com), que se enumeran en la siguiente tabla.

Producto: Empresa Cantidad Aplicaciones Reactividad

FRa de raton anti-humano purificada - MaxPab de anticuerpos policlonales, no conjugados: Abnova Corporation 50 pg La deteccion de anticuerpos, Transferencia Western (lisado transfectadas) Humano

FRa de raton anti-humano purificada - MaxPab de anticuerpos policlonales, no conjugados: Abnova Corporation 50 pg La detection de anticuerpos, Transferencia Western (lisado transfectadas) Humano

FRa de conejo anti- humano purificada - MaxPab de anticuerpos policlonales, no conjugados: Abnova Corporacion 10 0 pg La detection de anticuerpos, Transferencia Western (lisado transfectadas) Humano

Anticuerpo policlonal Anti-FRa de conejo, no conjugado: Aviva Sistemas Biology 50 pg Transferencia Western Humano, raton, rata

Anticuerpo policlonal FRa anti-humano de conejo, no conjugado: GeneTex 10 0 pl Transferencia Western. La utilidad de este producto en otras aplicaciones no se ha determinado. Humano

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con biotina: LifeSpan Biosciences 10 mg ELISA (1: 4000 juego- 1: 20.000), inmunofluorescencia, Imm unohistochemistry, Transferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con biotina: LifeSpan Biosciences No proporcion ado ELISA (1: 5000 juego- 1: 25.000), Transferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con Hrp: LifeSpan Biosciences 20 mg ELISA (1: 2000-1: 10000), inmunohistoquimica, Transferencia Western Bovino

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Producto: Empresa Cantidad Aplicaciones Reactividad

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con Hrp: LifeSpan Biosciences 10 00 pg ELISA (1: 2000-1: 12000), Cambio de Gel, inmunohistoqmmica (1: 100-1: 200), inmunohistoqmmica Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con Hrp: LifeSpan Biosciences 2000 pg (200 pl) ELISA, Transferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), conjugado con Hrp: LifeSpan Biosciences No proporcionad o ELISA, inmunohistoqmmica (secciones congeladas), inmunohistoqmmica (Parafina), Transferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), no conjugado: LifeSpan Biosciences 50 mg ELISA (1: 10000-1: 40.000), inmunoprecipitacion, T ransferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa anti- policlonal bovino de cabra (FRa), no conjugado: LifeSpan Biosciences 10 000 pg ELISA (1: 10000-1: 40.000), inmunoprecipitacion, T ransferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa policlonal anti-bovino de cabra (FRa), no conjugado: LifeSpan Biosciences 1 mL ELISA (1: 3000-1: 9000), inmunoprecipitacion, T ransferencia Western Bo vine

Receptor de folato alfa anti- policlonal anti-bovino de cabra (FRa), policlonal, no conjugado Receptor de folato alfa (Fra): LifeSpan Biosciences No proporcionad o ELISA (1: 3000-1: 9000), inmunoprecipitacion, T ransferencia Western Bovino

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) monoclonal, no conjugado: LifeSpan Biosciences 200 pg ELISA Bovino

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) monoclonal, no conjugado: LifeSpan BioSciences Folate receptor alfa (Fra) 200 pg ELISA Humano

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) monoclonal, no conjugado: LifeSpan Biosciences 200 pg ELISA Humano

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) monoclonal, no conjugado: LifeSpan Biosciences 200 pg ELISA No proporcionad o

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) monoclonal, no conjugado, clon 6d398: LifeSpan Biosciences 10 0 pl ELISA (1-10 pg/ml), citometna de flujo, inmunocitoqmmica, inmunohistoqmmica (secciones congeladas) Mono

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) policlonal, no conjugado: LifeSpan Biosc icos 1 mL ELISA Bovino

Receptor de folato alfa anti-bovino de raton (Fra) policlonal, no conjugado: LifeSpan Biosciences No proporcionad o No proporcionado Bovino

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Producto: Empresa Cantida d Aplicaciones Reactivida d

Anticuerpo policlonal FRa anti- humano de raton, no conjugado, receptor de folato de clon 1 (adulto): Novus Productos Biologico s 0,05 mL Transferencia Western, ELISA

FRa anti-humano de raton policlonal, no conjugado: Novus Productos Biologico s 0,05 mg ELI SA, Transferencia Western Humano

Anticuerpo policlonal purificado de afinidad FRa anti-humano de cabra, conjugado con biotina: R&D Systems 50 pg Transferencia Western Humano

Anticuerpo policlonal purificado de afinidad FRa anti-humano de cabra, no conjugado: R&D Systems 10 0 pg Citometria de Flujo, Transferencia Western Humano

Anticuerpo monoclonal FRa anti- humano de raton, conjugado de aloficocianina, clon 548908: R&D Systems 10 0 Tests Citometria de flujo Humano

Anticuerpo monoclonal FRa anti- humano de raton, conjugado de ficoeritrina conjugado, clon 548908: R&D Systems 10 0 Tes Ts Citometria de flujo Humano

Anticuerpo monoclonal FRa anti- humano de raton, no conjugado, clon 548908: R&D Systems 10 0 pg Citometria de flujo, inmunocitoquimica, Transferencia Western Humano

Anticuerpo monoclonal FRa anti- raton de humano, no conjugado: Estados Unidos Biologi cal 10 0 pg ELISA, citometria de flujo, inmunocitoquimica, Transferencia Western Humano

[U2U1J tn una realizacion preTeriaa, el anticuerpo que se une FRa comprenae ai menos uno ae los siguientes CDRs, como se deriva de cadenas pesadas y ligeras de LK26murino: StQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, StQ ID NO: 2 (Taltantes GGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, StQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, StQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, StQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y StQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Vease la Patente de tt.UU. N° 5.646.253.

[0202J Otras mutaciones pueden hacerse en las regiones de marco como se ensena en la Patente de tt.UU. N° 5.646.253.

[0203J tn otra realizaciOn preferida, el anticuerpo incluye una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (StQ ID NO: 13) LK26HuVKY (StQ ID NO: 14), LK26HuVKPW (StQ ID NO: 15), y LK26HuVKPW, y (StQ ID NO: 16); y una region variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en Lk26HuVH (StQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (StQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (StQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (StQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (StQ ID NO: 21). Vease la Patente de tt.UU. N° 5.646.253 y la Patente de tt.UU. N° 6.124.106. tn otra realizacion, el anticuerpo comprende la region variable de cadena pesada LK26KOLHuVH (StQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (StQ iD NO: 16). tn otra realizaciOn, el anticuerpo comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (StQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (StQ ID NO: 16). tn una realizacion adicional, el anticuerpo comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH FAIS, N (StQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVkPw, Y (StQ ID NO: 16).

[0204J tn algunas realizaciones, las muestras pueden necesitar ser modificadas con el Tin de hacer FRa accesible a la union del anticuerpo. tn un aspecto particular de los metodos de inmunocitoqmmica o inmunohistoqmmica, las portaobjetos se pueden transferir a un tampon de pretratamiento y opcionalmente calentar para aumentar la accesibilidad del antfgeno. tl calentamiento de la muestra en el tampon de pretratamiento rapidamente interrumpe la bi-capa lfpida de las celulas y hace que los antfgenos (puede ser el caso en muestras Trescas, pero no bpicamente lo que ocurre en las muestras

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fijadas) (es decir, la protema FRa) sean mas accesibles para la union del anticuerpo. El termino "tampon de pretratamiento" se usa indistintamente en este documento para referirse a un tampon que se utiliza para preparar las muestras de citologfa o la histologfa para la inmunotincion, en particular mediante el aumento de la accesibilidad de la protema FRa para la union de anticuerpos. El tampon de pretratamiento puede comprender una solucion salina pH especffica, un polfmero, un detergente, o un tensioactivo no ionico o anionico tal como, por ejemplo, un agente tensioactivo etilooxilado anionico o no ionico, un alcanoato o un alcoxilato o incluso mezclas de estos tensioactivos o incluso el uso de una sal biliar. El tampon de pretratamiento puede ser, por ejemplo, una solucion de 0,1% a 1% de acido desoxicolico, sal de sodio, o una solucion de sodio de laurilo-13-carboxilato de metilo (por ejemplo, Sandopan LS) o y complejo anionico etoxilado. En algunas realizaciones, el tampon de pretratamiento tambien puede utilizarse como un tampon de almacenamiento de portaobjetos. En una realizacion particular, la muestra, por ejemplo, la muestra de orina, se centrifuga, se agita con vortex, se diluye y/o se somete a tratamiento de guanidina.

[0205] Cualquier metodo para la fabricacion de protema FRa mas acesible para la union de anticuerpo puede utilizarse en la practica de la invencion, incluyendo los metodos de recuperacion de antfgeno conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Bibbo, et al. (2002) Acta. Citol. 46: 25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27: 365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Citol. Histologico. 25: 8-11.

[0206] Tras el pretratamiento para aumentar la protema de accesibilidad FRa, las muestras pueden ser bloqueadas usando un agente de bloqueo adecuado, por ejemplo, una peroxidasa reactiva de bloqueo, tal como peroxido de hidrogeno. En algunas realizaciones, las muestras pueden ser bloqueadas usando un reactivo de bloqueo de protema para prevenir union no espedfica del anticuerpo. El reactivo de bloqueo de protema puede comprender, por ejemplo, casema purificada. Un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o policlonal, que se une espedficamente a FRa se incuba despues con la muestra.

[0207] Las tecnicas para la deteccion son bien conocidas en la tecnica de union del anticuerpo. La union a FRa del anticuerpo puede ser detectada mediante el uso de reactivos qdmicos que generan una senal detectable que se corresponde con el nivel de union de anticuerpos y, en consecuencia, el nivel de expresion de protema FRa. En uno de los metodos de inmunohistoqdmica o inmunocitoqmmica de la invencion, se detecta la union de anticuerpos a traves del uso de un anticuerpo secundario que esta conjugado a un polfmero marcado. Ejemplos de polfmeros marcados incluyen, pero no se limitan a conjugados de polfmero-enzima. Las enzimas en estos complejos se utilizan tfpicamente para catalizar la deposicion de un cromogeno en el sitio de union antfgeno-anticuerpo, lo que resulta en la tincion de celulas que corresponde al nivel de expresion del biomarcador de interes. Las enzimas incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rabano picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AP).

[0208] En un metodo inmunohistoqmmico o inmunocitoqmmico de la invencion, la union del anticuerpo a la protema FRa se detecto a traves del uso de un polfmero marcado con HRP que se conjuga a un anticuerpo secundario. La union del anticuerpo tambien se puede detectar a traves del uso de un reactivo de sonda espedfica de la especie, que se une a anticuerpos monoclonales o policlonales, y un polfmero conjugado con HRP, que se une a la especie de reactivo de sonda espedfica. Los portaobjetos se tineron para la union usando cualquier cromogeno, anticuerpo, por ejemplo, el cromogeno 3,3-diaminobencidina (DAB), y despues se contratineron con hematoxilina y, opcionalmente, un agente de azulado tal como hidroxido de amonio o TBS/Tween-20. Otros cromogenos adecuados incluyen, por ejemplo, 3-amino-9-etilocarbazol (AEC). En algunos aspectos de la invencion, los portaobjetos son revisados microscopicamente por un citotecnico y/o un patologo para evaluar la tincion de celulas, por ejemplo, la tincion fluorescente (es decir, expresion FRa). Alternativamente, las muestras pueden ser revisadas a traves de microscopfa automatizada o por personal con la ayuda de software de ordenador que facilita la identificacion de celulas de tincion positiva.

[0209] En una realizacion preferida de la invencion, el anticuerpo esta marcado. Por ejemplo, la

deteccion de la union del anticuerpo se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo anti- FRa a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, luminiscentes materiales, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidase, o acetilocolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina,

diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 1311, 35S, 14C, o 3H. En una realizacion particular, el anticuerpo esta marcado con un radio-etiqueta, etiqueta de cromoforo, etiqueta de fluoroforo, o etiqueta de enzima.

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[0210] En una realizacion de la invencion muestras congeladas se preparan como se describio anteriormente y posteriormente se tineron con anticuerpos contra FRa diluido a una concentracion apropiada usando, por ejemplo, solucion salina tamponada con Tris (TBS). Los anticuerpos primarios pueden detectarse mediante incubacion de los portaobjetos en anti-inmunoglobulina biotinilada. Esta senal opcionalmente puede ser amplificada y se visualizo usando precipitacion con diaminobencidina del antfgeno. Ademas, los portaobjetos se pueden contratenir opcionalmente con, por ejemplo, hematoxilina, para visualizar las celulas.

[0211] En otra realizacion, muestras fijadas y embebidas se tineron con anticuerpos contra FRa y se contra-tineron como se ha descrito anteriormente para las secciones congeladas. Ademas, las muestras se pueden tratar opcionalmente con agentes para amplificar la senal con el fin de visualizar la tincion de anticuerpos. Por ejemplo, una deposicion catalizada por peroxidasa de biotinil-tiramida, que a su vez se hace reaccionar con (sistema catalizado amplificacion de senal (CSA), DAKO, Carpinteria, CA) estreptavidina conjugada con peroxidasa puede utilizarse.

[0212] Un experto en la tecnica reconocera que la concentracion de un anticuerpo particular utilizado para practicar los metodos de la invencion variara dependiendo de factores tales como el tiempo para la union, el nivel de especificidad del anticuerpo para FRa, y el metodo de preparacion de la muestra. Ademas, cuando se usan multiples anticuerpos, la concentracion requerida puede verse afectada por el orden en que los anticuerpos se aplican a la muestra, por ejemplo, al mismo tiempo como un coctel o secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales. Ademas, la qmmica de deteccion utilizada para visualizar la union a anticuerpo FRa debe ser optimizada para producir la senal a ruido deseado.

[0213] En una realizacion de la invencion, los metodos proteomicos, por ejemplo, espectrometna de masas, se utilizan para detectar y cuantificar la protema FRa. Por ejemplo, espectrometna de masas de tiempo de vuelo de desorcion/ionizacion por laser asociada a la matriz (MALDI-TOF MS) o espectrometna de masas de tiempo de vuelo de desorcion/ionizacion de mayor superficie (SELDI-TOF MS), que implica la aplicacion de una muestra, tal como suero, a un chip de union a protemas (Wright, GL, Jr., et al (2002) Experto Rev Mol Diagn. 2: 549; Li, J., et al (2002) Clin Chem. 48: 1296; Laronga, C., et al (2003) Dis Markers 19: 229; Petricoin, EF, et al. (2002)359: 572; Adam, BL, et al (2002) Cancer Res 62: 3609; Tolson, J., et al (2004) Lab Invest 84: 845; Xiao, Z., et al (2001) Cancer Res 61: 6029) se puede utilizar para detectar y cuantificar la protema FRa. Los metodos de espectrometna de masas se describen en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nos. 5.622.824, 5.605.798 y 5.547.835.

[0214] La presente invencion ademas implica, al menos en parte, la identificacion de FRa como biomarcador de pronostico, es decir, como un biomarcador de la progresion y/o la gravedad, de un cancer que expresa FRa tal como cancer de ovario o de cancer de pulmon de celulas pequenas. Por consiguiente, la presente invencion proporciona metodos de evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto aquejado de cancer de ovario comparando el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que una diferencia en el nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparacion con la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa rapidamente. Del mismo modo, los metodos de evaluacion del nivel de riesgo de que un sujeto desarrollara un cancer que expresa FRa implica comparar el nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que una diferencia en el nivel de FRa en la muestra (como la orina o suero de la muestra) derivada del sujeto en comparacion con la muestra de control es una indicacion de que el sujeto tiene un mayor nivel de riesgo de desarrollo de un cancer que expresa FRa en comparacion con riesgo normal en un individuo sano.

[0215] En una realizacion, la diferencia es un aumento. En otra realizacion, la diferencia es una disminucion. En algunos tipos de cancer (por ejemplo, carcinoma de celulas escamosas de la cabeza y cuello, cancer de ovario), un mayor nivel de expresion de FRa se asocia con un peor pronostico, mientras que en otros tipos de canceres (por ejemplo, de pulmon no de celulas pequenas canceres), un mayor nivel de expresion de FRa se asocia con un mejor pronostico. Por lo tanto, en una realizacion espedfica, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario o carcinoma de celulas escamosas de la cabeza y el cuello y la diferencia es un aumento. En otra realizacion espedfica, el cancer que expresa FRa es un cancer de pulmon no de celulas pequenas, y la diferencia es una disminucion.

[0216] En ciertos aspectos, la invencion proporciona metodos de evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa mediante la comparacion del nivel de FRa en una muestra derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento en el nivel de FRa en la muestra (tal como una muestra de orina o suero) derivada del sujeto en comparacion con la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa rapidamente, o una disminucion en el nivel de FRa en la muestra derivada del sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el cancer progresa lentamente o retrocedera. Del mismo modo, los metodos de evaluacion del nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cancer que expresa FRa implica comparar el nivel de FRa en una muestra

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derivada de un sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, en el que un aumento del nivel de FRa en la muestra (como la orina o suero de la muestra) derivada del sujeto en comparacion con la muestra de control es una indicacion de que el sujeto tiene un mayor nivel de riesgo de desarrollar un cancer que expresa FRan en comparacion el riesgo normal en un individuo sano, o una disminucion en el nivel de FRa en la muestra derivada de la materia en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto tiene un nivel inferior de riesgo de desarrollar un cancer que expresa FRa, en comparacion con un riesgo normal en un individuo sano.

[0217] Cualquier aumento o disminucion clmicamente relevante o estadfsticamente significativa, usando cualquier metodo de analisis conocido en la tecnica, puede utilizarse en la evaluacion de pronostico, el riesgo y otros metodos de la invencion. En una realizacion, un aumento en el nivel de FRa se refiere a un nivel que excede de un valor de corte determinado usando un analisis ROC como se ejemplifica en el Ejemplo 6. En otra realizacion, una disminucion en el nivel de FRa se refiere a un nivel en una muestra de ensayo que no exceda de un valor de corte determinado utilizando un analisis de ROC.

[0218] En otras realizaciones, el aumento o disminucion debe ser mayor que los lfmites de deteccion del metodo para determinar el nivel de FRa. En realizaciones adicionales, el aumento o disminucion ser al menos mayor que el error estandar de un metodo de evaluacion, y preferiblemente una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estandar del metodo de evaluacion. En algunas realizaciones, el aumento o disminucion se evalua utilizando estadfsticas parametricas o no parametricas descriptivas, comparaciones, analisis de regresion, y similares.

[0219] En otras realizaciones, el aumento o disminucion es un nivel en la muestra derivada del sujeto que es de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamentel 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 300%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 500%, aproximadamente el 600%, aproximadamente 700%, aproximadamente el 800%, aproximadamente 900% o aproximadamente 1,000% mas o menos que el nivel de FRa en la muestra de control. En realizaciones alternativas, el aumento o disminucion es un nivel en la muestra derivada del sujeto que es al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro, cinco o mas desviaciones estandar por encima o por debajo del nivel medio de FRa en la muestra de control. Como se usa aqrn, la frase "progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa" puede referirse a la progresion de un cancer que expresa FRa desde una menos un estado de cancer menos severo a un estado mas grave. Esto podna incluir un aumento en el numero o la gravedad de los tumores, el grado de metastasis, la velocidad con la que el cancer esta creciendo y la difusion, y similares. En ciertas realizaciones, la progresion es una progresion desde una fasa menos severa a una etapa mas severa, en la que la etapa se evalua de acuerdo con un esquema de clasificacion conocido en la tecnica. En una realizacion, en el que el cancer que expresa FRa es el cancer de ovario, la progresion se refiere a una progresion de la fasa I a la fasa II, de la etapa II a la fasa III, etc. En otra realizacion, en la que el cancer que expresa FRa no cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), la progresion se refiere a una progresion de la Etapa 0 a la Etapa IA, Etapa IA a la Etapa IB, Etapa IB a la Etapa IIA, Etapa IIA a la Etapa IIB, Etapa IIB de la Etapa IIC, etc. En otra forma de realizacion, en la que el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon no microcftico (CPNM), la progresion se refiere a una progresion desde un estado menos severo a uno mas severo, determinado con arreglo al sistema de clasificacion TNM. Vease Spira; Greene; Sobin.

[0220] Alternativamente, la frase "progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto que padece un cancer que expresa FRa" puede referirse a una regresion de un cancer que expresa FRa a partir de un estado mas grave a uno menos grave, tal como una disminucion en el numero o la gravedad de los tumores, el grado de metastasis, la velocidad con la que el cancer esta creciendo y la difusion, y similares. En ciertas realizaciones, la progresion es una progresion desde una etapa mas severa a una etapa menos grave, en la que la etapa se evalua de acuerdo con un esquema de clasificacion conocido en la tecnica. En una realizacion, en el que el cancer que expresa FRa es cancer del ovario, la progresion se refiere a una regresion de la Etapa IV a la fasa III, de la fasa III a la Etapa II, etc. En otra realizacion, en el que el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), la progresion se refiere a una progresion de la etapa IV a la etapa IIIB, Etapa IIIB a la Etapa IIIA, Etapa IIIA a la Etapa IIB, etc. En otra realizacion, en el que el cancer que expresa FRa no es cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), la progresion se refiere a una progresion de una etapa mas severa a una menos severa tal como se determina bajo el sistema de clasificacion TNM. Vease Spira; Greene; Sobin.

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[0221] En realizaciones adicionales, el nivel de FRa puede usarse para calcular la probabilidad de que

un sujeto esta afectado con un cancer que expresan FRa, la progresion de un cancer que expresa FRa en un sujeto, el nivel de riesgo de desarrollar un cancer que expresa FRa, el riesgo de recurrencia del cancer en un sujeto que esta siendo tratado por un cancer que expresa FRa, la supervivencia de un sujeto que esta siendo tratado por un cancer que expresa FRa, la eficacia de al regimen de ratamiento para tratar una cancer que expresa FRa, y similares, utilizando los metodos de la invencion, que pueden incluir los metodos de analisis de regresion conocidos por un experto en la tecnica. Por ejemplo, los modelos de regresion adecuados incluyen, pero no se limiten a CART (por ejemplo, Hill, T y Lewicki, P. (2006) "STATISTICS, Methods and Aplications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (por ejemplo,
www.evidence-based-medicine.co.uk), exponencial, normal y log normal (por ejemplo,
www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), logfstica (por ejemplo,

www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), parametrico, no parametrico, semi-parametrico (por ejemplo,
www.soc-serv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), lineal (por ejemplo,

www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), o aditivo (por ejemplo,

www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized additive model).

[0222] En una realizacion, un analisis de regresion incluye el nivel de FRa. En realizaciones adicionales, un analisis de regresion puede incluir covariables clmicos adicionales y/o moleculares. Tales covariables clmicos incluyen, pero no se limitan a, la edad del sujeto, la etapa del tumor, el grado del tumor, el tamano del tumor, el regimen de tratamiento, por ejemplo, quimioterapia y/o terapia de radiacion, el resultado clmico (por ejemplo, la recafda, supervivencia espedfica de la enfermedad, el fracaso de la terapia), y/o el resultado clmico como una funcion del tiempo despues del diagnostico, tiempo despues del inicio de la terapia, y/o el tiempo despues de la finalizacion del tratamiento. Covariables moleculares pueden incluir, pero no estan limitadas a valores de los marcadores moleculares adicionales. Por ejemplo, en realizaciones en las que el cancer que expresa FRa es cancer de ovario, tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, niveles de CA125 en suero, niveles de DF3 de suero, y/o niveles de LPA plasma.

[0223] En otros aspectos, la invencion proporciona metodos para monitorizar la eficacia de un regimen de terapia o tratamiento. Por ejemplo, la presente invencion proporciona metodos para monitorizar la eficacia del tratamiento MORAb-003 de cancer de ovario o cancer de pulmon en un sujeto que padece de cancer de ovario o cancer de pulmon. Espedficamente, los metodos implican determinar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que dicho sujeto ha sido previamente administrada MORAb-003; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en un control de la muestra, en donde un incremento o ningun cambio en el nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto como en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 no es eficaz; y en el que una disminucion en la nivel de FRa en la muestra derivada de dicho sujeto en comparacion con el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el tratamiento MORAb-003 es eficaz.

[0224] Por ejemplo, la muestra de control puede ser derivada de un sujeto no sometido al regimen de tratamiento y una muestra de ensayo puede derivarse de un sujeto sometido a al menos una parte del regimen de tratamiento. Alternativamente, la muestra de ensayo y la muestra de control se pueden derivar de la misma materia. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede ser una muestra derivada de un sujeto despues de la administracion de un agente terapeutico, tal como MORAb-003. La muestra de control puede ser una muestra derivada de un sujeto antes de la administracion de terapeutica o en una etapa anterior del regimen terapeutico. De acuerdo con ello, una disminucion en el nivel de expresion de FRa en la muestra de ensayo, respecto a la muestra de control, es una indicacion de que la terapia ha disminuido la progresion del cancer que expresa FRa, por ejemplo, cancer de ovario. Para canceres que expresan FRa en los que un nivel mas alto de FRa esta asociado con un peor pronostico, tales como por ejemplo, cancer de ovario o carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, una disminucion en el nivel de expresion de FRa en la muestra de ensayo, relativa a la muestra de control, es una indicacion de que la terapia es eficaz para retrasar la progresion del cancer que expresa FRa, o en la causa de una regresion del cancer, en el sujeto aquejado del cancer que expresa FRa. En una realizacion preferida, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario.

[0225] En diversas realizaciones de este aspecto de la invencion, la muestra puede ser orina, suero, plasma o ascitis. En realizaciones particulares, la muestra es orina o suero. Ademas, la FRa puede determinarse por contacto de la muestra con un anticuerpo que se une FRa, opcionalmente, usando anticuerpos como se describe en el presente documento y los metodos de ensayo como se describe en el presente documento.

[0226] En diversas realizaciones, el anticuerpo tratamiento MORAb-003 es (a) un anticuerpo que comprende la cadena pesada de secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO:8; (b) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003; o (c) un anticuerpo que comprende la

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SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

[0227] En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otras realizaciones, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon. En realizaciones mas espedficas, el cancer de pulmon es el cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC). En una de tales realizaciones, el NSCLC se selecciona del grupo que consiste de adenocarcinoma, carcinoma de pulmon de celulas escamosas, gran carcinoma de pulmon de celulas, pleomorfico NSCLC, tumor carcinoide, carcinoma de glandula salival, y carcinoma no clasificado. En una realizacion preferida, el NSCLC es adenocarcinoma. En realizaciones alternativas, el cancer de pulmon es el carcinoma de pulmon de celulas pequenas (SCLC). En otra realizacion, el cancer de pulmon es el carcinoma bronquioalveolar. En aun otra realizacion, el cancer de pulmon es un tumor carcinoide de pulmon.

[0228] En otro aspecto, la invencion proporciona metodos de estratificar un sujeto con un cancer que expresa FRa en grupos de terapia de cancer basado en el nivel determinado de FRa en una muestra. En una realizacion preferida, el metodo implica la estratificacion de un sujeto con un cancer que expresa FRa en uno de al menos cuatro grupos de terapia de cancer. En otras realizaciones, el metodo implica la estratificacion de un sujeto con un cancer que expresa FRa en uno de al menos aproximadamente dos, sobre las tres, sobre cuatro, aproximadamente cinco, aproximadamente seis, sobre siete, aproximadamente ocho, aproximadamente nueve, o diez grupos de terapia de cancer.

[0229] Segun la presente invencion, los niveles de FRa pueden estar asociados con la gravedad, es decir, la etapa, de la cancer que expresa FRa. Por ejemplo, el cancer de ovario se estratifico en diferentes etapas en funcion de la gravedad del cancer, como se expone en el presente documento. Por consiguiente, la presente invencion proporciona metodos para estratificar el cancer de ovario en etapa I, por ejemplo, Etapa IA, Etapa 1B o Etapa CI; Etapa II, por ejemplo, la Etapa IIA, Etapa IIB o Etapa IIC; Etapa III, por ejemplo, Etapa IIIA, Etapa IIIB o Etapa IIIC; o cancer de ovario en etapa IV.

[0230] SCLS o NSCLC pueden ser estratificados en diferentes etapas en funcion de la gravedad del cancer, como se expone en el presente documento. Por consiguiente, la presente invencion proporciona metodos de estratificacion del cancer de pulmon, por ejemplo, SCLS o NSCLC, en la etapa oculta (escondida); etapa 0; La etapa I, por ejemplo, estadios IA y IB; Etapa II, por ejemplo, estadios IIA y IIB; Etapa III, por ejemplo, etapas IIIA y IIIB; o cancer de pulmon en etapa IV.

[0231] En aun otro aspecto, la presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que FRa puede servir como un biomarcador predictivo para el tratamiento de canceres que expresan FRa. Espedficamente, los metodos de la presente invencion se proporcionan para evaluar si un sujeto respondera al tratamiento, por ejemplo, con MORAb-003, y si y cuando se inicia el tratamiento, por ejemplo, con MORAb-003, mediante la evaluacion de los niveles de FRa en un sujeto.

[0232] En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para predecir si un sujeto que padece de un cancer que expresa FRa, por ejemplo, cancer de ovario o de pulmon, respondera al tratamiento con MORAb-003, mediante la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra derivada de dicho sujeto; y comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en la muestra derivada de dicho sujeto con el nivel de FRa en una muestra de control, donde una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra deriva de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto responde al tratamiento con MORAb-003.

[0233] En ciertas realizaciones, el grado de diferencia entre los niveles de FRa no unidos a una celula de cancer en la muestra de ensayo en comparacion con la muestra de control es indicativo de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003. Por ejemplo, una diferencia de al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 veces o mayor que el error estandar del metodo de evaluacion es indicativo de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003. Alternativamente o en combinacion, una diferencia de al menos aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 10 0%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 300%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 500%, aproximadamente el 600%, aproximadamente el 700%, aproximadamente el 800%, aproximadamente 900% o aproximadamente 10 00% es indicativo de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003. Alternativamente o en combinacion, una diferencia de al menos aproximadamente 1,5, y mas preferiblemente de aproximadamente dos, sobre

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las tres, sobre cuatro, cinco o mas desviaciones estandar es indicativo de que el sujeto respondera al tratamiento con MORAb-003.

[0234] En diversas realizaciones, el anticuerpo de tratamiento MORAb-003 es (a) un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003; o (b) un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.

[0235] En diversas realizaciones, la muestra es orina, plasma, suero o ascitis. En realizaciones particulares, la muestra es orina o suero. En realizaciones adicionales, el cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer cerebral, cancer cervical, cancer de la nasofaringe, carcinoma de celulas escamosas de la cabeza y cuello, cancer endometrial, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de hipofisis, cancer colorrectal y cancer de tiroides medular. En una realizacion particular, el cancer que expresa FRa es cancer de ovario. En otra realizacion, el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon de celulas no pequenas, tales como adenocarcinoma.

B. Ensayos basados en anticuerpos anti-FRa para detectar canceres que expresan FRa

[0236] Hay una variedad de formatos de ensayo conocidos por los de experiencia ordinaria en la una tecnica para el uso de un anticuerpo para detectar un polipeptido en una muestra, incluyendo pero no limitado a analisis de inmunoabsorcion enzimatica (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, ensayo de fasa de solucion, dialisis de equilibrio, inmunodifusion y otras tecnicas. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, Dm, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Por ejemplo, el ensayo puede realizarse en un formato de transferencia de Western, en el que una preparacion de protema de la muestra biologica se somete a electroforesis, se transfirio a una membrana adecuada y se dejo reaccionar con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo en la membrana puede entonces ser detectado utilizando un reactivo de deteccion adecuado, como es bien conocido en la tecnica y se describe a continuacion.

[0237] En otra realizacion, el ensayo implica el uso de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte solido para unirse a la FRa diana polipeptido y retirarlo del resto de la muestra. La FRa unido a polipeptido puede entonces ser detectada usando un segundo anticuerpo reactivo con un determinante antigenico polipeptfdico distinto FRa, por ejemplo, un reactivo que contiene un resto informador detectable. Como ejemplo no limitativo, de acuerdo con esta realizacion, el anticuerpo inmovilizado y el segundo anticuerpo que reconoce determinantes antigenicos distintos pueden ser cualquiera de dos de los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento seleccionados de MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismos como se describe en el presente documento. Alternativamente, un ensayo competitivo puede ser utilizado, en el que FRa esta marcado con un resto indicador detectable y se deja unir al anticuerpo anti-FR inmovilizado a anticuerpo despues de la incubacion del anticuerpo inmovilizado con la muestra. La medida en que los componentes de la muestra inhiben la union del polipeptido marcado para el anticuerpo es indicativo de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y, como resultado, indicativo del nivel de FRa en la muestra.

[0238] El soporte solido puede ser cualquier material conocido por los de experiencia ordinaria en la tecnica al que el anticuerpo puede estar unido, tal como un pocillo de ensayo en una placa de microtitulacion, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, latex o un plastico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El anticuerpo puede ser inmovilizado sobre el soporte solido usando una variedad de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, que se describen ampliamente en la bibliograffa de patentes y cientffica.

[0239] En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo para la deteccion de FRa en una muestra es un ensayo de sandwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto primero un anticuerpo espedfico FRa (p.ej., MORAb-003, mOv18, 548908, 6D398 o variantes del mismo como se describe en el presente documento) que ha sido inmovilizado sobre un soporte solido, comunmente el pocillo de una de placa de microtitulacion, con la muestra biologica, de manera que una molecula soluble de origen natural en la muestra y que tiene un determinante antigenico que es reactivo se permite que el anticuerpo se una al anticuerpo inmovilizado (por ejemplo, un tiempo de incubacion de 30 minutos a temperatura ambiente es generalmente suficiente) para formar un complejo antfgeno- anticuerpo o un complejo inmune. Constituyentes no unidos de la muestra se retiran de los complejos inmunes inmovilizados. A continuacion, un segundo anticuerpo espedfico para FRa se anade, en el que el sitio de combinacion de antfgeno del segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la union del sitio de combinacion de antfgeno del primer anticuerpo inmovilizado para FRa (por ejemplo, MORAb- 003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismos como se describe aqrn, que no es igual que el

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anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre el soporte solido). El segundo anticuerpo puede estar marcado de forma detectable como se proporciona aqrn, de manera que se puede detectar directamente. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede ser detectado indirectamente a traves del uso de un anti-anticuerpo secundario (o "segunda etapa") marcado de manera detectable, o usando un reactivo de deteccion espedfica como se proporciona aqu! El metodo objeto de la invencion no se limita a cualquier procedimiento particular de deteccion, como los que tienen familiaridad con inmunoensayos apreciaran que hay numerosos reactivos y configuraciones para detectar inmunologicamente un antfgeno particular (por ejemplo, FRa) en un inmunoensayo de sandwich de dos anticuerpos.

[0240] En ciertas realizaciones preferidas de la invencion usando el ensayo de tipo sandwich de dos anticuerpos descrito anteriormente, el primero, el anticuerpo inmovilizado espedfico para FRa es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo espedfico para FRa es un anticuerpo policlonal. En ciertas otras formas de realizacion de la invencion, la primera, anticuerpo inmovilizado espedfico para FRa es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo espedfico para FRa es un anticuerpo policlonal. En ciertas otras formas de realizacion de la invencion, la primero, el anticuerpo inmovilizado espedfico para FRa es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo espedfico para FRa es un anticuerpo monoclonal. En ciertas otras formas de realizacion de la invencion, el primero, el anticuerpo inmovilizado espedfico para FRa es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo espedfico para FRa es un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, en las realizaciones cabe senalar que los anticuerpos monoclonales MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 o variantes de los mismo como se describen en el presente documento, como se proporciona aqrn, reconocen determinantes antigenicos distintos y no competitivos (por ejemplo, epftopos) en polipeptidos de FRa, de manera que cualquier combinacion de pares de estos anticuerpos monoclonales se pueden emplear. En otras realizaciones preferidas de la invencion, la primera, el anticuerpo inmovilizado espedfico para FRa y/o el segundo anticuerpo espedfico para FRa puede ser cualquiera del tipo de anticuerpos conocidos en la tecnica y referenciados en el presente documento, por ejemplo, a modo de ilustracion y no de limitacion, fragmentos Fab, F(ab')2 fragmentos, protemas de fusion de la region V de inmunoglobulina o anticuerpos de cadena sencilla. Aquellos familiarizados con la tecnica apreciaran que la presente invencion abarca el uso de otras formas de anticuerpos, fragmentos, derivados y similares, en los metodos descritos y reivindicados en el presente documento.

[0241] En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el segundo anticuerpo puede contener un resto indicador o marcador detectable tal como una enzima, tinte, radionuclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina, o similares. La cantidad del segundo anticuerpo que permanece unido al soporte solido entonces se determina utilizando un metodo apropiado para el resto indicador detectable espedfico o etiqueta. Para grupos radioactivos, el recuento de centelleo o metodos autorradiograficos son generalmente apropiados. Los conjugados anticuerpo-enzima se pueden preparar usando una variedad de tecnicas de acoplamiento (para una revision vease, por ejemplo, Scouten, WH, Methods in Enzymology 135: 30-65, 1987). Los metodos espectroscopicos pueden utilizarse para detectar colorantes (incluyendo, por ejemplo, productos colorimetricos de reacciones enzimaticas), grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina o estreptavidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comunmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Grupos indicadores enzimaticos pueden detectarse generalmente mediante la adicion de sustrato (generalmente durante un periodo espedfico de tiempo), seguido por medios espectroscopicos, analisis espectrofotometrico u otro de los productos de reaccion. Normas y adiciones estandar se pueden utilizar para determinar el nivel de polipeptido de mesotelina en una muestra, utilizando tecnicas bien conocidas.

[0242] Un metodo de cribado para la presencia de un cancer que expresa FRa de acuerdo con la presente invencion puede mejorarse adicionalmente por la deteccion de marcador asociado mas de un tumor en una muestra biologica de un sujeto. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona un metodo de cribado que, ademas de la deteccion de la reactividad de FRa no unido a una celula, tambien incluye la deteccion de al menos un marcador soluble adicional de un cuadro clmico maligno utilizando metodos establecidos como se conoce en la tecnica y proporcionado en el presente documento. Como se senalo anteriormente, hay actualmente un numero de antfgenos asociados a tumores solubles que son detectables en muestras de fluidos biologicos obtenidos facilmente.

C. Kits de la invencion

[0243] La invencion tambien proporciona kits para evaluar si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa expresando, para la evaluacion de la progresion de un cancer que expresa FRa, para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle un cancer que expresa FRa, o para monitorizar la eficacia de un regimen de terapia o tratamiento para un cancer que expresa FRa. Estos kits incluyen medios para determinar el nivel de expresion de FRa e instrucciones para el uso del kit para evaluar la progresion de un cancer que expresa FRa, para evaluar el nivel de riesgo de que un sujeto desarrolle

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un cancer que expresa FRa, o para supervisar la eficacia de un regimen de terapia o tratamiento para un cancer que expresa FRa.

[0244] Los kits de la invencion pueden comprender opcionalmente componentes adicionales utiles para realizar los metodos de la invencion. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra de control, por ejemplo, una muestra de un sujeto que tiene lentamente cancer de progresion lenta y/o un sujeto que no tiene cancer, uno o mas compartimentos de la muestra, y material de instruccion que describe el rendimiento de un metodo de la invencion y tejidos espedficos de los controles/estandares.

[0245] Los medios para determinar el nivel de FRa incluyen metodos conocidos en la tecnica para la evaluacion de los niveles de protema, como se discutio anteriormente, y formas de realizacion preferidas espedficas, por ejemplo, utilizando el anticuerpo MORAb-003, como se discute en el presente documento. Asf, por ejemplo, en una realizacion, el nivel de FRa se evalua poniendo en contacto una muestra derivada de un sujeto (tal como la orina o suero) con un receptor de folato alfa (Fra) agente de union. En una realizacion preferida, el agente de union es un anticuerpo. Muchos de los tipos de anticuerpos que se unen FRa se discuten mas arriba en los metodos de la invencion y tambien se pueden utilizar en los kits de la invencion.

[0246] Los medios para determinar el nivel de FRa pueden incluir ademas, por ejemplo, tampones u otros reactivos para su uso en un ensayo para determinar el nivel de FRa. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresion de FRa.

[0247] Los kits de la invencion pueden incluir tambien medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender uno o mas elementos del equipo o de los reactivos que se pueden utilizar para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para la obtencion de una muestra de un sujeto tambien pueden comprender medios para aislar componentes de la sangre, tales como suero, a partir de una muestra de sangre. Preferiblemente, el kit esta disenado para su uso con un sujeto humano.

III. Los ensayos de cribado

[0248] En realizaciones adicionales, la invencion tambien proporciona metodos (tambien denominados aqrn como "ensayos de seleccion") para identificar moduladores, es decir, compuestos candidatos o de ensayo o agentes (por ejemplo, protemas, peptidos, peptidomimeticos, peptoides, moleculas pequenas u otros farmacos), que modulan el crecimiento, la progresion y/o agresividad del cancer, por ejemplo, un cancer que expresa FRa, o una celula de cancer, por ejemplo, una celula de cancer de ovario, por monitoreo y comparacion de los niveles de FRa en una muestra. Tales ensayos comprenden tfpicamente un compuesto de ensayo, o una combinacion de compuestos de prueba, cuya actividad contra el cancer o una celula de cancer se evalua. Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en el presente documento pueden ser utiles, por ejemplo, para modular, por ejemplo, inhibir, mejorar, tratar, o prevenir la agresividad de un cancer que expresa FRa o una celula de cancer, por ejemplo, una celula de cancer del ovario. Al monitorear el nivel de FRa en una muestra, se puede determinar si el cancer que expresa FRa esta progresando o regresando y si el compuesto de prueba tiene el efecto deseado. Por ejemplo, en realizaciones en las que el cancer que expresa FRa es un cancer para el que mayores niveles de FRa se asocian con un peor pronostico, una disminucion en el nivel de FRa despues de la administracion del compuesto de prueba sena indicativa de la eficacia del compuesto de ensayo. Por el contrario, un aumento en el nivel de FRa despues de la administracion del compuesto de prueba indicana que el compuesto de ensayo no es eficaz en el tratamiento de cancer de ovario. Por el contrario, en formas de realizacion en las que el cancer que expresa FRa es un cancer para el que mayores niveles de FRa estan asociados con un mejor pronostico, un aumento en el nivel de FRa despues de la administracion del compuesto de prueba sena indicativo de la eficacia del compuesto de ensayo. Por el contrario, una disminucion en el nivel de FRa despues de la administracion del compuesto de prueba indicana que el compuesto de ensayo no es eficaz en el tratamiento de cancer de ovario.

[0249] Los compuestos de ensayo utilizados en los ensayos de cribado de la presente invencion pueden obtenerse de cualquier fuente disponible, incluyendo bibliotecas sistematicas de los compuestos naturales y/o sinteticos. Los compuestos de ensayo tambien se pueden obtener por cualquiera de los numerosos enfoques en los metodos de bibliotecas combinatorias conocidas en la tecnica, incluyendo bibliotecas biologicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moleculas que tienen las funcionalidades de peptidos, pero con un nuevo esqueleto no peptfdico que son resistentes a la degradacion enzimatica pero que sin embargo siguen siendo bioactivas; vease, por ejemplo, Zuckermann et al., 1994, J. Med Chem.. 37: 2678-85); bibliotecas en fase de solucion o en fasa solida paralelas espacialmente direccionables; metodos de bibliotecas sinteticas que requieren desconvolucion; el metodo de biblioteca 'una perla-un compuesto’; y metodos de bibliotecas sinteticas

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usando seleccion por cromatograffa de afinidad. La biblioteca biologica y enfoques de la biblioteca de peptoides se limitan a bibliotecas de peptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a peptidos, oligomeros no peptfdicos o bibliotecas de moleculas pequenas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).

[0250] Ejemplos de metodos para la smtesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la tecnica, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al.

(1993) Science 261: 13 03; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al.

(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.

[0251] Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solucion (por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam, 1991, Nature 354: 82-84), los chips (Fodor, 1993, Nature 364: 555-556), bacterias y/o esporas, (Ladner, USP 5.223.409), plasmidos (Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89: 1865-1869) o en fago (Scott y Smith, 1990, Science 249: 386-390; Devlin, 1990, Science 249: 40 4-406; Cwirla et al., 1990, Proc Natl Acad Sci. 87: 6.378-6382; Felici, 1991, J. Mol Biol 222: 301-310; Ladner, supra).

[0252] La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. determinacion de niveles fra en muestras de orina de sujetos humanos con y sin cancer ovariano medido por inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (eclia).

Materiales y metodos

[0253] Las muestras de orina se obtuvieron de sujetos humanos, incluidos los sujetos que sufren de cancer de ovario y los sujetos de control normales no aquejados de cancer de ovario. Los niveles de FRa en muestras de orina se determinaron utilizando un inmunoensayo de electroquemiluminescencia (ECLIA) de acuerdo con el siguiente procedimiento (vease Namba et al (1999) Analytical Science 15: 1087-1093):

i. Recubrimiento de anticuerpos a las microperlas

[0254] El anticuerpo receptor alfa anti-folato monoclonal se revistio sobre la superficie de microesferas (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal). Treinta y seis miligramos de microperlas se mezclan con 1,2 mL de anticuerpo MOV18 (0,36 mg/ml, Enzo Life Science) en 0,15 mol/L de solucion salina de tampon fosfato pH 7,8 (PBS), seguido de un mezclado suave durante 16 horas a temperatura ambiente. A continuacion, las microperlas se lavaron 5 veces con tampon HEPES 50 mM que contema suero normal de conejo 0,1% (NRS), 150 mmol/L de NaCl, 0,01% Tween 20 pH 7,5 (tampon de lavado). A continuacion, las microesferas revestidas se suspendieron en 1,2 mL de tampon HEPES 50 mM que contiene 20% NRS, 150 mmol/L de NaCl y 0,01% de Tween 20 pH 7,5 (tampon de reaccion) para bloquear la superficie no unida, seguido de un mezclado suave durante 3,5 horas a temperatura ambiente. Por ultimo, las microperlas se lavaron 5 veces con tampon de lavado y se resuspendieron con 1,2 mL de tampon HEPES 50 mM que contiene 10% NRS, 150 mmol/L de NaCl,10 mmol/l de EDTA-2Na y 0,01% de Tween 20 pH 7,5 (reaccion de buffer) de modo que la concentracion de microesferas era de 30 mg/mL. Las microesferas se almacenaron a 4°C hasta su uso.

ii. Etiquetado de anticuerpo con rutenio-quelato-NHS (Ru)

[0255] Un mililitro de MORAb-003 (1 mg/ml) en PBS se mezclo con 14 pl de Ru (10 mg/ml), la relacion molar inicial de anticuerpo a Ru era 1:20, seguido por agitacion durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reaccion se termino mediante la adicion de 25 pl de solucion de glicina 2 mol/l, seguido de incubacion durante 20 minutos. El anticuerpo marcado se purifico por filtracion en gel utilizando Sephadex G-25-(GE Healthcare) eluido con PBS. Se recogio la fraccion amarilla que se eluyo primero y se determino la concentracion de anticuerpo y Ru por medio del kit de ensayo de protemas Pierce BCA (Thermo Scientific) y la absorcion a 455 nm, respectivamente. La relacion molar final se calculo por la formula: relacion molar final=[(absorcion a 455)/13700]/[Ab(mg/ml/150.000)]. El anticuerpo marcado se almaceno a 4°C hasta su uso.

iii. Inmunoensayo de una etapa

[0256] Las microperlas revestidas de anticuerpo se establecen en la tabla reactivo de la Picolumi 8220 (Sanko, Tokio, Japon) despues de ajustar la concentracion de las perlas a 1,5 mg/ml (solucion de trabajo) en tampon de reaccion. El anticuerpo marcado con Ru se establecio en la tabla de reactivo del

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Picolumi 8220 despues de ajustar la concentracion de anticuerpo a 2 pg/ml (solucion de trabajo) en tampon de reaccion.

[0257] Diez microlitros de orina (diluidos 1:51 en tampon de reaccion) o FRa estandar (preparado en tampon de reaccion) y 100 pl de tampon de reaccion se dispensaron en un tubo de reaccion (Sanko, Tokio, Japon) y SET en Picolumi 8220.

[0258] Los pasos siguientes se llevaron a cabo automaticamente por Picolumi 8220. Veinticinco microlitros de perlas (de trabajo de la solucion) y 18 0 pl de Ru marcado anticuerpo (solucion de trabajo) se dispensaron. Despues de 26 minutos de incubacion a 30 +/- 2°C, las perlas se lavaron y se suspendieron con 300 pl de la solucion de electrolito (Sanko, Tokio, Japon). Las perlas lavadas se transfirieron posteriormente al electrodo y electroquimioluminiscencia se midio de emision (ECL).

[0259] Todas las mediciones ECL se llevaron a cabo por duplicado.

Resultados

[0260] La Tabla 1-representa los niveles en orina de FRa en sujetos individuales con cancer de ovario y los sujetos de control femeninos no afectados.

Tabla 1: Niveles FRa en la orina de los sujetos con cancer de ovario y los sujetos de control

femininos normales

Grupo: Muestra # FRa (pg/ml)

cancer de ovarios: 1 27800

: 2 40242

: 3 85580

: 4 4994

: 5 2017

: 6 3781

: 7 29469

: 8 47456

: 9 4479

: 10 11920

: 11 18352

: 12 162017

: 13 30630

: 14 14431

: 15 11801

: 16 13470

: 17 11563

: 18 22185

Grupo: Muestra # FRa (pg/ml)

: 19 52106

control normal: 20 8491

: 21 4885

: 22 3595

: 23 21301

: 24 22757

: 25 16578

: 26 6081

: 27 4195

: 28 12169

: 29 20639

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[0261] La Figura 2 representa la distribucion de niveles FRa en la orina en sujetos con cancer de ovario y en sujetos de control hembra normales, tal como se expone en la Tabla 1.

[0262] La Tabla 2 resume el numero de sujetos (n), media, desviacion estandar (SD), valores maximos (Max.) y mmimos (Min.) para los niveles de FRa en el grupo de cancer de ovario y el grupo de control normal de la mujer.

Tabla 2: Resumen de la medicion de orina FRa

: FRa (pg/ml)

: cancer de ovarios femenino normal

N: 19 10

Media: 31279 12069

SD: 37895 7654

Max.: 162017 22757

Min.: 2017 3595

Discusion

[0263] Un alto nivel de FRa se detecto en la orina de los sujetos con cancer de ovario. Por otra parte, los niveles de FRa difenan significativamente entre cancer de ovario y los grupos de control femininos normales (p=0,03, unilateral).

EJEMPLO 2. linealidad de dilucion - determinacion de niveles fra en muestras de orina que se diluyeron en serie medidos por electroquimioluminiscencia inmunoensayo (eclia)

[0264] La linealidad de dilucion es una medida de la precision de un ensayo. Dos muestras de orina se diluyeron en serie en un factor de 10 y 100. Los niveles FRa de cada muestra se midieron tal como se expone en el Ejemplo 1 y se compararon para evaluar el porcentaje de error. El error porcentual se calcula del siguiente modo:

[[(FRa en la muestra diluida)*(factor de difusion)! - (FRa en la muestra diluida)1*100 (FRa en la muestra no diluida)

[0265] Los resultados se exponen en la Tabla 3:

Tabla 3: Linealidad de dilucion para la orina

Muestra: Factor de dilucion FRa (pg/ml) Error (%)

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1: 25037 -

: 10 2601 4

: 100 279 11

2: 1 16649 -

: 10 1696 2

: 100 173 4

[0266] Los resultados anteriores demuestran la linealidad de dilucion en la evaluacion de los niveles de FRa en muestras de orina humana y que, dentro de los errores aceptables, la orina puede diluirse hasta un factor de al menos 100 al tiempo que conserva los niveles precisos de FRa. En consecuencia, la dilucion de las muestras de orina se puede considerar antes de determinar los niveles de FRa.

EJEMPLO 3: la centrifugacion de las muestras de orina - reproducibilidad

[0267] La reproducibilidad del ensayo ECLIA para una muestra de orina en particular tambien se examino. Por ejemplo, como se refleja en la Tabla 4, los ensayos de ECLIA de la misma muestra resultaron en resultados variables.

Tabla 4. Reproducibilidad sin centrifugacion de la muestra

: ECL Counts

Muestra: prueba 1 prueba 2

1: 29380 15046

2: 20912 17227

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[0268] Se planteo la hipotesis de que la presencia de material insoluble (precipitados) en muestras de orina era responsable de la variabilidad observada en la medicion de los niveles de FRa. Como resultado, la centrifugacion de muestras con el fin de eliminar el sedimento de orina, antes de la medicion de niveles FRa, se considero como una opcion para mejorar la exactitud y reproducibilidad del ensayo.

[0269] La Tabla 5 representa los resultados obtenidos cuando tres muestras se centrifugaron antes de la realizacion del ensayo ECLIA.

Tabla 5. Reproducibilidad con centrifugacion de la muestra


: FRa concentracion (ng/mL)

Prueba: Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

1: 10,4 9,2 13,3

2: 10,5 8,9 14,0

3: 10,3 9,2 13,4

Media: 10,4 9,1 13,6

Dakota del Sur: 0,1 0,1 0,3

CV(%): 1,0 1,1 2,2

[0270] Como se ha expuesto anteriormente, los resultados indican que la centrifugacion proporciona mediciones mas consistentes de concentracion de FRa.

[0271] Adicionalmente, dos muestras fueron sometidas a (i) la centrifugacion (a 2000 xg durante 2 min) y el sobrenadante eliminado para la medicion de FRa (representado como la muestra "A" a continuacion en la Tabla 6) y (ii) centrifugacion seguida de agitacion en vortex (representado como muestra "B" a continuacion en la Tabla 6), antes de la medicion de niveles FRa por el ensayo ECLIA expuesto en el Ejemplo 1. los resultados se reflejan en la Tabla 6 a continuacion.

Tabla 6: Efecto de la centrifugacion en niveles FRa en la orina

Muestra: Sedimento despues de la centrifugacion A/B FRa (pg/m L) Diferencia (%)

1: Sf (++) A 13678 -


: B 16559 21

2: Si (+) A 12271 -


: B 13206 8

[0272] La diferencia (%) se determino como sigue:

[[(Nivel de FRa en "B") - (nivel de FRa en "A")1*100 (nivel de FRa en "A")

[0273] Como se muestra en la Tabla 6, los niveles de FRa como se determina por el ensayo ECLIA vanan dependiendo de si la orina se clarifico por centrifugacion para eliminar precipitados o si la orina se agito en vortex para suspender o dispersar los sedimentos. Por consiguiente, en ciertas realizaciones la centrifugacion o agitacion de las muestras de orina pueden realizarse antes de determinar los niveles de FRa.

EJEMPLO 4. determinacion de niveles fra en muestras de orina centrifugadas de sujetos humanos con y sin cancer de ovario medidas por electroquimioluminiscencia inmunoensayo (eclia).

[0274] Sobre la base de los resultados del Ejemplo 3, el ensayo para la evaluacion de niveles FRa en los sujetos se modifico para introducir un paso de centrifugacion. Los niveles FRa se determinaron en las mismas muestras utilizadas en el Ejemplo 1, incluyendo el grupo de sujetos con cancer de ovario y el grupo de sujetos de control femininos normales.

Materiales y metodos

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[0275] La metodologfa utilizada fue como se describe en el Ejemplo 1, excepto que las muestras de orina se centrifugaron durante 10.000 x g durante 1 minuto y el sobrenadante resultante se diluyo posteriormente por 1:51 en tampon de reaccion.

Resultados

[0276] La tabla 7 representa los niveles de FRa en muestras de orina centrifugadas y no centrifugadas de sujetos aquejados de cancer de ovario y los sujetos de control sanos.

Tabla 7: Nivel de orina FRa-1 en el cancer de ovario y el grupo de control normal


: FRa (pg/ml)

Grupo: Muestra # sin centrifugaci on con la centrifugacion sedimento despues de la centrifugacion

cancer de ovarios: 1 27800 23960 +

: 2 40242 37852 +

: 3 85580 78976 +

: 4 4994 3766 +

: 5 2017 1512 -

: 6 3781 3443 -

: 7 29469 25728 +

: 8 47456 16556 +

: 9 4479 3357 -


: FRa (pg/ml)

Grupo: Muestra # Sin centrifucacio n con la centrifugacion sedimento despues de la centrifugacion

: 10 11920 5020 +

: 11 18352 16695 -

: 12 162017 82705 +

: 13 30630 4496 +

: 14 14431 8786 +

: 15 11801 10582 -

: 16 13470 5611 +

: 17 11563 5463 +

: 18 22185 14443 +

: 19 52106 38327 -

control normal: 20 8491 6867 +

: 21 4885 3754 -

: 22 3595 3529 -

: 23 21301 15047 +

: 24 22757 4850 +

: 25 16578 14366 +

: 26 6081 5201 -

: 27 4195 3135 -

: 28 12169 499 +

: 29 20639 2439 +

[0277] De acuerdo con los resultados expuestos en la Tabla 7, centrifugacion resulto en una disminucion en la medicion de niveles FRa en algunas muestras, como se ha demostrado anteriormente en la Tabla 6.

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EJEMPLO 5: deteccion de fra en sedimento urinario por inmunotransferencia

[0278] Basandose en los resultados mostrados en los Ejemplos 3 y 4, la presencia o ausencia de FRa en sedimento/precipitado de la orina se evaluo mediante Transferencia Western.

Materiales y metodos

[0279] Las muestras de orina a partir de 2 pacientes con cancer de ovario para los que concentraciones de FRa se midieron a 18.747 pg/ml y 145.564 pg/ml, respectivamente (vease la Tabla 10 supra), se sometieron a los siguientes procedimientos. Las muestras de control consistieron en lisado celular HeLa 10 pg, tejido hepatico lisado 20 pg, y lisado de tejido de cancer de ovario de 20 pg.

• 900 pl de orina se centrifugo durante 2 minutos a 10.000 g

• se elimino el sobrenadante

• el sedimento restante se disolvio en 15 pl de tampon de muestra PAGE (que contiene LDS 292 mM) y posteriormente

• se hirvio a 70°C durante 10 min

• la muestra completa (aprox. 20 pl) se cargo en el gel de bis-tris NuPAGE (Invitrogen)

• Despues de la electroforesis, las protemas se transfirieron a una membrana de PVDF

• 1% de leche descremada/0,05% de Tween 20/PBS se anadio para bloquear

• la membrana se lavo con 0,05% de Tween 20/PBS

• 0,5 mL de anticuerpo monoclonal 548 908 (R&D Systems) a 2 pg/ml se anadio y se incubo durante 60 minutos a temperatura ambiente

• la membrana se lavo con 0,05% de Tween 20/PBS

• se anadio 10 mL de IgG anti-raton-HRP (DAKO 2000 p0447, 1) y se dejo incubar durante 60 minutos

• la membrana se lavo con 0,05% de Tween 20/PBS

• eustrato Pierce ECL se anadio a la membrana

• la membrana se retiro de los sustratos y despues se obtuvieron imagenes usando LAS-3000 del sistema (FUJIFILM)

Resultados

[0280] La inmunotransferencia resultante se muestra en la Figura 3. En esta figura, carriles 1-5 corresponden a FRa detectada a partir de las siguientes fuentes:

(1) orina de pacientes con cancer de ovario con un nivel de FRa medido de 18.747 pg/ml

(2) orina de pacientes con cancer de ovario con un nivel de FRa medido a 145.564 pg/ml

(3) lisado de celulas HeLa: 10 pg

(4) lisado de tejido de tngado: 20 pg

(5) lisado de tejido de cancer de ovario: 20 pg

[0281] El carril 6 en la transferencia Western representa marcadores de peso molecular y demuestra que la banda observada en los carriles 1,2, 3 y 5 se ejecuta en el peso molecular esperado para FRa.

[0282] Los carriles 3 y 5 son muestras de control positivo y el carril 4 es una muestra de control negativo. La banda debil en el carril 1 y la banda clara en el carril 2 demuestra que FRa puede detectarse en el sedimento de la orina de pacientes con cancer de ovario en la Transferencia Western.

EJEMPLO 6. determinacion de niveles fra en muestras de orina humana normal tratadas por guanidina poe inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (eclia).

[0283] Sobre la base de los resultados del Ejemplo 4 en el que centrifugacion resulto en niveles disminuidos de FRa, y los resultados del Ejemplo 5, donde se demostro que el sedimento de orina obtenido a partir de la centrifugacion para contener inmunorreactiva FRa, se buscaron metodos para solubilizar los sedimentos de orina para obtener mediciones mas cuantitativas y precisas de FRa.

[0284] En este sentido, se intento el tratamiento de las muestras de orina hembra normales con guanidina antes de la evaluacion de niveles FRa.

[0285] La metodologfa utilizada era como se describe en el Ejemplo 1, excepto que las muestras de orina se mezclaron en una relacion 1:1 ya sea con guanidina 6 M en tampon (PBS) o tampon solo. Posteriormente, las muestras de orina se diluyeron por 1:51 en tampon de reaccion.

[0286] Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Nivel de FRa normal en orina con o sin tratamiento de guanidina

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Muestra: Tratamiento de guanidina FRa (pg/ml)

: std Ag Si 83964


: No 82512

Orina normal: 1 Si 9431


: No 7796

: 2 Si 5713


: No 4066

: 3 Si 9687


: No 9428

[0287] Los resultados de este experimento indican que guanidina no interfiere con mediciones de FRa. Como se puede observar para el control de antfgeno puro (Std Ag), esta metodologfa de tratamiento de guanidina y posterior dilucion no tiene ningun efecto en la medicion de FRa. Ademas, se notara que en las tres (3) muestras de orina evaluadas, los niveles de FRa fueron mayores en las muestras tratadas (solubilizadas) con guanidina en relacion con las muestras no tratadas con guanidina.

[0288] La fiabilidad de pre-tratamiento de guanidina de las muestras de orina se evaluo adicionalmente mediante la exposicion de tres muestras a guanidina y la medicion de la concentracion FRa de cada muestra de guanidina tratada 3 veces usando el ensayo ECLIA. Los resultados se reflejan en la Tabla 9 a continuacion:

Tabla 9: Reproducibilidad intra-ensayo de orina tratada con guanidina

: FRa (pg/ml)

Prueba: Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

1: 9210 5477 9889

2: 9638 5405 10 047

3: 10192 5812 10944

Media: 9680 5565 10293

SD: 492 217 569

CV(%): 5.1 3.9 5,5

[0289] Como se ha expuesto anteriormente, los resultados indican que el tratamiento de guanidina de la orina antes del ensayo FRa proporciona mediciones consistentes de concentracion FRa con CV muy bajos.

EJEMPLO 7. determinacion de los niveles fra en muestras de orina tratadas con guanidina de sujetos humanos con y sin cancer del ovario medidas por inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (eclia).

[0290] Sobre la base de los resultados del Ejemplo 6 en el que se muestra que el tratamiento de guanidina no interfiere con ensayos de FRa, un protocolo de ensayo modificado se empleo para medir FRa en las muestras de orina de los sujetos con y sin cancer de ovario en el Ejemplo 1.

[0291] se empleo el siguiente protocolo de ensayo:

Materiales y metodos

[0292] La metodologfa utilizada era como se describe en el Ejemplo 1, excepto que las muestras de orina se mezclaron en una relacion 1:1 con un tampon de guanidina 6 M y posteriormente se diluyeron 1:26 en tampon de reaccion.

Resultados

[0293] La Tabla 10 muestra los niveles de FRa en muestras de orina tratadas de guanidina de sujetos aquejados de cancer del ovario y sujetos de control sanos.

Tabla 10: Nivel de FRa en la orina en el cancer de ovario y el grupo de control normal

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Grupo: Muestra # FRa (pg/ml)

cancer de ovarios: 1 27015

2: 37315

3: 79579

4: 285

5: 1864

6: 2902

7: 279 14

8: 51864

9: 2699

10: 9455

11: 18396

12: 145564

13: 19046

14: 10440

15: 10977

16: 9199

17: 18223

18: 18747

19: 51098

control normal: 20 8012

21: 3797

22: 3323

23: 20976

24: 6941

25: 14512

26: 7286

27: 2789

28: 2617

29: 7233

[0294] La Figura 4 muestra la distribucion de niveles FRa en la orina de sujetos con cancer de ovario y sujetos normales de sexo femenino de control utilizando el protocolo modificado con el tratamiento de guanidina. Se observo una diferencia estadfsticamente significativa entre los grupos. La Tabla 11 resume estos resultados.

Tabla 11: Resumen de la medicion de FRa en orina

: FRa (pg/ml)

: cancer de ovarios control normal

N: 19 10

Media: 28557 7749

SD: 34990 5850

Max.: 145564 20976

Min.: 285 2617

[0295] Mediante el uso de los datos de este experimento, un analisis de caractenstica operativa del receptor (ROC) se realizo). La Figura 5 muestra una curva de ROC de la sensibilidad y especificidad de la medicion ECLIA de niveles FRa en orina despues de que la orina se trato con guanidina. AUC es el area bajo la curva, que mide la exactitud de la prueba para separar cancer de ovario de los sujetos de control.

[0296] Mediante el uso de un valor de corte arbitrario de 9100 pg FRa/ml, el AUC era de 0,70 con un valor predictivo positivo de 70% y un valor predictivo negativo del 80%, como se muestra en la Tabla 12. El uso de este valor de corte, 15/19 pacientes con cancer de ovario tema una concentracion de FRa encima de 9100 pg/ml y 8/10 sujetos normales teman una concentracion de FRa inferior a 9100 pg/mL.

Tabla 12: Tratamiento de guanidina para la medicion de la orina

: cancer de ovarios controlar

Numero de muestras: 19 10

Positivo: 15 2

Valor predictivo (%): 78,9 80,0

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EJEMPLO 8: correccion de creatinina de concentraciones fra determinada en muestras de orina tratadas con guanidina mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (eclia)

[0297] Las concentraciones de FRa se determinaron previamente utilizando ECLIA de muestras de orina tratadas de guanidina de pacientes con cancer de ovario y controles de las mujeres normales (vease el Ejemplo 7, Tabla 10). Aqrn, estas concentraciones de FRa fueron corregidas para los niveles de creatinina de orina con el fin de normalizar para la velocidad de filtracion glomerular. Los valores resultantes se sometieron a un analisis ROC.

Metodos

[0298] El nivel de creatinina urinaria se determino por el kit de prueba aprobado por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, determinante L CRE (Kyowa Medex, Japon). El valor corregido para concentracion de FRa en orina se calculo del siguiente modo:

Correccion de creatina de FRa de orina (ng/g)

=(Orina FRa (ng/L) x 1000) / (Creatina de orina (mg/dL) x10)

=(orina FRa (ng/L) x 1000) / (Creatina de orina (mg/L)

=(Orina FRa (ng/L) / (Creatina de orina (g/L)

=(Orina FRa (ng) / (Creatina de orina (g) o

= 1/1000 x Orina FRa (pg) / Creatina de orina (g)

Resultados

[0299] La Tabla 13 presenta los niveles de FRa de creatinine corregida resultantes.

Tabla 13: Niveles de FRa de creatinine corregida determinados usando ECLIA de muestras de orina tratadas con guanidina

Grupo: Muestra # FRa (pg/ml) Corregido FRa (pg FRa/g creatinina)

: 1 27015 11,6

: 2 37315 37,8

: 3 79 579 33,9

: 4 285 0,6

: 5 1864 6,7

: 6 2902 7,1

: 7 27914 54,9

: 8 51864 17,1

cancer de: 9 2699 13,5

ovarios: 9 9455 14,5

: 10 18396 23,1

: 11 145564 66,0

: 12 19046 9,1

: 13 10440 8,5

: 14 10977 7,4

: 15 9199 5,9

: 16 18223 13,0

: 17 18747 9,6

: 18 3797 7,7

: 19 3323 7,9

: 20 20976 10,7

: 21 6941 4,3

control normal: 22 14512 8,6

23: 7286 13,8

: 24 2789 4,3

: 25 2617 1,9

: 26 7233 3,1

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[0300] La Figura 6 muestra la distribucion de niveles FRa en cancer de ovario (OC) y sujetos de control femininos normales despues de la correccion para los niveles de creatinina en orina. Hay una diferencia estadfsticamente significativa entre los pacientes de cancer de ovario y los controles de niveles de FRa de creatinina corregida (p=0,007).

[0301] Los datos de resumen para el cancer de ovario y de sujetos de control normales se proporcionan en la Tabla 14.

Tabla 14: Resumen de las estadisticas para niveles de FRa de creatinina corregida

: FRa (pg/g-creatinina)

cancer de ovarios: control normal

N: 18 9

Media: 18,9 6,9

Dakota del Sur: 17,9 3,9

Max.: 66.0 13,8

Min.: 0,6 1,9

[0302] Los niveles de FRa de creatinina corregida se sometieron ademas a un analisis ROC. La curva ROC se muestra en la Figura 7. La Tabla 15 presenta la sensibilidad, especificidad, y el area bajo la curva (AUC) para varios valores de corte de la prueba de creatinina corregida.

Tabla 15: Sensibilidad, especificidad y AUC para varios valores de corte de la prueba de FRa de creatinina corregida

Lfmite: Sensibilidad Especificidad AUC

3,0: 94,4% 11,1% 0,67

4.0: 94,4% 2-2,2-% 0,70

5.0: 94,4% 44,4% 0,78

6.0: 88,9% 44,4% 0,74

9,0: 66,7% 77,8% 0,70

[0303] Como se senalo anteriormente, existe una clara discriminacion entre orinas de pacientes con cancer de ovario y las de los sujetos de control sanos femeninos.

EJEMPLO 9: inmunoensayo enzimatico (eia) y optimizacion del mismo

1. Inmunoensayo enzimatico (EIA)

Recubrimiento de anticuerpo a placas de microtitulacion

[0304] El anticuerpo receptor alfa anti-folato monoclonal se revistio sobre la superficie de placas de microtitulacion (Nunc-inmunoplaca, Thermo Scientific) del siguiente modo. Cien microlitros de anticuerpo (absorbancia 0,02 a 280 nm) en 50 mmol/L de tampon carbonato de pH 9,4 se dispenso en los pocillos, seguido de revestimiento durante 16 horas a 4°C. A continuacion, las microplacas se lavaron 2 veces con PBS que contema 0,05% de Tween 20 (PBS-T). Despues de esto 0,15 mL de PBS que contema 20% pH suero normal de conejo 7.8 se dispensaron en los pocillos para bloquear la superficie sin lfmites, seguido de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Por ultimo, las microplacas se lavaron 2 veces con PBS-T. Las placas recubiertas de anticuerpo se secaron y se mantuvieron a 4°C en bolsas de aluminio hasta su uso.

Etiquetado de biotina

[0305] El etiquetado con biotina se realizo de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes para EZ-Link Sulfo-NHS LC-LC-Biotina (N° de Producto 21338, Thermo Scientific). Brevemente, 1 mg de anticuerpo en 0,4 mL de PBS se mezclo con 0,013 mL de 10 mM de Sulfo-NHS-LC-LC-biotina, con una relacion inicial molar de anticuerpo a la biotina de 1:20, seguido de incubacion durante 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo acoplado de biotina se purifico por filtracion en gel utilizando una columna EP-10 (GE Healthcare) se eluyo con PBS para eliminar la biotina que no ha reaccionado. Con el fin de determinar el nivel de incorporacion de biotina, se utilizo el kit de cuantificacion EZ Biotina

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(Producto N° 28005, Thermo Scientific). El anticuerpo marcado con biotina se almaceno a -80°C hasta su uso.

Inmunoensayo de dos etapas

[0306] Para la primera reaccion, 40 pl de plasma o antfgeno estandar y 60 pl de tampon HEPES 50 mM que contiene 10% NRS, 150 mmol/L de NaCl,10 mmol/l de EDTA-2Na, 0,01% de Tween 20, pH 7,5 (tampon de reaccion) se dispenso en los pocillos recubiertos de anticuerpo. La placa se incubo durante 18 horas a 4°C, y posteriormente se lavaron 5 veces con PBS-T. Para la segunda reaccion, 100 pl de 10 m se dispenso g/ml de anticuerpo marcado con biotina en tampon de reaccion. La placa se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente, y posteriormente se lavo 5 veces con PBS-T. 100 pl de estreptavidina (Pierce) marcada con peroxidasa de rabano picante se dispenso. Despues de 30 minutos de incubacion a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5 veces con PBS-T. Finalmente, para el desarrollo del color, 100 pl de solucion de tMb (KPL) se dispenso y se dejo durante 15 minutos en la oscuridad. Despues de parar el desarrollo del color mediante la adicion de 100 pl de 1N HCl, la absorcion a 450 nm se leyo usando un lector de placas. Todas las etapas de lavado se realizaron automaticamente por la lavadora automatica de placas (AMW-8, Biotec, Japon), y todas las mediciones EIA se llevaron a cabo por duplicado.

[0307] La Figura 8 representa el ensayo EIA usando MOV18 como anticuerpo de captura y MORAb- 003 biotinilado como anticuerpo detector.

2. Optimizacion de los procedimientos de EIA

[0308] Los procedimientos de EIA anteriores se formularon, en parte, basandose en los siguientes experimentos disenados para optimizar el procedimiento.

[0309] En primer lugar, se compararon anticuerpo, avidina-HRP, anticuerpo marcado con biotina y marcado con HRP. En comparacion con anticuerpo marcado con HRP, el anticuerpo marcado con biotina y avidina-HRP proporcionaron una senal mas alta; por lo tanto, se emplearon anticuerpo marcado con biotina y avidina-HRP.

[0310] En segundo lugar, se compararon los procedimientos de incubacion de una y dos etapas. Como se representa en la Figura 9, un procedimiento de incubacion de dos etapas dio una senal mas alta y por lo tanto se empleo.

[0311] En tercer lugar, para optimizar el segundo tiempo de incubacion, se compararon los tiempos de incubacion de una a cuatro horas. Los resultados indicaron que los tiempos de incubacion de una hora proporcionan la senal mas alta a ruido y por lo tanto se empleo posteriormente un tiempo de incubacion de una hora.

[0312] En cuarto lugar, con el fin de optimizar la concentracion de trabajo de anticuerpo marcado con biotina, anticuerpos marcados con HRP y volumen de la muestra, se emplearon diferentes concentraciones como se expone en la descripcion anterior del ensayo ElA. Las optimas concentraciones de valores se describen anteriormente.

EJEMPLO 10: COMPARACION DE LA FRA EN PLASMA HUMANO USANDO INMUNOENSAYO DE ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECLIA) Y INMUNOENSAYO ENZIMATICO (EIA)

[0313] Los niveles de FRa se midieron en muestras de plasma humano tomadas de pacientes del cancer ovarico y controles femininos sanos utilizando el ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) descrito en el Ejemplo 1 y la Figura 1 (utilizando MORAb-003 como anticuerpo de captura y rutenio (Ru) marcado con MOV-18 como anticuerpo detector marcado) y el inmunoensayo enzimatico (EIA) como se describe en el Ejemplo 9 y la Figura 8. En ambos ensayos, se ensayo 40 pL de plasma.

[0314] La Tabla 16 muestra los niveles plasmaticos de FRa en el cancer de ovario y de sujetos de control normales, como se determina usando el EIA y ECLIA.

Tabla 16: Las concentraciones plasmaticas de FRa determinadas usando metodos de EIA y

ECLIA

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Grupo: Muestra # Concentracion FRa (pg/ml)

EIA: ECLIA

Cancer de ovarios: 1 10 73

2: <10 200

3: 56 286

4: 44 286

5: 353 1606

6: 83 494

control sano: 7 110 127

8: 162 112

9: 88 252

10: 180 254

11: 262 471

12: 206 396

[0315] Con una sola excepcion, los resultados para todos los sujetos indicaron que las concentraciones de FRa detectadas en suero utilizando EIA son mas bajos que los niveles detectados usando ECLIA, lo que demuestra que el ensayo EIA, con este formato, no es tan sensible como el ensayo ECLIA cuando esta combinacion particular de captura (MOV-18) y el detector de anticuerpos (MORAb- 003) se emplea. Por lo tanto, se llevaron a cabo experimented adicionales con otros tipos de anticuerpos para desarrollar un procedimiento de EIA mas sensible.

EJEMPLO 11: VIABILIDAD DE LOS DIFERENTES TIPOS DE ANTICUERPOS PARA MEDICION EIA DE FRa EN EL PLASMA HUMANO

1. Experimentacion preliminar de combinaciones de anticuerpo

[0316] Se consideraron varias combinaciones de anticuerpos de captura/deteccion. La experimentacion preliminar rindio los resultados expuestos en la Tabla 17.

Tabla 17


: Anticuorpo do captura

MORAB-003: MOV 18 5489081 R&D) 6D398

J l «§ >» Z x S £ v ~ -Z s ” s: 003 Est, on bianco 1.8 Bajo Eat. en bianco 1-S Bajo +++ -*-+ Eat. en bianco 1-S Bajo ++ ++ Eat. en bianco 1-S Alto ++ +

MOV 18: Est. on bianco 1-S Bajo * Eat. en bianco 1-S _____ Alto +++ Est. en bianco 1-S Alto -Hr Est. en bianco 1-S Hi*h +++

548908: Est. en bianco 1-S Bajo ++

2.Comparacion de ensayos de EIA usando varias combinaciones de anticuerpos y comparacion con el ensayo ECLIA

[0317] Los niveles de FRa en el plasma de pacientes con cancer de ovario y controles normales femininos sanos se midieron usando un ensayo inmunoenzimatico enlazado con enzimas (EIA) con diferentes combinaciones de anticuerpos de captura y marcados con biotina y en comparacion con los niveles de FRa medidos usando el ensayo ECLIA.

Materiales y metodos

[0318] El metodo ECLIA era como se describe en el Ejemplo 1 y se representa en la Figura 1 (usando el anticuerpo MORAb-003 como anticuerpo de captura y el anticuerpo Mov-18 como anticuerpo detector marcado). El metodo EIA era como se describe en el Ejemplo 9, excepto que las tres combinaciones diferentes de anticuerpos captura/detector se emplearon, tal como se representa en la Figura 10: MOV18/MORAb-003, 548,908/MORAb-003 y 6D398/MORAb-003. Los anticuerpos 548908 y 6D398 estan disponibles comercialmente. El anticuerpo 548908 se obtuvo de R&D Systems (North Las Vegas, NV) y el anticuerpo 6D398 se obtuvo de US Biological (Swampscott, MA 01907).

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Resultados

[0319] Las concentraciones de FRa (pg/ml) determinadas usando los metodos EIA y ECLIA se muestran en la Tabla 18. Ademas, las concentraciones de FRa (pg/ml) determinadas por EIA usando varias combinaciones de anticuerpos de captura/detector se representan graficamente en la Figura 11.

Tabla 18: Las concentraciones plasmaticas de FRa (pg/ml) determinada usando el EIA y metodos ECLIA con diversas combinaciones de anticuerpos de captura y el detector.

Grupo: Muostra # EIA 548908-MORAb-003 EIA 6D398-MORA6-003 EIA MOV18-MORAb-003 ECLIA MOV18-MORAO-003

C&ncer do ovario: 1 176 2 10 217

2: 85 <0 165

3: 257 35 - 296

4: 117 42 44 322

5: 2048 370 353 1335

6: 447 63 83 390

Control normal: 7 247 66 110 137

S: 213 110 162 185

9: 367 76 88 219

10: 364 152 180 228

11: 804 224 262 388

12: 473 194 206 318

[0320] Los datos de la Tabla 18 indican que las mediciones de niveles FRa con EIA utilizando la combinacion 54908-MORAb-003 da resultados que son mas similares a los resultados obtenidos utilizando el ensayo de ECLIA. Se realizaron analisis cuantitativos, lo que confirma esta observacion. Ademas, estos datos demuestran que la deteccion de FRa es dependiente de los anticuerpos y anticuerpos de combinacion empleados. Por consiguiente, diferentes combinaciones de anticuerpos se pueden emplear para la determinacion de FRa en fluidos biologicos. Ademas, ya que los datos obtenidos de los formatos de ensayo EIA y ECLIA son similares, diversos formatos de ensayo se pueden utilizar para la determinacion de FRa.

[0321] Para cada una de las tres combinaciones de anticuerpos de captura y detector utilizadas para el metodo de EIA, se realizo un analisis de regresion, y las concentraciones de FRa (pg/ml) determinadas con EIA se correlacionaron con las concentraciones determinadas con el ensayo ECLIA. Los resultados de este analisis se muestran en la Tabla 19 y en la Figura 12.

Tabla 19: Correlaciones de las concentraciones plasmaticas de FRa medidos por ECLIA con concentraciones medidas por EIA utilizando tres combinaciones de anticuerpos de captura y detector

Anticuerpo de captura anticuerpo- detector: 548098-003 MORAb- 6D398- MORAb-003 MOV18- MORAb-003

r: 0,960 0,781 0,715

Pendiente: 1,595 0,285 0,223

Interceptacion: -87,06 -0,64 58,62

[0322] Los resultados para EIA utilizando la combinacion de captura-detector 548098-MORAb-003 se correlacionaron bien (r=0,96) con los resultados para ECLIA.

EJEMPLO 12: niveles de plasma de fra determinados por eia y eclia en muestras de pacientes con cancer ovario

[0323] Las mediciones de niveles de FRa en suero se determinaron en un grupo de pacientes con cancer de ovario (n=17) y controles normales (n=35) utilizando ECLIA y EIA. Para las mediciones de la EIA, se empleo la combinacion de anticuerpo detector 548908 captura/MORAb-003. De otra manera, el procedimiento EIA era como se describe en el Ejemplo 9. El procedimiento ECLIA era como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 20.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

abla 20: Concentraciones de plasma FRa en pacientes con cancer de ovario y controles normales, como se determina usando EIA y ECLIA

Grupo: Muestra # EIA ECLIA

pg/mL
pg/mL

: 1 245. 217

: 2 247 223

: 3 194 229

: 4 2613 1335

: 5 154 153

: 6 319 215

: 7 516 390

Cancer de ovarios: 8 370 271

: 9 933 449

: 10 4768 4502

: 11 385 266

: 12 251 322

: 13 404 349

: 14 338 371

: 15 4147 2344

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Grupo: Muestra # EIA ECLIA

pg/mL
pg/mL

: 16 179 165

: 17 380 296

: 18 232 181

: 19 372 173

: 20 332 189

: 21 380 203

: 22 376 290

: 23 406 217

: 24 281 182

: 25 348 191

: 26 490 247

: 27 253 137

: 28 368 185

: 29 338 195

: 30 289 219

: 31 338 206

: 32 406 226

: 33 365 228

: 34 501 280

Controlar: 35 806 388

: 36 613 286

: 37 380 250

: 38 420 281

: 39 393 280

: 40 552 284

: 41 664 318

: 42 429 261

: 43 499 286

: 44 310 218

: 45 281 217

: 46 215 202

: 47 293 217

: 48 380 256

: 49 270 195

: 50 393 234

: 51 425 308

: 52 226 199

0324] La Figura 13 muestra la distribucion de concentraciones de FRa de plasma en sujetos con cancer de ovario y sujetos de control femininos normales como se determina usando EIA.

[0325] La Tabla 21 muestra las estadfsticas descriptivas de resumen para las concentraciones de FRa de plasma en cancer de ovario y sujetos de control normales femeninos como se determino usando EIA.

Tabla 21: Resumen de concentraciones plasmaticas FRa en el cancer de ovario y de sujetos de control femininos normales como se determino usando EIA.

: FRa (pg/ml)

: Cancer de ovarios Control normal

N: 17 35

Media: 967 389

SD: 1438 126

Max.: 4768 806

Min.: 154 215

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0326] La Figura 14 representa aun mas la correlacion entre las concentraciones plasmaticas FRa determinadas utilizando EIA y ECLIA. La correlacion es alta (r=0 0,95).

EJEMPLO 13. determinacion de niveles fra en muestras de orina y suero de pacientes con cancer de pulmon y pacientes con cancer ovarico como medidas por inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (eclia)

[0327] Niveles de FRa se determinaron en muestras de orina y suero de pacientes de cancer de pulmon y pacientes con cancer de ovario usando ECLIA donde se tomaron las muestras del mismo paciente. La correlacion entre los niveles FRa de suero y de orina tambien se determino.

Materiales y metodos

[0328] La metodologfa ECLIA utilizada es como se describe en el Ejemplo 1. La guanidina fue utilizada para solubilizar los sedimentos de orina tal como se describe en el Ejemplo 6.

Resultados

[0329] Los resultados de los ensayos de ECLIA de suero y orina de pacientes con cancer de pulmon y pacientes de cancer de ovario se presentan en la Tabla 22.

Tabla 22: FRa concentraciones en las muestras de orina y suero de pacientes con cancer pulmonar y pacientes de cancer de ovario, como se determina por ECLIA


: Suero Orina

Grupo: ID de conjunto pg/mL pg/mL

Cancer de pulmon: 1 146 2009

2: 153 4496

3: 206 -

4: 70 3562

5: 195 12381

6: 352 21873

7: 198 11296

8: 120 18570

9: 275 4455

10: 163 8662

11: 145 5294

12: 178 -

13: 165 1106

14: 187 7446

15: 168 11167

16: 217 24448

17: 142 6724

18: 177 14514

19: 236 822

20: 101 4826

21: 145 7723

22: 213 9887

23: 143 7422

24: 253 3376

25: 421 8045

26: 282 9414

27: 1605 7651

28: 240 13059

29: 695 10549

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0330] Los datos resumidos para niveles FRa de suero y orina de pacientes con cancer de pulmon se presentan en la Tabla 23.

Tabla 23: Resumen de las estadisticas para concentraciones FRa en las muestras de suero y orina de pacientes de cancer de pulmon, segun lo determinado por ECLIA

Cancer de pulmon: FRa (pg/ml)

Suero: Orina

N: 25 23

Media: 191 8700

SD: 75 6291

Max.: 421 24448

Min.: 70 822

[0331] Los datos resumidos para niveles FRa de suero y de orina de pacientes con cancer de ovario se presenta en la Tabla 24.

Tabla 24: Resumen de las estadisticas para concentraciones FRa en las muestras de suero y orina de pacientes de cancer de ovario, como se determina por ECLIA

Cancer de ovarios: FRa (pg/ml)

: Suero Orina

N: 4 4

Media: 705 10168

SD: 634 2266

Max.: 1605 13059

Min.: 240 7651

[0332] La Figura 15

muestra las

correlaciones entre las medidas de ECLIA de niveles FRa en muestras de suero y orina tomadas del mismo paciente. La correlacion para pacientes con cancer de pulmon era de r=0,24 (panel superior) y la correlacion para los pacientes con cancer de ovario era de r=-0,76 (panel inferior).

[0333] Estos datos demuestran la relativa falta de correlacion entre las concentraciones de FRa medidas en la orina en comparacion con el suero, especialmente como se muestra para pacientes de cancer de pulmon. Ademas, estos datos demuestran que FRa es basicamente no detectable por encima de los niveles de fondo en el suero de pacientes con cancer de pulmon frente a los controles normales mientras que FRa es detectable en la orina de estos pacientes.

EJEMPLO 14. evaluacion de los niveles de fra en muestras de suero de pacientes con cancer de ovario, los pacientes con cancer de pulmon, y los controles normales

[0334] Se evaluaron niveles de FRa en el suero de pacientes con cancer de ovario, los pacientes con cancer de pulmon, y controles normales. Niveles de FRa en suero se evaluaron usando ECLIA con dos pares diferentes de anticuerpos de captura-detector: Par 1, en el que 9F3 era el anticuerpo de captura y 24F12 era el anticuerpo detector, y el Par 2, en el que 26B3 era el anticuerpo de captura y 19D4 era el anticuerpo detector.

[0335] Los pares de FRa se ensayaron con las curvas de calibrador completo y 196 sueros individuales diluidos 1: 4. En un experimento, 26B3 se utilizo como anticuerpo de captura despues del procesamiento CR en un lote de placa (75 pg/ml, +B, +T) y 19D4 se uso como el anticuerpo detector a 1,0 pg/mL. En otro experimento, 9F3 se uso como el anticuerpo de captura y 24F12 se utilizo como anticuerpo detector en 1,0 pg/mL. Cada uno se proceso por Cr (lote 10070) con una proporcion de etiqueta a protema (L/P) de 13.3. El diluyente 100 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) + anticuerpo anti-raton humano (HAMA) + mIgG se utilizo para las muestras y calibrador. Eldiluyente 3 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) se utilizo para las detecciones.

[0336] Se empleo el siguiente protocolo para ECLIA. Se anadieron las muestras a 50 pl/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas y posteriormente se lavaron con solucion salina de tampon fosfato (PBS) con el detergente Tween 20 (PBST). El anticuerpo detector se anadio a 25 pl/pocillo. Las muestras se agitaron durante 2 horas y despues se lavaron con PBST. Por ultimo, la emision de electroquimioluminiscencia (ECL) de las muestras se leyo con 2X MSD® Buffer T.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0337] Los resultados se muestran en la Tabla 25 a continuacion.


: in o 1— ra #-■ c £ o [_) 0 c — 6 i S g 03 £ 1 ra E7 1 £ & CD Q I' W3 e 3 ■£ ■n > 9 •. £ T3 < e ~ -T 9 rn e i eg 6 o c '0 eg o o C 0) ■o 03 tfj b CP £ Q C O cd _ o cz: ds o CP "5 o eg E 0 c 'y CD 0 o c 0 0 03 4—* V? b eg 1 o £ 'u Ed g o sz d) 0 03 +■3 CO Q ra E o c ra D O c (U o <5 CO b l eg c= I cr V on CO E= c w ■TS 911 E .5 “ 5 P o b m' : : TJ u


: P e 3 Li, LL Li. Ll Ll, LL LL Ll LL LL Ll Ll LL


: o TJ n c 0 tO <N <N <N *N <N - *0 o TJ S3 on e ca


: f2 3. C M LU - - y - > y jtJ o o y m m £fl

: b n? CL £ yu > S3 ■’t- 6? CM S3 CD S3 o S3 CM !P S3 S3 CM S3 CM S3 I2"l S3 CM OQ

_1 E Ei! Cl LD li 8 _i _i: 0 _. a- _J 3 E Ja £ 3 ■o S L* W 1 3 o s o m lift CD 9? cn CD K rj CD mt ■77 CD CD 3 CD <P TF CD H r-- | CD is UD a CD «( CD cfi CD i-o OQ B

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: 'I' ^ 3 E E 3 ra Z * 131 a c « - s Ul ^ qi H - tN =0 -Tj CD h O £ CM to

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Un metodo de evaluacion de si un sujeto esta afectado con una Cancer que expresa FRa, comprendiendo el metodo la determinacion del nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula, en una muestra de orina derivada de dicho sujeto; y

comparar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula con el nivel de FRa en una muestra de control, en la que una diferencia entre el nivel de FRa en la muestra de orina derivada de dicho sujeto y el nivel de FRa en la muestra de control es una indicacion de que el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa;

en el que el nivel de FRa que no esta unido a una celula en la muestra de orina derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que se une FRa.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el cancer que expresa FRa se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, mesotelioma, cancer de ovario, cancer renal, cancer cerebral, cancer cervical, cancer de la nasofaringe, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, cancer endometrial, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de hueso, cancer de hipofisis, cancer colorrectal y cancer medular de tiroides; opcionalmente en el que el cancer que expresa FRa es cancer de ovario o cancer de pulmon; opcionalmente en el que el cancer que expresa FRa es cancer de pulmon de celulas no pequenas; opcionalmente en el que el cancer no microcftico de pulmon de celulas es adenocarcinoma.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la presencia de FRa en dicha muestra de orina en una concentracion de mas de 9.500 pg/ml, 10.000 pg/ml, 11.000 pg/ml, 12.000 pg/ml, 13.000 pg/ml, 14.000 pg/ml, 15.000 pg/ml, 16.000 pg/ml, 17.000 pg/ml, 18.000 pg/ml, 19.000 pg/ml, o 20.000 pg/ml es una indicacion de que el sujeto esta afectado por cancer de ovario.
4. El metodo de la reivindicacion 1, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

a. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MORAb-003;

b. un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO: 2

(MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3;

c. el anticuerpo MOV18;

d. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo MOV18;

e. el anticuerpo 548.908;

f. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 548.908;

g. el anticuerpo 6D398;

h. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 6D398;

i. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 26B3;

j. un anticuerpo que comprende la sEq ID NO: 55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO: 52-(NAKTLAE) como CDRL2 y SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) como CDRL3;

k. el anticuerpo 26B3;

l. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 19D4;

m. un anticuerpo que comprende la SEQ iD nO: 39 (HPYM-H+) como CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 41-(EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 35-(RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) como CDRL2 y SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) como CDRL3;

n. el anticuerpo 19D4;

o. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 9F3;

p. un anticuerpo que comprende la SEQ iD nO: 31-(SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO: 32- (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRHH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) como CDRL3;

q. el anticuerpo 9F3;

r. un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el anticuerpo 24F12;

s. un anticuerpo que comprende la sEq ID No: 47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRHH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) como CDRL2 y SEQ ID NO: 45-(QHFSKLPWT) como CDRL3;

t. el anticuerpo 24F12;

u. un anticuerpo que comprende una cadena ligera de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); y LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

v. un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la region variable seleccionada del grupo que consiste en LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I, I (SEQ ID NO: 20); y LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);

w. un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16);

x. un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16); y

y. (Y) un anticuerpo que comprende la region de cadena pesada variable LK26HuVH FAIS, N (SEQ ID NO: 18) y la region variable de cadena ligera LK26HuVKPW, Y (SEQ ID NO: 16).
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es (a) seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo quimerico, un fragmento Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, aficuerpo, avimer, versacuerpo, nanoanticuerpo, y un dominio de anticuerpo; o (b) marcado; opcionalmente en el que el anticuerpo esta marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un marcador radiactivo, un marcador de biotina, una etiqueta cromoforo, un marcador fluoroforo, un marcador ECL y una etiqueta enzima.
6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el nivel de FRa se determina mediante el uso de una tecnica seleccionada de entre el grupo que consiste en el analisis de Transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetna, inmunoprecipitacion, el dialisis de equilibrio, inmunodifusion, ensayo de fase de solucion, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) y el ensayo de ELISA.
7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra de control comprende un nivel de control estandarizado de FRa en un sujeto sano.
8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra de orina es (a) se trata con guanidina antes de determinar el nivel de FRa en la muestra de orina; o (b) diluido antes de determinar el nivel de FRa en la muestra de orina; o (c) se centrifuga, se agito con vortex, o ambos, antes de determinar el nivel de FRa en la muestra de orina.
9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el nivel de FRa en la muestra de orina derivada de dicho sujeto se evalua poniendo en contacto la muestra de orina con un par de anticuerpos seleccionados de entre el grupo que consiste en

(a) Anticuerpo MOV18 inmovilizado a un soporte solido y anticuerpo marcado MORAb-003,

(b) Anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y anticuerpo marcado 24F12,

(c) Anticuerpo 26B3 inmovilizado a un soporte solido y el anticuerpo marcado 19D4, y

(d) Anticuerpo 9F3 inmovilizado a un soporte solido y anticuerpo marcado 26B3.
10. El uso de un kit de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la evaluacion de si un sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa en un sujeto, comprendiendo el kit

un medio para determinar el nivel de receptor de folato alfa (Fra) que no esta unido a una celula en una muestra de orina derivada de dicho sujeto; y

instrucciones de uso del kit para evaluar si el sujeto esta afectado con un cancer que expresa FRa o para evaluar la progresion de un cancer que expresa FRa.

imagen1

imagen2

imagen3

I'Ku IpK/ml)

p = 0.010

imagen4

> Control . OC

imagen5

p ■ 0.007 70

60

Control DC

10

0

Fig. Oiatribucidn del nival da FRa rtvmdo por •! valor da raatinina an orina

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

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imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

MORAb-003

MORAb-003

Anticuerpo detector etiquetado

MORAb-003

6D398

548908

Mov-18

Ant icuorpo de captura

FRa (pg/mL)

imagen19

imagen20

Medicion de antieno est

500 1000 1503 2000 2500

FRa (pg mL)

003-Mov18

~-«3~Mcv18-003

543908-0C3

FRa <pg ml)

Distribuci6n de plasma FRa

5000

♦

4500

4000

♦

1500

1000

2500

♦

2000

1500

1000

4

500

4 n i-

i k_

I ?

0

♦ OC NC

ECl(p*/mll

imagen21

orina (pi/nd) or in a (pg/mi)

imagen22

plasma FRct pg/ml

imagen23

lua/M Dgj rujir)d

imagen24

FRa Par 2

imagen25

FRa Par 2

imagen26

Dl» JlOctl

imagen27