ES2291750T3

ES2291750T3 - Uso de nicotinamida-n-metiltransferasa como marcador de cancer colorrectal.

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Publication number: ES2291750T3
Application number: ES03813582T
Authority: ES
Inventors: Peter Berndt; Marie-Luise Hagmann; Hanno Langen; Stefan Palme; Markus Roessler; Wolfgang Rollinger; Michael Tacke; Werner Zolg; Johann Karl; Theresa Kott
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: AU2003296684A1; DE60315715T2; CN1742204A; ATE370414T1; MXPA05006382A; BR0317394A; JP2006510889A; KR100711046B1; HK1088947A1; EP1579220A2; US20060003368A1; DE60315715D1; US7205118B2; KR20050114604A; CA2510377A1; JP4248496B2; CN100437115C; CA2510377C; WO2004057336A3; EP1579220B1

Abstract

Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consta de los pasos siguientes: a) proporcionar una muestra líquida, extraída de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y c) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo formado en b) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Description

Uso de nicotinamida-N-metiltransferasa como marcador de cáncer colorrectal.

La presente invención se refiere al diagnóstico del cáncer colorrectal. Describe el uso de la nicotinamida-N-metiltransferasa (= NNMT) para el diagnóstico del cáncer colorrectal. Además se refiere en especial a un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida, derivada de un individuo, por medición de la NNMT en dicha muestra. La medición de la NNMT puede utilizarse p.ej. para la detección o el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.

El cáncer continúa siendo un reto importante para la salud pública a pesar de los progresos realizados en la detección y la terapia. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (= CRC) es uno de los tipos más frecuentes en el mundo occidental.

Cuanto antes se detecte o diagnostique el cáncer, tanto mayor será la probabilidad de supervivencia total. Esto es verdad en concreto para el CRC. El pronóstico en los estadios avanzados del tumor es pobre. Más de un tercio de los pacientes fallecerá por el avance de la enfermedad en un plazo de cinco años después del diagnóstico, equivalentes a un grado de supervivencia del 40% para los cinco años. El tratamiento actual cura solamente a una fracción de los pacientes y es obvio que tiene un efecto óptimo en aquellos pacientes que se han diagnosticado en un estadio precoz de la enfermedad.

En lo que respecta al CRC como problema de la salud pública, es esencial que se desarrollen más exploraciones eficaces y se adopten más medidas preventivas para el cáncer colorrectal.

Los procedimientos de detección precoz actualmente disponibles para el cáncer colorrectal incluyen el uso de ensayos para la sangre fecal o de procedimientos endoscópicos. Sin embargo, antes de que se pueda detectar la sangre fecal, es normal que el tumor haya alcanzado un tamaño significativo. La sensibilidad de los ensayos de sangre oculta en las heces, basados en el guayaco, es \approx del 26%, lo cual significa que el 74% de los pacientes que sufren lesiones malignas queda sin detectar (Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26, 41-55, 1997). La visualización de las lesiones precancerosas y cancerosas constituye la mejor estrategia de la detección precoz, pero la colonoscopia es invasiva y conlleva costes, riesgos y complicaciones significativos (Silvis, S.E. y col., JAMA 235, 928-930, 1976; Geenen, J.E. y col., Am. J. Dig. Dis. 20, 231-235, 1975; Anderson, W.F. y col., J. Natl. Cancer Institute 94, 1126-1133, 2002).

En los últimos años se ha publicado una cantidad tremenda de genes llamados específicos del colon o incluso específicos del cáncer colorrectal. La gran mayoría de los correspondientes artículos de investigación o solicitudes de patente se basan datos obtenidos por análisis de modelos de expresión del RNA en tejido (canceroso) de colon por comparación con otros tejidos diferentes y tejido normal adyacente, respectivamente. Tales estrategias pueden resumirse como técnicas diferenciales de visualización del mRNA.

Como ejemplo de datos disponibles de las técnicas de visualización del mRNA cabe mencionar y debatir el documento WO 01/96390. Esta solicitud describe y reivindica más de doscientos polinucleótidos aislados y los polipéptidos correspondientes como tales, así como su utilización para la detección del CRC. Sin embargo, es conocido en general que las diferencias del nivel del mRNA no se reflejan en el nivel de las proteínas correspondientes. Una proteína codificada por un mRNA raro puede encontrarse en grandes cantidades, mientras que una proteína codificada por un mRNA abundante puede ser difícil de detectar, si es que llega a encontrarse. Esta falta de correlación entre el nivel de mRNA y el nivel de proteína se debe a razones tales como la estabilidad del mRNA, la eficacia de la traducción, la estabilidad de la proteína, etc.

Existen también estudios recientes que investigan las diferencias en los modelos de proteínas entre los diferentes tejidos o entre tejido sano y tejido enfermo con el fin de identificar las moléculas de marcadores propuestas que puedan utilizarse para el diagnóstico del CRC. , G. y col., Cancer Research 62, 2437-2442, 2002, han identificado siete proteínas estructurales nucleares, que parecen ser más abundantes en el tejido del CRC que en tejido normal adyacente. No se indican las muestras líquidas extraídas de un individuo.

En WO 02/078636 se describen nueve manchas asociadas con el cáncer colorrectal, encontradas desorción e ionización láser de superficie ampliada (SELDI). Estas manchas son más frecuentes en sueros obtenidos de pacientes con CRC que en sueros obtenidos de individuos sanos de control. Sin embargo, la identidad de la o de las moléculas contenidas en dicha mancha, p.ej. su o sus secuencias, es desconocida.

A pesar de la lista abundante o incluso creciente de marcadores proteicos propuestos en el ámbito del CRC, actualmente no se conoce la utilidad clínica/diagnóstica de estas moléculas. Para que tenga utilidad clínica, un nuevo marcador diagnóstico en su condición de marcador único deberá tener por lo menos la eficacia del mejor marcador individual ya conocido de la técnica. O bien, un nuevo marcador debería conducir a un avance en la sensibilidad y/o especificidad diagnóstica, tanto si se emplea solo como en combinación con uno o más marcadores adicionales, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad diagnóstica de un ensayo se evalúa de la mejor forma posible por sus características de funcionamiento del receptor, que se describen con detalle a continuación.

Actualmente se dispone solamente de ensayos diagnósticos de la sangre para detectar el antígeno carcinoembriónico (CEA), una glucoproteína asociada al tumor, para asistir al diagnóstico en el campo del CRC. El CEA experimenta un aumento del 95% en muestras de tejido extraídas de pacientes de cáncer colorrectal, gástrico o pancreático y de la mayor parte de carcinomas de mama, de pulmón y de cabeza y cuello (Goldenberg, D.M. y col., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57, 11-22, 1976). Se ha publicado también que en pacientes de enfermedades no malignas existen niveles elevados de CEA, mientras que muchos pacientes de cáncer colorrectal tienen niveles normales de CEA en suero, en especial durante el estadio temprano de la enfermedad (Carriquiry, L.A. y Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42, 921-929, 1999; Herrera, M.A. y col., Ann. Surg. 183, 5-9, 1976; Wanebo, H.J. y col., N. Engl. J. Med. 299, 448-451, 1978). Se ha publicado que utilidad, que tiene el CEA cuando se mide a partir del suero o del plasma para detectar las recurrencias, es controvertida y que todavía no se ha aplicado a gran escala (Martell, R.E. y col., Int. J. Biol. Markers 13, 145-149, 1998; Moertel, C.G. y col., JAMA 270, 943-947, 1993).

A la luz de los datos disponibles, la determinación del CEA en el suero no presenta sensibilidad ni especificidad que permita su utilización como ensayo de exploración del cáncer colorrectal en una población asintomática (Reynoso, G. y col., JAMA 220, 361-365, 1972; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48, 1151-1159, 2002).

La sangre total, el suero o el plasma son las fuentes más utilizadas para muestras en el trabajo clínico rutinario. La identificación de un marcador de tumor CRC precoz que permita una detección fiable del cáncer o proporcione una información temprana conduciría a un ensayo diagnóstico que ayudaría en gran manera al diagnóstico y a la gestión o control de esta enfermedad. Por lo tanto, existe una demanda clínica urgente de mejora del diagnóstico del CRC a partir de muestras de sangre. Es especialmente importante mejorar el diagnóstico precoz del CRC, ya que los pacientes diagnosticados precozmente tienen probabilidades de supervivencia mucho mayores que las que tienen los enfermos diagnosticados en un estadio avanzado de la enfermedad.

El cometido de la presente invención es investigar si puede identificarse un nuevo marcador que pueda ayudar en el diagnóstico del CRC.

De modo sorprendente se ha encontrado que el uso de la proteína NNMT permite superar por lo menos parcialmente los problemas ya conocidos del estado de la técnica.

La presente invención se refiere, pues, a un método de diagnóstico del cáncer colorrectal, que consiste en los pasos de a) proporcionar una muestra líquida, extraída de un individuo, b) poner en contacto dicha muestra con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y c) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo formado en b) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Por tanto, es preferido que el método consista en la utilización de una muestra líquida extraída de un individuo en el paso (a).

Otra forma preferida de ejecución de la invención es un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consiste en los pasos de a) poner en contacto una muestra líquida extraída de un individuo con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y b) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo formado en a) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.

La proteína nicotinamida-N-metiltransferasa (NNMT) (Swiss-PROT: P40261) se caracteriza por la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1. La NNMT tiene un peso molecular aparente de 29,6 kDa y un punto isoeléctrico de 5,56.

La NNMT cataliza la N-metilación de la nicotinamida y de otras piridinas. Esta actividad es importante para la biotransformación de muchos fármacos y compuestos xenobióticos. Se ha publicado que esta proteína se expresa de modo predominante en el hígado y se localiza en el citoplasma. La NNMT se ha clonado a partir del cDNA de hígado humano y contiene un marco de lectura abierto de 792 nucleótidos que codifica a una proteína de 264 aminoácidos, que tiene una masa molecular calculada de 29,6 kDa (Aksoy, S. y col., J. Biol. Chem. 269, 14835-14840, 1994). En la bibliografía técnica apenas hay referencias sobre el rol potencial de esta enzima en el cáncer humano. En un artículo se describe una mayor actividad enzimática de la NNMT hepática como marcador de la caquexia cancerosa en los ratones (Okamura, A. y col., Jpn. J. Cancer Res. 89, 649-656, 1998). En un estudio reciente se ha demostrado la regulación decreciente del gen de la NNMT en respuesta a la radiación en líneas celulares sensibles a la radiación (Kassem, H. y col., Int. J. Cancer 101, 454-460, 2002).

Como es obvio para los expertos en la materia, la presente invención no se ha pensado para limitarse a la proteína NNMT de longitud completa de la SEQ ID NO: 1. También están comprendidos dentro de la presente invención los fragmentos fisiológicos o artificiales de la NNMT, las modificaciones secundarias de la NNMT, así como las variantes alélicas de la NNMT. Los fragmentos artificiales comprenden con preferencia un péptido producido artificialmente o por técnicas recombinantes, que contiene por lo menos un epítope de interés diagnóstico, que contiene por lo menos 6 aminoácidos contiguos derivados de la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1. Tal fragmento puede utilizarse con ventaja para la generación de anticuerpos o como patrón de un inmunoensayo. El fragmento artificial contiene con mayor preferencia por lo menos dos epítopes de interés, apropiados para efectuar un inmunoensayo de tipo sandwich.

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En las formas preferidas de ejecución, el nuevo marcador NNMT puede utilizarse para fines de seguimiento y también de exploración.

Cuando se emplea en pacientes, el seguimiento del método diagnóstico de la presente invención puede ayudar a evaluar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la recurrencia tumoral en el seguimiento de los pacientes. Los niveles elevados de NNMT guardan una correlación directa con la carga tumoral. Después de la quimioterapia, un incremento a corto plazo (de pocas horas a 14 días) de la NNMT puede servir como indicador de la muerte de las células tumorales. En el seguimiento de los pacientes (de 3 meses a 10 años), un incremento de la NNMT puede utilizarse como indicador de la recurrencia tumoral.

En una forma preferida de ejecución, el método diagnóstico según la presente invención se emplea para fines exploratorios, es decir, se emplea para evaluar el CRC en sujetos sin diagnóstico previo, para ello se mide el nivel de la NNMT y se establece la correlación entre el nivel medido y la presencia o la ausencia del CRC.

El cáncer colorrectal progresa con mucha frecuencia a partir de adenomas (pólipos), transformándose en carcinomas. Los diferentes estadios de CRC se suelen clasificar con arreglo a los estadios de A a D de Dukes.

La clasificación del cáncer en estadios consiste en puntuar una enfermedad en términos de extensión, progresión y severidad. Agrupa a los pacientes de modo que se pueden hacer generalizaciones acerca del pronóstico y la elección de la terapia.

Actualmente, el sistema TNM es el más empleado para la clasificación de la extensión anatómica del cáncer. Constituye un sistema de clasificación en estadios uniforme y aceptado internacionalmente. Hay tres variables básicas: T (la extensión del tumor primario), N (el estado de los nódulos linfáticos regionales) y M (la presencia o ausencia de metástasis distantes). Los criterios TNM se han publicado por la UICC (Unión Internacional contra el Cáncer), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (coordinadores), TNM Classification of Malignant Tumours, quinta edición, 1997).

Lo que es especialmente importante es que la diagnosis precoz del CRC se traduzca en un diagnóstico mucho mejor. Los tumores malignos del colon-recto surgen a partir de tumores benignos, es decir, de un adenoma. Por lo tanto, los pacientes que se diagnostican en el estadio del adenoma tienen un mejor pronóstico. Los pacientes diagnosticados tan pronto como pueda ser un estadio T_{is}, N0, M0 o en el T1-3; N0; M0, si se tratan adecuadamente tienen más de un 90% de probabilidades de sobrevivir 5 años al diagnóstico, si se comparan con la probabilidad de sobrevivir 5 años que tiene solamente el 10% de los pacientes diagnosticados, cuando ya están presentes metástasis distantes.

En el sentido de la presente invención, un diagnóstico precoz del CRC indica un diagnóstico del estado premaligno (adenoma) o de un estadio tumoral, en el que no existe ningún tipo de metástasis (ni próximas ni distantes), es decir, en el que están presente el adenoma en el estadio T_{is}, N0, M0 o en el T1-4; N0; M0. T_{is} indica un carcinoma "in situ".

En una forma preferida de ejecución, la NNMT se emplea para el diagnóstico del CRC de un modo tan precoz como pueda ser el estadio del adenoma.

Es preferido además que el CRC se diagnostique cuando todavía no haya crecido plenamente a través de la pared del intestino, por tanto cuando todavía no ha perforado el peritoneo visceral ni ha invadido otros órganos o estructuras, es decir, el diagnóstico se efectúa en cualquier estadio de T_{is}; N0; M0 hasta T3; N0; M0 ( = T_{is}-3; N0; M0).

El método diagnóstico de la presente invención se basa en una muestra líquida que se extrae de un individuo. A diferencia de los métodos conocidos de la técnica, la NNMT se mide específicamente a partir de esta muestra líquida mediante el uso de un agente de fijación específico.

Un agente de fijación específico es, p.ej., un receptor de la NNMT, una lectina que se fije sobre la NNMT o un anticuerpo contra la NNMT. Los expertos en la materia podrán apreciar que el término específico se emplea para indicar que otras biomoléculas presentes en la muestra no se fijan de modo significativo sobre el agente de fijación específico de la NNMT. Un nivel de reactividad cruzada inferior al 5% no se considera significativo.

Un agente de fijación específico es con preferencia un anticuerpo reactivo con la NNMT. El término anticuerpo indica un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de tales anticuerpos, así como los constructos genéticos que contienen el dominio de fijación de un anticuerpo.

Los anticuerpos se general por procedimientos del estado de la técnica, p.ej. los descritos en Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11, el libre entero, pero en especial las páginas 43-78; Elsevier, Amsterdam, 1990). Además, los expertos en la materia conocen bien los métodos basados en inmunosorbentes, que pueden utilizarse para el aislamiento específico de anticuerpos. Con estos medios se puede mejorar la calidad de los anticuerpos policlonales y, de este modo, su acción en los inmunoensayos (Tijssen, P., lugar citado, páginas 108-115). Para los fines descritos en la presente invención pueden utilizarse anticuerpos policlonales cultivados en conejos. Sin embargo, está claro que también pueden utilizarse anticuerpos policlonales de otras especies, p.ej. de ratas o de cobayas, así como anticuerpos monoclonales. Dado que los anticuerpos monoclonales pueden producirse en cualquier cantidad requerida y con propiedades constantes, constituyen una herramienta ideal para el desarrollo de ensayos del trabajo clínico rutinario. La generación y el uso de anticuerpos monoclonales contra la NNMT en un método según la presente invención constituyen otra forma de ejecución preferida.

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Dado que los expertos en la materia pueden apreciar ahora, que la NNMT se ha identificado como marcador útil para la diagnosis del CRC, pueden utilizarse métodos alternativos para generar anticuerpos. Estas estrategias consisten entre otras en utilizar para la inmunización de péptidos sintéticos, que representen un epítope de la NNMT. Como alternativa puede recurrirse también a la inmunización de DNA, también conocida como vacunación de DNA.

Para la medición se incuba la muestra líquida extraída de un individuo con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo de agente de fijación-NNMT. No es necesario específica cuáles son estas condiciones, porque los expertos en la materia conocen perfectamente cuales son las condiciones idóneas para la incubación, sin necesidad de efectuar trabajos experimentales innecesarios.

Como paso final del método descrito en la presente invención se mide la cantidad del complejo y se establece la correlación de la misma con el diagnóstico del CRC. Los expertos en la materia podrán apreciar que existen numerosos métodos para medir la cantidad del complejo del agente de fijación específico con la NNMT, todos ellos se describen con detalle en los manuales importantes (véase p.ej. Tijssen, P., lugar citado; o Diamandis y col., coord., Immunoassay, Academic-Press, Boston, 1996).

La NNMT se detecta con preferencia en un ensayo de formato sandwich. En tal ensayo, en primer lugar para capturar la NNMT se emplea un primer agente de fijación específico y en segundo lugar un segundo agente de fijación específico, que está marcado para poderse detectar directa o indirectamente.

Tal como se ha mencionado antes, ahora se ha encontrado de modo sorprendente que la NNMT puede medirse en una muestra líquida extraída de un individuo. No se requiere muestra de tejido ni biopsia para aplicar el marcador NNMT en la diagnosis del CRC.

En una forma de ejecución preferida, el método según la presente invención se lleva a la práctica tomando suero como material de muestra líquida.

En otra forma de ejecución según la invención, el método según la presente invención se lleva a la práctica tomando plasma como material de muestra líquida.

En otra forma de ejecución según la invención, el método según la presente invención se lleva a la práctica tomando sangre total como material de muestra líquida.

Además, los expertos en la materia ya saben que también se pueden preparar las heces de varias maneras para obtener una muestra líquida. Tal muestra líquida, derivada de las heces, constituye también una forma preferida de ejecución de la presente invención.

La aplicación de métodos rutinarios de Proteome a las muestras de tejidos conduce a la identificación de muchos marcadores potenciales, propuestos para el tejido seleccionado, mientras que los inventores de la presente invención han sido capaces de modo sorprendente de detectar la proteína NNMT en una muestra corporal líquida. Es incluso más sorprendente que hayan sido capaces de demostrar que la presencia de la NNMT en tal muestra líquida, extraída de un individuo, puede guardar correlación con el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Los anticuerpos contra la NNMT pueden utilizarse con gran ventaja en los procedimientos establecidos, p.ej. para detectar células de cáncer colorrectal "in situ", en biopsias o en procedimientos inmunohistológicos.

Un anticuerpo contra la NNMT se utiliza con preferencia en un inmunoensayo cualitativo (se determina si la NNMT está presente o ausente) o cuantitativo (se determina la cantidad de la NNMT).

Se ha demostrado que la determinación del nivel de la proteína NNMT es muy ventajosa en el ámbito del CRC. Por lo tanto, en otra forma preferida de ejecución, la presente invención se refiere al uso de la proteína NNMT como molécula marcadora en el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida extraída de un individuo.

El término molécula marcadora se emplea para indicar que un nivel más elevado del analito NNMT, medido a partir del líquido corporal de un individuo, apunta hacia la existencia de un CRC.

Es especialmente preferido el uso del nuevo marcador NNMT en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.

El uso de la proteína NNMT constituye en sí mismo un progreso significativo en el ámbito retador del diagnóstico del CRC. La combinación de las mediciones de la NNMT con las de otros marcadores conocidos, por ejemplo el CEA, o con otros marcadores del CRC todavía por descubrir, conducirá a nuevas mejoras. Por lo tanto, en otra forma preferida de ejecución, la presente invención se refiere al uso de la NNMT como molécula marcadora para el cáncer colorrectal en combinación con otra molécula marcadora del cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida extraída de un individuo. Los marcadores CRC adicionales elegidos, que pueden combinarse con la medición de la NNMT, son el CEA, el CA 19-9, el CA 72-4 y/o el CA 242.

La resolución de un ensayo se describe del mejor modo posible con sus características de funcionamiento de receptor (ROC) (véase en especial Zweig, M.H. y Campbell, G., Clin. Chem. 39, 561-577, 1993). La gráfica ROC es una gráfica de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes de la variación continua del umbral de decisión a lo largo del intervalo completo de datos observados.

La eficacia clínica de un ensayo de laboratorio depende de su resolución diagnóstica, o de la capacidad de clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La resolución diagnóstica mide la capacidad de un ensayo por distinguir correctamente entre dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Tales condiciones son por ejemplo salud y enfermedad o enfermedad benigna y maligna.

En cada caso, la gráfica ROC representa el solape entre dos distribuciones mediante el trazado de un gráfico de la sensibilidad frente a 1 - especificidad para la totalidad del intervalo de los umbrales de decisión. En el eje y se representa la sensibilidad, o la fracción positiva verdadera [definida como (el número de resultados positivos verdaderos del ensayo) (número de resultados positivos verdaderos + número de resultados negativos falsos)]. Esto se ha llamado también carácter positivo en presencia de una enfermedad o estado patológico. Se calcula solamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x se representa la fracción falsamente positiva o bien 1 - especificidad [definida como (el número de resultados positivos falsos)/(número de resultados negativos verdaderos + número de positivos falsos)]. Es un índice de la especificidad y se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado. Dado que las fracciones positivo verdadero y falso se calculan totalmente por separado, empleando los resultados de ensayo de dos subgrupos diferentes, la gráfica ROC es independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto de la gráfica ROC representa un par de sensibilidad/especificidad correspondiente a un umbral particular de decisión. Un ensayo con una discriminación perfecta (sin solape de las dos distribuciones de resultados) da lugar a una gráfica ROC que pasa por el ángulo superior izquierdo, en el que la fracción de positivos verdaderos es 1,0 o bien del 100% (sensibilidad perfecta) y la fracción de positivos falsos es de 0 (especificidad perfecta). La gráfica teórica de un ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados de los dos grupos) es una línea diagonal de 45º desde el ángulo inferior izquierdo hacia el ángulo superior derecho. La mayoría de las gráficas se sitúan entre estos dos extremos. (Si la gráfica ROC se sitúa por complejo por debajo de la diagonal de 45º, esto se remedia fácilmente invirtiendo los criterios de "carácter positivo" de "mayor que" a "menor que" y viceversa.) En sentido cualitativo, cuanto más cercana esté la gráfica al ángulo superior izquierdo, tanto mayor será la resolución global del ensayo.

Un objetivo conveniente para cuantificar la resolución del diagnóstico en un ensayo de laboratorio consiste en expresar su eficacia con un solo número. La medición global más frecuente es el área albergada debajo de la gráfica ROC. Por convención, esta área es siempre \geq 0,5 (si no lo es, se puede invertir la regla de decisión para que lo sea). El intervalo de valores comprendido entre 1,0 (separación perfecta de los valores del ensayo en dos grupos) y 0,5 (sin aparente diferencia distribucional entre los dos grupos de valores obtenidos en el ensayo). El área no depende solamente de una porción concreta de la gráfica, por ejemplo el punto más próximo a la diagonal o la sensibilidad para el 90% de especificidad, sino de la gráfica completa. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva, de la proximidad que tiene la gráfica ROC con la que sería la gráfica perfecta (área = 1,0).

La utilidad clínica del nuevo marcador NNMT se ha evaluado por comparación con y en combinación con el marcador ya establecido, el CEA, empleando un análisis de curva de operador-receptor (ROC; Zweig, M.H. y Campbell, G., Clin. Chem. 39, 561-577, 1993). Este análisis se ha basado en conjuntos de pacientes bien definidos, que constan de 50 muestras cada uno, extraídas de pacientes que se hallan en T-1; N0; M0, en un tumor más avanzado, es decir, T4 y/o varios grados de severidad de metástasis (N+ y/o M+) y individuos sanos de control, respectivamente.

El método diagnóstico basado en la medición de la NNMT sola en comparación con el marcador establecido CEA solo se ha encontrado que tiene por lo menos una resolución diagnóstica igual de buena (perfil de sensibilidad/especificidad), como lo demuestra el área albergada debajo de la curva.

Descripción de las figuras Figura 1

La figura 1 representa un ejemplo típico de un gel 2D cargado con una muestra tumoral (lado izquierdo) y un gel cargado con una muestra de control adaptado (lado derecho), obtenida de la mucosa adyacente sana. El círculo de la sección ampliada de estos geles indica la posición de la proteína NNMT. El peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de la NNMT corresponden a los valores teóricos de 29,6 kDa y 5,56, respectivamente. Esta proteína no es detectable por el mismo método en la mucosa sana.

Figura 2

La figura 2 representa un ejemplo típico de un "western blot". Se carga el gel con lisados de tejido tumoral colorrectal y del tejido de control sano adyacente de 4 pacientes (sujeto 27: recto ca, Dukes B; sujeto 29: recto ca, Dukes A; sujeto 39: colon ca, Dukes A; y sujeto 40: colon ca, Dukes B). Se ensaya la presencia de la NNMT en las muestra empleando un suero de anticuerpo policlonal de conejo anti-NNMT. Las pistas que contienen lisados tumorales se indican con "T", las pistas que contienen tejido de control normal se indican con "N". La pista del marcador que contiene un patrón de proteína de peso molecular se indica con "M". La flecha indica la posición de la banda de NNMT en el gel. Todas las muestras tumorales dan una señal intensa en la posición de la NNMT, mientras que apenas se detecta señal en los lisados del tejido de control normal adyacente. Esta fuerte sobreexpresión de la NNMT en el tejido tumoral de pacientes de cáncer colorrectal se observa en 14 de los 14 sujetos sometidos al ensayo.

Abreviaturas

ABTS:: 2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolina-sulfonato (6)], sal de diazonio

BSA:: albúmina de suero bovino

cDNA:: DNA complementario

CHAPS:: (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano-sulfonato)

DMSO:: sulfóxido de dimetilo

DTT:: ditiotreitol

EDTA:: ácido etilendiaminotetraacético

ELISA:: ensayo inmunosorbente ligando a enzima

HRP:: peroxidasa de rábano rusticano

IAA:: yodoacetamida

IgG:: inmunoglobulina G

IEF:: enfoque isoeléctrico

IPG:: gradiente de pH inmovilizado

LDS:: dodecil-sulfato de litio

MALDI-TOF:: espectrometría de masas llamada "matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight"

MES:: mesitilo, 2,4,6-trimetilfenilo

OD:: densidad óptica

PAGE:: electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS:: solución salina tamponada con fosfato

PI:: punto isoeléctrico

RTS:: sistema de traducción rápida

SDS:: dodecil-sulfato sódico

Ejemplo 1 Identificación de la NNMT como potencial marcador de cáncer colorrectal Fuentes de tejido

Con el fin de identificar las proteínas específicas de tumores como marcadores diagnósticos potenciales del cáncer colorrectal se realizan tres tipos diferentes de ensayos empleando métodos de Proteome.

Se analizan en total muestras de tejido de 10 pacientes que sufren cáncer colorrectal. De cada paciente se recogen tres tipos diferentes de tejido obtenidos en resecciones terapéuticas: tejido tumoral (>80% de tumor) (T), tejido sano adyacente (N) y mucosa descortezada de la mucosa sana adyacente (M). Los dos últimos tipos de tejido sirven como muestras de control sano adaptado. Inmediatamente después de la resección, los tejidos se congelan rápidamente y se almacenan a -80ºC antes de procesarlos. Los tumores se diagnostican con arreglo a criterios histopatológicos.

Preparación del tejido

Se introducen en un mortero 0,8-1,2 g de tejido congelado y se congelan por completo con nitrógeno líquido. Se pulveriza el tejido en el mortero, se disuelve en un volumen 10 veces mayor (p/v) del tampón de lisis (citrato Na 10 mM, MgCl_{2} 5 mM, 1% de Genapol X-080, 0,02% de azida sódica, Complete® sin EDTA [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 873 580]) y a continuación se homogeneíza en un homogeneizador de vidrio Wheaton® (20 x ajuste flojo, 20 x ajuste fuerte). Se someten 3 ml del material homogeneizado a una centrifugación de densidad en sucrosa (10-60% de sucrosa) a 4500 x g durante 1 h. Después de este paso de centrifugación se obtienen tres fracciones. La fracción de la parte superior del gradiente contiene proteínas solubles y se utiliza para el análisis posterior.

Enfoque isoeléctrico (IEF) y SDS-PAGE

Para el IEF se mezclan 3 ml de la suspensión con 12 ml del tampón de muestra (urea 7 M, tiourea 2 M, 2% de CHAPS, 0,4% de tampón IPG, pH = 4-7, 0,5% de DTT) y se incuban durante 1 h. Se concentran las muestras en un aparato Amicon® Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y se determina la concentración de proteínas empleando un ensayo Bio-Rad® (nº de cat. 500-0006; Rio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania) con arreglo al manual del fabricante. A un volumen equivalente a 1,5 mg de muestra de proteína se le añade tampón hasta un volumen final de 350 \mul. Se emplea esta solución para rehidratar las tiras de IPG de pH = 4-7 (Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania) durante una noche. Se realiza el IEF empleando el siguiente método de gradiente: 1.) 1 minuto a 500 V; 2.) 2 h a 3500 V; 3.) 22 h a 3500 V constantes, que dan lugar a 82 kVh. Después del IEF se almacenan las tiras a -80ºC o bien se utilizan directamente para el SDS-PAGE.

Antes del SDS-PAGE se incuban las tiras en tampón de equilibrado (urea 6 M, Tris/HCl 50 mM, pH = 8,8, 30% de glicerina, 2% de SDS), para la reducción se añade el DTT (15 min, + 50 mg DTT/10 min) y para la alquilación se añade la IAA (15 min, +235 mg de yodoacetamida/10 ml). Se colocan las tiras sobre geles de poliacrilamida del 12,5% y se someten a electroforesis a 1 W/gel durante 1 h y después a 17 W/gel. A continuación se fijan los geles (50% de metanol, 10% de acetato) y se tiñen durante una noche con el kit llamado Novex^{TM} Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, nº de cat. LC6025,45-7101).

Detección de la NNMT como potencial marcador del cáncer colorrectal

Cada paciente se analiza por separado por métodos de análisis por la imagen con el programa informático Proteome Weaver® (Definiens AG, Múnich, Alemania). Además se recortan todas las manchas del gel con un robot clasificador y se identifican las proteínas presentes en las manchas por espectrometría de masas MALDI-TOF (Ultraflex^{TM} Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente se comparan 4 geles de la muestra de tumor con 4 geles tanto de mucosa adyacente normal como de mucosa descortezada y se analizan las manchas distintivas, correspondientes a las proteínas de expresión diferencial. De este modo se encuentra que la proteína NNMT se expresa específicamente o se sobreexpresa intensamente en tejido tumoral y no es detectable en tejido sano de control. Por lo tanto, entre otras muchas proteínas, queda calificada como marcador candidato para el uso en el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos contra la proteína NNMT marcadora del cáncer colorrectal

Se generan los anticuerpos policlonales contra la NNMT, proteína marcadora del cáncer colorrectal, para el uso posterior como anticuerpos para la medición de los niveles de la NNMT en suero, plasma y sangre por ensayos de inmunodetección, p.ej. "western blot" y ELISA.

Expresión de proteína recombinante en E. coli

Con el fin de generar anticuerpos contra la NNMT se realiza la expresión recombinante de la proteína para obtener inmunógenos. La expresión se realiza aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En un primer paso se analiza la secuencia de DNA y se obtienen recomendaciones de rendimiento elevado de variantes mutacionales silentes de cDNA y secuencias del correspondiente cebador de PCR empleando el sistema "ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio comercial basado en una página de Internet (www.proteoexpert.com). Empleando los pares de cebadores recomendados se utiliza el sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de cat. 3186237) para generar moldes de PCR lineales a partir del cDNA y para la transcripción "in vitro" y la expresión de la secuencia de nucleótido que codifica a la proteína NNMT. Para la detección por "western blot" y posterior purificación, la proteína expresada contiene un His-tag. Se identifica la mejor variante de expresión. Todos los pasos, desde la PCR hasta la expresión y la detección se realizan con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se clona el correspondiente producto de la PCR, que contiene todas las regiones reguladores T7 necesarias (promotor, sitio de fijación ribosómica y terminador T7) en un vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, nº de cat. K 4300/01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión empleando las secuencias reguladoras T7 se transforma el constructo en E. coli BL 21 (DE 3) (Studier, F.W. y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990) y se cultivan las bacterias transformadas en 11 lotes para la expresión de la proteína.

Se realiza la purificación de esta proteína de fusión His-NNMT con arreglo a procedimientos estándar en una columna de quelato de Ni. Resumiendo, se centrifugan 11 de los cultivos bacterianos que contienen el vector de expresión para la proteína de fusión His-NNMT para obtener culotes. Se suspende de nuevo el culote celular en tampón de lisis, que contiene fosfato, pH = 8,0, cloruro de guanidio 7 M, imidazol y tioglicerina, después se homogeneíza empleando un Ultra-Turrax®. Se centrifuga el material insoluble a alta velocidad y se introduce el líquido sobrenadante en una columna cromatográfica de quelato de Ni. Se lava la columna con varios volúmenes de lecho de tampón de lisis y después se lava con tampón que contiene fosfato, pH = 8,0, y urea. Finalmente se eluye el antígeno fijado empleando tampón fosfato que contiene SDS, en condiciones ácidas.

Producción de anticuerpos monoclonales contra la NNMT a) Inmunización de ratones

Se inmunizan inicialmente ratones A/J de 12 semanas de edad por vía intraperitoneal con 100 \mug de NNMT. Siguen después de 6 semanas otras dos inmunizaciones intraperitoneales a intervalos mensuales. En este proceso se administran a cada ratón 100 \mug de NNMT adsorbida sobre hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de la Bordetella pertussis. A continuación se realizan las dos últimas inmunizaciones por vía intravenosa en los días 3º y 2º antes de la fusión, empleando 100 \mug de la NNMT en tampón PBS para cada una de ellas.

b) Fusión y clonación

Se fusionan células de bazo de los ratones inmunizados con arreglo al apartado a) con células de mieloma según Galfre, G. y Milstein, C., Methods in Enzymology 73, 3-46, 1981. En este proceso se mezclan aprox. 1 x 10^{8} células de bazo de ratones inmunizados con 2x10^{7} células de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se centrifugan (a 300 g y 4ºC durante 10 min). Después se lavan las células una vez con medio RPMI 1640 sin suero fetal bovino (FCS) y se centrifugan de nuevo a 400 g en un tubo cónico de 50 ml. Se descarta el líquido sobrenadante, se deshace suavemente el sedimento celular con golpecitos, se añade 1 ml de PEG (peso molecular = 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla por pipeteo. Después de 1 min en un baño de agua a 37ºC se añaden por goteo a temperatura ambiente durante un período de 4-5 min 5 ml de RPMI 1640 sin FCS. Después se añaden 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10% de FCS en aprox. 1 min, se mezclan a fondo, se completa hasta 50 ml con medio (RPMI 1640 + 10% de FCS) y después se centrifuga a 400 g y 4ºC durante 10 min. Se recogen las células sedimentadas en medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se siembra en un medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmoles/l de hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% de FCS). Como factor de crecimiento se añade al medio la interleucina 6 a razón de 100 U/ml.

Pasados unos 10 días se ensayan los anticuerpos específicos de los cultivos primarios. Se clonan los cultivos primarios positivos de NNMT en placas de cultivo celular de 96 hoyos mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. Como aditivo de crecimiento, en este proceso se añade de nuevo al medio la interleucina 6 a razón de 100 U/ml.

c) Aislamiento de la inmunoglobulina de los líquidos sobrenadantes del cultivo celular

Se siembran las células de hibridoma obtenidas en una densidad de 1x10^{5} células por ml en medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se dejan proliferar en un fermentador (Thermodux Co., Wertheim/Main, modelo MCS-104XL, nº de cat. 144-050) durante 7 días. En promedio se obtienen concentraciones de 100 \mug de anticuerpo monoclonal por ml de líquido sobrenadante del cultivo. La purificación de este anticuerpo del líquido sobrenadante del cultivo se efectúa por métodos convencionales de la química proteica (p.ej. con arreglo a Bruck, C. y col., Methods in Enzymology 121, 587-695, 1986).

Generación de anticuerpos policlonales a) Inmunización

Para la inmunización se prepara una emulsión reciente de una solución de proteína (100 \mug/ml de la proteína NNMT) y adyuvante complejo de Freund en proporción 1:1. Se inmuniza cada conejo con 1 ml de la emulsión en los días 1, 7, 14, 30, 60 y 90. Se extrae sangre y se emplea el suero anti-NNMT resultante para los ensayos posteriores del modo descrito en los ejemplos 3 y 4.

b) Purificación de la IgG (inmunoglobulina B) del suero del conejo por precipitación sucesiva con ácido caprílico y sulfato amónico

Se diluye un volumen de suero de conejo con 4 volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH = 4,0). Se ajusta el pH a 4,5 con Tris-base 2 M. Se añade por goteo el ácido caprílico (25 \mul/ml de muestra diluida) con agitación vigorosa. Después de 30 min se centrifuga la muestra (13 000 x g, 30 min, 4ºC), se descarta el culote y se recoge el líquido sobrenadante. Se ajusta el pH del líquido sobrenadante a 7,5 por adición de Tris-base 2 M y se filtra (0,2 \mum).

Se precipita la inmunoglobulina del líquido sobrenadante con agitación vigorosa por adición por goteo de una solución 4 M de sulfato amónico hasta una concentración final de 2 M. Se recoge la inmunoglobulina precipitada por centrifugación (8000 x g, 4ºC, 15 min).

Se descarta el líquido sobrenadante. Se disuelve el culote en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM y se dializa exhaustivamente. Se centrifugan los líquidos dializados (13 000 x g, 4ºC, 15 min) y se filtran (0,2 \mum).

Biotinilación de la IgG policlonal de conejo

La IgG policlonal de conejo se lleva a una concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de IgG se añaden 50 \mul de biotina-N-hidroxisuccinimida (3,6 mg/ml en DMSO). Después de 30 min a temperatura ambiente se cromatografía la muestra en columna Superdex® 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM). Se recoge la fracción que contiene la IgG biotinilada. Se biotinilan los anticuerpos monoclonales con arreglo al mismo procedimiento.

Digoxigenilación de la IgG policlonal de conejo

La IgG policlonal de conejo se lleva a una concentración de 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, NaCl 30 mM, pH = 7,5. Por cada ml de solución de IgG se añaden 50 \mul del éster N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenina-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 333 054) (3,8 mg/ml en DMSO). Después de 30 min a temperatura ambiente se cromatografía la muestra en columna Superdex® 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH = 7,5, NaCl 30 mM). Se recogen las fracciones que contienen la IgG digoxigenilada. Se marcan los anticuerpos monoclonales con digoxigenina por el mismo procedimiento.

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Ejemplo 3 "Western blot" para la detección de la NNMT en tejido de cáncer colorrectal humano empleado anticuerpo policlonal generado en el ejemplo 2

Se preparan lisados de tejido a partir de muestras tumorales y muestras sanas de control del modo descrito en el ejemplo 1, "preparación de tejido".

Se realizan la SDS-PAGE y el "western blot" empleando reactivos y equipo de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Por cada muestra de tejido que se ensaya se diluyen 10 \mug de lisado de tejido en NuPAGE® reductor (Invitrogen) tampón de muestra SDS y se calientan a 95ºC durante 10 min. Se pasan las muestras por geles NuPAGE® del 4-12% (Tris-glicina) en el sistema de tampón de elución MES. Se pincha la mezcla de proteínas separada en el gel sobre membranas de nitrocelulosa empleando el módulo llamado Invitrogen XCell^{TM} II Blot Module (Invitrogen) y el sistema de tampón de transferencia NuPAGE®. Se lavan las membranas 3 veces en PBS/Tween 20 del 0,05% y se bloquean con tampón Roti®-Block (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) durante 2 h. Se diluye el anticuerpo primario, el suero policlonal de conejo anti-NNMT (generación descrita en el ejemplo 2) en proporción 1:10.000 en tampón de bloqueo Roti®-Block y se incuba con la membrana durante 1 h. Se lavan las membranas 6 veces en PBS/Tween 20 del 0,05%. Se marca el anticuerpo primario de conejo fijado específicamente con un anticuerpo IgG policlonal de cabra anticonejo conjugado con POD, diluido hasta 10 mU/ml en 0,5 x tampón de bloqueo Roti®-Block. Después de una incubación de 1 hora se lavan las membranas 6 veces con PBS/Tween 20 del 0,05%. Para la detección del anticuerpo anticonejo conjugado con POD que se ha fijado, se incuba la membrana con sustrato de "western blot" del tipo Lumi-Light^{PLUS} (nº de cat. 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se expone sobre una película autorradiográfica.

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Ejemplo 4 ELISA para la medición de la NNMT en muestras de suero y plasma humanos

Para la detección de la NNMT en suero o en plasma humanos se desarrolla un ensayo ELISA sandwich. Para la captura y detección del antígeno se conjugan partes alícuotas del anticuerpo policlonal anti-NNMT (ver ejemplo 2) con biotina y digoxigenina, respectivamente.

Se incuban las placas de microvaloración de 96 hoyos, recubiertos con estreptavidina, con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-NNMT biotinilado durante 60 min en una concentración de 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH = 7,4, BSA del 1%, NaCl del 0,9% y Tween 20 del 0,1%. Después de la incubación se lavan las placas tres veces con NaCl del 0,9%, Tween 20 del 0,1%. A continuación se incuban los hoyos durante 2 h con una serie de diluciones de la proteína recombinante (ver ejemplo 2) como antígeno estándar o bien con muestras de plasma diluido de los pacientes. Después de la fijación de la NNMT se incuban los hoyos con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-NNMT digoxigenilado durante 60 min a razón de 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH = 7,4, BSA del 1%, NaCl del 0,9% y Tween 20 del 0,1%. A continuación se lavan las placas tres veces para eliminar el anticuerpo sin fijar. En el paso siguiente se incuban los hoyos con 20 mU/ml de conjugado de anti-digoxigenina-POD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1633716) durante 60 min en fosfato 10 mM, pH = 7,4, BSA del 1%, NaCl del 0,9% y Tween 20 del 0,1%. Seguidamente se lavan las placas tres veces en el mismo tampón. Para la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo se incuban los hoyos con 100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº de catálogo 11685767) y se determina la OD después de 30-60 min a 405 nm con un lector de ELISA.

Ejemplo 5 Análisis ROC para evaluar la utilidad clínica en términos de resolución diagnóstica

Se evalúa la resolución analizando muestras líquidas individuales obtenidas de conjuntos de pacientes bien caracterizados, es decir, 50 pacientes que se han sometido a colonoscopia y se han encontrado libres de adenoma o de CRC, 50 pacientes diagnosticados y clasificados como T1-3, N0, M0 del CRC y 50 pacientes diagnosticados de CRC avanzado, que tienen por lo menos infiltración tumoral por lo menos en un nódulo linfático próximo o formas más severas de metástasis, respectivamente. Se mide el CEA con el ensayo que es producto comercial (Roche Diagnostics, ensayo CEA, nº de cat. 1 173 1629 para el sistema analizador de inmunoensayo Elecsys®) y se mide la NNMT del modo descrito anteriormente. Los dos se cuantifican en el suero extraído de cada uno de estos individuos. Se efectúan análisis ROC con arreglo a Zweig, M.H. y Campbell, lugar citado. El poder discriminatorio para diferenciar a los pacientes del grupo T1-3, N0, M0 de los individuos sanos se mide por el área albergada debajo de la curva y se encuentra que es por lo menos igual de bueno para la NNMT que el obtenido con el marcador ya establecido, el CEA.

Los datos preliminares indican que la NNMT puede ser también muy útil para el seguimiento de los pacientes después de la intervención quirúrgica.

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<110> Roche Diagnostics GmbH

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F. Hoffmann-La Roche AG

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<120> Uso de la proteína NNMT como marcador del cáncer colorrectal

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<130> 21548

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<150> EP 02028715.7

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<151> 2002-12-20

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<160> 1

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 264

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Rasgos diversos

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<223> Nicotinamida-N-metiltransferasa (Swiss-PROT: P40261)

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<400> 1

1

2

Claims

1. Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que consta de los pasos siguientes:

a) proporcionar una muestra líquida, extraída de un individuo,

b) poner en contacto dicha muestra con un agente de fijación específico de la NNMT en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de fijación y la NNMT y

c) establecer la correlación existente entre la cantidad de complejo formado en b) y el diagnóstico del cáncer colorrectal.

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra es suero.

3. El método según la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra es plasma.

4. El método según la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra es sangre total.

5. Uso de la proteína NNMT como molécula marcadora para el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida extraída de un individuo.

6. Uso de la proteína NNMT como molécula marcadora para el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra derivada de pacientes de CRC en el estadio de adenoma.

8. Uso según la reivindicación 6, en el que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra de pacientes de CRC en el estadio T_{is}-3; N0; M0.

9. Uso de la proteína NNMT como molécula marcadora del cáncer colorrectal en combinación con otra molécula marcadora del cáncer colorrectal para el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo.