CN108802386A - 基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法 - Google Patents

基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，步骤一，采用偶联葡萄糖脱氢酶的方法构建适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系；步骤二，葡萄糖酸在酸性条件下发生内酯化，生成葡萄糖酸内酯；步骤三，葡萄糖酸内酯与羟胺碱反应，生成异羟肟酸；步骤四，异羟肟酸与三氯化铁反应可生成有色络合物，该络合物具有特征吸收峰，可通过分光光度比色法进行定量。本发明具有精度高、广谱性、检测浓度范围宽、成本低等特点。本发明操作简单，对实验人员的操作技能要求不高，无需大量的预实验。

Description

基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：羰基还原酶广泛的应用于化学、医药、农学等诸多领域。对羰基还原酶的开发，改造等都可能需要用到高通筛选体系和方法。目前最常用、且公认适合于所有羰基还原酶的高通量筛选体系的方法为辅酶消耗法，即检测NAD(P)H减少量来间接反应产物生成量。其原理如下式：
每产生1分子的产物，就会消耗1分子的NAD(P)H。而NAD(P)H在340nm 处有特异吸收峰，且吸光度值与NAD(P)H存在线性关系；因此可以表征产物的生成量。因其主要存在检测范围小，误差大，成本高，不易操作等缺点，并未被广泛用于羰基还原酶的筛选。
检测范围小：随着NAD(P)H的浓度增加，吸光度值很快就会达到分光光度计的极限值(查阅NAD(P)H的吸光度曲线可知)
误差大：还原型的辅酶NAD(P)H容易被多种酶利用，系统中不仅仅只有目标羰基还原酶
成本高：NAD(P)H价格昂贵
不此外，没有高效低成本的高通量筛选体系和方法可以用了。使得对羰基还原酶筛选比较困难；限制了对羰基还原酶的研究及其应用。易操作：要控制反应时间，反应酶量等。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)检测范围小：基于检测NAD(P)H减少量来间接反应产物生成量的高通量筛选方法检测范围为0-1.2mM。A＝abc；其中A为吸光度，a为摩尔吸光系数，NAD(P)H在340nm处的摩尔吸光系数约为6300，b为光径(单位cm)，c 为NAD(P)H浓度，一般的分光光度计最大吸光度为4.0，对应上述公式，最大 NAD(P)H的检测浓度为1.2mM。而1.2mM的产物浓度还属于非常低的水平。
(2)误差大：还原型的辅酶NAD(P)H容易被多种酶利用，包括有氧化还原酶类等。在高通量筛选的体系中往往不可能只有目标酶，还有与目标酶一样可以消耗NAD(P)H的酶(他们不能将底物转换成产物)。将其他酶消耗的 NAD(P)H，计算成目标酶消耗的，从而导致检测结果不准确。
(3)成本高：NAD(P)H价格昂贵。NADH的价格为1380元/克(Sigma 官网)；NADPH的价格为16485元/克(Sigma官网)。表征等物质量的产物生成，需要消耗等物质量的还原性辅酶，采用NAD(P)H来构建高通量筛选体系成本高。
解决上述技术问题的难度和意义：
难度：
①高通量反应体系需要检测浓度范围大，因为随着底物浓度增加，会导致诸如底 物抑制、产物抑制等一系列问题。因此为了筛选出来的酶更具有实际应用价值，在筛选的时 候最好能直接采用较高的浓度。
②减少实验误差，在没有对应底物的情况下，系统中的非目标酶消耗还原型辅酶NAD(P)H的量会存在一个最大值；减少非目标酶消耗的NAD(P)H在总辅酶中所占的比例是减少实验误差的有效途径。
③寻找其他价格相对便宜的方案替代基于使用大量还原型辅酶的高通量筛选方法，该方案应该具有普世性，即不因为底物不同而不能进行筛选。
意义：
①提高底物检测浓度，筛选出来的酶更具有实际应用价值。主要体现在两个方面：一方面是低浓度活性高的酶，在高浓度(应用浓度)下反应时候不一定表现不出高活性；另一方面是有的不能实现的筛选项目得以实现高通量筛选，如底物浓度耐受。
②减少实验误差有利于提高筛选结果的可靠性。
③降低高通量筛选的成本，有利于对羰基还原酶的研究和改造。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法。
本发明是这样实现的，一种基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法。以葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶相偶联，葡萄糖脱氢酶负责将氧化型的辅酶NAD(P)+转化成还原型的辅酶NAD(P)H，同时生成等物质量的葡萄糖酸；羰基还原酶则消耗还原型的辅酶NAD(P)H生成等物质量的产物和氧化型的辅酶NAD(P)+。检测葡萄糖酸的生成量，就可以反应产物的生成量，因为葡萄糖酸与产物在物质量上是等量的。具体包括以下步骤：
步骤一，采用偶联葡萄糖脱氢酶的方法构建适用于所有能直接或间接消耗 NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系；100μl待检测酶液， 20μl 20mM的氧化型辅酶NAD(P)+(根据实际情况：筛选以NADH为辅酶的加入NAD+；筛选以NADPH为辅酶的加入NADP+)，20μl底物(浓度根据筛选的实际需要)，30μl 1M葡萄糖溶液，30ul GDH酶液。37℃，180rpm反应1h。 5000rpm离心10min去上清用于检测。
步骤二，葡萄糖酸在酸性条件下发生内酯化，生成葡萄糖酸内酯；在水溶液中葡萄糖酸和葡萄糖酸内酯处于一个动态的平衡，当加入羟胺碱后，葡萄糖酸内酯不断的被消耗，整个平衡边向葡萄糖酸内酯的方向移动。
步骤三，葡萄糖酸内酯与羟胺碱反应，生成异羟肟酸；40μl检测样品(上清)，100μl羟胺碱混合物均匀后室温静置2min。
步骤四，异羟肟酸与三氯化铁反应可生成有色络合物，该络合物具有特征吸收峰，可通过分光光度比色法进行定量。向上述反应体系中加入50μl 4M盐酸调节pH至酸性，加入50μl FeCl3试剂；可生成有色络合物，该络合物在500nm 波长处具有最大吸收峰。
进一步，所述步骤一中羰基还原酶在还原底物的过程中需要消耗等物质量的辅酶NAD(P)H，与之偶联葡萄糖脱氢酶以后，葡萄糖酸的生成量与产物的生成量相同。
进一步，所述适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化 还原酶的高通量筛选体系为：见图2。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)精度高，通过对同一样品进行两种检测方法(HPLC和高通量筛选方法) 所得到的进行比较。结果显示该高通量筛选体系的检测结果与HPLC检测结果高度一致，误差值<3％；说明该体系可作为高效液相检测的一个替代方案；利用此方法构建高通量筛选体系切实可行。
(2)广谱性，适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶，只要能够利用NAD(P)H生成NAD(P)+就可以配套葡萄糖脱氢酶以后，检测葡萄糖酸的含量。
(3)检测浓度范围更宽，葡萄糖酸相对稳定，且检测浓度高于NAD(P)H；可以实现100mM的检测浓度。
(4)成本低，NAD(P)+的价格远低于NAD(P)H，且用量少。
(5)操作简单，对实验人员的操作技能要求不高，无需大量的预实验。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法流程图。
图2是本发明实施例提供的适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成 NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系结构示意图。
图3是本发明实施例提供的葡萄糖酸浓度线性示意图。
图4是本发明实施例提供的chKRED15酶量线性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，包括以下步骤：
S101：采用偶联葡萄糖脱氢酶的方法构建适用于所有能直接或间接消耗 NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系(如图2)；羰基还原酶在还原底物的过程中需要消耗等物质量的辅酶NAD(P)H，与之偶联葡萄糖脱氢酶以后，葡萄糖酸的生成量与产物的生成量相同；
S102：葡萄糖酸在酸性条件下发生内酯化，生成葡萄糖酸内酯；
S103:葡萄糖酸内酯与羟胺碱反应，生成异羟肟酸；
S104:异羟肟酸与三氯化铁反应可生成有色络合物，该络合物具有特征吸收峰，可通过分光光度比色法进行定量。
下面结合实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
测定有色络合物最大吸收波长
在1.5ml的EP管中加入200μl 40mmol/L葡萄糖酸，400μl羟胺碱混合均匀后室温静置10min，加入200μl 4mol/L盐酸调节pH至酸性，加入100μl FeCl3试剂；以200μl ddH2O代替40mmol/L葡萄糖酸为空白对照。混合均匀后进行全波长扫描测定有色络合物最大吸收波长。结果显示在有色络合物在λ＝500nm附近有最大吸收峰。而对照没有在该波长下吸光度值很低，可将OD500作为该有色络合物的检测波长。
实施案例2
高通量筛选体系线性检测
将葡萄糖酸储存液稀释成不同浓度的葡萄糖酸(1，2，3……10mmol/L；10， 20，30……100mmol/L)，在96空板中加入40μl葡萄糖酸，80μl羟胺碱混合均匀后室温静置10min。加入40μl 4mol/L盐酸调节pH至酸性，加入20μl FeCl3试剂；以40μl ddH2O代替葡萄糖酸为空白对照。混合均匀后在最大吸收波长条件下检测吸光度。在1-100mmol/L葡萄糖酸的条件下具有良好的线性(R2＝ 0.9995)，结果如图3所示。
实施例3
高通量筛选体系
将某羰基还原酶A的粗酶上清以0，10，20……100μl依次加入到96空板中，向其中加入BL21-pET28a-(空)粗酶上清(浓度与羰基还原酶A的酶浓度相同)，使每孔中的体积相同(100μl)。依次加入20μl 20mmol/L NADP+，20μl 100mmol/L羰基还原酶A的底物，30μl1mol/L葡萄糖溶液，30μl葡萄糖脱氢酶(1mg/ml)。37℃，180rpm反应1h，5000rpm×10min离心取上清检测。检测方法为向96空板中加入40μl检测样品，100μl羟胺碱混合均匀后室温静置2min。加入50μl 4mol/L盐酸调节pH至酸性，加入50μl FeCl3试剂；不加底物的样品为空白对照。混合均匀后在最大吸收波长条件下检测吸光度。该高通量筛选体系具有良好的线性(R2＝0.9995)，结果如图4所示。
实施例4
高通量筛选体系精度验证
投加反应体系为490μl羰基还原酶A的粗酶上清，20μl 20mmol/L NADP+， 100μl100mmol/L底物，100μl 1mol/L葡萄糖溶液，490μl葡萄糖脱氢酶 (1mg/ml)。反应时间分别为5，10，15，20，25，30min(通过控制不同时间加入底物来实现反应时间的长短，且最终同时终止反应)。反应结束有，取200μl反应液加入400μl羟胺碱，混合均匀后静置2min，加入200μl 4mol/l盐酸，200μl FeCl3试剂，不加底物(相同时间点)的样品为空白对照，用分光光度计检测吸光度值后根据标准曲线计算转化率；另取200μl经乙酸乙酯萃取，水浴氮气吹干去除有机溶剂，异丙醇复溶后采用高效液相色谱(HPLC)检测计算转化率；比较高通量筛选体系与HPLC结果，计算误差值。结果显示该高通量筛选体系的检测结果与HPLC检测结果高度一致，误差值<3％；说明该体系可作为高效液相检测的一个替代方案；该高通量检测方法切实可行。
注：误差＝(︱高通量-HPLC︱/HPLC)*100％
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，其特征在于，所述的基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，包括以下步骤：
步骤一，采用偶联葡萄糖脱氢酶的方法构建适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系；
步骤二，葡萄糖酸在酸性条件下发生内酯化，生成葡萄糖酸内酯；
步骤三，葡萄糖酸内酯与羟胺碱反应，生成异羟肟酸；
步骤四，异羟肟酸与三氯化铁反应可生成有色络合物，该络合物具有特征吸收峰，可通过分光光度比色法进行定量。
2.如权利要求1所述的基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤一中羰基还原酶在还原底物的过程中需要消耗等物质量的辅酶NAD(P)H，与之偶联葡萄糖脱氢酶以后，葡萄糖酸的生成量与产物的生成量相同。
3.如权利要求1所述的基于与葡萄糖脱氢酶相偶联的羰基还原酶高通量筛选方法，其特征在于，所述适用于所有能直接或间接消耗NAD(P)H生成NAD(P)+的氧化还原酶的高通量筛选体系为：见图2。
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