CN101097197A - 肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒可以是干粉状态，在使用前溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、α－酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、还原型辅酶及稳定剂，这些成分可以配成单剂试剂盒、双剂试剂盒及三剂试剂盒；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出肌酐的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的测定方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。
化学测定法——成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。
高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。
毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。
酶学测定法——主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、中请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物-还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定肌酐浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行肌酐浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明肌酐浓度测定方法原理如下：
肌酐+水+H+
肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨离子
氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶
谷氨酸脱氢酶 谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧
谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+
过氧化氢
这种方法应用肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)将肌酐酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶：谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算出肌酐浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明肌酐诊断试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
肌酐脱亚胺酶 2000U/L
谷氨酸脱氢酶 50000U/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
本发明的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、
谷氨酸氧化酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶。
α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶。
α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定肌酐浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的肌酐诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
肌酐脱亚胺酶 2000U/L
谷氨酸脱氢酶 50000U/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出肌酐浓度的大小。
实施例二
本实施例的肌酐诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
谷氨酸脱氢酶 40000U/L
谷氨酸氧化酶 15000U/L
α-酮戊二酸 12mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
肌酐脱亚胺酶 4000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。
实施例三
本实施例的肌酐诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
α-酮戊二酸 10mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷氨酸脱氢酶 60000U/L
谷氨酸氧化酶 20000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
肌酐脱亚胺酶 4000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定肌酐浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出肌酐浓度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的肌酐浓度测定方法，其方法原理如下：
肌酐+水+H+ 肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨离子
氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶
谷氨酸脱氢酶 谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧
谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+
过氧化氢
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐浓度大小测定结果。
肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)作为作用酶，功能为将肌酐酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶：谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出肌酐浓度。
还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
2.一种肌酐诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 40-500mmol/L
稳定剂 1-50mmol/L
还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L
肌酐脱亚胺酶 200-50000U/L
谷氨酸脱氢酶 2000-500000U/L
谷氨酸氧化酶 2000-500000U/L
α-酮戊二酸 2-20mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶组成。α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、α-酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶组成。α-酮戊二酸、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CNA2006100855842A CN101097197A (zh) | 2006-06-26 | 2006-06-26 | 肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度的测定方法 |
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| CNA2006100855842A CN101097197A (zh) | 2006-06-26 | 2006-06-26 | 肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度的测定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102298026A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-12-28 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 |
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| CN102298026A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-12-28 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 |
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