CN101329330A - 草酸诊断/测定试剂盒及草酸浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的草酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定草酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、酮戊二酸、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种草酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定草酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
草酸作为一种最简单的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有重要的生理功能，并且在植物抗逆性中发挥积极作用。草酸多以钾盐或钙盐的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中却以游离酸的形式存在，草酸有毒，能溶解于水。草酸是一种重要的化工原料，广泛用于医药、染料、涂料、稀土金属的分离和提纯以及衣物的漂白。
测定草酸的方法有：离子色谱法、电导离子色谱法、HPLC方法。临床上大多数结石属草酸钙结石。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定草酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的草酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行草酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明草酸浓度测定方法原理如下：
草酸+氧草酸氧化酶二氧化碳+过氧化氢
二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶
D-异柠檬酸+辅酶
这种方法应用草酸氧化酶(oxalate oxidase；EC 1.2.3.4)偶联异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)酶促反应连续监测法/终点比色法。草酸氧化酶酶解草酸反应产生二氧化碳，再通过偶联异柠檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算草酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明草酸诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
草酸氧化酶 10000U/L
异柠檬酸脱氢酶 12000U/L
酮戊二酸 20mmol/L
本发明的草酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶。
还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶。
还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定草酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的草酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
草酸氧化酶 10000U/L
异柠檬酸脱氢酶 12000U/L
酮戊二酸 20mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测草酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的草酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
酮戊二酸 20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
草酸氧化酶 10000U/L
异柠檬酸脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测草酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的草酸诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
酮戊二酸 20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
草酸氧化酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定草酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测草酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的草酸浓度测定方法，其方法原理如下：
草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+过氧化氢
二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 异柠檬酸脱氢酶
D-异柠檬酸+辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出草酸的浓度大小测定结果。
2.一种草酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L
草酸氧化酶 1000-80000U/L
异柠檬酸脱氢酶 1000-80000U/L
酮戊二酸 1-50mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶组成。还原型辅酶、草酸氧化酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CNA2007100247216A CN101329330A (zh) | 2007-06-21 | 2007-06-21 | 草酸诊断/测定试剂盒及草酸浓度测定方法 |
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| CNA2007100247216A CN101329330A (zh) | 2007-06-21 | 2007-06-21 | 草酸诊断/测定试剂盒及草酸浓度测定方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110699423A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-17 | 浙江大学 | 一种检测草酸浓度的试剂、试剂盒及方法 |
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2007
- 2007-06-21 CN CNA2007100247216A patent/CN101329330A/zh active Pending
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