CN101620080A - 锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。

Description

锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic doublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明锰离子浓度测定方法原理如下：

草酸+氧 草酸氧化酶/Mn ²⁺  二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸+

                                       辅酶A+辅酶

氨+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 丙氨酸+水+辅酶

这种方法应用需要锰离子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase；EC1.2.3.4)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)酶促反应速率比色法。草酸氧化酶的激活程度与锰离子的浓度成正比。草酸氧化酶酶解草酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰离子的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                            100mmol/L

稳定剂                            500mmol/L

还原型辅酶                        0.25mmol/L

草酸氧化酶                        6000U/L

丙酮酸脱氢酶                      8000U/L

丙氨酸脱氢酶                      10000U/L

草酸                              12mmol/L

乙酰辅酶A                         9mmol/L

氯化铵                            15mmol/L

本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵。

试剂2

缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。

还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶。

还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锰离子浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的锰离子诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

还原型辅酶                       0.25mmol/L

草酸氧化酶                       6000U/L

丙酮酸脱氢酶                     8000U/L

丙氨酸脱氢酶                     10000U/L

草酸                             12mmol/L

乙酰辅酶A                        9mmol/L

氯化铵                           15mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。

实施例二

本实施例的锰离子诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

还原型辅酶                       0.25mmol/L

草酸                             12mmol/L

乙酰辅酶A                        9mmol/L

氯化铵                           15mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

草酸氧化酶                       6000U/L

丙酮酸脱氢酶                     8000U/L

丙氨酸脱氢酶                     10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。

实施例三

本实施例的锰离子诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

还原型辅酶                       0.25mmol/L

草酸                             12mmol/L

乙酰辅酶A                        9mmol/L

氯化铵                           15mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

丙酮酸脱氢酶                     8000U/L

丙氨酸脱氢酶                     10000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

草酸氧化酶                       6000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定锰离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.02；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达5mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.2±0.1ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。

Claims (6)

1.一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的锰离子浓度测定方法，其方法原理如下：

草酸+氧草酸氧化酶/Mn2+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+

                                      辅酶A+辅酶

氨+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸+水+辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰离子的浓度大小测定结果。

2.一种锰离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液                20——500mmol/L

稳定剂                1——4000mmol/L

还原型辅酶            0.1——0.35mmol/L

草酸氧化酶            1000——80000U/L

丙酮酸脱氢酶          1000——80000U/L

丙氨酸脱氢酶          1000——80000U/L

草酸                  1——50mmol/L

乙酰辅酶A             1——50mmol/L

氯化铵                1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶组成。还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、草酸、乙酰辅酶A、氯化铵在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。