CN101096701A

CN101096701A - 腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度的测定方法

Info

Publication number: CN101096701A
Application number: CNA200610085572XA
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2006-06-26
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2008-01-02

Abstract

本发明涉及一种酶循环扩增法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、腺苷、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Description

腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度的测定方法

技术领域

本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的测定方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。

腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是：

腺苷(白色结晶粉末)+水(H₂O) 腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH₄ ⁺)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。

检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下：

腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子

氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸

+辅酶+水

谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+α-酮戊二酸+

过氧化氢

这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)将腺苷酶解产生氨。

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶：谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算出腺苷脱氨酶活性浓度。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酸脱氢酶 50000U/L

谷氨酸氧化酶 10000U/L

α-酮戊二酸 16mmol/L

本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。

α-酮戊二酸谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶。

α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酸脱氢酶 50000U/L

谷氨酸氧化酶 10000U/L

α-酮戊二酸 16mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶活性浓度的大小。

实施例二

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

α-酮戊二酸 12mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

谷氨酸脱氢酶 40000U/L

谷氨酸氧化酶 15000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。

实施例三

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

α-酮戊二酸 10mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

谷氨酸脱氢酶 60000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

谷氨酸氧化酶 20000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Claims

1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：

腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子

氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水

谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+α-酮戊二酸+过氧化氢

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪

下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶活性浓度大小测定结果。

腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨。

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶：谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出腺苷脱氨酶活性浓度。

还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

2.一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 40--500mmol/L

稳定剂 1--50mmol/L

还原型辅酶 0.1--0.35mmol/L

谷氨酸脱氢酶 2000--500000U/L

谷氨酸氧化酶 2000--500000U/L

α-酮戊二酸 2--20mmol/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；

也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamateoxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶组成。α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶组成。α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。