CN110018158A - 一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，本发明使用DNS还原显色的方法检测橘青霉发酵液中还原糖的含量，本发明在DNS比色法的基础上，加入碘液指示剂，依据蓝色消失判断淀粉被淀粉酶完全分解，避免了传统滴定终点颜色判断失误的发生，进一步提高了检测结果的准确性。同时本发明还确定了橘青霉发酵液中淀粉酶的最佳酶解温度和最适DNS溶液添加量的选择，有力的确保工业化测定数值的准确性和测定方法应用的可行性，本发明检测淀粉酶活力的方法测定线性范围广，重复性好，适合工业和临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检验测定技术领域，具体涉及一种橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法。
背景技术
淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一种酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、还原糖等1,4—葡聚糖，是水解1,4—糖苷键的酶，根据淀粉酶的来源可分为植物淀粉酶、动物淀粉酶和微生物淀粉酶。
淀粉酶广泛分布于动物的内脏、植物茎芽及微生物中。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，可以无差别地切断1,4—糖苷键。因此，其特征是引起底物溶液粘度下降和碘蓝颜色的消失，最终产物以麦芽糖和葡萄糖等还原糖为主，还生成少量的极限糊精。
据报道细菌、牛乳、霉菌中存在淀粉酶。微生物中的淀粉酶与植物中的淀粉酶的不同点在于可以将可溶性淀粉没有分支的直链淀粉的底物完全分解成麦芽糖，而植物淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断葡聚糖链。在作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至1,6—键的前面反应就停止了，因此会生成分子量比较大的极限糊精。
DNS水杨酸比色法是常见的测植物中还原糖的方法，但是使用DNS水杨酸比色法检测微生物淀粉酶，还未见报道，同时应用在DNS水杨酸比色的基础上加入碘显色指示结合的方法测样品还原糖可以精确表达淀粉酶活力，DNS比色-碘指示结合的方法应用于微生物工业生产尚属首次。
现在已有的检测淀粉酶活力的方法主要包括：黏度测定法、比浊法、糖化法、淀粉一碘比色法、酶速率法与染料释放法等。其中，黏度测定法和比浊法由于影响因素较多，缺乏特异性和灵敏度，已被淘汰。糖化法虽然可以直接测定酶活性，但是操作复杂。目前应用较为广泛的是碘量法、酶速率法和染料释放法。其中，淀粉一碘法因具有成本低、检测仪器便宜、试剂稳定、操作简便、结果可靠，所以应用范围最广，但是碘容易分解气化的缺点一直没有解决。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取质量分数为1％的淀粉悬浮液1.0ml加入到25ml定量瓶中，添加pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，55℃预热10min；
(2)取1ml待测橘青霉淀粉酶于试管中，于55℃水浴中预热10min；
(3)将步骤(1)预热的淀粉缓冲液与步骤(2)预热的橘青霉发酵液淀粉酶液混合反应，反应55℃反应30min后，加入碘液指示剂，直至蓝色消失，加入2.5ml DNS显色试剂，在100℃沸水浴中反应10min后，加入1.0ml 4％NaOH溶液终止反应；
(4)迅速冷却至室温，取适量反应液定容后，使用紫外分光光度读出520nm处吸光度的数值；
(5)设置空白对照：在步骤(1)中不加所述的橘青霉发酵液，只加入同体积的去离子水，按下式计算橘青霉发酵液淀粉酶的活力：
每1ml橘青霉发酵液中淀粉酶活力U＝K*N*(A—B)/W*(X÷60)；
式中：
A为反应样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
B为空白样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
U为橘青霉发酵液淀粉酶活性，u/ml；
W为橘青霉发酵液样品取样量，ml；
K为还原糖标准曲线斜率；
X为酶解反应时间X min；
60为1小时60min；
N为稀释倍数，N＝稀释液体积V/25。
其中，所述DNS显色试剂的配制方法如下：
将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有192g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中一周后使用。
其中，所述葡萄糖标准曲线制作方法如下：
取多支定量管编号，分别加入葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液；混合均匀后，在沸水浴中加热10min，取出，用冷水迅速冷却至室温，定容、摇匀、静置，使用紫外分光光度计测出520nm吸光度数值；以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出葡萄糖标准曲线。
其中，所述葡萄糖标准液为1mg/mL。
其中，所述pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制方法如下：
称取柠檬酸20.00g，溶解后定容至1000mL为A液；称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL为B液；取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
其中，步骤(1)中，所述淀粉悬浮液的配置方法如下：
取经105℃干燥4小时的可溶性淀粉1.0g，加水20ml，搅匀后，边搅拌边添加5mol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入1mol/L盐酸使溶液pH值为5.5，加水稀释至100ml。
DNS水杨酸比色法测定淀粉酶活力的基本原理是：淀粉在淀粉酶的作用下生成葡萄糖等还原糖，而淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，将黄色的3,5-二硝基水杨酸变成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。用此方法的酶活力定义：在55℃、pH 5.6条件下，每小时从1％的可溶性淀粉溶液中释放出1mg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位。
有益效果：
(1)本发明首次使用DNS比色-碘蓝指示结合的方法用于检测橘青霉发酵液中的淀粉酶，该实验方案和技术路线具有创新性；
(2)本发明首次将淀粉酶的检测领域扩展到微生物领域，国内首次公开报道应用于工业生产检测，方法简易，容易操作，易于生产应用；
(3)本发明以3,5-二硝基水杨酸还原显色变为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸代替传统的淀粉-碘滴定检测淀粉酶活力，克服了淀粉-碘滴定法滴定终点颜色判断困难的缺点，使实验结果更准确；
(4)本发明以碘液作为指示液，在酶解淀粉反应中加入碘液，碘液与可溶性淀粉结合形成蓝色复合物，当淀粉分解完全后，蓝色消失，准确判断反应终点，进一步提高了检测结果的准确性；
(5)本发明提供了一种测定橘青霉发酵液中淀粉酶最佳酶解温度的方法，给出了最佳酶解温度，此方法可以真实反映微生物样品中淀粉酶的活力，保证了检测结果的准确性。使用DNS比色法检测橘青霉发酵液中淀粉酶活力还未见报道，同时使用DNS比色法-碘蓝指示的方法检测淀粉酶活力，检测结果更加准确，使用该技术路线检测淀粉酶活力具有开创性，因此本发明的检测方法和技术路线具有很高价值的创新性。
附图说明
图1葡萄糖标准液。
图2 DNS溶液添加量对橘青霉发酵液中淀粉酶的活力影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限实施例表示的范围，也可应用于其他微生物样品的检测。
实施例1：葡萄糖标准曲线制作。
取6支25mL定量管编号，按表分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖测试结果
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热10min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，摇匀。调分光光度计波长至520nm，用0号管调零点，测出吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，做出标准曲线，如图1所示。
实施例2：橘青霉发酵液中淀粉酶活力的检测方法。
(1)缓冲液配制：称取柠檬酸20.00g，溶解后定容至1000mL为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH 5.6之缓冲液。
(2)底物处理：取1％的淀粉悬浮液1.0ml加入到25ml定量瓶中，添加pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，55℃预热10min，精确计时。
(3)样品处理：取1ml酶液于各只试管中，于55℃水浴中预热10min，精确计时。
(4)样品与底物反应：将预热酶液与预热淀粉缓冲液混合反应，反应55℃反应30min后加入一滴碘液指示剂，直至蓝色消失，加入3.0mlDNS显色试剂，(加入DNS的量足以氧化淀粉完全分解成葡萄糖的量计算)在100℃沸水浴中反应10min后，加入1.0ml 4％NaOH溶液终止反应。
(5)检测溶液的配制：迅速冷却至室温，取适量反应液定容后，使用紫外分光光度读出520nm处吸光度的数值。
(6)空白实验：另取1％的淀粉悬浮液1.0ml加入到25ml定量瓶中，添加pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，55℃预热10min后，加入1ml保温后的去离子水，然后加入3.0mlDNS显色试剂，将定量瓶移至沸水浴中加热10min，加入1.0ml 4％NaOH溶液，作为空白对照。按下式计算橘青霉发酵液中淀粉酶的活力：
U＝K*N*(A—B)/W*(X÷60)
式中：
A为反应样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
B为空白样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
U为橘青霉发酵液中淀粉酶活性，u/ml；
W为橘青霉发酵液样品取样量，ml；
K为还原糖标准曲线斜率；
X为酶解反应时间X min；
60为1小时60min；
N为稀释倍数N＝稀释液体积V/25。
实施例3：橘青霉发酵液中淀粉酶酶解最佳温度选择。
实施过程：取1ml橘青霉发酵液中淀粉酶酶液于试管中，40℃保温一段时间，加入适量1％水溶性淀粉悬浊液，在30～90℃下水浴加热，酶解反应30min加入一滴碘指示剂，直至蓝色消失，加入3.0ml显色试剂DNS溶液，沸水浴反应10min，加入1.0ml 4％NaOH溶液终止反应，迅速冷却至室温，使用紫外分光光度520nm处读取吸光度的数值。
表2不同温度下橘青霉发酵液中淀粉酶的活力
| 酶解温度℃ | 40 | 50 | 55 | 60 | 70 |
| 酶活力mg/h/ml | 1.711 | 2.541 | 3.627 | 3.021 | 0.981 |
表3不同温度下橘青霉发酵液中淀粉酶的活力稳定性
表2和表3中结果显示，利用本发明检测橘青霉发酵液中淀粉酶活力的方法，在55℃酶解温度下，酶活力最高且稳定，温度过低会抑制酶活，温度过高有会使酶失活，因此在55℃酶活力最佳状态下，检测酶活力的方法准确性最高。
实施例4：橘青霉发酵液中淀粉酶酶解最适DNS溶液添加量的选择。
实施过程：取适量橘青霉发酵液于试管中，55℃保温10min，加入适量1％水溶性淀粉悬浊液，在55下水浴加热，酶解反应30min后滴加一滴碘指示剂，至蓝色消失，加入3.0ml的显色试剂DNS溶液，沸水浴反应10min，加入1.0ml 4％的NaOH溶液终止反应，迅速冷却至室温，使用紫外分光光度520nm处读取吸光度的数值。图2为不同DNS溶液添加量下橘青霉发酵液中淀粉酶的活力。
图2中的结果表明，DNS溶液添加量低于2.5ml时，随着添加量增加，酶活力上升，这说明添加的3,5-二硝基水杨酸量不足以完全氧化橘青霉酶液中的还原糖，当DNS溶液添加量为2.5～3.5ml时，酶活力稳定在3.66mg/h/ml，这表明酶液中的还原糖已经被完全氧化，继续增加DNS溶液酶活也没有明显变化，当DNS溶液添加量增加到5.0ml时，酶活数值略微增加，这是由于随着多余DNS溶液的增多，样品颜色加深，使得紫外检测结果偏大，干扰检测的精度，所以最适DNS溶液添加量应为2.5～3.0ml。
表4重复性检测结果
根据表4中的测定值，橘青霉发酵液中淀粉酶活力基本稳定在3.620mg/h/ml左右，这说明本发明利用DNS比色-碘指示结合的方法检测橘青霉发酵液中淀粉酶活力的方法稳定性和重复性好。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取质量分数为1％的淀粉悬浮液1.0ml加入到25ml定量瓶中，添加pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，55℃预热10min；
(2)取1ml待测橘青霉发酵液于试管中，于55℃水浴中预热10min；
(3)将步骤(1)预热的淀粉缓冲液与步骤(2)预热的淀粉酶液混合反应，反应55℃反应30min后，加入碘液指示剂，直至蓝色消失，加入2.5～3ml DNS显色试剂，在100℃沸水浴中反应10min后，加入1.0ml4％NaOH溶液终止反应；
(4)迅速冷却至室温，取适量反应液定容后，使用紫外分光光度测出520nm处吸光度的数值；
(5)设置空白对照：操作同步骤(1)～(4)，只是在步骤(2)中不加所述的橘青霉酶液，以去离子水代替；
按下式计算橘青霉发酵液中淀粉酶的活力：
每1ml橘青霉发酵液含淀粉酶活力U＝K*N*(A—B)/W*(X÷60)；
式中：
A为反应样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
B为空白样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；
U为橘青霉发酵液淀粉酶活性，u/ml；
W为橘青霉发酵液样品取样量，ml；
K为还原糖标准曲线斜率；
X为酶解反应时间X min；
60为1小时60min；
N为稀释倍数，N＝稀释液体积V/25。
2.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述DNS显色试剂的配制方法如下：
将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有192g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中一周后使用。
3.根据权利要求1所述橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准曲线制作方法如下：
取多支定量管编号，分别加入葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液；混合均匀后，在沸水浴中加热10min，取出，用冷水迅速冷却至室温，定容、摇匀、静置，使用紫外分光光度计测出520nm吸光度数值；以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出葡萄糖标准曲线。
4.根据权利要求3所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准液为1mg/mL。
5.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制方法如下：
称取柠檬酸20.00g，溶解后定容至1000mL为A液；称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL为B液；取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
6.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述淀粉悬浮液的配置方法如下：
取经105℃干燥4小时的可溶性淀粉1.0g，加水20ml，搅匀后，边搅拌边添加5mol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入1mol/L盐酸使溶液pH值为5.5，加水稀释至100ml。
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