CN102286610A

CN102286610A - 一种快速微量测定糖化酶活力的方法

Info

Publication number: CN102286610A
Application number: CN2011101989991A
Authority: CN
Inventors: 相宏宇; 谢秋宏; 刘洋; 孟兆丽; 唐芳荣; 徐云
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2011-07-16
Filing date: 2011-07-16
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-16
Also published as: CN102286610B

Abstract

本发明提供一种快速微量测定糖化酶活力的方法，取A、B两支EP管，分别加入可溶性淀粉溶液和醋酸缓冲液混均；在B管中加入待测酶液混均反应后，向A、B两管中加NaOH混均后冷却，A管中补加热变性的酶液作为空白对照；另取两只EP管，分别加入去离子水，吸取上述A、B两管溶液分别加入到两只EP管内，加入DNS溶液，沸水浴反应取出，冷却后加入到96孔板内，加去离子水混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据葡萄糖与OD值标准曲线即可计算其还原糖含量。本发明解决了现有糖化酶检测方法存在的检测程序烦琐、耗时较长或需要稀释很高倍数，造成误差较大等缺欠。

Description

一种快速微量测定糖化酶活力的方法

技术领域

本发明是涉及生物化学分析方法及微生物菌株筛选方法，具体的说是一种快速微量测定糖化酶活力的方法，属于化学检测技术领域。

背景技术

糖化酶全称是葡萄糖淀粉酶（GlucoamylaseEC.3.2.1.3）又称为淀粉α-1,4葡萄糖苷酶，γ淀粉酶。在发酵行业中主要用作将淀粉转化为葡萄糖,所以习惯上被称为糖化酶。糖化酶不仅用于酒类和酒精生产及制取葡萄糖浆，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。在糖化酶生产及糖化酶菌株筛选过程中需要测定糖化酶活力，而国标法测定糖化活力，是采用硫代硫酸钠滴定法测定酶解产物中还原糖含量，需要体系较大，所用试剂需要标定，程序烦琐，耗时较长，测定一个样品需要一个小时，而采用DNS法直接测定，需要稀释很高倍数，造成误差较大，这对于高通量测定糖化酶活力以及糖化酶的性质研究是不利的。

发明内容

本发明提供一种快速微量测定糖化酶活力的方法，其目的是解决了现有糖化酶检测方法存在的检测程序烦琐、耗时较长或需要稀释很高倍数，造成误差较大等缺欠。

本发明的快速微量测定糖化酶活力的方法，包括以下步骤：

1）96孔板内葡萄糖标准曲线的制备

取烘干至恒重的葡萄糖1g，用去离子水溶解，容量瓶定容至100mL，制备10mg/mL葡萄糖储备液；分别将其稀释成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL葡萄糖溶液；取8只EP管，分别加入100μl去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50μl，最后加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中2min, 从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的标准曲线；

2）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl和0.05M的 pH4.6醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于（40±0.2）℃温水浴中预热5~10min；在B管中加入待测酶液40μl，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加1M NaOH20μl, 混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管中补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

3）另取两只EP管，分别加入100μl去离子水，吸取上述A、B两管溶液各50μl，分别加入到两只EP管内，并加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min，从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其OD值，根据步骤1）制备的96孔板内葡萄糖与OD值标准曲线计算其还原糖含量；

再根据下列公式计算糖化酶活力；

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

式中，

B为总还原糖含量；

A为对照管中还原糖含量；

B-A为酶反应生成还原糖含量；

2为反应30min，换算成1h酶活力系数；

16.5为换算成1mL的反应体系；

N为稀释倍数。

注：试剂的调配和待测酶液的稀释请参照中华人民共和国国家标准/食品添加剂// 糖化酶制剂 GB8276-2006，中国标准出版社。

本发明的积极效果在于：克服了传统滴定法和DNS法测定糖化酶活力的缺点，即：传统的滴定法需要配制和标定不同试剂，程序烦琐，且滴定终点需要目测，人为误差严重，而DNS法测定商品酶活力时需要稀释很高的倍数才能使释放的还原糖控制在线性范围内，稀释很高倍数后会增加测定误差。本发明不需要稀释很高倍数即可测定糖化酶活力并且操作程序简单，实现了96孔板高通量快速测定。

附图说明

图1为本发明96孔板内葡萄糖含量与OD值标准曲线图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1）葡萄糖标准曲线的制备：

取烘干至恒重的葡萄糖1g，用去离子水溶解，容量瓶定容至100mL，制备10mg/mL葡萄糖储备液。分别将其稀释成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL葡萄糖稀释液。取8只EP管，分别加入100μl去离子水，再分别加入上述不同浓度的葡萄糖稀释液50μl，最后加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min，迅速取出，放入冰水浴中2min, 从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定其吸光度值，建立葡萄糖浓度与OD值的关系曲线，实验结果如图1所示。

从图1可以看出，葡萄糖浓度在1mg/mL~8mg/mL，其浓度与OD值成线性关系，对其进行线性回归，得出相关系数R=0.9996。

实施例2

1）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl，和0.05M, pH4.6的醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于（40±0.2）℃温水浴中预热5~10min；在B管（反应管）中加入待测酶液S（山东淄博国奥集团公司）40μl，立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中加1M的NaOH 20μl，混均后，同时将两管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管（对照管）中补加热变性的酶液S（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

2）另取两只EP管，分别加入100μl去离子水，吸取上述A、B两管溶液各50μl，分别加入到两只EP管内，并加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min，从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定OD值，根据标准曲线计算其还原糖含量。再根据糖化酶活力计算公式计算糖化酶活力。

3）葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。

4）糖化酶活力计算公式：

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

式中，B：总还原糖含量，A：对照管中还原糖含量。B-A酶反应生成还原糖含量，2：反应30min，换算成1h酶活力系数。16.5：换算成1mL的反应体系。N：稀释倍数。

连续平行测量5次，实验及统计结果见表1

表1：酶液S 5次测量的实验结及统计结果

从实验结果可以看出，按本发明方法进行商品酶液活力测定，5次测量结果非常接近，其相对标准差为1.43%，说明该方法测定糖化酶活力平行性好，实验结果稳定。

实验例1

1）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl和0.05M的pH4.6醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于40℃温水浴中预热10min；在B管（反应管）中加入适当稀释的商品酶液E₁(山东淄博国奥集团公司)40μl；立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向2个管中加1MNaOH20μl, 混均后，同时将2个管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管（对照管）中分别补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

2）另取两支EP管，分别加入100μl去离子水，吸取上述反应液及对照液各50μl，分别加入到2只EP管内，并加入200μlDNS溶液，沸水浴准确反应5min取出，放入冰水浴中2min，从每只反应管内取出20μl，加入到96孔板内，再加入250μl去离子水，用枪头吹打几次，混合均匀后用酶标仪在540nm处测定OD值，根据标准曲线计算其还原糖含量；

3）葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。

4）糖化酶活力计算公式：

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

同时通过国标法对商品酶液E₁进行酶活力测定，其比较结果见表2。

实验例2

1）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl和0.05M的pH4.6醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于40℃温水浴中预热10min；在B管（反应管）中加入适当稀释的商品酶液E₂ (山东淄博国奥集团公司)40μl；立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向2个管中加1MNaOH20μl, 混均后，同时将2个管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管（对照管）中分别补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

3）葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。

4）糖化酶活力计算公式：

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

同时通过国标法对商品酶液E₂进行酶活力测定，其比较结果如见表2。

实验例3

1）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl和0.05M的pH4.6醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于40℃温水浴中预热10min；在B管（反应管）中加入适当稀释的商品酶液E₃ (山东淄博国奥集团公司)40μl；立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向2个管中加1M的NaOH 20μl, 混均后，同时将2个管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管（对照管）中分别补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

3）葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。

4）糖化酶活力计算公式：

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

同时通过国标法对商品酶液E₃进行酶活力测定，其比较结果如见表2。

实验例4

1）取A、B两支EP管，分别加入2%可溶性淀粉溶液500μl，和0.05M, pH4.6的醋酸缓冲液100μl，漩涡混合器混均，于40℃温水浴中预热5min；在B管（反应管）中加入适当稀释的商品酶液E₄ (山东淄博国奥集团公司)40μl；立即计时，混均；在此温度下准确反应30min后，立即向2个管中加1MNaOH20μl, 混均后，同时将2个管取出，迅速放入冰水浴中，冷却，并于A管（对照管）中分别补加热变性的酶液（将酶液沸水浴5min）40μl，作为空白对照；

3）葡萄糖标准曲线的制备参照实施例1。

4）糖化酶活力计算公式：

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

同时通过国标法对商品酶液E₄进行酶活力测定，其比较结果如见表2。

表2：利用本发明测定不同商品糖化酶与国标法测定结果比较。

样品名称	国标法测定酶活（U/mL）	本发明测定酶活力（U/mL）	误差（%）
				实验例1	148000	146052	1.3
实验例2	150000	153843	2.5
				实验例3	141000	147859	1.9
实验例4	201430	205516	2.0

由表2可以看出，通过国标法测定的商品酶活力与本发明测定的商品酶活力结果非常接近，误差均小于5%。说明该方法与滴定法测定糖化酶活力精度相差不大，但本发明实验程序简单，实验时间短，易于应用在糖化酶生产企业的在线检测及糖化酶菌株的筛选。

Claims

1.一种快速微量测定糖化酶活力的方法，包括以下步骤：

1）96孔板内葡萄糖标准曲线的制备

再根据下列公式计算糖化酶活力；

糖化酶活力（U/mL）=(B-A)*2*16.5*N

式中，

B为总还原糖含量；

A为对照管中还原糖含量；

B-A为酶反应生成还原糖含量；

2为反应30min，换算成1h酶活力系数；

16.5为换算成1mL的反应体系；

N为稀释倍数。