CN1865928A - 辅酶ⅰ及其衍生物含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辅酶I及其衍生物含量的测定方法。配置pH8.0－11.0焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.01％－0.3％水合肼。在上述缓冲液中加入底物溶液和待测定的辅酶I及其衍生物测定液，在分光光度计上，于还原型辅酶I及其衍生物的最大吸收峰处调零后，加入3α－类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。本发明的3α－类固醇脱氢酶是诊断试剂的常用原料，来源广泛。反应缓冲液中加入肼使反应向正方向进行，辅酶I及衍生物将全部转化为还原型辅酶I及衍生物，根据还原型辅酶I及衍生物在特定波长的摩尔吸光值，可以定量的计算出辅酶I及衍生物的含量。

Description

辅酶I及其衍生物含量的测定方法
技术领域
本发明涉及一种辅酶I及其衍生物含量的测定方法。
背景技术
氧化型辅酶I与还原型辅酶I双向转变时可出现特征性吸收光谱的改变。在一定条件下，可与被测物的浓度呈线性改变，许多化学分析方法是基于这一原理实现的，但氧化型/还原型辅酶I的化学性质存在许多缺陷。氧化型/还原型辅酶I衍生物的化学性质则有了较大的改变，(主要表现为最大吸收峰改变、摩尔吸光值增加、反应Km值改变、溶液稳定性和稳定pH范围大大增加。)还原型辅酶I衍生物的最大吸收波长在340-405nm之间，氧化型/还原型辅酶I衍生物参与的氧化-还原反应可通过吸光值的变化定量检测生化反应底物，因而是许多生化检测试剂的核心原料。
原料的纯度会影响到诊断试剂的质量，在试剂配制的过程中，有必要的对原料质量进行监控。此外，在辅酶I及其衍生物的生产过程中，由于工艺步骤较多，对每一步骤进行纯度测定也很重要。辅酶I及其衍生物种类较多，目前缺乏统一的检测方法。如果采用HPLC(高效液相)方法，过程较为繁琐，需要标准品，实际推广应用不便。
在脱氢酶的存在下，辅酶I及其衍生物作为辅酶参与反应，氧化型辅酶I及衍生物将转化为还原型辅酶I及其衍生物，但反应一般均为可逆反应，由于产物反馈抑制，辅酶I及衍生物不能完全转化。
乙醇脱氢酶参与的反应中加入氨基脲可将产物固定，使反应转为单向反应。利用这一原理测定辅酶I含量的方法已有报道，但乙醇脱氢酶来源于酵母，需要自己提取，实际操作较为麻烦。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅酶I及其衍生物含量的测定方法。
测定辅酶I及其衍生物的方法：配置0.03-0.2M、pH8.0-11.0焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.01％-0.3％水合肼，加入底物和待测定液，底物浓度为0.005-0.08mg/ml，测定液的浓度为0.01-0.3mg/ml；在分光光度计上，于还原型辅酶I及其衍生物的最大吸收峰处调零后，按反应体积加入0.05-1U/ml的3α-类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。依如下计算公式计算辅酶I及其衍生物含量，计算公式为：待测定液样品含量(w/v)＝(A-A0)×V1×MW/(ε×V2)×100％，其中A为加3α-类固醇脱氢酶反应最终吸光值，A0为不加3α-类固醇脱氢酶的最终吸光值，V1为反应体积，Mw为辅酶I或其衍生物分子量，ε为还原型辅酶I或其衍生物的摩尔吸光值。
所述的底物为雄酮、胆酸钠或脱氧胆酸钠。辅酶I及其衍生物为辅酶I、硫代辅酶I或3-乙酰吡啶辅酶I。
本发明的3α-类固醇脱氢酶是诊断试剂的常用原料，来源广泛。本方法利用辅酶I及其衍生物在3α-类固醇脱氢酶存在下参与氧化还原反应，并用肼将产物固定，使反应向正方向进行。辅酶I及衍生物将全部转化为还原型辅酶I及衍生物，根据还原型辅酶I及衍生物在特定波长的摩尔吸光值，可以定量的计算出辅酶I及衍生物的含量。
HPLC(高效液相)和本方法检测对比如表
  HPLC法   脱氢酶酶化学比色法
  检测时间检测成本标准品检测步骤灵敏度   60min约200元需要多，样品需预处理2μg/ml   10min很低不需要少，直接检测10μg/ml
具体实施方式
本发明的测定原理
3α-类固醇脱氢酶以氧化型辅酶I及衍生物为辅酶，在碱性条件和较高的底物浓度下进行反应。水合肼将反应产物固定，使辅酶I及衍生物几乎全部化为还原型辅酶I及衍生物，根据还原型辅酶I及衍生物在特定波长的摩尔吸光值，可以定量的计算出辅酶I及衍生物的含量。
样品测定液
精确称量0.1g左右的样品，蒸馏水定容到终浓度在0.01-0.3mg/ml之间。
酶反应缓冲液
焦磷酸钠缓冲液中加入50％水合肼，水合肼体积百分比为0.01％-0.3％。
底物溶液
雄酮预先溶解于甲醇中，2mg/ml；
胆酸盐或脱氧胆酸盐可直接加入酶反应缓冲液中。
3α-类固醇脱氢酶甘油液
3α-类固醇脱氢酶溶解于pH＝7.5，0.05M磷酸盐冲液中，其中含有50％(v/v)甘油，100mM NaCl，EDTA 1mM，3α-类固醇脱氢酶的浓度为250U/ml。
实施例1：测定辅酶I
配置0.06M、pH8.9焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.03％水合肼。加入底物和待测定液，底物为雄酮，浓度为0.02mg/ml，测定液的浓度为0.01-0.3mg/ml；在分光光度计上，于340nm调零后，按反应体积加入0.3U/ml的3α-类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。依如下计算公式计算辅酶I及其衍生物含量，计算公式为：待测定液样品含量(w/v)＝(A-A0)×V1×663/(6220×V2)×100％，其中A为加3α-类固醇脱氢酶反应最终吸光值，A0为不加3α-类固醇脱氢酶的最终吸光值，V1为反应体积，663为辅酶I分子量，6220为还原型辅酶I的摩尔吸光值。
测定结果
  测定方法                               含量(mg/ml)
  对照(HPLC)酶法   0.0100.009   0.0200.019   0.1010.105   0.2070.192   0.3000.290
实施例2：测定硫代辅酶I
测定在避光下进行，配置0.03M、pH8.0焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.01％水合肼。加入底物和待测定液，底物为胆酸钠，浓度为0.005mg/ml，测定液的浓度为0.01-0.3mg/ml；在分光光度计上，于398nm调零后，按反应体积加入0.05U/ml的3α-类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。依如下计算公式计算辅酶I及其衍生物含量，计算公式为：待测定液样品含量(w/v)＝(A-A0)×V1×680/(11900×V2)×100％，其中A为加3α-类固醇脱氢酶反应最终吸光值，A0为不加3α-类固醇脱氢酶的最终吸光值，V1为反应体积，680为硫代辅酶I分子量，11900为还原型硫代辅酶I的摩尔吸光值。
实施例3：测定3-乙酰吡啶辅酶I
配置0.2M、pH11.0焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.3％水合肼。加入底物和待测定液，底物为脱氧胆酸钠，浓度为0.08mg/ml，测定液的浓度为0.01-0.3mg/ml；在分光光度计上，于363nm调零后，按反应体积加入1U/ml的3α-类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。依如下计算公式计算3-乙酰吡啶辅酶I含量，计算公式为：待测定液样品含量(w/v)＝(A-A0)×V1×662/(7800×V2)×100％，其中A为加3α-类固醇脱氢酶反应最终吸光值，A0为不加3α-类固醇脱氢酶的最终吸光值，V1为反应体积，662为3-乙酰吡啶辅酶I分子量，7800为3-乙酰吡啶辅酶I摩尔吸光值。

Claims (3)

1.一种测定辅酶I及其衍生物的方法，其特征在于：配置0.03-0.2M、pH8.0-11.0焦磷酸钠缓冲液，其中含有体积百分比为0.01％-0.3％水合肼，加入底物和待测定液，底物浓度为0.005-0.08mg/ml，测定液的浓度为0.01-0.3mg/ml；在分光光度计上，于还原型辅酶I及其衍生物的最大吸收峰处调零后，按反应体积加入0.05-1U/ml的3α-类固醇脱氢酶，反应至吸光值不再增加为止，根据吸光值变化计算辅酶I的含量。依如下计算公式计算辅酶I及其衍生物含量，计算公式为：待测定液样品含量(w/v)＝(A-A0)×V1×MW/(ε×V2)×100％，其中A为加3α-类固醇脱氢酶反应最终吸光值，A0为不加3α-类固醇脱氢酶的最终吸光值，V1为反应体积，Mw为辅酶I或其衍生物分子量，ε为还原型辅酶I或其衍生物的摩尔吸光值。
2.根据权利要求1所述的一种测定辅酶I及其衍生物的方法，其特征在于：所述的底物为雄酮、胆酸钠或脱氧胆酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种测定辅酶I及其衍生物的方法，其特征在于：所述的辅酶I及其衍生物为辅酶I、硫代辅酶I或3-乙酰吡啶辅酶I。
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