CN109187389A - 一种海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒 - Google Patents

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张庆芳
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Abstract

本发明属于生物技术领域。涉及一种海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒，所述试剂盒由海洋低温尿酸氧化酶(20～40U/ml)、4‑氨基安替比林(20～40mM)、苯酚(1～2％)、过氧化物酶(10～20U/ml)、标准尿酸溶液(200～300μmol/L)、硼酸钠缓冲液(pH 8.5 0.5M)组成；检测方法为：将待测尿酸样品溶于0.6ml的硼酸钠缓冲液中，将0.1ml海洋低温尿酸氧化酶、0.15ml 4‑氨基安替比林，0.1ml苯酚，0.05ml过氧化物酶依次加入到25mL比色管中，20℃室温环境中孵育10min。然后通过加入1.0ml乙醇停止反应，去离子水定容至20mL。通过分光光度计读取540nm处的吸光度值，依据公式得到尿酸浓度。本发明试剂盒在20℃室温环境中及高盐环境下均可使用，操作简单，检测快速，10min之内便可检测尿酸浓度，并且检测尿酸浓度准确性高，稳定性好。

Description

一种海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及尿酸浓度检测方法，具体是一种海洋低温尿酸氧化酶酶测定尿酸的检测试剂盒。
背景技术
人体内嘌呤代谢的最终产物是生物分子尿酸(2，4，6三羟基嘌呤，简称UA)，健康成年人正常尿酸的水平为血清中0.15～0.4mmoL/L，尿中250～750mg/L(149～446mmol/(L.24h)。尿酸分子式是C5H14N4O3，分子量MW为16811，不溶于水，也难溶于酸。在生物体内以盐的形式存在，因而溶解度较高。在尿酸酶的作用下，可以被氧化成尿素囊。尿酸异常时常提醒为痛风、肾病、高尿酸血等疾病。因此，体内尿酸浓度的异常可作为这些疾病的早期诊断的重要指标。如今尿酸的检测和分析在疾病的临床诊断和治疗方面的应用日益广泛。
临床上建立了许多尿酸的检测方法，如酶法、尿酸生物传感器、磷钨酸法、色谱分析法等，磷钨酸法中钨磷酸易于空气中氧气反应，特异性与灵敏度较低；色谱分析法结果准确，分离效果好，但是操作比较复杂，成本昂贵，对临床的意义不大；偶联过氧化物酶比色法灵敏度高、快速、安全、易实现自动化，适应临床的需要，目前国内使用的基本全部为此方法，但此方法使用环境局限，耗时较长，并且受血清本底干扰，影响结果的准确性。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种海洋低温酶测定尿酸的检测试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒，所述试剂盒由海洋低温尿酸氧化酶、4-氨基安替比林、苯酚、过氧化物酶、硼酸钠缓冲液组成。
上述低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒，海洋低温尿酸氧化酶20～40U/ml，4-氨基安替比林20～40mM，苯酚1～2％，过氧化物酶10～20U/ml，硼酸钠缓冲液0.5M pH 8.5组成。
上述低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒，所述低温尿酸氧化酶是以深海海泥、海水为样品，通过透明圈法对菌株进行初筛，其初筛培养基中添加大量K2HPO4以提高酶活，结合酶偶联分光光度法测酶活，进行复筛，最终得到海洋低温尿酸氧化酶高产菌株，酶活达到42.5U/mL，低温尿酸氧化酶来源于苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)。
应用上述低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒检测尿酸浓度的方法包括以下步骤：
(1)将测定的尿酸样品溶于装有0.6ml的硼酸钠缓冲液的25mL比色管中，随后加入0.1ml海洋低温尿酸氧化酶，使其反应30s；使反应生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢；
(2)将0.15ml 4-氨基安替比林，0.1ml苯酚，0.05ml过氧化物酶依次加入步骤(1)的反应液中；
(3)将步骤(2)反应液混匀之后，20℃室温环境中孵育10min，然后通过加入1.0ml无水乙醇停止反应，去离子水定容至20mL；
(4)空白对照管：不加尿酸样品，其他同于上述操作步骤；
(5)标准管：样品为标准尿酸溶液，浓度为已知200～300μmol/L；
(6)全程在540nm下测量吸光度值，依据公式(1)即可得到尿酸浓度(mol/ml)；
其中，δA样品是样品吸光度值变化量；
δA空白空白对照管吸光度值变化量；
δA标准标准管吸光度值变化量；
标准浓度为标准液的浓度值。
本发明尿酸浓度测定方法原理如下：
(1)
(2)
本发明所用的尿酸氧化酶一定浓度的硼酸钠缓冲液的情况下，尿酸酶活性为40U/ml，根据上述反应式可知，尿酸氧化酶促反应速率与样本中尿酸的浓度成正比，在波长540nm处，可检测出反应体系的吸光度变化，因此可测出已知标准尿酸在已知酶活性的尿酸氧化酶催化下的酶促反应速率，从而计算出酶活并总结出以下公式：
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明用于测定血清中尿酸浓度方法，所用试剂盒配置简单，原料来源广泛、成本低，环保安全，不需要使用有毒的有机溶剂；不同于市场上相关的中高温试剂盒，本发明试剂盒在20℃室温环境中及高盐环境下均可使用，操作简单，检测快速，10min之内便可检测尿酸浓度，并且检测尿酸浓度准确性高，稳定性好。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
海洋低温尿酸氧化酶尿酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，海洋低温尿酸氧化酶(来源于苛求芽孢杆菌Bacillus fastidiosus)是以深海海泥、海水为样品，通过透明圈法对菌株进行初筛，结合酶偶联分光光度法测酶活，进行复筛，得到海洋低温尿酸氧化酶高产菌株；然后采用(NH4)2SO4盐析、透析、超滤、凝胶过滤层析(Sephadex G-100)等方法对海洋低温尿酸氧化酶高产菌株所产尿酸氧化酶进行分离纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示纯化后的蛋白为单一条带，该酶分子量约为33.1kDa；经过该菌株发酵生产得到的尿酸氧化酶酶活达到42.5U/mL。
使用上述试剂盒测定尿酸浓度，具体如下：
(1)将测定的尿酸样品溶于装有0.6ml的硼酸钠缓冲液的25mL比色管中，随后加入0.1ml海洋低温尿酸氧化酶，使其反应30s；是反应生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢；
(2)将.15ml 4-氨基安替比林，0.1ml苯酚，0.05ml过氧化物酶依次加入步骤(1)的反应液中；
(3)将步骤(2)反应液混匀之后，20℃室温环境中孵育10min。然后通过加入1.0ml无水乙醇停止反应，去离子水定容至20mL；
(4)空白对照管：不加尿酸样品，其他同于上述操作步骤；
(5)标准管：其中样品为标准尿酸溶液，浓度为已知200～300μmol/L。
(6)全程在540nm下测量吸光度值，依据公式(1)即可得到尿酸浓度(mol/ml)；
其中，δA样品是样品吸光度值变化量；
δA空白空白对照管吸光度值变化量；
δA标准标准管吸光度值变化量；
标准浓度为标准液的浓度值。
根据以上测定方法，以市场上购买的醋酸检测试剂盒与本发明试剂盒为检测样本，分别进行稳定性追踪检测，得到自配试剂与对照试剂的高盐样品稳定性、37℃和20℃加速稳定性、长期稳定性试验结果(见表1)。
表1与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表1可以看出本发明以组分浓度为海洋低温尿酸氧化酶20U/ml、4-氨基安替比20mM、苯酚1％、过氧化物酶10U/ml、硼酸钠缓冲液pH 8.5 0.5M组成时，相比于对照组，稳定性较高，灵敏度与准确度都相对较高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的尿酸浓度。
实施例2
海洋低温尿酸氧化酶尿酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，海洋低温尿酸氧化酶同实施例1。
按照实施例1的方法进行检测。分别进行稳定性追踪检测，得到自配试剂与对照试剂的高盐样品稳定性、37℃和20℃加速稳定性、长期稳定性试验结果(见表2)。
表2与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表2可以看出本发明以组分浓度为海洋低温尿酸氧化酶30U/ml、4-氨基安替比30mM、苯酚1.5％、过氧化物酶15U/ml、硼酸钠缓冲液p H 8.5 0.5M组成时，相比于对照组，稳定性较高，灵敏度与准确度都相对较高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的尿酸浓度。
实施例3
海洋低温尿酸氧化酶尿酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，海洋低温尿酸氧化酶同实施例1。
按照实施例1的方法进行检测。分别进行稳定性追踪检测，得到自配试剂与对照试剂的高盐样品稳定性、37℃和20℃加速稳定性、长期稳定性试验结果(见表3)。
表3与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表3可以看出本发明以组分浓度为海洋低温尿酸氧化酶40U/ml、4-氨基安替比40mM、苯酚2％、过氧化物酶20U/ml、硼酸钠缓冲液pH 8.5 0.5M组成时，相比于对照组，稳定性较高，灵敏度与准确度都相对较高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的尿酸浓度。
相比于对照组，相比于对照组，稳定性最高，灵敏度与准确度也最高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的尿酸浓度。
经过试验验证，采用本发明检测试剂盒及测定方法，可准确测出尿酸浓度。

Claims (4)

1.一种海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由海洋低温尿酸氧化酶、硼酸钠缓冲液、4-氨基安替比林、苯酚、过氧化物酶组成。
2.如权利要求1所述的海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒，其特征在于，海洋低温尿酸氧化酶20～40U/ml、4-氨基安替比林20～40mM、苯酚1～2％、过氧化物酶10～20U/ml、硼酸钠缓冲液0.5M pH 8.5组成。
3.如权利要求1或2所述的海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒，其特征在于，所述海洋低温尿酸氧化酶来源于苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)。
4.应用权利要求1所述的海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸检测试剂盒检测尿酸浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将测定的尿酸样品溶于装有0.6ml的硼酸钠缓冲液的25mL比色管中，随后加入0.1ml海洋低温尿酸氧化酶，使其反应30s；使反应生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢；
(2)将0.15ml 4-氨基安替比林，0.1ml苯酚，0.05ml过氧化物酶依次加入步骤(1)的反应液中；
(3)将步骤(2)反应液混匀之后，20℃室温环境中孵育10min，然后通过加入1.0ml无水乙醇停止反应，去离子水定容至20mL；
(4)空白对照管：不加尿酸样品，其他同于上述操作步骤；
(5)标准管：其中样品为标准尿酸溶液，浓度为已知200～300μmol/L。
(6)全程在540nm下测量吸光度值，依据公式(1)即可得到尿酸浓度(mol/ml)；
其中，δA样品是样品吸光度值变化量；
δA空白空白对照管吸光度值变化量；
δA标准标准管吸光度值变化量；
标准浓度为标准液的浓度值。
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