WO2022236861A1 - 检测生理活性物质的方法以及检测工具 - Google Patents
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Abstract
一种检测生理活性物质的方法以及一种用于检测生理活性物质的检测工具。检测生理活性物质的方法包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。该检测生理活性物质的方法及其应用，打破一般的检测需要使用医学仪器的限制并且做法便利容易实现。
Description
本发明属于生物科学领域，具体涉及一种通过生物酶催化反应在体外或者离体检测生理活性物质的方法以及相关的检测工具，特别涉及检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用。
生物体内存在各种执行重要生理功能的物质。例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质为生物中最重要的辅酶，存在于所有生物之中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸主要为人体内各细胞的生物反应中传送氢离子；在细胞呼吸反应如糖酵解、糖异生等，以至DNA修复和粒线体的调控也与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸有直接相连的关系。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还参与生物体中的大部分生化反应，并为多种重要基因如SIRTUINS1-7和PARP等的反应底物，启动这些基因的基本功能。
早于一世纪前，科学家已从酿酒过程中发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在，并经过多年的研究深入了解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的结构、形态变化和对生物的作用和重要性。近年研究发现人体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的会随年岁增长和疾病而大幅减少；身体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在下降时可诱发多种与新陈代谢衰退的顽疾如二型糖尿病、与脑退化有关的认知障碍症和因基因收复机制失效而引致的癌症等。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可因年龄差异、身体状况变化、饮食方式、以至日常活动等出现各种变化。
目前显示或检测诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质的方法可以为使用医疗级光谱仪测定的显色法以及利用高效液相色谱和质谱进行的浓度检测。这些方法虽然能有效地准确检测体内的生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，但需要使用价格高昂的仪器和聘用专业人士进行分析，加上检测方法复杂及耗时，不为如血压量 度和血糖检测般便利并且可以由用户在家中每天自我进行。这些原因都有妨碍检测体内的重要生理活性物质的普及化，长远来说大众未能从这些生理活性物质预测身体的病变、生理变化或衰老情况，对公共健康构成障碍。
本领域中需要提出一种体外检测生物体内重要生理活性物质的新方法及其应用，为大众认识和了解生理活性物质在体内的变化、预测健康状况及其重要性提供便利的桥梁。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种通过生物酶催化反应在体外或者离体检测生理活性物质的方法以及相关的检测工具，特别是检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用。本发明所提出的方法是以生物酶催化反应为基础并结合显色法的一套检测生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法，可以使用用户的离体样本(如血清或体液)在家中通过发明中所提出的方法和工具自行进行生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的评估，为生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)检测的做法带来前所未有的便利。
具体而言，本发明提供了：
1.一种检测生理活性物质的方法，包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。
其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和/或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
优选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。
其中所述方法包括在反应试剂的存在下，使用混合生物酶催化生理活性物质产生颜色变化引发物以获得检测结果。
任选地，所述混合生物酶的用量为0.5-10000U,优选为1-200U，更优选为1-50U；其中U为每1mg的生物酶在pH6和摄氏25度的环境下每1min催化生成1nmol产物。
其中所述检测结果基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔浓度总和。
其中所述的显示检测结果包括采用显色物质促使颜色变化引发物发生颜色变化，并且将颜色变化与标准进行对比，
优选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定所述显色剂的惰性物料中的至少一者，以及
任选地，所述对比包括将颜色变化输入电子设备，并且利用计算机程序自动显示检测结果。
其中所述的样本为来自生物体的血液、血清、体液或其组合，优选为血液、尿液、血清和唾液，更优选为血清。
其中所述混合生物酶包含以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类，具体包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)和5’磷酸肌苷脱氢酶(EC 1.1.1.205)中的至少一种，优选包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)或木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)，更优选包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)；
任选地，所述混合生物酶还同时包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC 1.6.3.3)，并且
所述反应试剂包含所述的一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；
任选地，所述反应试剂还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者。
其中所述方法包括在反应试剂的存在下，同时加入甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，以催化生理活性物质生成过氧化氢。
其中所述方法在下列条件下进行：pH 6.0-8.0，优选为pH 6.5-7.8，更优选为pH7.5–7；并且温度为20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。
其中所述方法包括同时进行下列反应：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸； (2)以反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢；(3)期间生成的过氧化氢与显色物质进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，整个酶组合的共同运作组成一个循环链式反应。
其中所述的显色剂为靛酚类配合物；任选地，所述显色剂使用化学和物理方法固定于惰性固体材料、纤维材料或其组合的载体中；任选地，所述载体的形状是颗粒状、块状、柱状、片状或条带状；并且任选地，所述显色包括在液体样本中加入显色剂，从而在液体中进显色反应或者加入检测液体中过氧化氢浓度的显色测试纸。
其中所述的显示检测结果包括通过生物酶催化反应产生颜色变化引发物(优选过氧化氢)并且与显色物质进行不可逆转的化学反应，其中该化学反应因颜色变化引发物的含量所不同而呈现可观察的颜色变化，并且
任选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定有所述显色剂的惰性物料中的至少一者。
其中所述的颜色变化为原始颜色与反应后呈现颜色的对比变化；原始颜色分别优选为无色、黄色和红色，更优选为无色；反应后呈现的颜色分别优选为蓝色、绿色和紫色，更优选为蓝色。
其中所述的颜色变化包括在载体上以线条、充填色的比例、各种图形所显示的数量、对比色的强度或者软件程序上显示的颜色变化来表示样本中的生理活性物质的量。
其中所述的检测结果包括以“高、中、低或检测不到生理活性物质”作为基准，其中高为样本中生理活性物质的浓度在50uM或以上，中为样本中生理活性物质的浓度为21-50uM，并且低或检测不到为样本中生理活性物质的浓度在20uM或以下。
其中所述方法包括：
(i)将包含所述生理活性物质的样本置于容器中；
(ii)加入混合生物酶，以催化生理活性物质进行反应以生成 颜色变化引发物；
(iii)加入反应试剂，以与混合生物酶相互作用生成颜色变化引发物；以及
(iv)用显色物质显示颜色变化引发物的颜色变化，并且与标准颜色进行对比。
任选的，所述方法还包括：在步骤(iv)之前，将加入样本、混合生物酶和反应试剂的容器置于20-40℃的恒温装置中。
2.一种用于检测生理活性物质的检测工具，包含：
(i)用于容纳包含所述生理活性物质的样本的容器；
(ii)用于催化生理活性物质进行反应以生成颜色变化引发物的混合生物酶；
(ii)用于与混合生物酶相互作用以生成颜色变化引发物的反应试剂；以及
(iii)显色物质，用于显示颜色变化引发物的颜色变化。
其中所述检测工具选自检测试剂盒、自动化检测仪器或者手动检测仪器。
其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
任选地，所述混合生物酶包含甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的组合；
任选的，所述反应试剂包含一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选包含甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇中的至少一者，更优选为甲酸或其衍生物；
反应试剂当中还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者；
任选地，所述显色物质选自选自显色剂、显色试纸、显色凝胶显色树脂、显色膜和固定显色剂的惰性物料中的至少一种；并且
任选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。
本发明有以下特点和有益效果：
1.本文提出的检测生理活性物质的方法及其应用，打破一般的检测需要使用医学仪器的限制，用户可以在家中自行操作并得知自身生理活性物质的资讯，做法便利容易，帮助个人健康管理；以及
2.使用酶法反应作为技术核心，做法简便容易而且安全，而且配合本发明中所构想的配套设备和应用程序实现用户可以每天监控身体内的生理活性物质的可能。
附图简要说明
图1示出了与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测结果对应的颜色。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
很多生理活性物质在生物体发挥重要的生理功能，并且可以作为反应身体状况的指标。这些生理活性物质包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，更具体为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
特别是，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD
+)就是其中的一种重要的生理活性物质。NAD
+在体内以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的形式存在并可以在酶的催化下转化成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为生物中传递氢离子的辅酶。NADH在体内的总量可作为身体状况的其中一个新指标。具体来说，可以检测氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度的总和，当其下降时反映身体中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平下降，该状况可以导致身体健康出现负面变化。及早作出应对如服用烟酰胺单核苷酸可有效补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，有效避免烟酰胺腺嘌呤二核苷酸逐步或突然下降时引发的一连串 健康风险。
因此开发可显示并且检测诸如NAD
+和NADH等生理活性物质的方法及其应用，可以实时和持续性检测并且反映自身的生理状况，在这些生理活性物质的浓度发生变化(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸下降时)能及时发现并即时作出适合的应对措施有实际迫切的需要。
本发明人发现在抗衰老研究中，都指示了人体中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸会随年岁的增长而逐渐减少，并且引发与新陈代谢和基因受损所引发的一连串顽疾，因此发明人认识到了解自身的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平是当今防御健康的重要环节，理应在知识上普及并让普罗大众能在任何地方和时间进行自我监测。然而，多年来普罗大众对健康检测的认知薄弱，只维持于单靠量度血压、血糖等单一的守旧方法；近年智能穿带和家用装置的掘起，使更多人利用心跳率、用氧量和体脂评估进一步作为健康指标，足证大众认同防御健康的重要性，然而这些数据相比烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平检测，仍未能反映身体全面状况。
在市面上的健康检测市场中，用户都非常重视检测的便利性并以此项视为首要条件，再而考虑该检测的代表性和经济负担方决定采用。其中，血压计、血糖仪和智能穿戴装置，皆有卓越的便利性，因此广为大众采纳使用。发明人认为诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质的检测也理应朝向相同方向发展。然而，目前检测诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质的方法，只能局限于在实验室中进行并需要使用昂贵仪器，在便利性和价格上不能与前者匹比，显而这是诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质未能普及关注的最大原因。
因此发明人通过提出一种检测生理活性物质的新方法及其应用，打破了传统上的限制，为普罗大众对诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质的关注奠下重要的基石。
在一个方面中，本发明提供了一种检测生理活性物质的方法，该方法包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质转化为颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。检测生理活性物质的方法可以在 体外进行。例如，从个体采集含有待检测的生理活性物质的样本，如血液、唾液、尿液等，然后在体外对样本进行检测。
检测生理活性物质的方法可以用于非诊断或治疗目的，因为检测的生理活性物质虽然可以反映身体的健康状况，但是用于采集样本的个人未必患有疾病，健康的人体内仍然存在生理活性物质的变化。
根据本发明的一个优选实施方案，检测生理活性物质的方法可以包括(i)将包含生理活性物质的样本置于容器中；(ii)加入混合生物酶，以催化生理活性物质进行反应以生成颜色变化引发物；(iii)加入反应试剂，以与混合生物酶相互作用生成颜色变化引发物；以及(iv)用显色物质显示颜色变化引发物的颜色变化，并且与标准颜色进行对比。该方法还可以包括：在步骤(iv)之前，将加入样本、混合生物酶和反应试剂的容器置于20-40℃的恒温装置中。生理活性物质可以选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可以包括氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其组合。
优选地，颜色变化引发物可以选自过氧化氢。
在一个例子中，生物酶催化包括在反应试剂的存在下，采用混合生物酶催化生理活性物质产生颜色变化引发物以获得检测结果。混合生物酶可以包含一类以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类(EC 1.x.x.x)的一种，其中可以使用的包括甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)或5’磷酸肌苷脱氢酶(EC 1.1.1.205)，优选为甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)和木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)，更优选为甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)。
所述混合生物酶还可以同时包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC 1.6.3.3)或其任意组合。反应试剂可以包含所属的一类氧化还原酶类(EC 1.x.x.x)的氢离子供体作为底物，具体可以包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷等，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；反应试剂还可以包 括常用pH缓冲化合物，例如三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐等。
生物酶催化可以包括在反应试剂中同时加入甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，以进行催化反应生成过氧化氢。过氧化氢是优选的颜色变化引发物质，能够与各种显色物质发生显色反应，发生颜色改变。颜色变化可以作为显示检测结果的重要手段。
检测结果可以为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔浓度总和。
在获得检测结果后，可以基于颜色变化显示该结果。例如显示检测结果包括采用显色物质促使颜色变化引发物发生颜色变化，并且将颜色变化与标准进行对比。
优选地，显色物质可以包括显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和所有可以固定该显色剂的惰性物料。
颜色对比可以将颜色变化结果与标准颜色进行肉眼对比，也可以将将颜色变化输入电子设备，并且利用计算机程序自动显示检测结果。
在一个实施方案中，可以通过生物酶催化转化样本中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应生成过氧化氢，在特定的条件和反应时间下量度过氧化氢的生产量并以颜色的转变/对比作结果显示，以反应样本中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度。
根据本发明的方法，样本可以为来自生物体的血液、血清、体液或其组合，优选为血液、尿液、血清和唾液，更优选为血清。
具体来说，样本可以为生物样本中的血液和血清或各种体液和含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的中性酸碱度液体，优选为血液、尿液、血清和唾液。由于血清中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸较高，而且用户方便收集和处理，因此以血清为佳
根据本发明的方法，生物酶催化的条件可以包括pH 6.0-8.0，优选为pH 6.5-7.8，更优选为pH7.5–7。生物酶催化的温度可以为20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。
优选地，生物酶催化包括同时进行下列反应：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(2)以反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢；(3)期间生成的过氧化氢与显色物质进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，整个酶组合的共同运作组成一个循环链式反应。
在该优选方法中，同时使用了还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase；EC 1.6.3.3)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase；EC 1.17.1.9)，并且反应过程可以包括：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(2)反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶再与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢，期间生成的过氧化氢与显色剂/试纸进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，整个酶组合的共同运作组成一个循环链式反应。因此，该方法可以构成一个整套的方法。
整套方法可以在特定的反应时间内进行，并需要配合特定的物理条件，该条件可以使用恒温装置或者使用为本文所述的方法和工具所设计的装置进行。用户可以在检测完成后，以肉眼检测结果显示的方式根据本文所提供的描述和图示进行自我判断，或使用智能电话应用程序中的分析功能进行分析。
反应的时间可以为5-30min，优选为5-20min，更优选为5-15min。物理条件可以包括pH 6.0-8.0，优选为pH 6.5-7.8，更优选为pH7.5–7，以及温度20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。
检测装置可以包括恒温震动计时装置、保温装置、色谱仪和具有拍摄功能的智能手机或装置。
根据本发明的方法，显色剂可以为靛酚类配合物。任选地，所述显色剂使用化学和物理方法固定于惰性固体材料、纤维材料或其组合的载体中。所述载体的形状可以是颗粒状、块状、柱状、片状或条带状。
所述显色可以包括在液体样本中加入显色剂，从而在液体中进显色反应或者加入检测液体中过氧化氢浓度的显色测试纸。
根据本发明的方法，显示检测结果可以包括通过生物酶催化反应产生颜色变化引发物(优选过氧化氢)并且与显色物质进行不可逆转的化学反应，其中该化学反应因颜色变化引发物的含量所不同而呈现可观察的颜色变化。
当生理活性物质为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸时，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶转化生成的过氧化氢与显色物质发生不可逆转的化学反应；显色物质所表达的颜色变化与样本溶液中过氧化氢的浓度有着线性的关系；由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶转化生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则会再次经过上述的酶法循环进行反。
显色物质可以选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和所有可以固定该显色剂的惰性物料。
颜色变化可以为原始颜色与反应后呈现颜色的对比变化；原始颜色分别优选为无色、黄色和红色，更优选为无色；反应后呈现的颜色分别优选为蓝色、绿色和紫色，更优选为蓝色。
颜色变化还可以包括在载体上以线条、充填色的比例、各种图形所显示的数量、对比色的强度或者软件程序上显示的颜色变化来表示样本中的生理活性物质的量。
根据本发明的一个优选方面，检测结果可以包括以“高、中、低或检测不到生理活性物质”作为基准，其中高为样本中生理活性物质的浓度在50uM或以上，中为样本中生理活性物质的浓度为21-50uM，并且低或检测不到为样本中生理活性物质的浓度在20uM或以下。
在另一个方面中，本发明还提供了一种用于检测生理活性物质的检测工具，包含：(i)用于容纳包含所述生理活性物质的样本的容 器；(ii)用于催化生理活性物质进行反应以生成颜色变化引发物的混合生物酶；(iii)用于与混合生物酶相互作用以生成颜色变化引发物的反应试剂；以及(iv)显色物质，用于显示颜色变化引发物的颜色变化。
检测工具可以制成各种形式，包括并且不限于检测试剂盒、自动化检测仪器或者手动检测仪器。在检测工具中，生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。混合生物酶包含一类以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类(EC 1.x.x.x)的一种，其中可以使用的包括甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)或5’磷酸肌苷脱氢酶(EC 1.1.1.205)，优选为甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)和木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)，更优选为甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)；所述混合生物酶同时包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC 1.6.3.3)。反应试剂包含所属的一类氧化还原酶类(EC 1.x.x.x)的氢离子供体为底物，具体可以包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷等，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；反应试剂当中还可以包括常用pH缓冲化合物包括三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐等。
显色物质选自选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和所有可以固定该显色剂的惰性物料。并且任选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。
根据本发明的一个具体实施方案，检测生理活性物质的方法包括下列步骤：用户首先使用采血针在右上的食指上采血并使用一次性微量采血管毛细吸管定量100ul的血液到血液采集管中，在桌上离心机进行5min的离心并使用新的一次性微量采血管毛细吸管定量40ul的上清液到检测管中，用手指轻弹检测管侧3-5次使刚加入的上清液和已预载在检测管中的反应溶液混合后，打开检测管的盖并置于检测器中，检测器为一个恒温震动计时装置-检测器可以保温当中的检测 管至37℃并有序的作低率震荡以加强检测管中的溶液混合。装置还可以有计时设计，以声响和灯光提示用户反应的开始和结束。用户还可用自己的方式方法保温至37℃如置于恒温水窝中进行保温而不采用该另配置的检测器。用户在加入上述的溶液后加入显色剂/试纸，反应时间为15min，期间应将检测器静置或继续保温；反应时间完结后可开启检测器以个人判断按图1或使用手机程序进行颜色的分析。
通过本发明的方法和检测工具，用户可以使用离体样本(如血清或体液)在家中自行进行生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的评估，为生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)检测的做法带来前所未有的便利。
例子
以下例子中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明，否则所述百分比为体积百分比。
下列例子中所用材料和设备的描述如下：
检测器:来自基因港(香港)生物科技有限公司，NADD-PT2；
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC 1.6.3.3):购自Merck,USA；
甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9):购自Merck,USA；
甲酸钠:购自Merck,USA；
三羟甲基氨基甲烷：购自Merck,USA；
实施例1:检测血浆中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(使用检测器)
配置酶法反应溶液，准备下表1所需的化学物并按量加入纯水中并搅拌至完全溶解
表1
| 化学物 | 份数/每份纯水 |
| 甲酸钠 | 50 |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 92 |
化学物完全溶解后使用12M盐酸调节pH至7.5，然后同时加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶和甲酸脱氢酶各57mU(生物 酶活力单位的U为每1mg的生物酶可以在pH6和摄氏25度的环境下每1min催化生成1nmol产物)，混合后将40ul反应溶液加入至检测管中备用。
使用者为男性，年龄73岁，体重82kg，身体状况正常。使用者先使用采血针在右手食指上刺洞，使用一次性微量采血毛细吸管定量采血100ul(管尖向上数起的第五条刻度线)将血液加入到血液收集管并使用桌式离心机以10,000rpm进行10min的离心并以另一支一次性微量采血毛细吸管取40ul的上清液(管尖向上数起的第二条刻度线)并加入至检测管中，以手指在管侧弹3-5次使当中的反应溶液和上清液得已混合，便可以将检测管置于检测器中。检测器有提温和保温的作用，可以为酶反应提供37℃的最佳反应温度；检测器在温度稳定后会自动进行计时，并以指示灯和声音提示使用者从检测器顶端的洞口插入试纸或加入显色剂，反应过程当中检测器会有序地震动以增加反应溶液的混合。酶反应时间为15min，检测器会以指示灯和声音提示使用者检测结束，应在2min内取出试纸或打开检测器观察显色剂的颜色变化，使用者在取出试纸可以根据结果表以肉眼作判断，或使用手机程序作软件分析并记录结果。男性使用者的试纸上颜色偏向白色，只能隐约看到非常浅淡的绿色，与结果表(图1)当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“低或检测不到”所表示的颜色描述和图示非常吻合，与结果表当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“中”所表示的颜色描述和图示则不匹配，因此以肉眼的判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸“低或检测不到”。
使用手机程序的结果也判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“低或检测不到”。
实施例2:检测血浆中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(不使用检测器)
按实施例1配置反应溶液备用，此实施例中有两位使用者，分别为实施例1中的73岁男性使用者，另一位是21岁女性使用者，两者都身体状况正常。使用者根据实施例1的采血方法进行采血和离心，在进行血液离心的同一时间准备一个保温杯并倒入约40℃的温水，水位需要足够完全覆盖检测管的底部，将检测管中套入提供的浮 环并关上杯盖保温10min。按实施例1中的方法取上清液并加入已预温的反应溶液中，稍微混合后插入试纸或加入显色剂，将检测管放置回保温中但不用关上杯盖，计时15min的反应并于每隔5min中作3-5下混合，混合的操作可提升检测的准确性。酶反应时间结束后取出试纸或观察显色剂的颜色变化，使用者在取出试纸可以根据结果表以肉眼作判断，或使用手机程序作软件分析并记录结果。男性使用者的试纸上颜色偏向白色，只能隐约看到浅淡的绿色，与图1当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“低或检测不到”所表示的颜色描述和图示非常吻合，与图1当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“中”所表示的颜色描述和图示则不匹配，因此以肉眼的判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“低或检测不到”；使用手机程序的结果也可以判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“低或检测不到”，与实施例中1使用检测器的结果一致。女性使用者的试纸上颜色呈深绿色至蓝色，与图1当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“高”所表示的颜色描述和图示吻合，与图1当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“中”所表示的颜色描述和图示在对比上则样本较为深色，因此以肉眼的判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“高”；使用手机程序的结果也可以判断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“高”。
本实例中说明本发明的方法中酶法催化反应的使用是核心原素，检测器和手机程序均为辅助上的设备，可以增添用户上的便利。
实施例3:检测唾液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
按实施例1的方式配置反应溶液备用，使用者为实施例2中以血浆为检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为“高”的21岁女士；使用者将唾液吐进杯内，然后使用一次性微量采血毛细吸管定量采唾液40ul，并直接加入检测管中按实施例1的方法进行整个检测。使用者的试纸上颜色为白色，与结果表当中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的“低或检测不到”所表示的颜色描述和图示吻合。结果与实施例2中的结果存着差异。唾液中的含量绝大部分为水、电解质和蛋白酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量极微，不足以用这方法进行检测或以唾液所得的检测结果代表自身的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，使用者应以血浆样本的结果作为合适的参考。
实施例4:检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸标准溶液
准备含有0uM、10uM、20uM、和100uM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度标准溶液各100ul，并取当中的40ul加入检测管中以实施例1的方法使用试纸和检测器进行测试，并得出下表2的结果：
表2
以上述结果分析一种检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用的可靠性，在阴性和低样本中检测中皆能实际反映其结果，而在上比较接近两个级别结果的时候，则因为颜色的变化相差较少的时候会出可现误判的情况。此实施例表明了本发明的方法及其应用可以显示较明显的区分，而较接近两区的结果时会存在一定的判断差异，而导致这种误判是源于试纸或显色剂的颜色变化在这位置上较为狭窄，而改进手机应用程序上对颜色分辨别的能力和当中的运算法皆能有效改进上述的误判。
对比例1:增加酶的量检测血浆中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
按实施例1的方法配置反应溶液，并加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶和甲酸脱氢酶各0.57U。加入的酶的量比实施例1多十倍。使用者同样为实施例1的男士，并按实施例1的方式进行整个过程，而检测的结果为的“中”，结果与实施例1不同。
酶的量和反应时间是本发明的方法及其应用中可以影响其准确 性的主要因素：增加或减少酶的量能改变酶法反应在特定的时间中由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化成过氧化氢的量，从而改变检测结果，时间的改变与酶量的影响道理相同，在同样的酶的量下延长反应时间会产生更多量的过氧化氢。因此，本发明的方法及其应用中所使用的酶的量和制定的反应时间皆有关联，当中的参数已调节至最适合本发明的方法中的使用。任何单一方面甚至两方面的调整天会偏离表中的描述颜色，对表中相应的结果分析有误判的可能。
对比例2:分开加入酶制剂检测血浆中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
按实施例1的方法配置反应溶液，并先加入甲酸脱氢酶57mM；使用者为实施例2中的21岁女士，按实施例1的方法进行采血和检测工序，并使用试纸和检测器。在反应进行至7分30秒时加入酶制剂还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶57mU，继续进行酶法反应直至15min。试纸的颜色为浅绿色，可视为“低或检测不到”，检测的结果与实施例2中这位使用者所得到的检测结果相差甚远。
以上说明在本发明的方法中所使用的两种酶是一个紧密配合的组合，使用者血浆中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸借甲酸脱氢酶转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，继而再由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶从刚在第一步转化成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和样本中原有的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸一起转化至过氧化氢和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，而产生的过氧化氢会与试纸/显色剂进行显色反应从中消耗，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则再被甲酸脱氢酶使用为底物产生过氧化氢，借着这个组合在反应时间中倍增其量而得出分明的显色结果。因此，在这对比例中失去这组合，使过氧化氢的产生量比实施例2的低，从而不能达到检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用的应有功能。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种修改或改变。这些改变均在本发明要求保护的范围之内。
Claims (20)
- 一种检测生理活性物质的方法，包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和/或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；优选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。
- 根据权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述方法包括在反应试剂的存在下，使用混合生物酶催化生理活性物质产生颜色变化引发物以获得检测结果；以及任选地，所述混合生物酶的用量为0.5-10000U,优选为1-200U，更优选为1-50U；其中U是指每1mg的生物酶在pH6和摄氏25度的环境下每1min催化生成1nmol产物。
- 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述检测结果基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔浓度总和。
- 根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的显示检测结果包括采用显色物质促使颜色变化引发物发生颜色变化，并且将颜色变化与标准进行对比，优选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定所述显色剂的惰性物料中的至少一者，以及任选地，所述对比包括将颜色变化输入电子设备，并且利用计算机程序自动显示检测结果。
- 根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述的样本 为来自生物体的血液、血清、体液或其组合，优选为血液、尿液、血清和唾液，更优选为血清。
- 根据权利要求3所述的方法，其中所述混合生物酶包含以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类，具体包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)和5’磷酸肌苷脱氢酶(EC 1.1.1.205)中的至少一种，优选包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)或木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.9)，更优选包含甲酸脱氢酶(EC 1.17.1.9)；任选地，所述混合生物酶还包含还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC 1.6.3.3)，并且所述反应试剂包含所述的一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；任选地，所述反应试剂还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者。
- 根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述方法包括在反应试剂的存在下，同时加入甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，以催化生理活性物质生成过氧化氢。
- 根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述方法在下列条件下进行：pH 6.0-8.0，优选为pH 6.5-7.8，更优选为pH7.5–7；并且温度为20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。
- 根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述方法包括同时进行下列反应：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(2)以反应生成 的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢；(3)期间生成的过氧化氢与显色物质进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，整个酶组合的共同运作组成一个循环链式反应。
- 根据权利要求5所述的方法，其中所述的显色剂为靛酚类配合物；任选地，所述显色剂使用化学和物理方法固定于惰性固体材料、纤维材料或其组合的载体中；任选地，所述载体的形状是颗粒状、块状、柱状、片状或条带状；并且任选地，所述显色包括在液体样本中加入显色剂，从而在液体中进显色反应或者加入检测液体中过氧化氢浓度的显色测试纸。
- 根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中所述的显示检测结果包括通过生物酶催化反应产生颜色变化引发物(优选过氧化氢)并且与显色物质进行不可逆转的化学反应，其中该化学反应因颜色变化引发物的含量所不同而呈现可观察的颜色变化，并且任选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定有所述显色剂的惰性物料中的至少一者。
- 根据权利要求12所述的方法，其中所述的颜色变化为原始颜色与反应后呈现颜色的对比变化；原始颜色分别优选为无色、黄色和红色，更优选为无色；反应后呈现的颜色分别优选为蓝色、绿色和紫色，更优选为蓝色。
- 根据权利要求12所述的方法，其中所述的颜色变化包括在载体上以线条、充填色的比例、各种图形所显示的数量、对比色的强度或者软件程序上显示的颜色变化来表示样本中的生理活性物质的量。
- 根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中所述的检测结果包括以“高、中、低或检测不到生理活性物质”作为基准，其中高为样本中生理活性物质的浓度在50uM或以上，中为样本中生理活性物质的浓度为21-50uM，并且低或检测不到为样本中生理活性物质的浓度在20uM或以下。
- 根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中所述方法包括：(i)将包含所述生理活性物质的样本置于容器中；(ii)加入混合生物酶，以催化生理活性物质进行反应以生成颜色变化引发物；(iii)加入反应试剂，以与混合生物酶相互作用生成颜色变化引发物；以及(iv)用显色物质显示颜色变化引发物的颜色变化，并且与标准颜色进行对比。
- 根据权利要求16所述的方法，还包括：在步骤(iv)之前，将加入样本、混合生物酶和反应试剂的容器置于20-40℃的恒温装置中。
- 一种用于检测生理活性物质的检测工具，包含：(i)用于容纳包含所述生理活性物质的样本的容器；(ii)用于催化生理活性物质进行反应以生成颜色变化引发物的混合生物酶；(ii)用于与混合生物酶相互作用以生成颜色变化引发物的反应试剂；以及(iii)显色物质，用于显示颜色变化引发物的颜色变化。
- 根据权利要求18所述的检测工具，其中所述检测工具选自 检测试剂盒、自动化检测仪器或者手动检测仪器。
- 根据权利要求18或19所述的方法检测工具，其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；任选地，所述混合生物酶包含甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的组合；任选的，所述反应试剂包含一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选包含甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇中的至少一者，更优选为甲酸或其衍生物；反应试剂当中还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者；任选地，所述显色物质选自选自显色剂、显色试纸、显色凝胶显色树脂、显色膜和固定显色剂的惰性物料中的至少一种；并且任选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。
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