CN101169410A - 氨诊断/测定试剂盒及氨浓度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂及抗干扰剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出氨浓度的大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定氨浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明氨浓度测定方法原理如下：
氨离子+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 丙氨酸+水+辅酶
丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨离子+丙酮酸+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水
这种方法应用丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)作为作用酶，功能为将氨酶解产生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycineoxidase；EC 1.4.3.19)作为循环酶：再将丙氨酸再次变回氨，使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地循环扩增产出过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)作为显色酶，将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出氨浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明氨诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
丙氨酸脱氢酶 6000U/L
甘氨酸氧化酶 8000U/L
丙酮酸 16mmol/L
过氧化物酶 40000U/L
还原型色原体组合 6mmol/L
抗干扰剂 30mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的氨诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、还原型色原体组合及抗干扰剂。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶。
还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合。
试剂2
缓冲液、丙酮酸、还原型色原体组合及抗干扰剂。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶。
还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的氨诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
丙氨酸脱氢酶 6000U/L
甘氨酸氧化酶 8000U/L
丙酮酸 16mmol/L
过氧化物酶 40000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出氨的浓度大小。
实施例二
本实施例的氨诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
丙氨酸脱氢酶 6000U/L
甘氨酸氧化酶 8000U/L
过氧化物酶 40000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出氨的浓度大小。
实施例三氨诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
丙氨酸脱氢酶 6000U/L
甘氨酸氧化酶 8000U/L
过氧化物酶 40000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出氨的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好。
Claims (7)
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的氨浓度测定方法，其方法原理如下：
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出氨浓度大小测定结果。
2.一种氨诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——50mmol/L
还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L
丙氨酸脱氢酶 1000——80000U/L
甘氨酸氧化酶 1000——80000U/L
丙酮酸 2——50mmol/L
过氧化物酶 500——500000U/L
还原型色原体组合 0.1——20mmol/L
抗干扰剂 1——50mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成双剂试剂；
试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成多剂试剂；
试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述氨诊断/测定试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080430 |