CN105651878A - 一种抗坏血酸含量测定试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗坏血酸含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒包含的试剂有：由偏磷酸溶于蒸馏水后配制而成的试剂一，由磷酸组成的试剂二，以及由？L-抗坏血酸组成的试剂三。本发明的样本前处理过程快速，可以有效地保留样本中抗坏血酸，而且提取液成分简单，仅用1%的偏磷酸溶液即可，成本极低。本发明的方法采用紫外检测器，通过保留时间定性、峰面积定量，测定结果更加准确。本发明的测定步骤只需要在测定前简单配制试剂一和试剂二，操作简单，非专业人士也能实施。本发明的方法在自动进样器的辅助下可以连续进样，适用于样本的批量测定，节省测定时间和人力。

Description

一种抗坏血酸含量测定试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种抗坏血酸含量测定试剂盒及其方法。

背景技术

维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人和动物生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。维生素大致可分为脂溶性和水溶性两大类，水溶性维生素主要包括维生素B1、维生素B2、抗坏血酸等。

抗坏血酸（AsA）即维生素C，在生物体内，抗坏血酸是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的威胁，抗坏血酸同时也是一种辅酶。目前市面已有的检测抗坏血酸的方法为滴定法和光度分析法。

滴定法又包括2,6-二氯靛酚滴定法和直接碘量法两种。2，6-二氯靛酚滴定法，在滴定过程中还原型抗坏血酸还原2，6-二氯酚靛酚后，自身被氧化生成脱氢抗坏血酸，在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯酚靛酚的量与样品中所含抗坏血酸的量成正比。该法缺陷在于特异性差，许多其他还原性的化合物均可以还原2，6-二氯酚靛酚，且生成的有色化合物不稳定，加上测定终点难以准确判断，给测定结果造成较大误差。

直接碘量法的原理是利用碘的氧化性，用淀粉作指示剂，采用碘标准溶液进行直接滴定，当抗坏血酸被碘完全氧化后，过量的碘与淀粉作用而使溶液变蓝，并指示滴定终点，依据所消耗的碘量即可计算出试样中抗坏血酸的含量。但是碘溶液具有不稳定性，易挥发，致使碘标准液的配制与标定比较繁琐。

光度分析法常选用的是2，4-二硝基苯肼法，但该法干扰因素较多，2，4-二硝基苯肼除了与抗坏血酸发生反应外，还可以与五碳糖、六碳糖等碳水化合物反应，从而影响了测定结果，且反应显色时间较长，37℃下的反应需耗时3-4h，操作费时。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种抗坏血酸含量测定试剂盒及其方法，可快速准确的测算出抗坏血酸的含量。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种抗坏血酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：

试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由偏磷酸溶于蒸馏水后配制而成，置于120mL试剂瓶中；

试剂二，液体×1瓶，4℃保存，由磷酸组成，置于5mL试剂瓶中；

试剂三，维生素C标准品×1支，-20℃保存，由L-抗坏血酸组成，置于1.5mLEP管中。

进一步的，所述试剂一中，偏磷酸的质量为0.8g，蒸馏水的体积为80mL。

进一步的，所述试剂二中，磷酸的体积为5mL。

进一步的，所述试剂三中，L-抗坏血酸的质量为0.5mg。

抗坏血酸不稳定，在样品处理和储存过程中极易氧化，而抗坏血酸在254nm波长下有吸收峰，故高效液相色谱为抗坏血酸的测定提供了简单、快速且准确的方法。

一种基于高效液相色谱法的抗坏血酸含量测定方法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、涡旋震荡器、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各1个，0.45μm）、C18柱（4.6×250mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、内衬管（50个，放置在样品瓶内用于微量样品进样）、甲醇（色谱级，200mL）和超纯水；

步骤2溶剂的除杂处理；

将500mL超纯水用0.45μm的水系滤膜抽滤，将200mL甲醇用0.45μm的有机系滤膜抽滤，分别除去超纯水和甲醇中的杂质，以防止堵塞色谱柱；

步骤3流动相的配制；

取100mL除杂后的甲醇和400mL除杂后的超纯水混合（1：4的比例），并加入0.5mL所述试剂二，混匀，配成流动相；

步骤4溶剂的脱泡；

将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱；

步骤5抗坏血酸的提取；

称取0.1g样本，加入1mL所述试剂一，冰浴匀浆，采用离心率8000g离心10min，取上清液，用所述试剂一定容至1mL，混匀，使用针头式过滤器过滤后待测；

步骤6标准品的配制；

在所述试剂三中加入1mL所述试剂一，配成500μg/mL的母液，将母液用所述试剂一分别稀释成40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的抗坏血酸标准品溶液，分别将四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液采用针头式过滤器过滤后待测；

步骤7抗坏血酸含量测定操作步骤；

1）开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速0.6mL/min，柱温25℃，保留时间10min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组；

2）启动输液泵，使流动相通过色谱柱，待基线稳定后开始加样；

3）分别加入四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液10μL，在10min内可分离抗坏血酸，抗坏血酸的保留时间为5min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算四组不同浓度的抗坏血酸标准品的峰面积；

4）加入样品10μL，在相应保留时间处检测抗坏血酸的峰面积；

步骤8抗坏血酸含量的计算；

以标准品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算抗坏血酸标准曲线，将样品峰面积代入标准曲线，计算出样品抗坏血酸的含量。

本发明的有益效果是：

1、由于抗坏血酸不稳定，因此本发明的样本前处理过程快速，可以有效地保留样本中抗坏血酸，而且提取液成分简单，仅用1%的偏磷酸溶液即可，成本极低。

2、本发明的方法采用紫外检测器，通过保留时间定性、峰面积定量，测定结果更加准确。

3、本发明的测定步骤只需要在测定前简单配制试剂一和试剂二，操作简单，非专业人士也能实施。

4、本发明的方法在自动进样器的辅助下可以连续进样，适用于样本的批量测定，节省测定时间和人力。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。

具体实施方式

下面将结合实施例，来详细说明本发明。

一种抗坏血酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：

试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由0.8g偏磷酸溶于80mL蒸馏水后配制而成，置于120mL试剂瓶中；

试剂二，液体×1瓶，4℃保存，由5mL磷酸组成，置于5mL试剂瓶中；

试剂三，维生素C标准品×1支，-20℃保存，由0.5mgL-抗坏血酸组成，置于1.5mLEP管中。

抗坏血酸不稳定，在样品处理和储存过程中极易氧化，而抗坏血酸在254nm波长下有吸收峰，故高效液相色谱为抗坏血酸的测定提供了简单、快速且准确的方法。

一种基于高效液相色谱法的抗坏血酸含量测定方法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、涡旋震荡器、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各1个，0.45μm）、C18柱（4.6×250mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、内衬管（50个，放置在样品瓶内用于微量样品进样）、甲醇（色谱级，200mL）和超纯水；

步骤2溶剂的除杂处理；

将500mL超纯水用0.45μm的水系滤膜抽滤，将200mL甲醇用0.45μm的有机系滤膜抽滤，分别除去超纯水和甲醇中的杂质，以防止堵塞色谱柱；

步骤3流动相的配制；

取100mL除杂后的甲醇和400mL除杂后的超纯水混合（1：4的比例），并加入0.5mL所述试剂二，混匀，配成流动相；

步骤4溶剂的脱泡；

将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱；

步骤5抗坏血酸的提取；

称取0.1g样本，加入1mL所述试剂一，冰浴匀浆，采用离心率8000g离心10min，取上清液，用所述试剂一定容至1mL，混匀，使用针头式过滤器过滤后待测；

步骤6标准品的配制；

在所述试剂三中加入1mL所述试剂一，配成500μg/mL的母液，将母液用所述试剂一分别稀释成40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的抗坏血酸标准品溶液，分别将四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液采用针头式过滤器过滤后待测；

步骤7抗坏血酸含量测定操作步骤；

1）开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速0.6mL/min，柱温25℃，保留时间10min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组；

2）启动输液泵，使流动相通过色谱柱，待基线稳定后开始加样；

3）分别加入四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液10μL，在10min内可分离抗坏血酸，抗坏血酸的保留时间为5min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算四组不同浓度的抗坏血酸标准品的峰面积；

4）加入样品10μL，在相应保留时间处检测抗坏血酸的峰面积；

步骤8抗坏血酸含量的计算，

以标准品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算抗坏血酸标准曲线，将样品峰面积代入标准曲线，计算出样品抗坏血酸的含量。

注意事项：

1、本试剂盒适用于抗坏血酸含量大于0.1ug/mL的待检样本的检测，正式测试之前请做预实验；

2、抗坏血酸不稳定，操作过程应注意避光；

3、为了避免使用过程中柱压过大，流速由小到大调节；

4、使用完毕时，用50%的甲醇洗色谱柱30min；

5、标准品的稀释倍数要根据样品中抗坏血酸浓度确定，样品中抗坏血酸的峰面积必须落在不同浓度的抗坏血酸标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种抗坏血酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由偏磷酸溶于蒸馏水后配制而成，置于120mL试剂瓶中；

试剂二，液体×1瓶，4℃保存，由磷酸组成，置于5mL试剂瓶中；

试剂三，维生素C标准品×1支，-20℃保存，由L-抗坏血酸组成，置于1.5mLEP管中。

2.根据权利要求1所述的抗坏血酸含量测定试剂盒，其特征在于：

所述试剂一中，偏磷酸的质量为0.8g，蒸馏水的体积为80mL；

所述试剂二中，磷酸的体积为5mL；

所述试剂三中，L-抗坏血酸的质量为0.5mg。

3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的抗坏血酸含量测定方法，其特征在于，基于高效液相色谱法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、涡旋震荡器、水系针头式过滤器、水系滤膜、有机系滤膜、C18柱、可调式移液器、样品瓶、内衬管、色谱级甲醇和超纯水；

步骤2溶剂的除杂处理；

将500mL超纯水用0.45μm的水系滤膜抽滤，将200mL甲醇用0.45μm的有机系滤膜抽滤，分别除去超纯水和甲醇中的杂质，以防止堵塞色谱柱；

步骤3流动相的配制；

取100mL除杂后的甲醇和400mL除杂后的超纯水混合，并加入0.5mL所述试剂二，混匀，配成流动相；

步骤4溶剂的脱泡；

将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱；

步骤5抗坏血酸的提取；

称取0.1g样本，加入1mL所述试剂一，冰浴匀浆，采用离心率8000g离心10min，取上清液，用所述试剂一定容至1mL，混匀，使用针头式过滤器过滤后待测；

步骤6标准品的配制；

在所述试剂三中加入1mL所述试剂一，配成500μg/mL的母液，将母液用所述试剂一分别稀释成40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的抗坏血酸标准品溶液，分别将四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液采用针头式过滤器过滤后待测；

步骤7抗坏血酸含量测定操作步骤；

1）开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速0.6mL/min，柱温25℃，保留时间10min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组；

2）启动输液泵，使流动相通过色谱柱，待基线稳定后开始加样；

3）分别加入四组不同浓度的抗坏血酸标准品溶液10μL，在10min内可分离抗坏血酸，抗坏血酸的保留时间为5min，计算四组不同浓度的抗坏血酸标准品的峰面积；

4）加入样品10μL，在相应保留时间处检测抗坏血酸的峰面积；

步骤8抗坏血酸含量的计算；

以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标计算抗坏血酸标准曲线，将样品峰面积代入标准曲线，计算出样品抗坏血酸的含量。