CN105734113B - 一种酶法检测d-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶法检测D‑3‑羟丁酸的试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按3份：1份体积比的比例组成：试剂1：3L
Figure DDA0000631801830000011
试剂2：1L

Description

一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物试剂，具体涉及一种检测试剂盒,尤其涉及一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法。
背景技术
糖尿病酮症酸中毒是一临床常见病，多发病，原因是血酮体增高引起，D-3-羟丁酸是血中酮体的主要成份(占78％)，它可以反映血液中酮体生成的情况。当酮症酸中毒时，D-3-羟丁酸明显升高，因而，D-3-羟丁酸可用于酮症酸中毒早期诊断与治疗监控，并可指导糖尿病的灭酮治疗及疗效监控。由于在酮症酸中毒时，患者对胰岛素产生拮抗作用，导致蛋白质合成障碍和蛋白质降解代谢，因此，可通过测定早晨的空腹血糖，来了解严重损伤、急重疾病、败血症以及营养支持的病人体内脂肪蛋白质的动员情况。对减肥、限食或妊娠呕吐者，通过测定D-3-羟丁酸有助于监测饥饿酮症酸中毒的发生。
通常，D-3-羟丁酸测定方法有酶法、气相色谱法、放射化学法、毛细管等速电泳法等。放射化学方法由于辐射和化学物质难以接受；毛细管等速电泳操作时间长,步骤复杂，不适合临床应用。酶法检测的原理为NAD+被还原为NADH，NADH在340nm处有最大吸收峰，其吸光度值与D-3-羟丁酸的浓度呈正相关。但是该方法灵敏度低，抗干扰能力差，特别是胆红素对检测有严重干扰，经常出现负值，影响检测，现有酶法试剂盒的组成：试剂R1Tris缓冲液100mmol/L草酸20mmol/Lβ-羟丁酸脱氢酶1KU/L试剂R2INT 1mmol/L NAD+2.5mmol/L。因而，需要改进酶法检测D-3-羟丁酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计抗干扰，提高灵敏度，酶法检测血液或血清中D-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法。
本发明基于采用酶动力学法，原反应底物氧化型辅酶变成新的反应底物3-乙酰吡啶氧化型辅酶的方法来测定血清或血浆中的D-3-羟丁酸。因在D-3-羟丁酸脱氢酶的催化作用下，D-3-羟丁酸被氧化，生成乙酰乙酸，同时ACNAD+被还原为ACNADH，ACNADH在405nm处有最大吸收峰，其吸光度值的上升与D-3-羟丁酸的浓度呈正相关。本发明经过研究发现，通过添加抗干扰剂(十二烷基聚乙二醇醚)，会使D-3-羟丁酸试剂盒抗干扰的能力大大加强，满足临床使用的要求。
本发明提供了一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按3份：1份(体积比)的比例组成：
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000021
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000022
Figure BDA0000631801820000031
所述试剂1的缓冲液选自TRIS(三羟甲基氨基甲烷)tris(hydroxymethyl)aminomethane)、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)、BICINE(N,N-双(2-羟乙基甘氨酸)或HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)。
所述Brij35(十二烷基聚乙二醇醚)。
所述十二烷基聚乙二醇醚为抗干扰剂。
试剂盒PH值为8.5.
本发明的检测D-3-羟丁酸试剂盒，在使用时,试剂1加检测样本后再加入试剂2,即可进行检测。
本发明的另一目的是提供了上述D-3-羟丁酸试剂盒的制备方法：
该方法包括下列步骤：
(一)制备试剂1:(3L)(试剂体积)
(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；
(2)依次加入缓冲液、D-3-羟丁酸脱氢酶、十二烷基聚乙二醇醚、叠氮钠；
(3)加入D-3-羟丁酸脱氢酶；
(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为3L混合均匀，即得；(二)制备试剂2:(1L)(试剂体积)
向容器内依次加入草酸盐、3-乙酰吡啶氧化型辅酶、叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。
本发明方法由于在酶法检测D-3-羟丁酸试剂盒中加入抗干扰剂十二烷基聚乙二醇醚,试剂的抗胆红素干扰的性能大大增强。试剂的灵敏度大大提高，从而使D-3-羟丁酸试剂盒的检测样本的准确度大大提高，有较大的临床应用价值。
具体实施方式
以下实施例所用试剂原料均通过市售得到。
Figure BDA0000631801820000041
实施例1制备D-3-羟丁酸检测试剂盒
组成:
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000042
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000043
Figure BDA0000631801820000051
制备:
(一)制备试剂1:(3L)
(1)先向容器内加入2.4L的去离子水；
(2)依次加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液、十二烷基聚乙二醇醚、叠氮钠；
(3)加入酶：D-3-羟丁酸脱氢酶
(4)最后加入去离子水至总体积为3L混合均匀，即得；
(二)制备试剂2:(1L)
向容器内依次加入草酸盐、3-乙酰吡啶氧化型辅酶、叠氮钠去离子水加至总体积为1L，混合均匀。
实施例2
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000052
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000053
Figure BDA0000631801820000061
制备方法同实施例1。
实施例3
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000062
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000063
制备方法同实施例1
实施例4
本发明实施例1的试剂盒检测效果试验：
测定方法：
步骤一:输入参数于自动生化分析仪:(奥林巴斯400)
温度37℃,主波长405nm,副波长505nm,
试剂1180ul(实施例1试剂1).试剂260ul(实施例1试剂2).
对照试剂：D-3-羟丁酸试剂盒(试剂1180ul；试剂260ul，配方(试剂1：Tris缓冲液,D-3-羟丁酸脱氢酶,叠氮钠试剂2：草酸盐、氧化型辅酶、叠氮钠)检测样本6ul(血清样本)来自上海东方肝胆医院，用分离胶储血管分离血清，浓度为3.56mmol/L
读数点：16-24
步骤二:测定前将试剂1与试剂2同时放入试剂仓内
步骤三输入定标因子：2218
在使用时,试剂1加检测样本后再加入试剂2,即可进行检测。
以下通过试剂检测不同浓度的胆红素样本中的D-3-羟丁酸
Figure BDA0000631801820000071
上述检测结果表明本发明的试剂盒采用3-乙酰吡啶氧化型辅酶作为反应底物加入Brij35对试剂有很强的抗干扰能力，随着胆红素浓度的增加，对抗胆红素干扰会更明显，检测40mg/dl的样本跟对照试剂相比，检测结果只下降了5％，而采用氧化型辅酶试剂的检测结果下降了50％。
实施例5与朗道D-3-羟丁酸试剂盒的临床相关性比较试验
本实施例1试剂盒与朗道D-3-羟丁酸试剂盒作了临床相关性比较：
与市售得到的朗道试剂盒(试剂1:1*60ml试剂2:1*20ml)配方(试剂1：Tris缓冲液,EDTA,草酸；试剂2(酶/辅酶)：NAD+,3-HBDH。)生产商(英国朗道公司)平行进行检测
使用仪器：自动生化分析仪(奥林巴斯400)
检测样本：取40例不同浓度的临床样本。(上海东方肝胆医院)收集，静脉采血，采血后，采用分离胶储血管分离血清，D-3-羟丁酸的样本浓度从0.01-4.00mmol/L,共40例)
测定方法
步骤一:输入参数于自动生化分析仪:
温度37℃,主波长340nm,辅波长405nm,
在使用时,试剂1加检测样本(6ul)后再加入试剂2,即可进行检测。
对照试剂：英国朗道D-3-羟丁酸试剂盒(试剂1180ul；试剂260ul，配方中未加入十二烷基聚乙二醇醚，以氧化性辅酶作为反应底物)生产商(英国朗道公司)；
读数点：16-24
步骤二:测定前将试剂1与试剂2平衡至室温(温度25℃),然后放入试剂仓内
步骤三输入定标因子：2218
在自动生化分析仪(奥林巴斯400)上输入以上参数，在使用时,试剂1加检测样本后再加入试剂2,即可进行检测。
试验结果:
Figure BDA0000631801820000091
Figure BDA0000631801820000101
根据上面的临床比对数据，本试剂与朗道试剂的临床相关性良好，没有差异。可以替代朗道试剂用于临床检测D-3-羟丁酸,并且本试剂盒抗胆红素干扰性能良好。
实施例6
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000111
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000112
制备方法同实施例1。
实施例7
试剂1：(3L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000113
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000631801820000114
Figure BDA0000631801820000121
制备方法同实施例1。

Claims (5)

1.一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按3份：1份体积比的比例组成：
试剂1：3L
Figure FDA0002298832290000011
试剂2：1L
Figure FDA0002298832290000012
2.根据权利要求1所述的一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂1的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、3-(N-吗啉)丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸或4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
3.根据权利要求1所述的一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒，其特征在于，所述十二烷基聚乙二醇醚为抗干扰剂。
4.根据权利要求1所述的一种酶法检测D-3-羟丁酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒PH值为8.5。
5.如权利要求1所述一种酶法检测D-3-羟丁酸试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒由下列试剂1和试剂2，按3份：1份体积比的比例组成：
试剂1：3L
Figure FDA0002298832290000021
试剂2：1L
Figure FDA0002298832290000022
制备方法包括下列步骤：
(一)制备试剂1:3L
(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；
(2)依次加入缓冲液、十二烷基聚乙二醇醚、叠氮钠；
(3)加入D-3-羟丁酸脱氢酶；
(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为3L混合均匀，即得；
(二)制备试剂2:1L
向容器内依次加入草酸盐、3-乙酰吡啶氧化型辅酶、叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。
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