CN101169425A

CN101169425A - 铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

Info

Publication number: CN101169425A
Application number: CNA200610096886XA
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2008-04-30

Abstract

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在40－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出铜浓度的大小。

Description

铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

正常成人体内含铜量为80～150mg，血循环铜占总铜量的10％。血浆中约95％铜a₂球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)，经酸处理后才能与铜试剂反应。其余5％为游离铜。许多酶都含有铜，如细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响铁的吸收、运送和利用。

生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利用铜离子在火焰中被还原为Cu⁰，从铜空心阴极灯发出的光波Cu⁰吸收的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极“剥下”或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分析。中子活化分析是利用中子将⁶³Cu转变成不稳定⁶⁴Cu同位素，后者衰变时释放γ射线可在1。34MeV计数，应用于特定研究中心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定铜浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行铜浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明铜浓度测定方法原理如下：

这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase；EC1.4.3.13；EC 1.4.3.14)酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应连续监测法。赖氨酸氧化酶作为作用酶，功能为将赖氨酸酶解产生氨及过氧化氢。丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶作为循环酶：丙氨酸脱氢酶的酶促作用使氨产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶再将丙氨酸再次变回氨并同时产生过氧化氢，使氨不断地被重复循环利用，因此连续不断地产生过氧化氢。过氧化物酶作为显色酶，通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处测定染料-吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小速度，得出铜浓度大小测定结果。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明铜诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 20mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

赖氨酸氧化酶 12000U/L

丙氨酸脱氢酶 16000U/L

甘氨酸氧化酶 16000U/L

过氧化物酶 30000U/L

还原型色原体组合 0.1——20mmol/L

所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N，N-双乙基-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4-双氯石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯石碳酸磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

仨溴羥基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

双甲基苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3-甲基-乙基-羥基苯胺

4-氨基抗砒

石碳酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

4-氨基抗砒

N，N-双乙基-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，4-双氯石碳酸

4-氨基抗砒

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯石碳酸磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

4-氨基抗砒

仨溴羥基苯甲酸

4-氨基抗砒

双甲基苯胺

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

4-氨基抗砒

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

4-氨基抗砒

3-甲基-乙基-羥基苯胺

本发明的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。

过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、还原型色原体组合、赖氨酸、丙酮酸。

试剂3

缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。

过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的铜诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 20mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

赖氨酸氧化酶 12000U/L

丙氨酸脱氢酶 16000U/L

甘氨酸氧化酶 16000U/L

过氧化物酶 30000U/L

4-氨基抗砒 2mmol/L

石碳酸 10mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测铜样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出铜的浓度大小。

实施例二

本实施例的铜诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 10mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

赖氨酸氧化酶 15000U/L

丙氨酸脱氢酶 12000U/L

甘氨酸氧化酶 16000U/L

过氧化物酶 20000U/L

4-氨基抗砒 0.6mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测铜样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出铜的浓度大小。

实施例三

本实施例的铜诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂l

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

赖氨酸 20mmol/L

丙酮酸 16mmol/L

双甲基苯胺 2mmol/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

赖氨酸氧化酶 12000U/L

丙氨酸脱氢酶 12000U/L

甘氨酸氧化酶 12000U/L

过氧化物酶 20000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测铜样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出铜的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。

Claims

1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的铜浓度测定方法，其方法原理如下：

将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出铜浓度大小测定结果。

2.一种铜诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——50mmol/L

还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L

赖氨酸 1——50mmol/L

丙酮酸 1——50mmol/L

过氧化物酶 500——80000U/L

赖氨酸氧化酶 1000——80000U/L

丙氨酸脱氢酶 1000——80000U/L

甘氨酸氧化酶 1000——80000U/L

还原型色原体组合 0.1——20mmol/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；

也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、赖氨酸、丙酮酸、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

7.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合：

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N，N-双乙基-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4-双氯石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯石碳酸磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

仨溴羥基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

双甲基苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

3-甲基-乙基-羥基苯胺

4-氨基抗砒

石碳酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

4-氨基抗砒

N，N-双乙基-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，4-双氯石碳酸

4-氨基抗砒

2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯石碳酸磺酸

4-氨基抗砒

3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐

4-氨基抗砒

仨溴羥基苯甲酸

4-氨基抗砒

双甲基苯胺

4-氨基抗砒

N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺

4-氨基抗砒

2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)

4-氨基抗砒

4-羥基-3-甲氧基苯甲酸

4-氨基抗砒

3-甲基-乙基-羥基苯胺