JP2009219367A - ウリカーゼ活性を有する蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ウリカーゼ活性を有する蛋白質の低温反応性の向上および熱安定性を、蛋白質工学的手法により両立させる方法、並びに該方法によって作成した低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ改変体。
【選択図】 なし
Description
(1)30℃における酵素活性が55℃における酵素活性の1.2倍以上であり、下記の理化学的性質を有することを特徴とする、低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
熱安定性:60℃,10分間処理で80%以上の酵素活性が残存
至適pH:pH7〜8で50%以上
(2)ウリカーゼ活性を有する蛋白質がウリカーゼの変異体であり、野生型の30℃における酵素活性が55℃における酵素活性の1/5以下であることを特徴とする、(1)記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(3)30℃における比活性が野生型に比して1.5倍以上であり、更に25℃における比活性が野生型に比して2.0倍以上の変異体であることを特徴とする、(2)記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(4)野生型に比して熱安定性が実質的に同等以上の変異体であることを特徴とする、(2)または(3)記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(5)配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が50%以上の相同性を有する変異体であることを特徴とする、(1)〜(4)いずれか1記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(6)配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が80%以上の相同性を有する変異体であることを特徴とする、(1)〜(4)いずれか1記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(7)配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の279位またはそれと同等の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、(1)〜(4)いずれか1記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(8)配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の279位またはそれと同等の位置のアミノ酸がロイシンに置換されていることを特徴とする、(1)〜(4)いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(9)配列表の配列番号3、4または5に記載されるアミノ酸配列を有する変異体であることを特徴とする、(1)〜(4)いずれか1記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
(10)(1)〜(9)のいずれか1記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質を含む尿酸測定キット。
(11)(1)〜(9)のいずれか1記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質を含む尿酸センサー。
(12)(1)〜(9)のいずれか1記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
(13)(12)に記載の遺伝子を含むベクター。
(14)(13)に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
(15)(14)に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、ウリカーゼ活性を有する蛋白質の製造法。
ウリカーゼ活性は、尿酸を基質とし、ウリカーゼ反応による過酸化水素の発生を吸光度の変化で測定した。終濃度0.30mMの尿酸、10U/mlの西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、0.02%(W/V)の4−アミノアンチピリン、0.02%(W/V)のADPS、0.001%(W/V)のTriton X−100,0.1mMのEDTAを含む50mMホウ酸緩衝液(pH8.0)、および酵素希釈液(0.001%(W/V)のTriton X−100,0.1mMのEDTAを含む50mMホウ酸緩衝液(pH8.0))で適宜希釈したウリカーゼ溶液から成る反応混液3mlにて、反応を開始する。37℃で反応混液の546nmの吸光度を10秒毎に〜5分間測定し、反応の進行に伴う1分間当りの吸光度変化を計測する(ΔODtest)。盲検は、酵素溶液を含まない反応混液にて上記同様に操作を行って吸光度を測定した(ΔODblank)。得られた吸光度変化およびキノンイミン色素のミリモル吸光係数より過酸化水素の生成速度を計算し、ウリカーゼの酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの尿酸を酸化する酵素量を1単位(U)とする。
Bacillus sp.TB−90株由来のウリカーゼ遺伝子を含む発現プラスミドpKU1(特許第1966484号公報)と、配列表の配列番号3記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績製)を使用して、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号2に記載のアミノ酸配列の279番目のトリプトファンがロイシンに置換されたウリカーゼ改変体(配列番号3に相当)をコードする組換えプラスミド(pUOD−W279L)、配列番号2に記載のアミノ酸配列の279番目のトリプトファンがロイシンに287番目のプロリンがグリシンにそれぞれ置換されたウリカーゼ改変体(配列番号4に相当)をコードする組換えプラスミド(pUOD−W279L+P287G)、配列番号2に記載のアミノ酸配列の279番目のトリプトファンがロイシンに287番目のプロリンがグリシンに305番目のシステインがセリンにそれぞれ置換されたウリカーゼ改変体(配列番号5に相当)をコードする組換えプラスミド(pUOD−W279L+P287G+C305S)、をそれぞれ取得した。
Claims (15)
- 30℃における酵素活性が55℃における酵素活性の1.2倍以上であり、下記の理化学的性質を有することを特徴とする、低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
熱安定性:60℃,10分間処理で80%以上の酵素活性が残存
至適pH:pH7〜8で50%以上 - ウリカーゼ活性を有する蛋白質がウリカーゼの変異体であり、野生型の30℃における酵素活性が55℃における酵素活性の1/5以下であることを特徴とする、請求項1記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 30℃における比活性が野生型に比して1.5倍以上であり、更に25℃における比活性が野生型に比して2.0倍以上の変異体であることを特徴とする、請求項2記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 野生型に比して熱安定性が実質的に同等以上の変異体であることを特徴とする、請求項2または3記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が50%以上の相同性を有する変異体であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が80%以上の相同性を有する変異体であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の279位またはそれと同等の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列の279位またはそれと同等の位置のアミノ酸がロイシンに置換されていることを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 配列表の配列番号3、4または5に記載されるアミノ酸配列を有する変異体であることを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の低温反応性が高く且つ熱安定なウリカーゼ活性を有する蛋白質。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質を含む尿酸測定キット。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質を含む尿酸センサー。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のウリカーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
- 請求項12に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項13に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項14に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、ウリカーゼ活性を有する蛋白質の製造法。
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