CN101173933A

CN101173933A - 铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

Info

Publication number: CN101173933A
Application number: CNA2006100973092A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-05-07

Abstract

本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。

Description

铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

正常成人体内含铜量为80～150mg，血循环铜占总铜量的10％。血浆中约95％铜a₂球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)，经酸处理后才能与铜试剂反应。其余5％为游离铜。许多酶都含有铜，如细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响铁的吸收、运送和利用。

生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利用铜离子在火焰中被还原为Cu⁰，从铜空心阴极灯发出的光波Cu⁰吸收的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极“剥下”或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分析。中子活化分析是利用中子将⁶³Cu转变成不稳定⁶⁴Cu同位素，后者衰变时释放γ射线可在1。34MeV计数，应用于特定研究中心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymaticdoubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定铜浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行铜浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明铜浓度测定方法原理如下：

赖氨酸+氧+水赖氨酸氧化酶/Cu ²⁺ 6-氨基-2-氧代己酸+氨+过氧化氢

氨+酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+水+辅酶

过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶辅酶+2水

这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase；EC1.4.3.13；EC 1.4.3.14)酶(偶)联谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase；EC 1.4.1.2；EC 1.4.1.3)、NADH过氧化物酶(NADH peroxidase；EC1.11.1.1；EC 1.11.1.2)酶促反应连续监测/速率比色法。赖氨酸氧化酶酶解赖氨酸反应产生氨及过氧化氢，再通过(偶)联合谷氨酸脱氢酶、NADH过氧化物酶分别作用于氨及过氧化氢，最终都将还原型辅酶(在340nm 有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算铜的浓度大小。谷氨酸脱氢酶及NADH过氧化物酶可以只加一个，二个都加就起倍增作用，可以提高灵敏度一倍。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明铜诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 20mmol/L

酮戊二酸酯 16mmol/L

赖氨酸氧化酶 12000U/L

谷氨酸脱氢酶 16000U/L

本发明的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯。

试剂2

缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。

还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、赖氨酸、酮戊二酸酯。

试剂3

缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶。

还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定铜浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的铜诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 20mmol/L

酮戊二酸酯 16mmol/L

赖氨酸氧化酶 12000U/L

谷氨酸脱氢酶 16000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测铜样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出铜的浓度大小。

实施例二

本实施例的铜诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

赖氨酸 12mmol/L

酮戊二酸酯 20mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

赖氨酸氧化酶 16000U/L

谷氨酸脱氢酶 20000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测铜样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

实施例三

本实施例的铜诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

赖氨酸 10mmol/L

酮戊二酸酯 26mmol/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

赖氨酸氧化酶 24000U/L

谷氨酸脱氢酶 36000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定铜浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测铜样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims

1.一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的铜浓度测定方法，其方法原理如下：

赖氨酸+氧+水赖氨酸氧化酶/Cu²⁺ 6-氨基-2-氧代己酸

+氨+过氧化氢

氨+酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+

水+辅酶

过氧化氢+还原型辅酶 NADH过氧化物酶辅酶+2水

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出铜的浓度大小测定结果。

2.一种铜诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20-500mmol/L

稳定剂 1-50mmol/L

还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L

赖氨酸 1-50mmol/L

酮戊二酸酯 1-50mmol/L

赖氨酸氧化酶 1000-80000U/L

谷氨酸脱氢酶 1000-80000U/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、赖氨酸、酮戊二酸酯组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、赖氨酸、酮戊二酸酯、赖氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述铜诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。