ES2285469T3 - Utilizacion de la proteina celular transportadora de acido retinoico de tipo ii (crabp ii) como marcador del cancer de mama. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico del cáncer de mama que comprende los siguientes pasos: a) proporcionar una muestra líquida obtenida de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de unión específica a la proteína celular transportadora de ácido retinoico de tipo II bajo las condiciones adecuadas para que se forme un complejo entre dicho agente de unión y la proteína celular transportadora de ácido retinoico de tipo II y c) correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el diagnóstico del cáncer de mama.
Description
Utilización de la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II (CRABP II) como
marcador del cáncer de mama.
La presente invención está relacionada con el
diagnóstico del cáncer de mama. Describe la utilización de la
proteína celular transportadora de ácido retinoico de tipo II en el
diagnóstico del cáncer de mama. Asimismo, está especialmente
relacionada con un método para el diagnóstico del cáncer de mama a
partir de una muestra líquida procedente de un individuo mediante
la medición de la proteína celular transportadora de ácido retinoico
de tipo II en dicha muestra. La medición de la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II puede emplearse, p.
ej., en la detección precoz o en el diagnóstico del cáncer de
mama.
El cáncer sigue constituyendo uno de los
principales retos de la salud pública a pesar del progreso realizado
en la detección y el tratamiento. Entre los diversos tipos de
cáncer existentes, el cáncer de mama (CM) es uno de los más
frecuentes en las mujeres del mundo occidental.
Cuanto antes se pueda detectar/diagnosticar el
cáncer, mejor será la tasa general de supervivencia. Este hecho es
especialmente válido en el caso del CM. Los estadios avanzados del
tumor presentan un mal pronóstico. Más de un tercio de los
pacientes morirá por el progreso de la enfermedad en un plazo de
cinco años a partir del diagnóstico, lo que corresponde a una tasa
de supervivencia a cinco años aproximada del 40%. El tratamiento
actual solamente está curando una fracción de los pacientes y se
observa claramente un mayor efecto en los pacientes a los que se ha
realizado el diagnóstico en un estadio inicial de la enfermedad.
Con respecto al CM como problema de salud
pública, es esencial que se desarrollen medidas preventivas y de
cribado más efectivas para el cáncer de mama.
Los procedimientos de detección más temprana del
cáncer de mama que están disponibles en la actualidad consisten en
la exploración clínica mamaria y la mamografía. Sin embargo, antes
de que un tumor sea palpable o pueda detectarse en un mamograma,
habitualmente su tamaño ya es significativo. La densidad del tejido
mamario y la edad del paciente son factores importantes de
predicción de la exactitud de la mamografía exploratoria. La
sensibilidad oscila del 63% en mujeres con mamas con una densidad
extrema al 87% en mujeres con mamas con una proporción de tejido
adiposo extremadamente elevada. La sensibilidad aumenta con la edad
del 69% en mujeres de unos 40 años al 83% en mujeres a partir de 80
años (Carney, P.A., et al., Ann. Intern. Med. 138 (3) (2003)
168-175). Solamente el 20-25% de las
anomalías detectadas por mamografía que se biopsian resultan ser
malignas. La visualización de lesiones precancerosas o cancerosas es
la mejor estrategia para la detección precoz, pero la mamografía es
una prueba costosa que requiere una actuación y una interpretación
de los resultados realizadas con un alto grado de habilidad y de
cuidado (WHO, Screening for Breast Cancer, 10 de mayo, 2002;
Esserman, L., et al., J. Natl. Cancer Inst. 94 (2002)
369-375).
En los últimos años se ha descrito una enorme
cantidad de genes denominados específicos de la mama, o incluso
denominados específicos del cáncer de mama. La gran mayoría de los
artículos de investigación o solicitudes de patentes
correspondientes se basan en datos obtenidos mediante el análisis de
los patrones de expresión del RNA en el tejido mamario (canceroso)
comparado con un tejido diferente o con un tejido normal adyacente.
Estas investigaciones se pueden resumir bajo el concepto de técnicas
de visualización de mRNA diferenciales.
La patente WO 00/60076 se mencionará y será
comentada como ejemplo de datos disponibles de técnicas de
visualización de mRNA. Esta solicitud describe y reivindica más de
doscientos polinucleótidos aislados y sus polipéptidos
correspondientes, así como su empleo en la detección del CM. No
obstante, es de conocimiento general que las diferencias en la
cantidad de mRNA no se reflejan en el nivel de las proteínas
correspondientes. Una proteína codificada por un mRNA escaso puede
encontrarse en cantidades muy elevadas y una proteína codificada por
un mRNA abundante puede sin embargo ser prácticamente imposible de
detectar o encontrar (Chen, G., et al., Molecular and
Cellular Proteomics, 1.4 (2002) 304-313). Esta falta
de correlación entre la cantidad de mRNA y la cantidad de proteína
se debe a razones como la estabilidad del mRNA, la eficiencia de la
traducción, la estabilidad de la proteína, etc. También existen
estrategias de investigación recientes sobre las diferencias en los
patrones proteicos entre diferentes tejidos o entre tejidos sano y
enfermo con el fin de identificar moléculas marcadoras candidatas
que puedan emplearse en el diagnóstico del CM. Wulfkuhle et
al. Cancer Research 62 (2002) 6740-6749 han
identificado cincuenta y siete proteínas que se expresaron de forma
diferencial en tejido mamario canceroso y tejido normal adyacente.
No se informó de ningún dato procedente de muestras líquidas
obtenidas de un individuo.
La patente WO 02/23200 describe cerca de doce
manchas asociadas a cáncer de mama halladas mediante desorción e
ionización por láser en superficie mejorada (SELDI, siglas en
inglés). Estas manchas se observan con mayor frecuencia en sueros
obtenidos de pacientes con CM que en los obtenidos de controles
sanos. Sin embargo, se desconoce la identidad de la/s molécula/s
que conforman dicha mancha, p. ej. su secuencia.
Durante muchos años se han utilizado secreciones
mamarias obtenidas a través del pezón como método no invasivo
potencial para identificar marcadores específicos del cáncer de
mama. Kuerer et al. compararon las secreciones mamarias
emparejadas obtenidas a través de los dos pezones de mujeres con
carcinoma de mama invasivo unilateral mediante electroforesis en
gel 2D (Kuerer, H.M., et al., Cancer 95 (2002)
2276-2282). Se detectaron de 30 a 202 manchas
proteicas diferentes en las secreciones mamarias obtenidas a través
del pezón de mamas con carcinoma de mama y no en las secreciones
mamarias correspondientes obtenidas a través del pezón de las mamas
sanas. Estas manchas se detectaron mediante un análisis de imagen
de gel. No obstante se desconoce identidad de las manchas
proteicas. A pesar del enorme listado, que no para de crecer, de
marcadores proteicos candidatos en el campo del CM, hasta la fecha
se desconoce la utilidad clínica/diagnóstica de estas moléculas.
Para que tenga utilidad clínica, un marcador diagnóstico nuevo como
marcador individual debe ser por lo menos igual de bueno que el
mejor marcador individual que se conoce en el campo. O bien, un
marcador nuevo debería suponer una mejora de la sensibilidad o la
especificidad del diagnóstico, tanto si se emplea de forma
individual como en combinación con uno o varios marcadores
diferentes. La sensibilidad o la especificidad diagnóstica de una
prueba se valora mejor por sus características de rendimiento
diagnóstico, que serán descritas con detalle más adelante.
En la actualidad, para facilitar el diagnóstico
en el campo del CM solamente hay disponibles análisis sanguíneos
diagnósticos basados en la detección del antígeno tumoral
15-3 (CA 15-3), una mucina asociada
al cáncer, y del antígeno carcinoembrionario (CEA), una
glicoproteína asociada al cáncer. El antígeno tumoral CA
15-3 se ve normalmente aumentado en pacientes con
cáncer de mama avanzado. En mujeres con cáncer de mama de estadio
inicial es poco habitual que presenten una concentración de CA
15-3 elevada (Duffy, M.J., Critical Reviews in
Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262). Los
cánceres de ovario, pulmón y próstata también pueden incrementar
los niveles de CA 15-3. Unos niveles elevados de CA
15-3 pueden asociarse a trastornos no cancerosos,
como enfermedades benignas de mama u ovario, endometriosis,
enfermedad inflamatoria pélvica o hepatitis. El embarazo y la
lactancia también pueden causar el aumento de los niveles de CA
15-3 (National Cancer Institute, Cancer Facts, Fact
Sheet 5.18 (1998) 1-5). El uso principal del CEA
consiste en la evaluación del cáncer de colon, especialmente cuando
se ha producido metástasis. No obstante, una diversidad de cánceres
puede producir niveles elevados de CEA, incluido el cáncer de
mama.
Debido a la falta de especificidad en cuanto a
órganos o tumores, no se recomienda la medición de CA
15-3 o de CEA para el cribado del CM. Estos
marcadores tumorales son herramientas de diagnóstico que sirven de
ayuda en el seguimiento de pacientes con CM (Untch, M., et
al., J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352).
Las fuentes de muestras más habituales en la
práctica clínica son la sangre total, el suero, el plasma o las
secreciones mamarias obtenidas a través del pezón. La identificación
de un marcador tumoral de CM inicial que permitiera la detección
fiable del cáncer o proporcionara información pronóstica precoz,
podría suponer una prueba diagnóstica que sería de gran ayuda en el
diagnóstico y en el tratamiento de esta enfermedad. En
consecuencia, existe una necesidad clínica urgente de mejorar el
diagnóstico hematológico del CM. Es de especial importancia el
hecho de mejorar el diagnóstico precoz del CM, ya que la
probabilidad de supervivencia de los pacientes con un diagnóstico
precoz es mucho mayor que la de aquellos a los que se les ha
diagnosticado la enfermedad en un estadio avanzado.
La labor de la presente invención fue investigar
la posibilidad de identificar un nuevo marcador que facilite el
diagnóstico del CM.
De forma sorprendente, se ha encontrado que con
la utilización de la proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II se pueden superar, al menos en parte, los
problemas conocidos en la técnica actual.
La presente invención, por tanto, está
relacionada con un método para el diagnóstico del cáncer de mama que
comprende los siguientes pasos: a) obtener una muestra líquida de
un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de
unión específica a la proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II y c) correlacionar la cantidad de complejo
formado en (b) con el diagnóstico del cáncer de mama.
Otra realización preferida de la invención es un
método para el diagnóstico del cáncer de mama que comprende los
siguientes pasos: a) poner en contacto una muestra líquida obtenida
de un individuo con un agente de unión específica a la proteína
celular transportadora de ácido retinoico de tipo II bajo las
condiciones adecuadas para que se forme un complejo entre dicho
agente de unión y la proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II; y b) correlacionar la cantidad de complejo
formado en (a) con el diagnóstico del cáncer de mama.
Como apreciarán los expertos en la materia,
cualquier método de diagnóstico de este tipo se realiza in
vitro. Después del procedimiento la muestra del paciente se
deshecha. La muestra del paciente se emplea exclusivamente para el
método de diagnóstico in vitro de la invención y el material
que la compone no se transfiere de vuelta al organismo del
paciente. De forma característica, la muestra es una muestra
líquida.
La proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II (CRABP-II)
(Swiss-PROT: P29373) se caracteriza por la
secuencia dada en el ID. de SEC. núm.: 1. Esta secuencia es
traducida a una proteína con un peso molecular de 15.562 Da y un
punto isoeléctrico a pH 5,43.
Las dos isoformas de proteína celular
transportadora de ácido retinoico (CRABP-I y -II)
fueron caracterizadas por primera vez por Siegenthaler et
al. en 1992. Se observó que CRABP-II era la
isoforma principal, expresada en grandes cantidades en la epidermis
humana por fibroblastos y queratinocitos (Siegenthaler, G.,
Biochemical Journal 287 (1992) 383-389).
\newpage
Anders et al. (Anders, V., et al.,
Journal of Investigative Dermatology 106 (1996)
1070-1074) encontraron una concentración aumentada
de CRABP-II en casos de queratoacantoma y cáncer de
células escamosas, pero no de carcinoma de células basales de la
piel.
En el citoplasma, CRABP-II
regula la concentración, el transporte y el metabolismo del ácido
retinoico intracelular. Se ha demostrado que el ácido retinoico
induce la duplicación de los niveles de mRNA en el cáncer de células
escamosas mediante regulación positiva transcripcional (Vo, H.P.,
Crowe, D.L., Anticancer Research 18 (1998)
217-224).
La presencia de CRABP-II en
células de cáncer de mama humano fue descrita por primera vez por
Wang et al. 1998. Localizaron CRABP-II en
células de cáncer de mama humano por medio de técnicas de
inmunohistoquímica (Wang, Y., et al., Laboratory
Investigation 78 (1998) 30 A).
La función de CRABP-II en las
células de carcinoma mamario la describieron Budhu y Noy en 2002
(Molecular and Cellular Biology 22 (2002)
2632-2641). El CRABP-II citosólico
al unirse al ácido retinoico adquiere una localización nuclear e
interacciona con el receptor del ácido retinoico con quien
constituye un complejo de vida corta. La sobreexpresión de
CRABP-II en las líneas celulares mamarias MCF7
mejora su sensibilidad a la inhibición del crecimiento inducida por
el ácido retinoico.
En un primer análisis proteómico de unidades
ductales/lobulares normales emparejadas con carcinoma in situ
ductal (DCIS, siglas en inglés) de la mama humana, Wulfkuhle et
al. (Cancer Research 62 (2002) 6740-6749)
identificaron cincuenta y siete proteínas que se expresaron de forma
diferencial en células normales y células preneoplásicas. En DCIS
se halló un nivel de CRABP-II cinco veces superior
que en las células normales. Se ha descrito un aumento comparable a
este para un máximo de 23 proteínas. No obstante, no se llevaron a
cabo más investigaciones como, p. ej., si era posible detectar
CRABP-II en muestras líquidas (Wulfkuhle, J.D. et
al., supra).
La proteína CRABP-II se ha
mencionado en diferentes solicitudes de patente, además de un gran
número de genes y sus proteínas para el diagnóstico o el pronóstico
del desarrollo o de la progresión del cáncer de mama (WO 02/77176,
WO 02/101075, WO 02/59377). Pero no se ha descrito la aplicación
diagnóstica.
Como resultará obvio para los expertos en la
materia, no se debe interpretar que la presente invención se limite
a la proteína CRABP-II completa de ID. de SEC. núm.:
1. La presente invención también engloba fragmentos fisiológicos o
artificiales de CRABP-II, modificaciones secundarias
de CRABP-II y variantes alélicas de
CRABP-II. Los fragmentos artificiales comprenden
preferiblemente un péptido producido de forma sintética o mediante
técnicas recombinantes, que al menos contenga un epítopo de interés
diagnóstico formado por al menos 6 aminoácidos contiguos
procedentes de la secuencia descrita bajo el ID. de SEC. núm.: 1.
Este fragmento puede emplearse de forma ventajosa para generar
anticuerpos o bien como patrón en un inmunoensayo. Es más preferible
que el fragmento artificial contenga por lo menos dos epítopos de
interés que sean adecuados para preparar un inmunoensayo de tipo
sándwich.
En realizaciones preferidas, el nuevo marcador
CRABP-II puede emplearse para realizar funciones de
control o de cribado.
Cuando se emplea en el control de los pacientes
el método diagnóstico de acuerdo con la presente invención puede
servir de ayuda para evaluar la carga tumoral, la eficacia del
tratamiento y la recurrencia del tumor durante el seguimiento
realizado al paciente. Unos niveles aumentados de
CRABP-II están directamente correlacionados con la
carga tumoral. Un incremento a corto plazo de
CRABP-II tras la quimioterapia (de pocas horas a 14
días) puede servir como un indicador de la muerte de células
neoplásicas. En el seguimiento de los pacientes (de 3 meses a 10
años), un incremento de CRABP-II puede emplearse
como indicador de la recurrencia del tumor.
En una realización preferida, el método
diagnóstico presentado por la presente invención se emplea para
realizar funciones de cribado. Es decir, se utiliza para evaluar
individuos que carecen de un diagnóstico previo de CM midiendo el
nivel de CRABP-II y la correlación del nivel medido
con la presencia o ausencia de CM.
La clasificación del cáncer en estadios atiende
a criterios de extensión, progresión y gravedad de la enfermedad.
Agrupa a los pacientes de cáncer de manera que permite realizar
generalizaciones acerca del pronóstico o de la elección del
tratamiento.
Hoy en día el sistema TNM es la clasificación de
la extensión anatómica de cáncer más empleada. Representa un
sistema aceptado internacionalmente de estadificación uniforme.
Existen tres variables básicas: T (la extensión del tumor
primario), N (el estado de los nódulos linfáticos regionales) y M
(la presencia o ausencia de metástasis a distancia). Los criterios
del TNM los publica la UICC (Unión Internacional Contra el Cáncer)
(Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds.): TNM Classification of
Malignant Tumours, quinta edición, 1997). El sistema de
estadificación para el cáncer de mama ha sido revisado
recientemente (Singletary, S.E., et al., Journal of Clinical
Oncology 20 (2002) 3628-3636).
Lo que realmente es importante es que el
diagnóstico precoz del CM se traduce en un pronóstico mucho mejor.
Así, el mejor pronóstico lo tienen aquellos pacientes que se
encuentran en estadios tan iniciales como T_{is}, N0, M0 o
T1-3, N0, M0 que, si se tratan adecuadamente,
presentan una probabilidad mayor del 90% de sobrevivir 5 años
después del diagnóstico mientras que la tasa de supervivencia a 5
años de los pacientes diagnosticados cuando ya padecen metástasis a
distancia es del 18%.
Por lo que respecta a la presente invención, un
diagnóstico precoz del CM consiste en un diagnóstico en un estado
preneoplásico (DCIS) o en un estadio tumoral en el que no existe
ningun tipo de metástasis (ni a distancia ni ganglionar), es decir,
T_{is}, N0, M0 o T1-4, N0, M0. T_{is} denota
carcinoma in situ.
En una realización preferida se emplea
CRABP-II para diagnosticar el CM en un estadio no
metastásico, es decir, que el diagnostico se hace en un estadio
T_{is}, N0, M0 o T1-3, N0, M0
(=T_{is}-3, N0, M0).
El método diagnóstico presentado por la presente
invención está basado en una muestra líquida que procede de un
individuo. A diferencia de los métodos conocidos en el campo,
CRABP-II se mide de forma específica en la misma
muestra líquida empleando un agente de unión específica.
Un agente de unión específica es, p. ej., un
receptor de CRABP-II, una lectina de unión a
CRABP-II o un anticuerpo frente a
CRABP-II. Un agente de unión específica presenta una
afinidad por su molécula diana correspondiente de al menos 10^{7}
l/mol. La afinidad del agente de unión específica por su molécula
diana es preferiblemente de 10^{8} l/mol o incluso más
preferiblemente de 10^{9} l/mol. Como apreciará cualquier experto
en la materia, el término "específico" se emplea para indicar
que otras biomoléculas presentes en la muestra no se unen de forma
significativa al agente de unión específica a
CRABP-II. De un modo preferible, el grado de unión
a una biomolécula diferente a la molécula diana da como resultado
una afinidad de unión de solamente el 10% de la afinidad de la
molécula diana, más preferiblemente de solo el 5% o menos. El agente
de unión específica más preferido debe cumplir los dos criterios
mínimos anteriores, para la afinidad y para la especificidad.
Un agente de unión específica es preferiblemente
un anticuerpo reactivo frente a CRABP-II. El término
"anticuerpo" se refiere a un anticuerpo policlonal, un
anticuerpo monoclonal, fragmentos de dichos anticuerpos o
constructos genéticos que comprenden el dominio de unión de un
anticuerpo. También se puede utilizar cualquier fragmento de
anticuerpo que cumpla los criterios anteriores de un agente de unión
específica.
Los anticuerpos se generan mediante
procedimientos establecidos actualmente en el campo, p. ej. como
describe Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme
immunoassays 11 (1990); el libro entero, pero en especial las
páginas 43-78; Elsevier, Amsterdam). Además, Los
expertos en la materia ya conocen bien los métodos que emplean
inmunosorbentes que pueden utilizarse para el aislamiento específico
de anticuerpos. Mediante estos métodos es posible mejorar la
calidad de los anticuerpos policlonales y, por tanto, su acción en
los inmunoensayos. (Tijssen, P., supra, páginas
108-115).
Para alcanzar los resultados descritos en la
presente invención se han empleado anticuerpos policlonales y
monoclonales. Los anticuerpos policlonales se han generado en
conejos. No obstante, también se pueden utilizar claramente
anticuerpos policlonales procedentes de otras especies como ratas o
cobayas. Los anticuerpos monoclonales se obtienen de células
esplénicas de ratones inmunizados. Dado que se puede producir
cualquier cantidad que se requiera de anticuerpos monoclonales con
unas propiedades constantes, estos representan una herramienta
ideal para el desarrollo de una prueba de aplicación en la práctica
clínica. La generación y el uso de anticuerpos monoclonales frente
a CRABP-II en un método según la presente invención
constituye aun otra realización preferida.
Como apreciará cualquier experto en la materia,
ahora que CRABP-II ha sido identificada como
marcador que sirve para el diagnóstico del CM, cabe la posibilidad
de utilizar métodos alternativos para alcanzar un resultado
comparable a los resultados de la presente invención. Por ejemplo,
se pueden emplear estrategias alternativas para generar
anticuerpos. Estas estrategias incluyen, entre otras, la utilización
de péptidos sintéticos que representan un epítopo de
CRABP-II para la inmunización. Es preferible que un
péptido sintético contenga una subsecuencia del ID. de SEC. núm.: 1
que sea específica de CRABP-II; es decir, que en
comparación posea una homología menor con otros péptidos
relacionados. Se prefiere que el péptido sintético contenga una
secuencia contigua formada por un número de 5 a 25 residuos
aminoacídicos del ID. de SEC. núm.: 1. Es más preferible que el
péptido contenga una secuencia contigua formada por un número de 10
a 15 residuos aminoacídicos del ID. de SEC. núm.: 1.
Una subsecuencia especialmente preferible de
CRABP-II consiste en los residuos aminoacídicos
85-96 del ID. de SEC. núm.: 1. Una subsecuencia más
preferida todavía consiste en los residuos aminoacídicos
106-120 del ID. de SEC. núm.: 1 y un residuo de
cisteína adicionado a su extremo carboxiterminal para facilitar el
acoplamiento mediante enlaces SH.
Como alternativa es posible utilizar métodos de
inmunización genética también conocidos como vacunación
genética.
Para realizar las mediciones, la muestra líquida
obtenida de un individuo se incuba con el agente de unión
específica a CRABP-II bajo unas condiciones
adecuadas para la formación de un complejo entre
CRABP-II y el agente de unión. No es necesario
especificar estas condiciones adecuadas de incubación puesto que los
expertos en la materia pueden fácilmente identificarlas sin hacer
ningún esfuerzo especial.
\newpage
En un último paso de acuerdo con el método
descrito en la presente invención se mide la cantidad de complejo y
se correlaciona con el diagnóstico de CM. Como apreciará cualquier
experto en la materia, existen numerosos métodos para medir la
cantidad de complejo formado entre el agente de unión específica y
CRABP-II, todos ellos descritos con detalle en
libros de texto de referencia (véase, p. ej., Tijssen P.,
supra o Diamandis et al., eds. (1996) Immunoassay,
Academic Press, Boston).
El ensayo de detección de
CRABP-II es preferiblemente uno de tipo sándwich. En
este tipo de ensayo se emplea un primer agente de unión específica
para capturar CRABP-II por un lado y, por otro, un
segundo agente de unión específica que está marcado para facilitar
su detección de forma directa o indirecta.
Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha
observado de forma sorprendente que CRABP-II puede
medirse en una muestra líquida obtenida de un individuo. Para
aplicar el marcador CRABP-II en el diagnóstico del
CM no se necesita ninguna muestra de tejido o de biopsia.
En una realización preferida, el método
presentado por la presente invención se lleva a cabo con suero como
material líquido de muestra.
En otra realización preferida, el método
presentado por la presente invención se lleva a cabo con plasma como
material líquido de muestra.
En otra realización preferida, el método
presentado por la presente invención se lleva a cabo con sangre
total como material líquido de muestra.
En otra realización preferida, el método
presentado por la presente invención se lleva a cabo con secreciones
mamarias obtenidas a través del pezón como material líquido de
muestra.
Mientras la aplicación de los métodos habituales
en la proteómica a muestras de tejido conduce a la identificación
de muchos candidatos de marcadores potenciales para el tejido
seleccionado, los inventores de la presente invención han sido
capaces de detectar sorprendentemente CRABP-II en
una muestra líquida del organismo. Es aún más sorprendente el hecho
de que han sido capaces de demostrar que la presencia de
CRABP-II en dicha muestra líquida obtenida de un
individuo puede correlacionarse con el diagnóstico del cáncer de
mama.
La utilización de los anticuerpos frente a
CRABP-II puede resultar muy ventajosa en
procedimientos establecidos, p. ej. en la detección de células de
cáncer de mama in situ, en biopsias o en procedimientos
inmunohistológicos.
Preferiblemente se emplea un anticuerpo frente a
CRABP-II en un inmunoensayo cualitativo
(CRABP-II presente o ausente) o cuantitativo (se
determina la cantidad de CRABP-II).
La medición de la cantidad de proteína
CRABP-II ha resultado ser muy ventajosa en el campo
del CM. Por esta razón, en otra realización preferida, la presente
invención está relacionada con el uso de la proteína
CRABP-II como marcador molecular en el diagnóstico
del cáncer de mama a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
El término "molécula marcadora" se emplea
para indicar que un nivel aumentado del analito
CRABP-II medido en un líquido del organismo de un
individuo marca la presencia de CM.
Se prefiere especialmente que el nuevo marcador
CRABP-II se utilice en el diagnóstico del cáncer de
mama.
El propio uso de la proteína
CRABP-II representa un progreso importante en el
desafiante campo del diagnóstico del CM. Si se combina la medición
de CRABP-II con otros marcadores conocidos, p. ej.
CA 15-3 y CEA, o con otros marcadores de CM
conocidos o que aún están por descubrir, será posible obtener
todavía más adelantos. Por esta razón, en otra realización
preferida, la presente invención está relacionada con el uso de
CRABP-II como marcador molecular de cáncer de mama
en combinación con uno o varios marcadores moleculares de cáncer de
mama para el diagnóstico del cáncer de mama a partir de una muestra
líquida obtenida de un individuo. A este respecto, la expresión
"uno o varios" denota de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5 y,
más preferiblemente, 3. Los otros marcadores de CM seleccionados
con los que se puede combinar la medición de
CRABP-II son CEA y CA 15-3. Lo más
preferido es que se use CRABP-II como parte de un
repertorio de marcadores que incluye por lo menos
CRABP-II y CA 15-3. Por lo tanto,
otra realización preferida de la presente invención consiste en la
utilización de la proteína CRABP-II como marcador
molecular de cáncer de mama en combinación con uno o varios
marcadores moleculares de cáncer de mama para el diagnóstico del
cáncer de mama a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo, siendo al menos uno de los otros marcadores moleculares
CA 15-3.
El método de la invención se emplea
preferiblemente con muestras de pacientes de los que se sospecha que
padecen cáncer de mama. Un individuo del que se sospecha que padece
cáncer de mama es un individuo para el que han descartado otros
tipos de cáncer. Otros cánceres incluyen, entre otros, los de colon,
pulmones, estómago, ovario y próstata. Por tanto, una realización
preferida de la invención consiste en un método para el diagnóstico
del cáncer de mama que comprende los siguientes pasos: a) obtener
una muestra líquida de un individuo del que se sospecha que padece
cáncer de mama, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de
unión específica a la proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II bajo las condiciones adecuadas para la
formación de un complejo entre dicho agente de unión y la proteína
celular transportadora de ácido retinoico de tipo II y c)
correlacionar la cantidad de complejo formado en (b) con el
diagnóstico del cáncer de mama.
Los reactivos para diagnóstico en el campo de
los ensayos de unión específica, como los inmunoensayos, normalmente
se proporcionan en un equipo que comprende el agente de unión
específica y los reactivos complementarios necesarios para llevar a
cabo el ensayo. La presente invención también está relacionada por
tanto con un equipo inmunológico que contiene por lo menos un
agente de unión específica a CRABP-II y reactivos
complementarios para la medición de CRABP-II.
La mejor descripción de la exactitud de una
prueba la ofrecen las características de rendimiento diagnóstico
(ROC, del inglés Receiver Operating Characteristics) (véase
en especial Zweig, M. H. y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577). La curva ROC es una representación de
todos los pares formados por los datos referentes a sensibilidad y
a especificidad que resultan de la variación continua del umbral de
decisión a lo largo de la totalidad del abanico de datos
observados.
La función clínica de una prueba analítica
depende de su exactitud diagnóstica o su capacidad de clasificar de
forma correcta los individuos en subgrupos clínicamente relevantes.
La exactitud diagnóstica mide la capacidad del análisis para
distinguir correctamente entre dos trastornos diferentes de los
individuos investigados. Estos trastornos son, por ejemplo, salud o
enfermedad o enfermedad benigna frente a enfermedad maligna.
En cada caso, la curva ROC representa la
superposición entre las dos distribuciones mediante la
representación del parámetro sensibilidad frente a 1 -
especificidad a lo largo de todo el abanico de umbrales de decisión.
En el eje de ordenadas se encuentra la sensibilidad o la fracción
de verdaderos positivos [definida como (número de resultados
verdaderos positivos)/(número de resultados verdaderos positivos +
número de resultados falsos negativos)]. A este parámetro también
se le ha denominado positividad en cuanto a la presencia de una
enfermedad o trastorno. Para calcularla se parte solamente del
subgrupo afectado. En el eje de abscisas se encuentra la fracción
de falsos positivos [definida como (número de resultados falsos
positivos)/(número de resultados verdaderos negativos + número de
resultados falsos positivos)]. Se trata de un índice de
especificidad y se calcula exclusivamente a partir del subgrupo no
afectado. Dado que las fracciones de falsos y verdaderos positivos
se calculan de forma separada totalmente, si se utilizan los
resultados de dos subgrupos diferentes, la curva ROC es
independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada
punto de la curva ROC representa un binomio
sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión
en concreto. Un análisis con una discriminación perfecta (sin
superposición en las dos distribuciones de resultados) presenta una
curva ROC que discurre por la parte superior izquierda, allí donde
la fracción de verdaderos positivos es 1,0 o del 100% (sensibilidad
perfecta) y la fracción de falsos positivos es 0 (especificidad
perfecta). La curva teórica de un análisis sin discriminación
(distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una
línea diagonal con 45º de inclinación que va de la esquina inferior
izquierda a la esquina superior derecha. La mayoría de las curvas
se encuentran entre estos dos extremos. (Si la curva ROC se
encuentra totalmente bajo la diagonal del 45º, esto se puede
solucionar invirtiendo el criterio para "positividad" de
"mayor que" a "menor que" o vicerversa.) Por lo que
respecta a la calidad, cuanto más cercana esté la curva a la
esquina superior izquierda mayor será la exactitud general del
análisis.
Un objetivo práctico en la cuantificación de la
exactitud diagnóstica de una prueba de laboratorio consiste en
expresar su resultado con un único número. La medida global más
común es el área bajo la curva ROC. La convención es que esta área
siempre es \geq 0,5 (si no es así, es posible invertir la norma de
decisión para conseguir que se cumpla). Los valores oscilan entre
1,0 (separación perfecta de los valores analíticos de los dos
grupos) y 0,5 (sin diferencias evidentes entre la distribución de
los dos grupos de valores). El área no depende solamente de una
fracción en concreto de la curva, como el punto más cercano a la
diagonal o la sensibilidad cuando la especificidad es del 90%, sino
de la curva en su totalidad. Se trata de una expresión descriptiva
cuantitativa de lo cercana que está la curva ROC de la curva
perfecta (área = 1,0).
La utilidad clínica del nuevo marcador
CRABP-II se ha evaluado comparándola o combinándola
con el marcador establecido CA 15-3 mediante el
empleo de un análisis de curvas de rendimiento diagnóstico (ROC;
Zweig, M. H. y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577). Este análisis se ha basado en cohortes de
pacientes bien definidas formadas por 50 muestras cada una de
pacientes con, respectivamente: carcinoma lobular o ductal invasivo
en T1-3, N0, M0; con un tumor más avanzado, es
decir, T4 o metástasis de extensión diversa (N+ o M+); carcinoma
medular, papilar, mucinoso y tubular; carcinoma in situ; y
controles sanos.
Al comparar el método diagnóstico basado en la
medición exclusiva de CRABP-II con el basado en la
medición exclusiva del marcador establecido CA
15-3, se ha descubierto que el primero presenta una
exactitud diagnóstica (perfil sensibilidad/especificidad) por lo
menos igual de buena que el segundo, como demuestra el área bajo la
curva.
Se presentan los siguientes ejemplos,
referencias, listado de secuencias, tablas y figuras para ayudar a
la comprensión de la presente invención cuyo auténtico ámbito de
aplicación se expone en las reivindicaciones anexas.
Figura 1 La figura 1 muestra un ejemplo típico
de un gel 2D cargado con una muestra de tumor (lado izquierdo) y un
gel cargado con una muestra del control correspondiente (lado
derecho). El círculo en la sección ampliada de estos geles indica
la posición de la proteína celular transportadora de ácido retinoico
de tipo II (CRABP-II). Al utilizar el mismo método
no se ha detectado esta proteína en tejido sano.
Figura 2 La figura 2 muestra curvas ROC: Cáncer
de mama frente a controles o frente a otros cánceres. El eje de
abscisas indica el valor calculado restándole a 1 el valor de
especificidad. El eje de ordenadas indica la sensibilidad. En ambos
casos el valor de 1 corresponde al 100%. Los valores ROC
determinados para CRABP-II, CEA y CA
15-3 son el 73%, 51% y 54%, respectivamente.
Figura 3 La figura 3 muestra curvas ROC: Cáncer
de mama frente a controles o frente a otros cánceres, excluido el
cáncer de ovario. El eje de abscisas indica el valor calculado
restándole a 1 el valor de especificidad. El eje de ordenadas
indica la sensibilidad. En ambos casos el valor de 1 corresponde al
100%. Los valores ROC determinados para CRABP-II,
CEA y CA 15-3 son el 74%, 50% y 58%,
respectivamente.
ABTS Sal diamónica del ácido
2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]
BSA albúmina sérica bovina
cDNA DNA complementario
CHAPS
(3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato)
DMSO dimetilsulfóxido
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilendiamino tetraacético
ELISA ensayo inmunoenzimático sobre fase
sólida
HRP peroxidasa de rábano picante
IAA yodoacetamida
IgG inmunoglobulina G
IEF isoelectroenfoque
IPG gradiente de pH inmovilizado
LDS dodecil-sulfato de litio
MALDI-TOF espectrometría de
masas mediante ionización-desorción por láser
asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo
MES mesitil,
2,4,6-trimetilfenil
DO densidad óptica
PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida
PBS solución salina tamponada con fosfato
PI punto isoeléctrico
RTS sistema de traducción rápida
SDS dodecil-sulfato sódico
UICC Unión internacional contra el cáncer
Con la finalidad de identificar proteínas
específicas del tumor como marcadores potenciales del cáncer de
mama, se realiza el análisis de dos tipos diferentes de tejido
empleando métodos propios de la proteómica.
En total se analizan muestras de tejido de 14
pacientes que padecen cáncer de mama. De cada paciente se toman
muestras de dos tipos diferentes de tejido a partir de resecciones
terapéuticas: tejido tumoral (tumor > 80% ) (T) y tejido sano
adyacente (N). El último tipo de tejido sirve como muestra control
sana correspondiente. Los tejidos se congelan inmediatamente
después de la resección y se conservan a -80ºC hasta su procesado.
El diagnóstico de los tumores se realiza según criterios
histopatológicos.
Se disponen 0,8-1,2 g de tejido
congelado en un mortero y se congelan totalmente con nitrógeno
líquido. El tejido se pulveriza en el mortero, se disuelve en un
volumen multiplicado por 10 (p/v) de tampón de lisis (citrato
sódico 40 mM, MgCl_{2} 5 mM, Genapol X-080 1%,
azida sódica 0,02% y Complete® sin EDTA [Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania, núm. de Cat. 1 873 580]) y seguidamente realizó
un homogenado en un homogeneizador Wheaton® de vidrio (20 x pistón
de ajuste holgado, 20 x pistón de ajuste casi total). Se someten 3
ml del homogenado a una centrifugación por densidad de sacarosa
(10-60% sacarosa) durante 1 h a 4.500 x g. Después
de este paso de centrifugación se obtienen tres fracciones. La
fracción superior del gradiente contiene las proteínas solubles y
se emplea para posteriores análisis.
Se rehidrata y se lava sefarosa 4B activada con
CNBr liofilizada (Amersham Biosciences,
17-0430-01) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se disuelve anticuerpo monoclonal
dirigido contra albúmina humana en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,3, NaCl
0,5 M, 10 mg/ml. Se mezcla 1 ml de solución de anticuerpo con 1 ml
de sefarosa 4B activada con CNBr rehidratada. El tiempo de reacción
es de 1 h. El bloqueo de los grupos activos restantes y el lavado
del gel se realiza de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Se equilibran 7 ml de gel antialbúmina en tampón
de lisis sin Genapol X-080. Se aplican 7 ml de la
fracción superior de la centrifugación por densidad de sacarosa
(véase el apartado anterior de preparación de tejidos) sobre la
columna y se realiza el lavado con tampón de lisis sin Genapol
X-080. El efluente combinado se utiliza para los
experimentos de isoelectroenfoque.
Para el IEF se mezclan 3 ml de la preparación de
tejido del que se ha eliminado la albúmina sérica humana con 12 ml
de tampón de muestra (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 2%, tampón IPG
0,4% pH 4-7, DTT 0,5%) y se incuban durante 1 h.
Las muestras se concentran en un dispositivo Amicon®
Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y
se determina la concentración de proteínas empleando el ensayo para
proteínas Bio-Rad® (núm. de Cat.
500-0006; Bio-Rad Laboratories GmbH,
München, Alemania) siguiendo las instrucciones del manual del
proveedor. A un volumen correspondiente a 1,5 mg de proteína se le
añade tampón de muestra hasta un volumen final de 350 \mul. Esta
solución se usa para rehidratar tiras de IPG de pH
4-7 (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania)
durante la noche. Se realiza el IEF siguiendo el siguiente protocolo
de gradiente: (1.) 1 minuto a 500 V; (2.) 2 h a 3500 V; (3.) 22 h a
3500 V constantes dando lugar a 82 kVh. Tras el IEF, se conservan
las tiras a -80ºC o bien se emplean directamente para
SDS-PAGE.
Antes del procedimiento
SDS-PAGE, las tiras se incuban en tampón de
equilibrio (urea 6 M, Tris/HCl 50 mM, pH 8,8, glicerol al 30%, SDS
al 2%), para la reducción en DTT (15 min, + 50 mg DTT/10 ml) y para
la alquilación en IAA (15 min, + 235 mg de yodoacetamida/10 ml) is
added. Las tiras se colocan sobre geles de poliacrilamida 12,5% y
se someten a electroforesis a 1 W/gel y después durante 1 H a 17
W/gel. Seguidamente, se fijan los geles (metanol al 50%, acetato al
10%) y se tiñen durante la noche con el equipo de tinción
Novex^{TM} Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe,
Alemania, núm. de Cat. LC6025, 45-7101).
Cada paciente es analizado por separado mediante
análisis por imagen con el programa ProteomeWeaver® (Definiens AG,
München, Alemania). Asimismo, todas las manchas del gel son cortadas
por un robot que las recoge y se identifican las proteínas
presentes en las manchas por espectrometría de masas
MALDI-TOF (Ultraflex^{TM} Tof/Tof, Bruker
Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente se comparan 4
geles de la muestra de tumor con 4 geles de tejido adyacente cada
uno y se analizan en busca de manchas destacadas que correspondan a
proteínas expresadas de forma diferencial. Con este sistema se
descubre que CRABP-II se expresa de forma
específica, o bien sufre una sobreexpresión importante, en el tejido
tumoral mientras que no se puede detectar en el tejido control
sano. Por esta razón, junto con muchas otras proteínas, la
CRABP-II cumple los requisitos para ser un marcador
candidato de uso en el diagnóstico del cáncer de mama.
Se genera un anticuerpo policlonal frente a la
proteína CRABP-II marcadora de cáncer de mama para
su posterior uso en la medición de los niveles séricos, plasmáticos
o hemáticos de CRABP-II mediante ensayos de
inmunodetección, p. ej. transferencias Western o ELISA.
Con el propósito de generar anticuerpos frente a
CRABP-II, se lleva a cabo la expresión recombinante
de la proteína para la obtención de inmunógenos. La expresión se
realiza aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100
y E. coli. En un primer paso se analiza la secuencia de DNA
y, empleando el sistema "ProteoExpert RTS E.coli HY",
se obtienen recomendaciones para una producción elevada de variantes
mutacionales silentes de cDNA y de sus respectivas secuencias
cebadoras para PCR. Se trata de un servicio comercial por internet
(www.proteoexpertcom). Si se emplean los pares de cebadores
recomendados, se debe utilizar el sistema "RTS 100 E. coli
Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, núm. de Cat. 3186237) para
generar moldes lineales de PCR a partir del cDNA para la
transcripción y la expresión in vitro de la secuencia
nucleotídica que codifica la proteína CRABP-II. Para
la detección mediante transferencia Western y la posterior
purificación, la proteína expresada contiene una cola de histidinas.
Se debe identificar la variante que se exprese mejor. Todos los
pasos desde la PCR hasta la expresión y la detección se realizan de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de PCR
respectivo, que contiene todas las regiones T7 reguladoras
necesarias (promotor, sitio de unión a ribosomas y terminador T7),
se clona en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania,
núm. de Cat. K 4300/01) según las instrucciones del fabricante.
Para conseguir la expresión empleando las secuencias reguladoras T7,
se transforma E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W., et
al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89) con el
constructo y las bacterias transformadas se cultivan en un volumen
de 1 l para la expresión proteica.
La purificación de la proteína de fusión
His-CRABP-II se realiza según
procedimientos estándar sobre una columna quelante de níquel. En
resumen, se precipita por centrifugación 1 l de cultivo bacteriano
que contiene el vector de expresión para la proteína de fusión
His-CRABP-II. El pellet celular se
resuspende en tampón de lisis que contiene fosfato, pH 8,0; cloruro
de guanidio 7 M; imidazol y tioglicerol; y seguidamente se
homogeneiza en un Ultra-Turrax®. El material
insoluble se precipita mediante centrifugación a alta velocidad y se
aplica el sobrenadante a una columna cromatográfica quelante de
níquel. La columna se lava con varios volúmenes de lecho de tampón
de lisis seguido de lavados con tampón que contiene fosfato, pH 8,0
y urea. Finalmente, se eluye el antígeno unido con un tampón de
fosfato que contiene SDS bajo condiciones ácidas.
Asimismo, se expresa y purifica la proteína
CRABP-II como se describe en Kleywegt, G.J. et
al., Structure 2 (1994) 1241-1258, en
particular la página 1252 ("Protein preparation").
Los péptidos se sintetizan y se purifican según
procedimientos químicos propios de la técnica actual.
El péptido CRABP-II que
corresponde a las posiciones 85 a 96 del ID. de SEC. núm.: 1
contiene un residuo de cisteína. A partir de este punto también nos
referiremos al péptido como CRABP-II
(85-96) o péptido CRABP-II
(85-96).
Al péptido CRABP-II que
corresponde a las posiciones 106 a 120 del ID. de SEC. núm.: 1 se le
añade un residuo de cisteína en su extremo carboxiterminal. A
partir de este punto también nos referiremos a este péptido como
CRABP-II (106-120 Cys) o péptido
CRABP-II (106-120 Cys).
La síntesis se lleva a cabo por procedimientos
químicos heterobifuncionales (maleimida/SH).
El péptido CRABP-II
(85-96) se acopla con hemocianina activada con
3-maleimido-hexanoil
N-hidroxisuccinimida éster (MHS). El péptido
CRABP-II (106-120 Cys) se acopla
igualmente con hemocianina activada con
3-maleimido-hexanoil
N-hidroxisuccinimida éster (MHS). La hemocianina se
lleva a una concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 100
mM, pH 7,2. Se añaden 100 \mul de MHS (12,3 mg en DMSO) por cada
ml de hemocianina y se incuban durante 1 h. La muestra se dializa
durante toda la noche frente a NaH_{2}PO_{4}/NaOH 100 mM, pH 6,5
y se ajusta a 6 mg/ml con tampón de diálisis. Se disuelve el
péptido CRABP-II (85-96) o el
péptido CRABP-II (106-120 Cys) en
DMSO (5 mg/ml para un péptido de 1.500 Da [Dalton]). Por cada ml de
hemocianina activada con MHS (6 mg/ml) se añaden 20 \mul de EDTA
100 mM, pH 7,0 y 100 \mul del péptido CRABP-II
(85-96) que contiene cisteína o del péptido
CRABP-II (106-120 Cys). Transcurrida
1 h, se bloquean los grupos de maleimida restantes añadiendo 10
\mul de cisteína 0,5 M/HCl por cada ml de mezcla de reacción. Este
preparado se emplea la inmunización sin purificación posterior.
Inicialmente se inmunizan ratones A/J de 12
semanas por vía intraperitoneal con 100 \mug de
CRABP-II o conjugado de
péptido-hemocianina (véase el apartado anterior).
Pasadas 6 semanas se realizan dos inmunizaciones intraperitoneales
más con un intervalo de un mes. En este proceso a cada ratón se le
administran 100 \mug de CRABP-II o de conjugado
de péptido-hemocianina adsorbidos en hidróxido de
aluminio y 10^{9} bacterias Bordetella pertussis.
Posteriormente, las dos últimas inmunizaciones se llevan a cabo por
vía intravenosa el tercer y segundo día previos a la fusión,
empleando 100 \mug de CRABP-II o de conjugado de
péptido-hemocianina en tampón PBS en cada
una.
una.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fusionan células esplénicas de los ratones
inmunizados según el punto a) con células de mieloma de acuerdo con
Galfre, G. y Milstein, C., Methods in Enzymology 73 (1981)
3-46. En este procedimiento se mezclan cerca de
1x10^{8} células esplénicas del ratón inmunizado con 2x10^{7}
células de mieloma (P3X63-Ag8-653,
ATCC CRL1580) y se centrifugan (10 min a 300 x g y 4ºC). A
continuación se lavan las células una vez con medio RPMI 1640 sin
suero fetal bovino (FCS) y se centrifugan de nuevo a 400 x g en un
tubo cónico de 50 ml. Se deshecha el sobrenadante, el sedimento
celular se desprende mediante golpecitos ligeros, se añade un 1 ml
de PEG (peso molecular de 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla
mediante pipeteado. Transcurrido 1 min en un baño de agua a 37ºC,
se añaden 5 ml de RPMI 1640 sin FCS gota a gota a temperatura
ambiente en un lapso de tiempo de 4 a 5 min. Después se añaden 5
ml de RPMI 1640 con un 10% de FCS gota a gota durante cerca de 1
min, se mezcla a conciencia, se añade medio hasta alcanzar 50 ml
(RPMI 1640 + 10% de FCS) y posteriormente se centrifuga durante 10
min a 400 x g y a 4ºC. Las células sedimentadas se resuspenden en
medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se siembran en medio
de selección con hipoxantina-azaserina (100 mmol/l
de hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% de
FCS). Como factor de crecimiento se le añade al medio interleucina
6 a una concentración de 100 U/ml.
Pasados unos 10 días los cultivos primarios se
analizan en busca del anticuerpo específico. Los cultivos primarios
positivos para CRABP-II se clonan en placas de
cultivo de 96 pocillos mediante citofluorometría. En este proceso
también se le añade al medio como factor de crecimiento interleucina
6 a una concentración de 100 U/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de hibridoma obtenidas se siembran a
una densidad de 1x10^{5} células por ml en medio RPMI 1640 que
contiene un 10% de FCS y se dejan proliferar durante 7 días en un
fermentador (Thermodux Co., Wertheim/Main, modelo
MCS-104XL, núm. de pedido 144-050).
De media se obtienen concentraciones de 100 \mug de anticuerpo
monoclonal por ml en el sobrenadante del cultivo. La purificación de
este anticuerpo del sobrenadante del cultivo se lleva a cabo por
métodos convencionales en el estudio químico de las proteínas (p.
ej. siguiendo a Bruck, C., et al., Methods in Enzymology 121
(1986) 587-695).
Para la inmunización se prepara una nueva
emulsión de la solución proteica [100 \mug/ml de
CRABP-II o conjugado de
péptido-hemocianina que contiene el péptido
CRABP-II (85-96) o el péptido
CRABP-II (106-120 Cys)] con
adyuvante de Freund en una proporción de 1:1. Para cada uno de los
péptidos se inmuniza cada conejo con 1 ml de emulsión en los días
1, 7, 14, 30, 60 y 90. Se extrae sangre y el suero
anti-CRABP-II se emplea en otros
experimentos descritos en los ejemplos 3 y 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluye un volumen de suero de conejo con 4
volúmenes de tampón de acetato (60 mM, pH 4,0). El pH se ajusta a
4,5 con base Tris 2 M. Se añade ácido caprílico (25 \mul/ml de
muestra diluida) gota a gota en agitación vigorosa. Transcurridos
30 min se centrifuga la muestra (13.000 x g, 30 min, 4ºC), se
deshecha el pellet y se recoge el sobrenadante. El pH del
sobrenadante se ajusta a 7,5 al añadir base Tris 2 M y se realiza un
filtrado (0,2 \mum).
\newpage
Se realiza la precipitación de la
inmunoglobulina del sobrenadante en agitación vigorosa con la
adición gota a gota de una solución de sulfato de amonio 4 M hasta
una concentración final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas
se recogen por centrifugación (8.000 x g, 15 min, 4ºC).
El sobrenadante se deshecha. El pellet se
disuelve en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM y se
dializa de forma exhaustiva. El líquido de diálisis se centrifuga
(13.000 x g, 15 min, 4ºC) y se filtra (0,2 \mum).
La IgG policlonal de conejo se lleva a una
concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5,
NaCl 30 mM. Se añaden 50 \mul de
biotina-N-hidroxisuccinimida (3,6
mg/ml en DMSO) por cada ml de solución de IgG. Pasados 30 min a
temperatura ambiente la muestra se somete a cromatografía en
Superdex 200 (Na_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). La
fracciones que contienen IgG biotinada se recogen. Los anticuerpos
monoclonales se biotinan de acuerdo con el mismo procedimiento.
La IgG policlonal de conejo se lleva a una
concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, NaCl 30
mM, pH 7,5. Se añaden 50 \mul de
digoxigenina-3-O-metilcarbonil-E-ácido
aminocaproico-N-hidroxisuccinimida
éster (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, núm. de Cat. 1 333
054)(3,8 mg/ml en DMSO). Pasados 30 min a temperatura ambiente la
muestra se somete a cromatografía en Superdex 200
(NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). La fracciones
que contienen IgG digoxigenada se recogen. Los anticuerpos
monoclonales se marcan con digoxigenina de acuerdo con el mismo
procedimiento.
SDS-PAGE y la transferencia
Western se llevan a cabo con reactivos y equipo de Invitrogen,
Karlsruhe, Alemania. Se diluyen muestras de plasma humano a 1:20 en
tampón de muestra reductor NuPAGE® LDS (Invitrogen) y se calienta
durante 5 min a 95ºC. Se corren alícuotas de 10 \mul sobre geles
NuPAGE® al 4-12% (Bis-Tris) en el
sistema de tampón MES. La mezcla de proteínas separadas en el gel
se transfiere a membranas de nitrocelulosa con el módulo de
transferencia Invitrogen XCell II^{TM} Blot Module (Invitrogen) y
el sistema tampón de transferencia NuPAGE®. Las membranas se lavan
tres veces en PBS/0,05% Tween-20 y se bloquean con
tampón SuperBlock Blocking (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford,
IL, EE. UU.). El anticuerpo primario biotinado se diluye en tampón
SuperBlock Blocking (0,01-0,2 \mug/ml) y se incuba
con la membrana durante 1 h. Las membranas se lavan tres veces en
PBS/0,05% Tween-20. El anticuerpo primario biotinado
unido de forma específica se marca con un conjugado
estreptavidina-HRP (20 mU_{ABTS}/ml en tampón
SuperBlock Blocking). Después de una hora de incubación, las
membranas se lavan tres veces en PBS/0,05% Tween-20.
El conjugado estreptavidina-HRP unido se detecta con
un sustrato quimioluminiscente (SuperSignal West Femto Substrate,
Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE. UU.) y película
autorradiográfica. El tiempo de exposición varía entre 10 min y toda
la noche.
Para la detección de CRABP-II en
suero o plasma humanos se desarrolló un ELISA tipo sándwich
empleando placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas de
estreptavidina.
Para la detección de CRABP-II en
suero o plasma humanos se desarrolló un ELISA tipo sándwich
empleando placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas de
estreptavidina.
Se incubaron 20 \mul de una muestra de suero o
plasma humanas o de una dilución seriada de la proteína
CRABP-II recombinante como antígeno estándar con
100 \mul de anticuerpo policlonal
anti-CRABP-II
(85-96) biotinado (0,1 \mug/ml) y con anticuerpo
monoclonal anti-CRABP-II
digoxigenado (0,1 \mug/ml) en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA 1%, NaCl
0,9% y Tween-20 0,1%. Después de toda la noche de
incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces
con NaCl 0,9%, Tween-20 0,1%. Para la detección de
complejos antígeno-anticuerpo se añadieron 100
\mul de anticuerpo monoclonal antidigoxigenina conjugado con
peroxidasa en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA 1%, NaCl 0,9% y
Tween-20 0,1% y se incubaron durante 2 h. El exceso
de conjugado se eliminó mediante tres lavados de las placas con
NaCl 0,9% y Tween-20 0,1%. La cantidad de conjugado
unido se detectó mediante la incubación con 100 \mul de solución
ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania, núm. de Cat.
11685767) durante 30-60 min. El desarrollo del color
se cuantificó a 405 nm con un lector de ELISA. La concentración de
CRABP-II en una muestra de suero o plasma se calculó
a partir de la curva estándar con una dilución seriada de
CRABP-II recombinante.
La exactitud se evalúa analizando muestras
líquidas individuales obtenidas de cohortes de pacientes bien
caracterizados. El colectivo control (véase la tabla 1) incluía 50
pacientes a los que se había sometido a una mamografía. Hubo 40
pacientes cuya mamografía salió negativa y no se detectaron síntomas
de otras enfermedades mamarias. Se diagnosticaron 5 pacientes con
mastitits (3 de 5 con una mamografía positiva) y 5 pacientes con
microcalcificación (todos con mamografía positiva). La cohorte de
muestra se resume en la tabla 1.
Se agruparon 50 pacientes de cáncer de mama
entre los que había pacientes con carcinoma invasivo ductal o
lobular en diferentes estadios. Debido al objetivo de diagnosticar
el cáncer de mama en estadios iniciales, la proporción de
individuos en estadios UICC I y UICC II fue del 78%. Para analizar
la especificidad respecto a otros tumores sólidos también se midió
un colectivo de muestras de diferentes tipos de cáncer: 40 de colon,
20 de pulmón, 20 de estómago, 20 de ovario y 20 de próstata. A
partir del suero obtenido de cada uno de estos individuos se ha
cuantificado los siguientes marcadores: CA 15-3 y
CEA, medidos con ensayos comerciales (Roche Diagnostics, CA
15-3-assay: núm. de Cat. 0 304
5838 y CEA-assay: núm. de Cat. 1731629) para
el analizador de inmunoensayos Elecsys® Systems; y
CRABP-II, medida del modo antes descrito.
El valor de corte se define con respecto al
percentil del 95% del grupo control, de modo que equivalga a una
especificidad del 95%. Por lo tanto, en la presente serie de
experimentos el valor de corte para CRABP-II se
establece en 0,92 ng/ml.
Cabe destacar que los tres pacientes control
positivos (de los que se había asumido que eran falsos positivos)
de la medición de CRABP-II en el grupo de
"Controles sanos" no presentan mastitis ni
microcalcificaciones. Este tipo de pacientes normalmente dan lugar
a una proporción elevada de resultados de mamografía positivos. No
se encontró ninguna reacción positiva en los grupos de cáncer de
pulmón, estómago o próstata. Solamente hubo tres resultados
positivos en los pacientes con cáncer de colon. Esta observación es
comparable a la del grupo de controles sanos. Las reacciones más
positivas se observan en el grupo de cáncer de ovario, es decir, en
6 de 20.
Los datos que resumen la sensibilidad y la
especificidad de CRABP-II comparada con los
marcadores CEA y CA 15-3 se muestran en las tablas
2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis ROC de acuerdo con Zweig,
M. H. y Campbell, supra. Se encontró que el poder de
discriminación para diferenciar los pacientes del grupo de cáncer de
mama de los pacientes del grupo de "controles sanos" medido
por el área bajo la curva era al menos igual de bueno para
CRABP-II (64%) que para CA 15-3
(60%) y CEA (65%). Por otro lado, CRABP-II mostró
una elevada especificidad para el cáncer de mama, ya que no hubo
resultados positivos en ninguna de las muestras de cáncer de
estómago, pulmón o próstata. En las muestras de cáncer de colon
solamente 3 de 40 fueron positivas (comparable con el grupo de
controles sanos) y en las de cáncer de ovario 6 de 20 muestras
fueron positivas. Este hecho indica un mejor poder de discriminación
de CRABP-II (73%) que de CA 15-3
(54%) y CEA (51%), cuando se compara el colectivo con cáncer de mama
con la totalidad de controles, incluidos el resto de tumores
sólidos.
En resumen, CRABP-II es igual de
sensible que CA 15-3 y al mismo tiempo muestra una
especificidad más elevada en el grupo control aumentado, es decir,
en el grupo control que incluye los otros tipos de cáncer. Asimismo,
CRABP-II detecta más tumores en estadios iniciales.
CRABP-II tiene una especificidad muy elevada para
los tumores mamarios. No se han obtenido resultados positivos en
muestras de suero procedentes de pacientes con cáncer de pulmón,
estómago o próstata, y solamente se han obtenido reacciones
positivas menores en muestras procedentes de pacientes con cáncer
de colon. En las muestras de cáncer de ovario la especificidad es
menor, pero sigue siendo mayor que la especificidad del marcador CA
15-3. Si se toman todas las muestras control
incluyendo el resto de tumores sólidos, el poder de discriminación
de CRABP-II (73%) es más elevado que el de CA
15-3 (54%) y CEA (51%). Los datos indican que
CRABP-II también puede ser de gran ayuda en el
diagnóstico del cáncer de mama o en el seguimiento de pacientes
tras un tratamiento quirúrgico.
En algunas de las muestras de pacientes de CM
tanto los niveles de CRABP-II como los de CA
15-3 son elevados. Además, en muestras individuales
obtenidas de pacientes diferentes de cáncer de mama se encuentra que
uno de CRABP-II o CA 15-3 es
positivo. Este hecho implica una mayor sensibilidad si ambos
marcadores se miden en la muestra de un paciente. En el caso de que
una muestra de un paciente se clasifique como positiva cuando uno
de los marcadores CRABP-II o CA 15-3
sea positivo, es posible conseguir una sensibilidad del 40%. Debido
a la elevada especificidad de CRABP-II, la
especificidad de esta combinación es comparable a la especificidad
de CA 15-3 solo. En consecuencia, la mayor
sensibilidad de la combinación de los marcadores
CRABP-II y CA 15-3 no repercute
negativamente sobre la especificidad (del 75% para solamente CA
15-3 y del 78% para la combinación).
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cáncer de mama
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (10)
1. Un método para el diagnóstico del cáncer de
mama que comprende los siguientes pasos:
a) proporcionar una muestra líquida obtenida de
un individuo,
b) poner en contacto dicha muestra con un agente
de unión específica a la proteína celular transportadora de ácido
retinoico de tipo II bajo las condiciones adecuadas para que se
forme un complejo entre dicho agente de unión y la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II y
c) correlacionar la cantidad de complejo formado
en (b) con el diagnóstico del cáncer de mama.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que se caracteriza también por que dicha muestra es
suero.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que se caracteriza además por que dicha muestra es
plasma.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que se caracteriza además por que dicha muestra es sangre
total.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que se caracteriza también por que dicha muestra es secreción
mamaria obtenida a través del pezón.
6. La utilización de la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II como marcador molecular
en el diagnóstico del cáncer de mama a partir de una muestra
líquida obtenida de un individuo.
7. La utilización de la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II como marcador molecular
en el diagnóstico precoz del cáncer de mama a partir de una muestra
líquida obtenida de un individuo.
8. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que el diagnóstico precoz se hace a partir
de muestras de pacientes de CM en estadio
T_{is}-3; N0; M0.
9. La utilización de la proteína celular
transportadora de ácido retinoico de tipo II como marcador molecular
de cáncer de mama en combinación con uno o varios marcadores
moleculares de cáncer de mama para el diagnóstico del cáncer de
mama a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.
10. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 9, en la que el otro marcador molecular es CA
15-3.
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