CN111269957A - 一种基于比色法检测生物样品中nad+含量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于检测生物样品中NAD+含量的反应液，所述反应液包含反应液包含双苷肽，八肽胆囊收缩素(CCK‑8)，乙醇脱氢酶，烟酰胺和无水乙醇。本发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。本发明提供的反应液和检测方法可以检测低至0.1μmol/L的NAD+，在0～1000nmol/L之间呈良好的线性关系，灵敏度更高，线性范围更宽。对于科学研究和临床评价都有着重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种基于比色法检测细胞及组织内NAD+含量的方法及其应用。
背景技术
NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，广泛存在于生命体内。NAD有两种存在形式，一种是氧化形式NAD+，另一种是还原形式NADH。在细胞内大部分氧化还原反应中起传递电子的作用。因此，维持适量水平的NAD对于机体的细胞呼吸功能非常重要。NAD有三种重要的合成途径：①是从头合成途径，通过限速酶NAMPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase)烟酰胺磷酸核糖转移酶来维持；②Preis-Handler passway，合成原料为食物中方摄取的烟酸(nicotinic acid)；③挽救途径，通过循环使用降解的NAD产物，比如烟酰胺。随着年龄的增长，NAD+和NAMPT 在多个组织器官中的水平都明显下降。NAD+的消失是细胞死亡的主要原因。 NAD在调节细胞氧化还原状态以及调控细胞信号转中都发挥重要的作用。
但目前的NAD检测方法对样品要求较高，需要在较短的时间内完成所有检测操作；显色的稳定性、灵敏度有待提高，当前的科学研究和临床评价亟需更好的NAD+含量的检测方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种显色稳定、灵敏度高的检测NAD+含量的反应液，同时提供一种更稳定、更灵敏的基于比色法检测NAD+含量的方法。
本发明公开了，一种用于检测生物样品中NAD+含量的反应液，所述反应液包含反应液包含双苷肽，八肽胆囊收缩素，其中各组分的浓度为：
双苷肽50mmol/L～100mmol/L；
CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；
乙醇脱氢酶10单位/L～15单位/L；
烟酰胺100mmol/L～150mmol/L；
无水乙醇5％～10％。
根据本发明提供的反应液通过用CCK-8显色产生的甲瓒更加稳定且更易溶解于水，反应产物更加稳定，灵敏度更高。同时，本发明在显色方面相比 MTT法更为稳定，本发明的CCK-8法显色在显色后1小时内读数都可以得到很好的标准曲线图；同时，结合本发明在研究过程中检测人外周血实验结果来看，当血液样品加入0.5mol/L高氯酸后放入-80℃保存，在2个月内检测依旧稳定、灵敏、准确。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的反应液为每毫升包含820μL 的61mmol/LpH7.4的双苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千单位/mL乙醇脱氢酶，28.5μL的3.5mol/L烟酰胺，57μL无水乙醇。
本发明还提供了一种用于检测NAD+含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述的反应液、样品裂解剂和pH中和剂。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中的样品裂解剂为高氯酸，所述pH剂中和剂为碱性试剂，优选地，所述pH中和剂为KOH水溶液或NaOH 水溶液。
本发明进一步提供了一种基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，包括以下步骤：
将待测生物样品与上述的反应液进行显色反应，显色稳定后在波长450 nm处测定吸光值；
根据由若干个浓度梯度的NAD+标准品溶液建立的NAD+浓度与吸光值的标准曲线，计算得到待测生物样品中的NAD+含量。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的待测生物样品在与反应液反应前先在裂解液中进行裂解处理，在裂解处理后将pH调节到中性，然后将中性混合液离心得到的上清液，再将所述上清液与反应液进行显色反应；优选地，所述的裂解液为高氯酸；更优选地，所述裂解液为浓度0.5mol/L高氯酸水溶液。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的待测生物样品选自细胞样品、血液样品或组织样品；
优选地，所述的血液包括外周血；
优选地，所述的组织样品选自脑、心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、骨髓、胸腺、肺中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中，当所述的样品为细胞时，去除培养基后，加入高氯酸进行裂解；
当所述的样品为血液样品时，进行抗凝处理后，加入到高氯酸中裂解，至血液呈暗红棕色；
当所述的样品为组织样品时，将组织样品与高氯酸混合，进行低温研磨。
在根据本发明的一个实施方案中，当所述的样品为细胞时，按每2×106细胞配比480μL高氯酸进行裂解；
当所述的样品为血液样品时，按每100μL以内的血液样品配比480μL 高氯酸进行裂解；
当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸的用量为使组织样品被高氯酸完全浸没。
在根据本发明的一个实施方案中，当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸按480μL高氯酸配比如下质量范围的组织样品进行裂解：
| 组织 | 取样质量范围 |
| 肝脏 | 7.5mg～8.5mg， |
| 肌肉 | 9.5mg～10.5mg， |
| 脂肪 | 30mg～35mg， |
| 脑 | 9.5mg～10.5mg， |
| 心脏 | 7.5mg～8.5mg， |
| 脾脏 | 9.5mg～10.5mg， |
| 肺 | 7.5mg～8.5mg， |
| 肾脏 | 7.5mg～8.5mg， |
| 胸腺 | 9.5mg～10.5mg |
当所述的样品为血液样品时，按每40μL血液样品配比480μL高氯酸进行裂解。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用高氯酸裂解液提取组织及细胞样本，裂解更加充分，可将组织中的NADH全部降解，使得检测NAD+含量更加准确，且不影响NAD+的稳定性。
(2)烟酰胺在本发明中可更有效地抑制酶的过度反应，使酶促反应终止。
(3)用CCK-8显色产生的甲瓒更加稳定且更易溶解于水，反应产物更加稳定，灵敏度更高。同时，本发明在显色方面相比MTT法更为稳定，本发明的CCK-8法显色在显色后1小时内读数都可以得到很好的标准曲线图；同时，结合本发明在研究过程中检测人外周血实验结果来看，当血液样品加入0.5 mol/L高氯酸后放入-80℃保存，在2个月内检测依旧稳定、灵敏、准确。
(4)本发明的方法操作简便，具有高效、灵敏、快速、稳定之特点，从开始显色到读数1小时内便可完成。本方法可以检测低至0.1μmol/L的 NAD+，在0～1000nmol/L之间呈良好的线性关系，灵敏度更高，线性范围更宽。对于科学研究和临床评价都有着重要作用。
(5)本发明具有普遍适用性，可适用于培养细胞、动物血液及组织、人血液、骨髓及各种组织样本的NAD+含量测定。同时，所需样品用量少，例如测定组织样品时，样品量仅需8～35mg；血液样品仅需40μL(人和小鼠均可)，骨髓样品仅为2×106的细胞，显著优于目前市售试剂盒。
附图说明
图1是本发明的检测原理示意图。
图2是本发明的标准曲线的制备流程图。
图3是实施例1绘制得到的NAD+浓度标准曲线图。
图4是实施例4检测肝脏中的NAD+含量的结果分析图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但并非用于限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如无特殊说明以下实施例中的NAD+标准品浓度为100μmol/L，乙醇脱氢酶在-80℃下保存；高氯酸裂解液、KOH中和液在室温保存；双苷肽(pH7.4) 在4℃下保存；CCK-8、烟酰胺均在-20℃下保存。
双甘肽、烟酰胺用水配制成所需浓度的溶液。
实施例1方法的建立及NAD+标准曲线的绘制
1.准备8个干净的管子并标记A-H，并且在A管内加990μL 61mmol/L 双苷肽溶液，B-H管内分别加500μL 61mmol/L双苷肽溶液。取10μL浓度为100μmol/L的NAD+标准品储液加入A管，充分混匀后为标准曲线的第一个浓度点1000nmol/L。接下来倍比稀释，如图2所示，从A管取500μL加入B管，充分混匀。再从B管取500μL加入C管，充分混匀，以此类推加至G管，G管的终体积为1000μL。不要在H管加标准品，此管为空白对照管，即标准曲线的本底值，以期排除几种试剂发生的自身非特异性的显色反应。
亦可根据实际使用标准品的体积成倍数调整(如增加)双苷肽肽以及100 μmol/LNAD+标准品的使用量。
2.将步骤1制备好的不同浓度的标准品溶液按照每孔100μL加到96孔板内，每个浓度的标准品建议加两个孔，最后读数取两个孔的平均值，以确保实验的准确性。
3.配制反应液
以10个反应的反应液为例，反应液的配方包含61mmol/L双苷肽(pH7.4) 820μL，CCK-8 100μL，2.6千单位/mL乙醇脱氢酶5μL，3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数调整(如增加)。
4.显色反应
在步骤2中已加入标准品溶液的96孔板中，每孔加入100μL反应液， 37℃孵育30-40分钟后放入酶标仪在450nm波长进行测定并读数。
5.获得标准曲线方程
先分别计算A-H每管标准液的吸光值读数的平均值，然后分别用A-G管吸光值的平均值减去H管吸光值的平均值，即得到不同浓度的NAD+标准品溶液实际的吸光值读数。用浓度1000nmol/L、500nmol/L、250nmol/L、125 nmol/L、62.5nmol/L、31.3nmol/L、15.6nmol/L和0nmol/L作为x轴，用计算好的实际NAD+的吸光值作为y轴，趋势线选项选择线性、设置截距为零绘制标准曲线并获得标准曲线方程。标准曲线如图3所示。
反应时间应控制在1小时内，过长会影响结果的可靠性。
实施例2细胞样本中NAD+含量的检测
1.待测细胞：小鼠骨髓细胞，HEK细胞。
2.去除培养基：加PBS洗两遍，洗去残留培养基。分别在2×106小鼠骨髓细胞或HEK细胞中加入480μL高氯酸裂解液，用涡旋振荡器振荡，使细胞充分裂解，冰上静置5分钟。
所述的细胞数量的选择可根据具体实验细胞而定，由于细胞种类和实验目的不一样，细胞的NAD+含量也不尽相同，建议先用不同数量或者处理方式的细胞做一次预实验，确定细胞使用数量。
3.加入80μL 3mol/L KOH，涡旋震荡，再加入560μL 125mmol/L双苷肽pH7.4，振荡器混匀，得到待测样品。
同时设置空白对照：不加细胞样品，只加480μL 0.5mol/L高氯酸，80μL 3mol/LKOH，560μL 125mmol/L双苷肽pH7.4。
4.将待测样品(步骤2裂解好的细胞)和空白对照组在12000g 4℃下低温离心10min。也可以在室温下离心，低温离心可进一步保证NAD+不被降解。
5.将上清转移至一个新的离心管内，注意不要将沉淀吸出。如果不及时检测需要将样品插在冰上或者置于4℃冰箱内。
6.配制反应液和对照反应液：
以十个反应所需的反应液使用量为例，所述的反应液包含的61mmol/L 双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，2.6千单位/mL乙醇脱氢酶5μL， 3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
以十个反应所需的对照反应液使用量为例，所述的对照反应液包含的61 mmol/L双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
7.将步骤5得到的上清样品和空白对照按照每孔100μL加到96孔板内，每个样品和空白对照需要加4个孔，其中2个孔在显色的时候加入反应液，另2个孔在显色的时候加入对照反应液。
加入对照反应液的目的是检测样品中NAD+与其他酶是否发生酶循环反应，即作为阴性对照，在最后计算的时候，加反应液得到的数值减去对照反应液的数值。除了对照反应液中没有乙醇脱氢酶外，其他配方同反应液。
8.显色反应
按照实施例1的方法配制不同浓度的标准品(1000nM、500nM、250nM、 125nM、62.5nM、31.3nM、15.6nM和0nM)，加入标准品的所有孔和样品、空白对照其中的2个孔每孔加入100μL反应液，样品另外的2个孔每孔加入100μL对照反应液进行反应。37℃孵育30-40分钟后放入酶标仪中进行读数，吸收光为450nm。(注：由于标准品中只有NAD+不存在其他物质故不用加对照反应液)
9.计算样品NAD+浓度
首先，根据标准品读数获得标准曲线。先分别计算A-H每个点的读数的平均值，然后分别用A-G的平均值减去H空白的平均值，即得到实际NAD+的读数。用浓度作为x轴，用计算好的实际NAD+的读数作为y轴，趋势线选项选择线性、设置截距为零绘制NAD+浓度与酶标仪读数相对应的标准曲线并获得标准曲线方程。标准曲线如图3所示。
其次，计算样品浓度。先分别计算加反应液的样品和空白对照的吸光值平均数以及加对照反应液的样品和空白的吸光值平均数。反应液和对照反应液的样品吸光值平均值分别减去各自的空白对照的吸光值平均值，得到反应液和对照反应液扣除本底的数值，再用扣除本底后的反应液数值减去扣除本底后的对照反应液的数值，即实际NAD+读数。将得到的实际NAD+读数带入到标准曲线方程求出对应的NAD+浓度。反应时间应控制在1小时内，过长会影响结果的可靠性。
实施例3血液样本中的NAD+含量的检测
1.血样采集
(1)人外周血：医院EDTA采血管采集，浓度为15g/L，得到人外周血样品。
(2)小鼠外周血：收集小鼠外周血后使用10μL 0.1mol/L EDTA抗凝，得到小鼠外周血样品。
分别用所述的血样进行后续步骤的实验研究。
2.取40μL外周血样品加入到480μL 0.5mol/L高氯酸中，震荡至少5 秒直至血液由鲜红色变为暗红棕色。
3.加入80μL 3mol/L KOH，涡旋振荡，再加入560μL 125mmol/L双苷肽pH7.4，振荡器混匀。
4.将步骤3裂解好的血细胞在12000g 4℃低温离心10min。也可以在室温下离心，低温离心可进一步保证NAD+不被降解。
5.将上清转移至一个新的离心管内，注意不要将沉淀吸出。如果不及时检测需要将样品插在冰上或者置于4℃冰箱内。
6.配制反应液和对照反应液
以十个反应所需的反应液使用量为例，所述的反应液包含的61mmol/L 双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，2.6千单位/mL乙醇脱氢酶5μL， 3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
以十个反应所需的对照反应液使用量为例，所述的对照反应液包含的61 mmol/L双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
7.将步骤5得到的上清样品和空白对照按照每孔100μL加到96孔板内，每个样品和空白对照需要加4个孔，其中2个孔在显色的时候加入反应液，另2个孔在显色的时候加入对照反应液。
加入对照反应液的目的是检测样品中NAD+与其他酶是否发生酶循环反应，即作为阴性对照，在最后计算的时候，加反应液得到的数值减去对照反应液的数值。相比反应液，对照反应液中没有乙醇脱氢酶。
8.显色反应
待测样品、空白对照其中的2个孔每孔加入100μL反应液，样品另外的 2个孔每孔加入100μL对照反应液进行反应。37℃孵育30-40分钟后放入酶标仪中进行读数，吸收光为450nm。(注：由于标准品中只有NAD+不存在其他物质故不用加对照反应液)
9.计算样品NAD+浓度
通过实施例1获得标准曲线方程计算样品浓度，标准曲线如图3所示。
先分别计算加反应液的样品和空白的平均数以及加对照反应液的样品和空白的平均数。反应液和对照反应液的样品平均值分别减去各自的空白平均值，得到反应液和对照反应液扣除本底的数值，再用扣除本底后的反应液数值减去扣除本底后的对照反应液的数值，即实际NAD+读数。将得到的实际 NAD+读数带入到标准曲线方程求出对应的NAD+浓度。反应时间应控制在1 小时内，过长会影响结果的可靠性。
实施例4组织样本中的NAD+含量的检测
1.取相应的组织(如小鼠脑、心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺，肺)至1.5mlEP管中，加入480μL 0.5mol/L高氯酸(置于冰上)，震荡混匀至少5秒，使组织被高氯酸浸泡，置于冰上。低温研磨，频率70Hz，研磨10秒，中断15秒，总时间1分15秒研磨组织，若还有明显组织存在建议加长研磨时间但是需要保持低温。
2.加入80μL 3mol/L KOH，再加入560μL 125mmol/L双苷肽pH7.4，振荡器混匀。
3.将裂解好的组织在12000g 4℃低温离心10min。也可以在室温下离心，低温离心可进一步保证NAD+不被降解。
4.将上清转移至一个新的离心管内，注意不要将沉淀吸出。如果不及时检测需要将样品插在冰上或者置于4℃冰箱内。
5.配制反应液和对照反应液
以十个反应所需的反应液使用量为例，所述的反应液包含的61mmol/L 双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，2.6千单位/mL乙醇脱氢酶5μL， 3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
以十个反应所需的对照反应液使用量为例，所述的对照反应液包含的61 mmol/L双苷肽(pH7.4)820μL，CCK-8 100μL，3.5mol/L烟酰胺28.5μL，无水乙醇57μL。每个试剂的使用量可根据实际使用量成倍数增加。
6.将步骤4得到的上清样品和空白对照按照每孔100μL加到96孔板内，每个样品和空白对照需要加4个孔，其中2个孔在显色的时候加入反应液，另2个孔在显色的时候加入对照反应液。
加入对照反应液的目的是检测样品中NAD+与其他酶是否发生酶循环反应，即作为阴性对照，在最后计算的时候，加反应液得到的数值减去对照反应液的数值。相比反应液，对照反应液中没有乙醇脱氢酶。
7.显色反应
待测样品、空白对照其中的2个孔每孔加入100μL反应液，样品另外的 2个孔每孔加入100μL对照反应液进行反应。37℃孵育30-40分钟后放入酶标仪中进行读数，吸收光为450nm。(注：由于标准品中只有NAD+不存在其他物质故不用加对照反应液)
8.计算样品NAD+浓度
通过实施例1获得标准曲线方程计算样品浓度，标准曲线如图3所示。
先分别计算加反应液的样品和空白的平均数以及加对照反应液的样品和空白的平均数。反应液和对照反应液的样品平均值分别减去各自的空白平均值，得到反应液和对照反应液扣除本底的数值，再用扣除本底后的反应液数值减去扣除本底后的对照反应液的数值，即实际NAD+读数。将得到的实际 NAD+读数带入到标准曲线方程求出对应的NAD+浓度。由于取材量不一样，最后用浓度除以组织重量，即得到每毫克组织NAD+浓度。
反应时间应控制在1小时内，反应时间过长会影响结果的可靠性。
图4展示了分别取2mg、5mg和10mg小鼠肝脏组织通过本实施例的检测方法测得的每毫克组织NAD+浓度结果。检测不同重量肝脏组织中NAD+ 的量，组织量与NAD+量呈现明显的关联。
优选的，经过发明人大量的研究与实践，对于不同组织的取样量建议如下：肝脏取7.5mg-8.5mg；肌肉取9.5mg-10.5mg；脂肪取30mg-35mg；脑取9.5mg-10.5mg；心脏取7.5mg-8.5mg；脾脏取9.5mg-10.5mg；肺取7.5 mg-8.5mg；肾脏取7.5mg-8.5mg；胸腺取9.5mg-10.5mg
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测生物样品中NAD+含量的反应液，其特征在于，所述反应液包含双苷肽、八肽胆囊收缩素、乙醇脱氢酶、烟酰胺和无水乙醇，其中各组分的浓度为：
双苷肽 50mmol/L～100mmol/L；
CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；
乙醇脱氢酶 10单位/L～15单位/L；
烟酰胺 100mmol/L～150mmol/L；
无水乙醇 5％～10％。
2.如权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述的反应液为每毫升包含820μL的61mmol/L pH7.4的双苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千单位/mL乙醇脱氢酶，28.5μL的3.5mol/L烟酰胺，57μL无水乙醇。
3.一种用于检测NAD+含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的反应液、样品裂解剂和pH中和剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述样品裂解剂为高氯酸，所述pH剂中和剂为碱性试剂，优选地，所述pH中和剂为KOH水溶液或NaOH水溶液。
5.一种基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测生物样品与权利要求1或2所述的反应液进行显色反应，显色稳定后在波长450nm处测定吸光值；
根据由若干个浓度梯度的NAD+标准品溶液建立的NAD+浓度与吸光值的标准曲线，计算得到待测生物样品中的NAD+含量。
6.如权利要求5所述的基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于，所述的待测生物样品在与反应液反应前先在裂解液中进行裂解处理，在裂解处理后将pH调节到中性，然后将中性混合液离心得到的上清液，再将所述上清液与反应液进行显色反应；优选地，所述的裂解液为高氯酸；更优选地，所述裂解液为浓度0.5mol/L高氯酸水溶液。
7.如权利要求5或6所述的基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于：
所述的待测生物样品选自细胞样品、血液样品或组织样品；
优选地，所述的血液包括外周血；
优选地，所述的组织样品选自脑、心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、骨髓、胸腺、肺中的一种。
8.根据权利要求7所述的基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于，
当所述的样品为细胞时，去除培养基后，加入高氯酸进行裂解；
当所述的样品为血液样品时，进行抗凝处理后，加入到高氯酸中裂解，至血液呈暗红棕色；
当所述的样品为组织样品时，将组织样品与高氯酸混合，进行低温研磨。
9.根据权利要求7所述的基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于：
当所述的样品为细胞时，按每2×106细胞配比480μL高氯酸进行裂解；
当所述的样品为血液样品时，按每100μL以内的血液样品配比480μL高氯酸进行裂解；
当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸的用量为使组织样品被高氯酸完全浸没。
10.根据权利要求5所述的基于比色法检测生物样品中NAD+含量的方法，其特征在于，当所述的样品为组织样品时，所述的高氯酸按480μL高氯酸配比如下质量范围的组织样品进行裂解：
当所述的样品为血液样品时，按每40μL血液样品配比480μL高氯酸进行裂解。
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