CN103743689B - 一种辅酶ⅰnad或nadh含量检测试剂盒 - Google Patents

一种辅酶ⅰnad或nadh含量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒，包括以下试剂：浓盐酸酸性提取液；NaOH碱性提取液；0.715g HEPES和4.47mg EDTA制备的基质缓冲液15mL；40﹪乙醇液体4mL；12.47mgPMS的粉剂；4.26mgMTT的粉剂；0.58mg乙醇脱氢酶溶于10mM PBS，0.1％(W/V)BSA后制备的100U/mL乙醇脱氢酶液体1.8mL；7g NaCl定容至30mL的液体30mL；96﹪乙醇液体50mL。本发明适用于植物、动物、细胞和微生物等所有材料；解决了样本中NAD或NADH因为含量低、干扰多以致难以检测的问题；缩短了反应时间，简化了反应步骤，提高了检测效率。

Description

一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒。
背景技术
NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD或NADH含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD或NADH及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。并且，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
发明内容
本发明旨在提供了一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒，采用该试剂盒进行的检测方法操作简单、快速、特异、灵敏，为检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒，包括以下组成试剂：
1)酸性提取液：吸取428ul的浓盐酸定容至50mL的酸性提取液，1瓶，4℃保存；
2)碱性提取液：称取0.2g的NaOH定容至50mL的碱性提取液，1瓶，4℃保存；
3)试剂一：称取0.715g HEPES和4.47mg EDTA，定容至15mL，用KOH调PH至8.0后制备的基质缓冲液15mL，1瓶，4℃保存；
4)试剂二：40﹪乙醇液体4mL，1瓶，4℃保存；
5)试剂三：称取12.47mgPMS于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，-20℃保存；
6)试剂四：称取4.26mgMTT于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，4℃保存；
7)试剂五：称取0.58mg乙醇脱氢酶溶于10mM PBS，pH＝7.5，0.1％(W/V)BSA后制备的100U/mL乙醇脱氢酶液体1.8mL，1支，4℃保存；
8)试剂六：称取7g NaCl定容至30mL的液体30mL，1瓶，4℃保存；
9)试剂七：96﹪乙醇液体50mL，1瓶，4℃保存。
本发明的有益效果是：
1、本发明适用范围广：适用于植物、动物、细胞和微生物等所有材料；
2、本发明检测灵敏度高：解决了样本中NAD或NADH因为含量低、干扰多以致难以检测的问题，最低检测限达到10nm/L。
3、本发明操作简便：采用分光光度计和酶标仪均可检测，缩短了反应时间；简化了反应步骤，可以规模化检测，在提高检测结果准确性和可靠性的同时，提高了检测效率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒，包括以下组成试剂：
1)酸性提取液：吸取428ul的浓盐酸定容至50mL的酸性提取液，1瓶，4℃保存；
2)碱性提取液：称取0.2g的NaOH定容至50mL的碱性提取液，1瓶，4℃保存；
3)试剂一：称取0.715g HEPES和4.47mg EDTA，定容至15mL，用KOH调PH至8.0后制备的基质缓冲液15mL，1瓶，4℃保存；
4)试剂二：40﹪乙醇液体4mL，1瓶，4℃保存；
5)试剂三：称取12.47mgPMS于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，-20℃保存；
6)试剂四：称取4.26mgMTT于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，4℃保存；
7)试剂五：称取0.58mg乙醇脱氢酶溶于10mM PBS，pH＝7.5，0.1％(W/V)BSA后制备的100U/mL乙醇脱氢酶液体1.8mL，1支，4℃保存；
8)试剂六：称取7g NaCl定容至30mL的液体30mL，1瓶，4℃保存；
9)试剂七：96﹪乙醇液体50mL，1瓶，4℃保存。
一种采用本发明的辅酶ⅠNAD或NADH含量快速定容检测方法，分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。具体操作方法如下：
一、NAD和NADH的提取
1、血清(浆)中NAD+和NADH的提取
NAD+的提取：取0.1mL血清(浆)，加入0.9mL酸性提取液，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
NADH的提取：取0.1mL血清(浆)，加入0.9mL碱性提取液，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
2、组织中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：称取约0.1g组织，加入0.9mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
NADH的提取：称取约0.1g组织，加入0.9mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
3、细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：先收集400-500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入0.9mL酸性提取液，超声波破碎1min(强度20％，超声2s，停1s)，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
NADH的提取：先收集400-500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入0.9mL碱性提取液，超声波破碎1min(强度20％，超声2s，停1s)，煮沸5min；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10000g 4℃离心10min，取上清液冰上保存待测。
二、测定步骤(在1.5mLEP管中按下表依次加样)
试剂名称 测定孔(μL)
样本 50
试剂一 250
试剂二 75
试剂三 75
试剂四 75
试剂五 35
充分混匀后，室温避光静置40min
试剂六 500
充分混匀，静置5min后，20000g，4℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：
试剂七 1000
混匀，570nm下比色
注意事项
1、若用比色皿测，沉淀用试剂七溶解后必须立即测。最好加一个测一个。
2、若用酶标板测，必须在测定时再加试剂七，加入1000μL试剂七溶解沉淀，混匀后，取300μL至酶标板中测定。
3、不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。
4、本试剂盒50管保证测48个NAD+和NADH。
三、NAD+和NADH含量的计算
1、NAD+含量的计算
1.1血清(浆)中NAD+含量计算
NAD+含量(μmol/L)＝(测定管OD值-0.091)×35.5
1.2组织中NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+(μmol/g prot)＝(测定管OD值-0.091)×3.55÷样本蛋白浓度(g/L)
(2)按样本鲜重计算
NAD+(μmol/g mass)＝(测定管OD值-0.091)×3.55÷样本鲜重(g/L)
1.3细胞或细菌中NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+(μmol/g prot)＝(测定管OD值-0.091)×3.55÷样本蛋白浓度(g/L)
(2)按细菌或细胞密度计算
NAD+(μmol/104cell)＝(测定管OD值-0.091)×3.55÷细菌或细胞(104cell/L)
2、NADH含量的计算
2.1血清(浆)中NADH含量计算
NADH含量(μmol/L)＝(测定管OD值-0.091)×42.7
2.2组织中NADH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH(μmol/g prot)＝(测定管OD值-0.091)×4.27÷样本蛋白浓度(g/L)
(2)按样本鲜重计算
NADH(μmol/g mass)＝(测定管OD值-0.091)×4.27÷样本鲜重(g/L)
2.3细胞或细菌中NADH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH(μmol/g prot)＝(测定管OD值-0.091)×4.27÷样本蛋白浓度(g/L)
(2)按细菌或细胞密度计算
NADH(μmol/104cell)＝(测定管OD值-0.091)×4.27÷细菌或细胞密度(104cell/L)。
采用本发明的辅酶ⅠNAD或NADH含量快速定容检测方法和原有方法相比的优点：
1、回收率：98﹪-102﹪。
2、检测限：NAD和NADH标准品的最低检测限均达到10nm/L,动植物样本中NAD和NADH的最低检测限为0.1nmol/g鲜重。和原始方法相比，检测灵敏度提高了20倍左右。
3、本方法利用2mol/L NaCl作为乙醇脱氢酶催化NAD或NADH氧化还原的抑制剂，不但可以使酶促反应终止，而且可以使氧化型噻唑蓝(MTT)的还原产物甲瓒沉淀下来，大大缩短了检测时间。
4、最终反应产物在24小时内保持稳定。
5、与传统的使用高效液相色谱(HPLC)法相比，该方法取避免了干扰物质的影响。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种辅酶ⅠNAD或NADH含量检测试剂盒，其特征在于，包括以下组成试剂：
1)酸性提取液：吸取428ul的浓盐酸定容至50mL的酸性提取液，1瓶，4℃保存；
2)碱性提取液：称取0.2g的NaOH定容至50mL的碱性提取液，1瓶，4℃保存；
3)试剂一：称取0.715g HEPES和4.47mg EDTA，定容至15mL，用KOH调pH至8.0后制备，得基质缓冲液15mL，1瓶，4℃保存；
4)试剂二：体积分数为40﹪乙醇液体4mL，1瓶，4℃保存；
5)试剂三：称取12.47mgPMS于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，-20℃保存；
6)试剂四：称取4.26mgMTT于5mL棕色瓶中的粉剂，1瓶，4℃保存；
7)试剂五：称取0.58mg乙醇脱氢酶溶于10mM PBS，pH＝7.5，质量浓度为0.1％BSA后，制备得100U/mL乙醇脱氢酶液体1.8mL，1支，4℃保存；
8)试剂六：称取7g NaCl定容至30mL的液体30mL，1瓶，4℃保存；
9)试剂七：体积分数为96﹪乙醇液体50mL，1瓶，4℃保存。
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