CN102375049A - 生物信息获取方法和烟酰胺代谢物测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明申请涉及生物信息获取方法和烟酰胺代谢物测量方法。更具体地，涉及一种生物信息获取方法，包括：测量能够以微创方式从活生物体采集的样品中的烟酰胺代谢物的量；以及基于测得的烟酰胺代谢物的量获取关于该活生物体的信息。

Description

生物信息获取方法和烟酰胺代谢物测量方法

技术领域

本公开内容涉及生物信息获取方法(biological information acquisitionmethod)，具体地，涉及基于从活生物体(活有机体，living organism)采集(collect)的样品中烟酰胺代谢物(nicotinamide metabolite)的量来获取关于该活生物体的信息。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是细胞能量代谢中一种已知的氧化还原反应辅酶。NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式)是从作为养分消化的烟酰胺(NA)生物合成的。具体地，NA通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)，而NMN通过烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nmnat)转化为NAD+(参见图14)。

除了在氧化还原循环中被转化为NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式)，NAD+通过酶如去乙酰化酶(SIRT1)降解为NA和O-乙酰基-ADP-核糖(O-acetyl-ADP-ribose)而转化回到NA(参见图14)。

NAD代谢一度被认为仅局限在细胞内的一种现象，现在开始作为也发生在细胞外部的过程(包括转运)加以寻找。血液中NAD+、NADH、和NMN的浓度保持在几十微摩尔级别的高水平，该量为血液NA浓度(其仅为几个微摩尔)的十倍以上。血液NAD+、NADH、和NMN浓度不随NA的摄入而改变(参见Consideration of diurnal variations in human bloodNAD and NADP concentrations，J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo)，2009，Jun；55(3)：279-81)。因此，认为血液中NAD+、NADH、和NMN的浓度保持与NA无关，以及它们的需求和供给在细胞和组织之间、以及在组织和器官之间被控制。事实上，已知的是，将NA转化为NMN的Nampt在神经细胞或胰腺β细胞中几乎不表达，且自身不能合成NAD+的这些细胞依赖于细胞外供应NAD+(参见Nampt/PBEF/Visfatinregulates insulin secretion inbeta cells as a systemic NAD biosynthetic enzyme，Cell Metab，2007，Nov；6(5)：363-75，和Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosyntheticpathways delays axonal degeneration after axotomy，J Neurosci，2006，Aug16；26(33)：8484-91)。

关于烟酰胺代谢物(NA、NMN、NAD+、NADH)，已知NAD+和NADH的量，或它们的比率(NAD+的量/NADH的量)能够用作细胞状态和个体健康状况的指标。例如，因为NAD在细胞能量代谢中是功能性的，所以具有小量NAD+的细胞不能代谢脂肪，并倾向于累积脂肪。因此认为，能够基于NAD+的量获取关于个体对超重的易感性，或形成代谢综合征的风险的信息。而且，癌细胞需要大量的能量，并因此包含大量的NADH。因此，具有过多的大量NADH的细胞能够被认为是癌性的。在这方面，能够用来基于NADH的自身荧光(self-fluorescence)观察癌病变的内窥镜已经实际使用，且已经被用来基于NADH的量获取关于个体形成(发展，develop)癌症的风险、或有无发作(发病，onset)的信息。

烟酰胺代谢物涉及能量代谢的事实表明这些代谢物在细胞水平与疲劳相关。也考虑了在个体水平上疲劳可能涉及NAD+，如在Storage andsecretion of beta-NAD，ATP and dopamine in NGF-differentiated ratpheochromocytoma PC12 cells，Eur J Neurosci，2009，Sep；30(5)：756-68，Epub 2009 Aug 27(2009年8月27日电子版)中的报道，描述了神经细胞以与神经递质(neurotransmitter)相同的方式累积NAD+，并响应刺激而释放NAD+的机制。而且，已知器官响应于压力而经历代谢状态的变化，并且因为认为NAD代谢也经历压力诱导的变化，所以将有可能基于烟酰胺代谢物的量获取关于个体的压力的信息。

如上所述，神经细胞和胰腺β细胞依靠外部NAD+供给。在不同细胞类型中，神经细胞需要最大量的能量，并要求大量NAD+用于其神经活动。在NA缺陷(糙皮病)中，痴呆被认为是最常见症状，且NA缺陷认为是引起神经细胞能量代谢异常的一个因素。这表明了关于形成痴呆的风险、或有无发作的信息能够基于NAD+量获得的可能性。

胰腺β细胞代谢摄入的糖，且通过感测血糖水平而分泌胰岛素。因为糖的感测要求NAD+，所以NA也用作I型糖尿病的治疗药物。因此，认为基于烟酰胺代谢物的量，获取关于患糖尿病的风险、或有无发作的信息是可能的。

已经报道了在啮齿动物的血液中NMN浓度随年龄增加而降低，这表明年龄相关的血液NMN水平降低和痴呆或糖尿病之间有关联(参见Age-associated loss of Sirtl-mediated enhancement of glucose-stimulatedinsulin secretion in beta cell-specific Sirtl-overexpressing(BESTO)mice，Aging Cell，2008，Jan；7(1)：78-88，Epub 2007 Nov 14(2007年11月14日电子版))。

如上所述，认为基于烟酰胺代谢物(NA、NMN、NAD+、NADH)的量，有可能获取有用的生物信息，如关于形成疾病，如代谢综合征、癌症、痴呆和糖尿病的风险，或有无发作的信息，以及关于疲劳或压力状态的信息。

获取生物信息，如活生物体的压力、情感性(affectivity)、和月经周期的已知方法包括基于生理评价(psychological evaluation)的生物信息获取方法，涉及例如，问询和感觉问卷、测量例如脑电波或肌电的生理测试、以及涉及使用如工作记录的行为测量。例如JP-A-2006-94969公开了根据心率确定月经周期的技术。日本专利No.2582957公开了监视体温波动和心率的生命活动监视系统。

还开发了更简单的获取关于活生物体信息的技术，其中利用在血液、尿液或唾液中包含的生理活性物质作为指标。例如，JP-A-11-38004公开了用唾液中的肾上腺皮质甾醇和/或其代谢物的浓度作为指标来量化压力的方法。JP-A-2000-131318公开了允许用生物物质将压力水平作为“舒适”或“不舒适”，其中利用在血液等中包含的生物物质如β-内啡肽、多巴胺、免疫球蛋白A、和前列腺素D2作为指标。其中在血液、尿液、或唾液中包含的生理活性物质用作指标的生物信息获取方法是有利的，因为这些方法比涉及心理评价、生理测试、或行为测量的方法更简单，且不需要大型设备。

不久以前，在给定社会中的人具有或多或少相同的生活方式。为了更具体，我们习惯于在大约相同的时间上床和起床，在每天大约相同的时间进食，且基本在每天相同的时间工作。如今，人们自由选择他们自己的生活方式生活。日常习惯模式，如起床时间和就寝时间、饮食、和进食时间随不同个体而显著不同。而且，工作方式的更多便利和多样化产生了大群极度缺少锻炼时间和锻炼强度的人。

这样的生活方式的多样化在过去几十年的非常短时间内快速发生。生理上不能适应这样的生活方式的变化，导致许多人产生生理和精神痛苦。这些情形已产生了每个个体需要考虑他/她自己的生活方式，适当管理他/她健康的情形。而且，生活方式的多样化产生了需要开发针对特定生活方式的商品和服务、或销售策略规划。

健康管理和开发适于不同个体生活方式的商品要求这样的手段(措施，means)，即利用该手段，多种生活方式都可以标准方式表达和评价。然而，可利用用于个别地表达和评价不同模式的日常习惯，如起床时间和就寝时间、饮食、进食时间、以及锻炼时间和锻炼强度的指标，但还不能获得可用于综合表达和评估这些作为生活方式的日常习惯的指标。

发明内容

如上所述，需要这样的手段，利用该手段，生活方式的多样化可以标准化的方式表达和评估，该标准化的方式用于健康管理和以适于不同个体生活方式的方式开发商品。烟酰胺代谢物量可用作反映疾病的指标，如代谢综合征、癌症、痴呆、和糖尿病、以及关于疲劳或压力的活生物体的生理状态。因此，如果反映这样的生理状态的烟酰胺代谢物量能够利用以微创方式可从活生物体采集的样品，如唾液或尿液进行测量，则可以获取有用的信息，包括关于形成诸如上述疾病的风险、或有无发作的信息、关于疲劳或压力状态的信息、甚至关于生活方式的信息。

使用血液作为样品涉及血液采集，这是创伤性的，且对活生物体有精神上或身体上的要求。这可以作为压力感知，并且可引起活生物体生理状态的变化，且阻止获取精确的生物信息。因此，如上所述，优选用于烟酰胺代谢物量的测量的样品能够以微创方式从活生物体中采集，如从来自唾液或尿液。

因此，期望提供一种基于能够以微创方式从活生物体中采集的样品中的烟酰胺代谢物量，获取有用的生物信息的方法，该生物信息包括关于形成诸如代谢综合征的风险、或有无发作的信息，关于疲劳状态或其他状况的信息，以及关于生活方式的信息。

根据本公开内容的实施方式，提供了一种生物信息获取方法，包括测量能够以微创方式从活生物体中采集、且选自口腔粘膜上皮细胞(oralmucosa epithelial cell)、唾液和表皮体液(表皮流体，epidermal fluid)的一个或多个样品中的烟酰胺代谢物的量，并基于测得的烟酰胺代谢物的量获取关于活生物体的信息。

在该生物信息获取方法中，烟酰胺代谢物可以是选自烟酰胺、烟酰胺单核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的一种或多种。

该生物信息获取方法可用于获取关于选自代谢综合征、癌症、疲劳、压力、痴呆、糖尿病、生物节律(biological rhythm)和生活方式中的一种或多种的生物信息。

而且，根据本公开内容的另一个实施方式，提供了一种烟酰胺代谢物测量方法，用于测量选自口腔粘膜上皮细胞、唾液和表皮体液中的一个或多个生物样品中的烟酰胺代谢物的量，其中烟酰胺代谢物量反映了活生物体的生理状态。

在本公开内容中，“关于活生物体的信息(生物信息)”涵盖关于个体活生物体的生理状态的宽范围的信息。具体地，生物信息是关于例如形成疾病，如代谢综合征、癌症、痴呆、和糖尿病，这些疾病与烟酰胺代谢物量有可能的关联，或有无发作的信息。生物信息也指关于例如疲劳状态、压力、生物节律、或生活方式的信息。

而且，在本公开内容中，“生物节律”是指在生物现象中观察到的自发振荡周期节律。生物节律决定了在不同生物现象中观察到的并控制活生物体生理状态的宽范围的节律。例如，熟知的约24小时周期的昼夜节律(circadian rhythm)决，定了睡-醒节律，以及体温、血压和荷尔蒙分泌水平的每日波动节律，控制这些生理状态。生物节律由一组称为“生物钟(internal clock)”的基因控制。时钟基因充当“生物钟”，因而这些基因的行为，包括表达、活动、和定位以周期方式自发改变(振荡)，控制生物节律，以及由生物节律控制的不同生理状态。

而且，在本公开内容中，“生活方式”指一个人按不同模式的日常习惯定义的日常生活的方式，如睡眠的起床时间和就寝时间，饮食和进食时间、以及锻炼时间和锻炼强度。注意，“日常习惯”包括日常生活中进行的宽范围的活动，包括睡眠、进食、锻炼、洗澡、饮酒、抽烟、乘车上学或上班、以及看电视和显示器。

本公开内容提供基于能够以微创方式从活生物体内采集的样品中的烟酰胺代谢物的量，获取有用的生物信息的方法，包括关于形成疾病的风险如代谢综合征、或有无发作的信息，关于疲劳状态或其他状况的信息，以及关于生活方式的信息。

附图说明

图1A和图1B是解释从手指的皮肤表面获取生理活性物质的方法的图示。

图2是表示口腔粘膜上皮细胞中的NAD+和NADH量的测量结果的曲线(试验例1)。

图3是表示唾液中的皮质醇量的测量结果的曲线(试验例1)。

图4是表示口腔粘膜上皮细胞中的CLOCK/BMAL1表达水平的测量结果的曲线(试验例1)。

图5是表示唾液和表皮体液中的NAD+和NADH量的测量结果的曲线(试验例2)。

图6A到图6C是表示检测表皮体液中的NMN、NAD+、和NA的结果的色谱图(试验例2)。

图7是表示锻炼负荷(运动负荷，exercise load)后表皮体液中的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例3)。

图8A和图8B是表示醒来后表皮体液中的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例3)。

图9A和图9B是表示进食后表皮体液中的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例3)。

图10是表示摄入酒精后表皮体液中的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例3)。

图11A和图11B是表示年龄增加与表皮体液中的烟酰胺代谢物量之间关系的曲线(试验例3)。

图12A和图12B是表示在将皮质醇加入培养液后培养的皮肤的表皮表面的角质层上的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例4)。

图13A和图13B是表示在将葡萄糖加入培养液后培养的皮肤的表皮表面的角质层上的烟酰胺代谢物量的测量结果的曲线(试验例4)。

图14是解释烟酰胺代谢物的代谢路径的图示。

具体实施方式

本公开内容的发明人进行了各种研究，目的是利用烟酰胺代谢物量作为指标，获取生物信息，如关于形成疾病风险如代谢综合征，或有无发作的信息，关于疲劳状态的信息，以及关于生活方式的信息。这些研究揭示了以下的新发现。

(1)口腔粘膜上皮细胞中的烟酰胺代谢物的量显示了反映活生物体生理状态的变化。

(2)从唾液或表皮体液中检测烟酰胺代谢物也是可能的。

(3)表皮体液中烟酰胺代谢物的量显示了反映活生物体的生活方式的变化。

关于发现(1)，(1a)本公开内容的发明人已经揭示了，口腔粘膜上皮细胞中的NAD+和NADH量显示涉及刚醒来后暂时增加的日变化(昼夜变化，diurnal variation)，与唾液中皮质醇的量的情形一样。(1b)还已经揭示了，口腔粘膜上皮细胞中NAD+和NADH量的日变化与口腔粘膜表皮细胞中时钟基因CLOCK/BMAL1轭合物(结合物，conjugate)的表达水平的日变化反相(逆相，antiphase)。

熟知唾液中的皮质醇类，如皮质醇、皮质脂酮、和皮质酮的分泌量与活生物体的压力状态有关联(参见Stimulation of nicotinamide adeninedinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy，J Neurosci，，2006，Aug 16；26(33)：8484-91)。CLOCK和BMAL1是通过宽泛地决定在各种生物现象如睡眠和觉醒、体温、血压、和荷尔蒙分泌中观察到的生物节律而控制活生物体生理状态的代表性时钟基因。

口腔粘膜上皮细胞中NAD+和NADH量显示在皮质醇和CLOCK/BMAL1中观察到的变化是常见的变化的事实，表明NAD+和NADH量的变化也反映活生物体的生理状态，且因此能够用作生理状态的指标，如在皮质醇和CLOCK/BMAL1中一样。

关于发现(3)，发现表皮体液中的NAD+和NADH的量以这样的方式改变，即反映日常习惯模式，包括睡眠、进食、和锻炼、以及活生物体的年龄的方式。

本公开内容的发明人基于这些发现，完成了生物信息获取方法，其中测量能够以微创方式从活生物体中采集的口腔粘膜上皮细胞或表皮体液中的烟酰胺代谢物的量，并基于测得的烟酰胺代谢物的量获取关于活生物体的信息。而且，关于发现(2)，本发明的发明人发现，从唾液中检测烟酰胺代谢物也是可能的，并设计了一种利用唾液作为能够以微创方式从活生物体中采集的样品来获取生物信息的方法。

关于发现(1)和(3)，已经实施了测量在各种类型的细胞中的烟酰胺代谢物量。然而，没有表明能够以方便、微创方式从活生物体采集的口腔粘膜上皮细胞或表皮体液中烟酰胺代谢物的量显示反映活生物体的生理状态变化的报道。

而且，关于发现(2)，没有从不同于血液(血浆)的非细胞样品(noncellular sample)如唾液和表皮体液检测出烟酰胺代谢物的报道。从表皮体液获得烟酰胺代谢物的机理可能涉及烟酰胺代谢物分泌到例如汗液或皮脂中的可能性。还有这样的可能，即血液中烟酰胺代谢物穿过体表细胞到达体表。

下面描述根据本公开内容的获取生物信息方法的优选实施方式。应该注意，下面所述的实施方式仅是本公开内容的示例性实施方式，而不能解读为限制本公开内容的范围。以下面的顺序进行描述。

1、样品采集

(1)口腔粘膜上皮细胞的采集

(2)唾液的采集

(3)表皮体液的采集

2、样品中烟酰胺代谢物的量的测量

(1)体外测量

(2)体内测量

3、生物信息的获取

1.样品采集

本公开内容的实施方式的生物信息获取方法首先测量以微创方式可从活生物体采集的样品中的烟酰胺代谢物的量。然后基于测得的烟酰胺代谢物的量获取下面所述的生物信息。具体地，口腔粘膜上皮细胞、唾液、或体表体液被用作以微创方式可从活生物体采集的样品。采集每个样品的方法如下。

(1)口腔粘膜上皮细胞的采集

口腔粘膜上皮细胞是能够以最小创伤方式从活生物体采集的细胞样品的一个实例。口腔粘膜上皮细胞能够利用工具，如刷子和刮板从口腔粘膜表面刮取细胞采集。采集的部位优选是面颊背面上的粘膜。

用刷子等采集的口腔粘膜上皮细胞能够通过填充在样品管中的缓冲液，如磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤刷子而采集在样品管中。这里，细胞要么利用例如包含表面活性剂的缓冲液进行细胞溶解，要么通过例如在缓冲悬浮液中超声处理而物理分裂并细胞溶解，以便制备包含来源于口腔粘膜上皮细胞的烟酰胺代谢物的样品溶液。

(2)唾液的采集

唾液是非细胞样品，且能够以微创方式从活生物体采集。唾液能够通过例如将滤纸或毛细管放入口腔中并允许唾液吸收到滤纸或进入毛细管而被采集。采集的唾液被直接制备为含烟酰胺代谢物的样品溶液或在缓冲液中的样品溶液。

(3)表皮体液的采集

表皮体液，如汗液和皮脂也是非细胞样品，且能够以微创方式从活生物体采集。表皮体液可通过滤纸或毛细管与体表接触，并允许表皮体液吸收到滤纸或进入毛细管而采集。采集的表皮体液被直接或在缓冲液中制备为含烟酰胺代谢物的样品溶液。

可替换地，溶剂可以接触体表从而将表皮体液采集在溶剂中并制备样品溶液。溶剂可以是水或各种有机溶剂，例如酒精水溶液。接触溶剂的体表没有特别限制，且能够方便地使用例如手指或手掌的皮肤表面。

作为优选的获取表皮体液程序的具体实例，下面参考图1A和图1B描述从手指的皮肤表面获取表皮体液的方法。

图1A是利用微管(microtube)从食指的皮肤表面获取表皮体液的程序的图示。

用拇指握持包含溶剂如乙醇水溶液的微管底端，其中微管的上部开口与食指的尖部接触。在微管以食指和拇指握持下，翻转微管以使溶剂与食指皮肤表面接触。以该方式，食指皮肤表面上的表皮体液可采集在容纳在微管内的溶剂中。

图1B是举例说明利用注射器从食指的皮肤表面获取表皮体液的程序的图示。

装有溶剂如乙醇水溶液的注射器在尖端以拇指和中指握持，其中注射器与食指尖部接触。然后以右手拉注射器的活塞从而在注射器中产生负压。作为结果，皮肤表面被注射器吸住，且溶剂接触食指的皮肤表面。以该方式，相比于利用图1A中所示的微管的方法，基于注射器的负压，能够以更高产率采集接触皮肤表面的溶剂。

在图1A和图1B的采集程序中，表皮体液被采集在直接接触体表的溶剂中；然而，体表体液也可以下面的方式采集在溶剂中。具体地，例如，将塑料板以允许体表上的表皮体液附着到塑料板表面的方式压靠在体表上。然后，将溶剂滴在塑料板的表面上从而附着的表皮体液溶解并采集在溶剂中。

2、样品中烟酰胺代谢物量的测量

制备的样品溶液中的烟酰胺代谢物量可测量如下。

(1)体外测量

样品溶液中的烟酰胺代谢物可通过检测通过利用诸如液相色谱(HPLC)和毛细管电泳的技术分离的分子的光吸收、荧光、或氧化还原电势而进行测量。以该方法，可以利用通过使HPLC移动相溶剂或毛细管电泳凝胶直接接触皮肤表面而采集的表皮体液进行测量。

烟酰胺代谢物量也可以通过检测样品溶液和包含氧化还原酶和底物加辅酶NAD+和NADH的反应液体的混合物中的NAD+和NADH的氧化还原电势而进行测量。例如，心肌黄酶和2-氨基-1，4-萘醌(ANQ)可用作氧化还原酶和底物。利用NAD+和NADH的氧化还原电势进行烟酰胺代谢物量的测量是在NMN(用Nampt从样品溶液中的NA转化而来)用Nmnat转化为NAD+之后进行的。Further，measurement may be made usingthe epidermal fluid collected by directly contacting the reaction liquid to theskin surface.在这种方法中，可在用刷子等采集口腔粘膜上皮细胞，或采集的唾液直接采集到反应液体中之后进行测量。而且，可以利用通过使反应液体直接接触皮肤表面采集的表皮体液进行测量。

而且，烟酰胺代谢物量的测量可以使用利用酶循环反应的比色分析进行。使用比色分析的测量可以利用商购试剂盒实施(参见下面描述的实验例1)。

(2)体内测量

在本公开内容的实施方式中，烟酰胺代谢物的量利用从活生物体采集的口腔粘膜上皮细胞、唾液、和表皮体液进行测量。然而，关于口腔粘膜上皮细胞，测量方法不限于在采集和分离的细胞中的烟酰胺代谢物量的测量，并且口腔粘膜上皮细胞中的烟酰胺代谢物的量可以原位测量，而无需从活生物体分离细胞。

原位测量口腔粘膜上皮细胞中的烟酰胺代谢物量的方法的一个实例是基于NADH的自身荧光实施测量的方法。NADH在约350nm的激发波长，以及约450nm的发射波长处展现自身荧光。因而，在用飞秒激光(femtosecond laser)辐照口腔粘膜后，通过检测通过多光子激发在上皮细胞中的NADH的自身荧光，基于荧光强度的NADH的量化是可能的。使用多光子使得能够测量细胞中的烟酰胺代谢物的量，同时不损伤粘膜。注意该方法也可用于皮肤细胞中的烟酰胺代谢物量的原位测量。

对于表皮体液中的烟酰胺代谢物量的原位测量，可使用这样的方法，其中例如固定与烟酰胺代谢物特异性地发生反应(相互作用)的酶的电极或FET传感器与皮肤表面接触。

3、生物信息的获取

烟酰胺代谢物的测定量可用作反映活生物体的生理状态的指标。本公开内容的实施方式的生物信息获取方法可用来基于烟酰胺代谢物量，获取有用的生物信息，如关于形成疾病如代谢综合征、癌症、痴呆、和糖尿病，它们可能与烟酰胺代谢物量关联的风险，或有无发作的信息，关于疲劳或压力的信息，以及关于生活方式的信息。

该生物信息获取方法使用口腔粘膜上皮细胞、唾液、或体表体液作为能够以微创方式从活生物体采集的样品，并因此可用于便利地获取生物信息。当体表体液用作样品时，反映对象的生理状态的信息可特别精确地进行获取，而无需使对象太担心采集程序。因此，根据本公开内容的实施方式的生物信息获取方法可用来发现活生物体的健康状况，用于疾病、疲劳、和压力的诊断、预防、和预后。而且，该方法可用来提供反映日常习惯如起床时间和就寝时间、饮食、进食时间、和锻炼时间和锻炼强度的指标，且因此能够提供以标准化方式表达和评估各种各样的生活方式的装置。

实施例

试验例1

1、口腔粘膜上皮细胞中的NAD+和NADH量的测量

上皮细胞利用刷子(CytoSoft细胞检查刷；Medical Packaging Corp.)从单个对象(成年男性)的口腔粘膜采集。细胞是以4小时间隔共采集九次。第一次采集在7:00在对象醒来后立即进行，然后分别在11:00、15:00、和19:00、以及在23:00刚要就寝前进行一系列采集，最后在3:00在暂时唤醒对象后进行。每次采集三个样品。

每个采集时间采集的细胞通过在缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，和1％的蔗糖单月桂酸酯)中细胞溶解而破碎。然后利用2μl得到的细胞溶解产物(cell lysate)用商购比色分析试剂盒(Amplite Colorimetric NAD/NADH Assay Kit；ABD Bioquest Inc.)测量NAD+和NADH的量。测量结果在图2中给出。

2、唾液中皮质醇量的测量

唾液利用Sorbette(Salimetrics)采集。在用唾液浸泡Sorbette棉后，将塑料柄部对半切开，并置于2.0-ml试管中，然后将其离心以采集唾液。皮质醇的量用商购酶免疫测定(EIA)试剂盒(Salivary Cortisol EIAKit；Salimetrics)利用唾液来测量。测量结果在图3中给出。

3、口腔粘膜上皮细胞中的CLOCK/BMAL1表达水平的测量

CLOCK/BMAL1轭合物的表达水平根据JP-A-2008-67694的方法，利用通过破碎采集的口腔粘膜上皮细胞而获得的一部分细胞溶解产物进行测量。

首先，合成分别连接到CLOCK/BMAL1轭合物的DNA结合序列(SEQ ID NO：1)的5’-端和3’-端的带有荧光染料(FITC)的oligoDNA和淬灭物质(quencher substance)(BHQ)的寡DNA(oligoDNA)作为检测核酸链(参见表1)。SEQ ID NO：1的碱基序列是作为转录因子的CLOCK/BMAL1轭合物的识别序列。CLOCK/BMAL1轭合物识别这个序列，并在结合到该DNA后展现出转录活性。An oligoDNA with the basesequence of SEQ ID NO：2 was also synthesized as the complementary nucleicacid chain that binds to the detection nucleic acid chain to form a double strand(see Table 1).还合成带有SEQ ID NO：2的碱基序列的寡DNA作为结合到检测核酸链(detection nucleic acid chain)从而形成双链(double strand)的互补核酸链(complementary nucleic acid chain)(参见表1)。

表1

检测核酸链	5′FITC-acccag(AP)ccacgtgc-BHQ 3′	SEQ ID NO：1
			互补核酸链	5′gcacgtggatgggt 3′	SEQ ID NO：2

来自检测核酸链的5’-端的第六个碱基表示缺少鸟嘌呤的“AP位点(无嘌呤/无嘧啶位点(Apurinic/Apyrimidinic site))”。AP位点是缺少碱基(碱基掉落)的核酸链的位点。AP位点是通过AP-内切核酸酶特异性切断的，该AP-内切核酸酶识别双链，并裂解(切割)AP位点。

然后，利用用于COOH微粒的多联-蛋白耦接试剂盒(PolyLink-ProteinCoupling Kit)(Polyscience)将抗-BMAL 1抗体(Santa Cruz Biotechnology)固定在磁珠(micromer-M[PEG-COOH]；mcromod Partikel technologie)上，从而制备抗体磁珠。

离心(16000g，10分钟)细胞溶解产物以沉淀不溶成分。在分离上清液后，通过测量吸光度(280nm)使每个样品的蛋白质浓度相等。

样品用包含等量蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的PBS(pH7.5)和用0.05％吐温20(PBS-T)稀释，并在加入抗体磁珠下在4℃孵育2小时，以便将CLOCK/BMAL1轭合物结合到抗体磁珠。采集抗体磁珠，且将非特异性地结合至磁珠的分子用PBS-T洗涤。

然后，抗体磁珠悬浮在包含形成双链的检测核酸链和互补核酸链(每个都0.25μM)的溶液(10mM Tris-Cl(pH7.5)，50mM KCl，2.5％甘油，10mM EDTA，0.05％NP-40，0.05mg/mL鲑鱼精子DNA)中，并在37℃孵育1小时以使检测核酸链结合到在磁珠上捕获的CLOCK/BMAL1轭合物。采集抗体磁珠，且将非特异性地结合至CLOCK/BMAL1轭合物的分子用PBS-T洗涤。

然后，将抗体磁珠悬浮在水中，并在80℃孵育以离解结合到CLOCK/BMAL1轭合物的检测核酸链和互补核酸链的双链。

将离解的检测核酸链和互补核酸链的双链悬浮在20mM Tris-Acetat、10mM Mg-Acetat、50mM KCl、和1mM DTT(pH7.9)中，并在加入单链检测核酸链(0.2μM)和AP内切核酸酶下在37℃孵育。

在孵育过程中，AP内切核酸酶切割检测核酸链的AP位点，分离荧光染料和淬灭物质并引起游离荧光染料发荧光。同时，已结合到切割的检测核酸链的互补核酸链成为单链，并结合到另一单链检测核酸链而形成新双链。AP内切核酸酶切割新形成的双链并释放荧光染料。随着这个过程重复，荧光强度随时间增加。荧光强度的时间依赖性增加与细胞溶解产物中的CLOCK/BMAL1轭合物的量正相关。

图4表示在孵育过程中时间依赖性荧光强度增加的测量结果。

4、讨论

图2中口腔粘膜上皮细胞中的NAD+和NADH量显示在7:00起床时暂时增加。这是与图3中所示的唾液中皮质醇的量的变化一致的特征变化。已知唾液和血液中的皮质醇水平在压力下暂时增加，而且在起床时增加到等于甚至高于压力下的水平。

而且，图2中口腔粘膜上皮细胞中的NAD+和NADH量根据昼夜节律波动，在约11:00达到最大而在约23:00下降到最小，除去在起床时的暂时增加。这与图4中给出的口腔粘膜上皮细胞中的CLOCK/BMAL1轭合物量的变化后的昼夜节律反相。

试验例2

1、唾液和表皮体液中的NAD+和NADH量的测量

唾液中的NAD+和NADH的量利用一部分采集的唾液进行测量。表皮体液中的NAD+和NADH的量也利用采集的表皮体液进行测量。表皮体液是根据下面的程序采集的。

用纯水浸泡的纸巾轻擦食指尖部。用拇指握持包含50μL纯水的微管的底端，其中微管的上开口与食指尖部接触(参见图1A)。以食指和拇指握持微管，翻转微管从而使纯水接触食指皮肤表面1分钟。

图5表示在采集的唾液和表皮体液中的NAD+和NADH量利用比色分析试剂盒测量的结果。在唾液和表皮体液中都检测到NAD+和/或NADH。

2、表皮体液中的NMN、NAD+和NA量的检测

表皮体液用于通过液相色谱检测NMN、NAD+、和NA。

在液相色谱(UPLC/MS；Waters)分离后，通过质量分析检测NMN、NAD+、和NA，其中使用反相C18柱(Acquity UPLC BEH；Waters)，移动相为5mM醋酸铵，0.25％的醋酸，和1％的甲醇。结果在图6A到6C中给出。

在图6A中，在标准NMN中观察到的相同峰在相应于分子量为335的NMN(图中加圆圈)的柱保留时间的MS谱中得到证实。在图6B和6C中，在标准NAD+和NA中观察到的相同峰在相应于分子量为664和123的NAD+和NA(图中加圆圈)的柱保留时间的MS谱中得到证实。

试验例3

1、表皮体液中烟酰胺代谢物量和锻炼之间的关联

单个对象用测力计处于锻炼负荷下2分钟，且表皮体液以6分钟间隔采集。然后测量表皮体液中的NAD+和NADH的量。表皮体液的采集和NAD+和NADH量的测量根据试验例2中所述的方法进行。

结果在图7中给出。NAD+/NADH比率显示在锻炼负荷后立即暂时增加。因此该结果证实表皮体液中的烟酰胺代谢物的量能够以反映活生物体锻炼时间或锻炼强度的方式发生改变。

2、表皮体液中的烟酰胺代谢物量和睡眠之间的关联

表皮体液从单个对象在7:00醒来后立即采集，并在7:45、8:30、9:30和10:30采集。然后测量表皮体液中的NAD+和NADH量。表皮体液的采集和NAD+与NADH量的测量根据试验例2中描述的方法进行。

结果在图8A和8B中给出。NAD+和NADH量(参见图8A)、和NAD+/NADH比率(参见图8B)都显示在起床后暂时增加。根据称为CAR(皮质醇觉醒反应(Cortisol Awakening Response))现象，起床后这样的暂时增加也可在血液皮质醇浓度中观察到。有报道CAR可用作睡眠质量(效果)的指标(参见J.Psychosom.Res.，2000，Vol.49，No.5，pp.335-42；Psychoneuroendocrinology，2009，Vol.34，No.10，p.1476-85；Biol.Psychol.，2009，Vol.82，No.2，PP.149-55，J.Endocrinol.Invest.，2008，Vol.31，No.1，PP.16-24)。因此，确认了表皮体液中的烟酰胺代谢物量通过反映活生物体的醒来时间变化，且因此可用作睡眠质量评估的指标。

3、表皮体液中的烟酰胺代谢物量和进食之间的关联

11个对象被允许在从12:00到13:00的时间期过程中进食相同的食品，且表皮体液在12:00、13:00、14:00、15:00和16:00采集。图9A和9B表示根据试验例2中描述的方法实施的NAD+和NADH量的测量结果。

如图9A所示，进食两个小时后，NAD+和NADH量的和(总NAD(H))增加，峰值出现在15:00。在进食后1小时(n＝8)和进食后2小时(n＝2)，在几乎所有对象中观察到NAD+/NADH比率减小(n＝10/11)(参见图9B)。NAD+/NADH比率的暂时增加随摄入酒精相比进食时不摄入酒精被进一步加强(参见图10)。这些结果证实表皮体液中烟酰胺代谢物量通过反映活生物体的进食时间或饮食而变化。

4、表皮体液中烟酰胺代谢物量和年龄增大(aging)之间的关系

计算前述试验中11个对象中每一个对象的NAD+和NADH量的日平均值，其中表皮体液是从在12:00到13:00进食相同食品的对象采集的。

结果在图11A和11B中示出。发现表皮体液中的NAD+量(图11A)和NAD+/NADH比率(图11B)随年龄增大而降低。

试验例4

1、来自培养皮肤表面的烟酰胺代谢物的获取

评估培养的皮肤在表皮表面的角质层上响应于皮质醇或葡萄糖而分泌烟酰胺代谢物的能力。

三维培养皮肤(Kurabo；EPI-200X)用其与培养液接触的真皮侧进行培养。糖皮质激素(皮质醇)加入到培养液中以使最终浓度为50nM或500nM。在1小时后，150μL的PBS与表皮侧接触，并采集样品。然后利用商购比色计分析试剂盒(Amplite Colorimetric NAD/NADH Assay Kit，Amplite Colorimetric NADP/NADPH Assay Kit；ABD Bioquest公司)测量样品中的NAD+、NADH、NADP+、和NADPH的量。

结果在图12A和12B中示出。NAD+/NADH比率(图12A)独立地随着加入到培养液中的糖皮质激素增加浓度，而NADP+/NADPH比率没有变化(图12B)。

然后，在低浓度(最终浓度为1500mg/L)或高浓度(4500mg/L)葡萄糖加入到培养液后，150μL的PBS与表皮侧接触，且测量采集的样品中的NAD+、NADH、NADP+、NADPH的量。

结果在图13A和13B中示出。总NAD(H)量(NAD+量和NADH量的和)随着加入高浓度葡萄糖(图中“高”)的增加比随着加入低浓度葡萄糖(“低”)的增加更大，而与是否加入胰岛素无关(图13A)。总NADP(H)量(NADP+量和NADPH量的和)也以相同的方式增加(图13B)。

已知压力或酒精的摄入会增加血液皮质醇浓度。还报道，在起床时血液皮质醇浓度的暂时增加(CAR)可用作睡眠质量(效果)评估的指标。本发明试验例的结果表明这样的可能性，即压力或酒精诱导的血液皮质醇浓度的增加、或CAR能够作为皮肤表面上可测量的烟酰胺代谢物量增加进行检测。还认为进食后血液葡萄糖水平增加也能够作为皮肤表面上可测量的烟酰胺代谢物量增加进行检测也是可能的。

根据本公开内容的实施方式的生物信息获取方法可用来获取生物信息，包括关于形成疾病如代谢综合征、癌症、痴呆、或糖尿病的风险、或有无发作的信息、和关于疲劳状态或压力的信息，并因此可用于诸如上述的疾病的诊断、预防、或预后。该方法还提供这样的装置，通过该装置可基于反映日常习惯模式如起床时间和就寝时间、饮食、进食时间、锻炼时间和锻炼强度的指标，以标准化的方式表达和评估各种各样的生活方式。

本公开内容包含与于2010年8月4日向日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2010-175710公开的主题相关的主题，其整个内容结合于此以供参考。

本领域技术人员应该理解，可根据设计要求和其他因素做出不同修改、组合、子组合和变形，只要它们在所附权利要求或其等同替换限定的范围内。

Claims (5)

1.一种生物信息获取方法，包括：

测量能够以微创方式从活生物体采集的样品中的烟酰胺代谢物的量；以及

基于测得的所述烟酰胺代谢物的量，获取关于所述活生物体的信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是选自由口腔粘膜上皮细胞、唾液和表皮体液组成的组中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述烟酰胺代谢物是选自由烟酰胺、烟酰胺单核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸组成的组中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，获取的所述生物信息是关于选自由代谢综合征、癌症、疲劳、压力、痴呆、糖尿病、生物节律和生活方式组成的组中的一个或多个的信息。

5.一种烟酰胺代谢物测量方法，包括：

测量选自由口腔粘膜上皮细胞、唾液和表皮体液组成的组中的一个或多个生物样品中的烟酰胺代谢物的量，其中，所述烟酰胺代谢物的量反映所述活生物体的生理状态。

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