CN101169420A

CN101169420A - 肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度测定方法

Info

Publication number: CN101169420A
Application number: CNA2006100968836A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2008-04-30

Abstract

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，从而测算出肌酐的浓度大小。

Description

肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。

化学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。

高效液相层析法(HPLC)，肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。检索发现，申请号为90106198.0、申请日为1990.12.18的中国专利申请公开了用高效液相色谱直接测定人尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)，再通过分光光度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。

毛细管电泳法，血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。

酶学测定法主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。

检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物-还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。

据申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利介绍，该系统由于不断生成测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。其实在试剂中加入NADH或NADPH的稳定剂已经不是困难或增加成本的问题，反而比在试剂中增加一个反应系统要经济得多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定肌酐浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行肌酐浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明肌酐浓度测定方法原理如下：

肌酐脱亚胺酶(creatinine deaminase；EC 3.5.4.21)作为作用酶，功能为将肌酐酶解产生氨离子。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC1.4.3.19)和丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase EC 1.4.1.1)作为循环酶：丙氨酸脱氢酶利用氨离子和丙酮酸产生丙氨酸，甘氨酸氧化酶的酶促作用使丙氨酸产生过氧化氢、氨离子和丙酮酸，使氨离子不断地被丙氨酸脱氢酶重复循环利用，也不断地生成过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)作为显色酶，最终通过和过氧化氢的作用将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，可以测算肌酐的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明肌酐诊断试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

过氧化物酶 30000U/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

肌酐脱亚胺酶 6000U/L

丙氨酸脱氢酶 10000U/L

甘氨酸氧化酶 8000U/L

还原型色原体组合 0.1——20mmol/L

所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合：

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N，N-双乙基-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4-双氯石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯石碳酸磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

仨溴羥基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

双甲基苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3-甲基-乙基-羥基苯胺

4-氨基抗砒

石碳酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

4-氨基抗砒

N，N-双乙基-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，4-双氯石碳酸

4-氨基抗砒

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯石碳酸磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

4-氨基抗砒

仨溴羥基苯甲酸

4-氨基抗砒

双甲基苯胺

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

4-氨基抗砒

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

4-氨基抗砒

3-甲基-乙基-羥基苯胺。

本发明的肌酐诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、还原型色原体组合。

试剂2

缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。

还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸、还原型色原体组合。

试剂3

缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶。

还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的肌酐诊断试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

过氧化物酶 30000U/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

肌酐脱亚胺酶 6000U/L

丙氨酸脱氢酶 10000U/L

甘氨酸氧化酶 8000U/L

4-氨基抗砒 2mmol/L

石碳酸 10mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。

实施例二

本实施例的肌酐诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

丙酮酸 12mmol/L

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

过氧化物酶 40000U/L

肌酐脱亚胺酶 8000U/L

丙氨酸脱氢酶 12000U/L

甘氨酸氧化酶 6000U/L

4-氨基抗砒 0.6mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。

实施例三

本实施例的肌酐诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

双甲基苯胺 2mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

丙酮酸 20mmol/L

3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

过氧化物酶 20000U/L

肌酐脱亚胺酶 12000U/L

丙氨酸脱氢酶 16000U/L

甘氨酸氧化酶 8000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。

Claims

1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的肌酐浓度测定方法，其方法原理如下：

将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，得出肌酐浓度大小测定结果。

2.一种肌酐诊断试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——50mmol/L

肌酐脱亚胺酶 2000——12000U/L

丙氨酸脱氢酶 4000——20000U/L

甘氨酸氧化酶 2000——12000U/L

过氧化物酶 500——80000U/L

还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L

丙酮酸 2——30mmol/L

还原型色原体组合 0.1——20mmol/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；

也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

7.根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合：

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N，N-双乙基-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4-双氯石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯石碳酸磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

仨溴羥基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

双甲基苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3-甲基-乙基-羥基苯胺

4-氨基抗砒

石碳酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

4-氨基抗砒

N，N-双乙基-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，4-双氯石碳酸

4-氨基抗砒

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯石碳酸磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

N-乙基-n-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

4-氨基抗砒

仨溴羥基苯甲酸

4-氨基抗砒

双甲基苯胺

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

4-氨基抗砒

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

4-氨基抗砒

3-甲基-乙基-羥基苯胺