CN103575677B - 一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是：取0.5～3.5mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为65%～68%的浓硝酸，振荡混匀；所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；将混合液加热至沸腾，振荡驱酸，蒸发至近干，再加入纯水溶解，无损失的转移到10mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；采用分光光度法或/和原子吸收光谱法测定容量瓶中水溶液中的钴含量。本发明通过对待测样品酸化处理，避免了微生物培养基成分对钴测定干扰大的缺点，同时还不会引入其他杂质，具有操作简便、快速、准确及灵敏等优点，能成功应用于微生物培养体系中钴含量的测定。

Description

一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法

技术领域

本发明属于测定钴含量的方法，涉及一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法。特别适用于浓硝酸硝化法测定LB(即Luria-Bertani)或NA(即NutrientAgar)培养基中钴离子含量的方法。

背景技术

钴在土壤、水、空气及动植物等环境中广泛存在。钴是人体和植物所必须的微量元素之一。在人体内钴主要通过形成维生素B₁₂发挥生物学作用及生理功能，此外钴对铁的代谢、血红蛋白合成和细胞发育等均有重要生理功能。

天然水中钴含量很低，浓度多数为0.01～1.00mg/L，这样的浓度对人动植物不会产生毒害作用。有色金属冶炼厂和加工厂等企业的废水中常含高浓度的钴，例如：铅锌加工厂废水钴的浓度可达0.5～1.0mg/L，制备次氯酸盐的工厂废水钴浓度可达1.3mg/L。水中钴的浓度为0.1～0.27mg/L时，对西红柿等植物产生毒害作用，硫酸钴浓度为2.0mg/L可使农作物生长减缓，甚至枯萎。研究钴污染环境的修复技术一直未间断过，而微生物活体修复技术以其投资小、运行费用低、无二次污染等优点引起了广泛关注。因此，找到一种简便又快捷的测定微生物培养体系中钴离子含量的方法,具有重要意义。

现有技术中，检测钴的方法主要有分光光度法、原子吸收光谱法、极谱法、高效液相色谱法、化学发光法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，其中分光光度法具有设备简单、操作方便、价格低廉且准确度和精密度都较高等优点，被广泛使用。

现有技术中，微生物有4种常用培养体系：LB(即Luria-Bertani)培养基、NA(即NutrientAgar)培养基、淀粉酪素培养基和查氏培养基。研究发现：LB培养基和NA培养基会显著干扰钴离子的测定，影响率分别达24.20％和8.47％。采用现有技术方式难以实现微生物培养基中钴含量的准确测定。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术中的不足，提供一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法。本发明通过浓硝酸酸化样品以消除微生物常用培养基对钴测定的显著影响，实现微生物培养体系中钴的准确测定。

本发明的内容是：一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是包括下列步骤：

a、浓硝酸酸化处理待测样品：取0.5～3.5mL的待测样品置于开口容器(例如：小烧杯)中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为65％～68％的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；

所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；

b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近干(混合液中的水蒸发99％以上)，再加入1.0～5.0mL纯水溶解，得水溶液；

c、将水溶液无损失的转移到10mL容量瓶中，最后用纯水定容至刻度线；

d、采用分光光度法或/和原子吸收光谱法测定容量瓶中水溶液中的钴含量：

(1)采用分光光度法的测定方法是：取1.0mL容量瓶中水溶液于25mL比色管中，然后分别加入8.0mL柠檬酸铵-氨水缓冲液和3.0mL苦氨酸偶氮变色酸，用纯水定容至刻度线；摇匀静置15min，于464nm测定吸光度，根据标准曲线即可求得相应浓度；

步骤a中所述待测溶液(pH约为7)经预处理(即上述步骤a、b和c)后，其pH降低至2左右，而钴离子的络合显色是在一定的缓冲液中(pH＝10.2)进行的，这必然会影响测定；研究发现通过调节预处理后溶液的pH并不能消除这种影响，而控制缓冲液的用量则可解决；因此曾选用了5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL、11.0mL、12.0mL、13.0mL、14.0mL和15.0mL的缓冲液对预处理后的待测液进行测定，以缓冲液体积(mL)为横坐标，钴离子吸光度A为纵坐标，结果如附图1；从图1中可知，缓冲液用量在8.0～10.0mL范围内，钴离子的吸光度基本保持稳定；因此本方法选用8.0mL缓冲液。

(2)原子吸收光谱法：可采用AA700型原子吸收光谱仪测定。

本发明的内容中：步骤a中所述微生物培养体系是LB(即Luria-Bertani)或NA(即NutrientAgar)培养基；

微生物培养基中含有大量的多肽和氮基酸类物质。氨基酸的R基含有苯环共轭双键系统，与钴发生了某种螯合反应影响了钴的测定。本发明方法中选用浓硝酸酸化样品，其作用是将待测液中被培养基所螯合的钴再次释放为游离的钴离子，从而利于钴离子的测定。因此浓硝酸的用量会直接影响钴的回收率。为此曾采用待测溶液与浓硝酸(质量百分比浓度为65％～68％)的体积比为4:1、2:1、1:1、1:2和1:3进行比较试验，结果表明4:1和2:1的体积比使钴的回收率分别达到88.17％和89.27％，而体积比大于1:1时回收率皆可超过95％，满足了要求，因此本方法采用了1:1的比例。

本发明的内容中：步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100.00mg/L。

本发明的内容中：

1、所用的试剂及配置：

(1)浓硝酸(质量百分比浓度为65％～68％)；

(2)柠檬酸铵-氨水缓冲液：

每100mL溶液中含30mL质量百分比浓度为50％的柠檬酸铵水溶液和20mL浓氨水(质量百分比浓度为25％～28％)，纯水定容。

(3)0.2g/L苦氨酸偶氮变色酸：

上海长科试剂研究所金圣化工有限公司生产；准确称取0.050g苦氨酸偶氮变色酸于小烧杯中，用少量纯水溶解，无损失的转移至250mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，配制好后可以放置半个月。

(4)钴储备液：5.00g/L(以钴含量计)

将六水合氯化钴(分析纯)在220℃下干燥24h得到无水氯化钴，冷却至室温。将精确称取的5.5080g无水氯化钴溶于少量纯水中，无损失的转移至500mL容量瓶中。

(5)50.00mg/L钴标准溶液：

由5.00g/L钴储备液稀释得到。

(6)LB液体培养基和NA液体培养基(临时配制并灭菌)：

LB培养基(/L)：由酵母粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，加纯水定容至1000mL组成，调节pH＝7.2～7.4；

NA培养基(/L)：由牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，加纯水定容至1000mL组成，调节pH＝7.0。

2、所用的装置：

(1)7200型可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；

(2)电子万用炉(北京市永光明医疗仪器厂)；

(3)AA700型原子吸收光谱仪(美国PE公司PerkinElmerInstrumentCo.U.S.A.)。

3、钴标准曲线的绘制：

按表1所示，吸取50.00mg/L钴标准溶液(水溶液)分别置于15个25mL比色管中，然后分别加入8.0mL柠檬酸铵-氨水缓冲液和3.0mL苦氨酸偶氮变色酸，用纯水定容至刻度线，摇匀放置15min。在波长464nm处用1cm比色皿以试剂空白为参比测吸光度。

表1:钴标准曲线数据表：

编号

钴标准溶液体积

钴标准溶液的浓度

吸光度

	(μL)	(mg/L)
				1	0	0	0
2	5	0.01	0.006
				3	10	0.02	0.012
4	20	0.04	0.022
				5	40	0.08	0.041
6	80	0.16	0.081
				7	100	0.20	0.092
8	200	0.40	0.188
				9	300	0.60	0.276
10	400	0.80	0.373
				11	500	1.00	0.472
12	600	1.20	0.567
				13	650	1.30	0.619
14	700	1.40	0.641
				15	750	1.50	0.676

以钴标准溶液的浓度(mg/L)为横坐标x，相应的吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，见附图1，钴的含量在0～1.5mg/L范围内符合比尔定律。由附图可知，标准曲线方程为y＝0.4611x+0.0033，线性相关系数r²＝0.9991.通过检验相关系数的临界表可知，当f＝n-2＝15-2＝13时，置信度为99.9％的相关系数为0.7600。本发明所得线性相关系数为0.9991＞0.7600，认为该标准曲线具有很好的线性关系。另外，由所述的标准曲线求得ε值：

$\mathrm{\ϵ}=\frac{0.4611L/mg\×58.332g/mol}{1cm}=2.69\×{10}^{4}L\·{\mathrm{mol}}^{-1}\·{\mathrm{cm}}^{-1}$

与现有技术相比，本发明具有下列特点和有益效果：

(1)采用本发明，通过对待测样品用浓硝酸酸化、赶酸并控制缓冲液用量的步骤，避免了微生物培养基成分对钴测定的干扰大的缺点，同时还不会引入其他杂质，具有操作简便、快速、准确及灵敏等优点，能成功应用于微生物培养体系中钴的测定；

(2)采用本发明，通过浓硝酸酸化待测样品消除培养基的干扰，选用分光光度法辅以原子吸收光谱法对酸化后的样品进行测定，相对误差最大仅为1.10％；操作简单，价格便宜，能直接应用于微生物培养基中钴的测定，具有无毒、无害、精密度高、重复性好等优点；，实用性强。

附图说明

图1是预处理后的待测液中钴离子吸光度在不同缓冲液体积下的变化曲线图；其中以缓冲液体积(mL)为横坐标，以钴离子吸光度为纵坐标；

图2是以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法的钴标准曲线图；

其中，R²＝0.9991为线性相关系数的平方，以吸光度为纵坐标，以二价钴离子浓度(mg/L)为横坐标。

具体实施方式

现结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步描述；下面给出的实施例拟以对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：

LB培养基中钴(100.00mg/L)的分光光度法测定，步骤如下：

1.酸化：

将0.5～3.5mL的试样放入50mL小烧杯中，按1:1的体积小心的加入浓硝酸，每次加入后混匀；接着置于备有石棉网的电炉上至沸腾，一边振荡一边赶酸至近干，并加入少量纯水溶解，待冷却至室温，无损失的转移至10mL容量瓶中，纯水定容，混匀。

2.样品测试：

2.1分光光度法测定：吸取1.0mL上述溶液于25mL比色管中，分别加入8.0mL柠檬酸铵-氨水缓冲液和3.0mL苦氨酸偶氮变色酸，用纯水定容至刻度线，摇匀放置15min。在波长464nm处用1cm比色皿以试剂空白为参比测吸光度。根据标准曲线即可计算出LB培养基中钴的含量。

(1)分光光度法的精密度实验及结果：

所述的精密度以相对标准偏差表示。

准备1个100mL容量瓶，加入2.0mL5.00g/L钴储备液，用新鲜配制且高温灭菌的LB液体培养基定容至刻度线，摇匀得到100.00mg/L钴液；分别加入1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL和3.0mL于5个小烧杯中，按上述步骤测定吸光度；重复以上操作7次，结果见表2。

表2：精密度试验数据表：

由此可见，本发明测定微生物培养体系(LB)中钴的含量时，相对标准偏差最大为1.70％，精密度良好。

(2)分光光度法的准确度试验及结果：

准确度以相对误差表示。

准备1个100mL容量瓶，加入2.0mL5.0g/L钴储备液，用新鲜配制且高温灭菌的LB液体培养基定容至刻度线，摇匀得到100.00mg/L钴标液。分别加入0.5mL、1.5mL、2.5mL和3.5mL于4个小烧杯中，按上述步骤测定吸光度；重复以上操作3次，结果见表3。

表3：准确度实验数据表：

由此可见，酸化前测定细菌培养体系(LB)中钴的含量时，相对误差最小为-8.96％，而按照本发明酸化后，相对误差最大仅为1.10％。

(3)分光光度法的的回收率实验及结果

用LB培养基配置100.00mg/L钴液，分别加入0.5、1.0、2.0、2.5mL于小烧杯中，按上述步骤进行测定。由于蒸发至近干后又定容到了10mL，因此定容后的实际浓度分别是5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、25.00mg/L；重复以上操作3次，结果如表4。

表4:LB培养基中钴离子的回收率：

从表中可以看出，酸化前LB培养基中钴离子的回收率都小于91％，而按本发明酸化后，钴离子的回收率维持在96％～104％。

2.2原子吸收光谱法测定：

采用AA700型原子吸收光谱仪进行测定，结果如表5：

表5:LB培养基中钴离子(100.00mg/L)测定结果表：

按照本发明酸化被测样品后，同时采用分光光度法与原子吸收光谱测定钴离子浓度，由上表可知，酸化后回收率各提升了29.60％和24.5％，分别达到96.90％和97.10％。

实施例2：

LB培养基中钴(50.00mg/L)的测定，步骤如下：

用LB培养基配置50.00mg/L的钴标液，按实施例1中的步骤进行测定，结果如表6：

表6：LB培养基中钴离子(50.00mg/L)测定结果：

由上表6可知，分光光度法与原子吸收光谱测定LB培养基酸化后钴离子浓度，回收率分别从80.10％和75.20％上升到96.00％和98.56％。

实施例3：

NA培养基中钴的(100.00mg/L)测定

用NA培养基配置100.00mg/L的钴标液，按实施例1中的步骤进行测定，结果如表7：

表7：NA培养基中钴(100.00mg/L)的测定结果：

由表7可知，按照本发明对LB培养基酸化后，同时采用分光光度法与原子吸收光谱测定钴离子浓度，回收率分别从83.77％和88.17％提升至98.01％和98.17％。

实施例4：

一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，包括下列步骤：

a、浓硝酸酸化处理待测样品：取0.5mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为65％％的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；

b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近干，再加入1.0～5.0mL纯水溶解，得水溶液；

c、将水溶液无损失的转移到10mL容量瓶中，最后加入纯水定容至刻度线；

d、采用分光光度法测定容量瓶中水溶液中的钴含量；

其它同上述实施例，省略。

实施例5：

一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，包括下列步骤：

a、浓硝酸酸化处理待测样品：取3.5mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为67％的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；

所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；

b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近干，再加入1.0～5.0mL水溶解，得水溶液；

c、将水溶液无损失的转移到10mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；

d、采用分光光度法测定容量瓶中水溶液中的钴含量；

其它同上述实施例，省略。

实施例6：

一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，包括下列步骤：

a、浓硝酸酸化处理待测样品：取2.0mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为68％的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；

所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；

b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近干，再加入1.0～5.0mL水溶解，得水溶液；

c、将水溶液无损失的转移到10mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；

d、采用分光光度法测定容量瓶中水溶液中的钴含量；

其它同上述实施例，省略。

上述实施例4-6中：步骤a中所述微生物培养体系是LB或NA培养基。

上述实施例4-6中：步骤b和c中所述加入的水是纯水。

上述实施例4-6中：步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100.00mg/L。

本发明不限于上述实施例，本发明内容所述均可实施并具有所述良好效果。

Claims (3)

1.一种以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是包括下列步骤：

a、浓硝酸酸化处理待测样品：取0.5～3.5mL的待测样品置于开口容器中，按1：1的体积比加入质量百分比浓度为65%～68%的浓硝酸，振荡混匀，得混合液；

所述待测样品是微生物培养体系中含有钴离子的待测溶液；

所述微生物培养体系是LB或NA培养基；

b、将混合液置于备有石棉网的电炉上加热至沸腾，一边振荡一边驱酸，直到蒸发至近干，再加入1.0～5.0mL水溶解，得水溶液；

c、将水溶液无损失的转移到10.0mL容量瓶中，最后加入水定容至刻度线；

d、采用分光光度法测定容量瓶中水溶液中的钴含量。

2.按权利要求1所述以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是：步骤b和c中所述加入的水是纯水。

3.按权利要求1所述以分光光度法测定微生物培养体系中钴含量的方法，其特征是：步骤a中所述微生物培养体系中钴含量低于100mg/L。