CN112410313A

CN112410313A - 一种高热稳定性尿酸酶及其应用

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Publication number: CN112410313A
Application number: CN201910770862.5A
Authority: CN
Inventors: 徐华强; 石毅; 蒋轶
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明提供了一种高热稳定性尿酸酶及其应用。具体地，本发明提供了一种突变的尿酸氧化酶，其在第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、和/或第246位丝氨酸(S)引入突变以形成二硫键。本发明的突变的尿酸氧化酶的酶活性不受影响，热稳定性显著提高，并且能够抵抗蛋白酶K的降解，为获得更稳定的痛风治疗药物提供了重要的药物前体。

Description

一种高热稳定性尿酸酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种基于蛋白质晶体结构设计的高热稳定性尿酸酶及其应用。

背景技术

高尿酸血症和痛风是常见的代谢疾病，我国痛风的整体患病率在1％-5％左右，国内痛风患者人数至少1700万人，高尿酸血症整体患病率为13.2-21％。随着人们饮食结构的改变，更多地摄入高蛋白高嘌呤类化合物的食物，高尿酸血症和痛风的发病率越来越高，严重危害人民身心健康，人们对治疗高尿酸血症和痛风新药的需求日益剧增。痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱，尿酸含量过高引起的。正常情况下，体内需要被代谢的嘌呤都会在转化为黄嘌呤或者次黄嘌呤后，在黄嘌呤氧化酶作用下生成尿酸。人体内缺乏继续分解尿酸的能力，一般会通过肾脏排泄尿酸。在嘌呤摄入过多或肾脏功能受损的情况下，体内的尿酸累积会导致高尿酸血症。过多的尿酸会在体内形成针状晶体，被免疫系统识别，释放白细胞介素-1和其它细胞因子，起始免疫反应，促发急性痛风。

痛风的主要治疗方式是通过药物降低血液中的尿酸浓度。一般推荐将血尿酸浓度控制在6mg/dL以下，该浓度被称为血液尿酸(serum uric acid，SUA)的亚饱和浓度。血液中的尿酸浓度长期维持在亚饱和浓度以下可以减少体内的尿酸结晶，甚至使痛风石缩小。常规的治疗药物包括秋水仙碱、非甾体类抗炎药、促肾上腺皮质激素，以及黄嘌呤氧化酶抑制剂和利尿剂的联合使用。但部分患者由于对药物不耐受或因为药物禁忌症不适用，无法通过上述药物降低体内的血尿酸浓度。

尿酸氧化酶(EC 1.7.3.3)是一种由四个单体组成的四聚体酶，每个单体可以结合一个尿酸分子。人和猿类在进化过程中发生了突变，编码尿酸氧化酶的基因不再起作用。在除了人和猿类以外的哺乳动物中，尿酸会在尿酸氧化酶的作用下，被继续分解生成水溶性更好的尿囊素，并可继续被分解排泄。Pegloticase是一种聚乙二醇修饰的尿酸酶，于2010年在美国批准上市，可替代传统口服药物，以静脉注射的方式治疗痛风。给药后，血尿酸盐浓度可降至尿酸在血液中的溶解度(6.8mg/dL)以下，有利于尿酸盐结晶溶解，临床上可改善痛风的症状。但这种药物最大的副作用在于注射过程中的过敏反应。Rasburicase(SR29142)是一种在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的尿酸酶。Rasburicase可在用常规办法无法治疗的严重痛风病人中取得明显疗效，缩小痛风石，提高病人手指的灵活度。但是该类蛋白药物在注射过程的过敏反应仍是其应用上的最大挑战。

与小分子化学药物相比，蛋白酶类药物在制备、包装、运送和临床使用上都更需要保证稳定性。稳定的蛋白酶类药物可以增加体内药物的有效浓度，使药物发挥最大的效能，并在一定程度上降低免疫原性，减少免疫反应的发生。

传统提高蛋白质热稳定性的方法不考虑蛋白质结构与功能之间的关系，构建突变文库，筛选热稳定性较好的突变体，费时费力。于是，人们通过同源比对、蛋白质表面电荷优化、二硫键设计、脯氨酸效应设计、基因蛋白质解折叠设计、温度因子设计等多种方法，希望推进理性设计提高蛋白质热稳定性。

引入二硫键是提高蛋白质的稳定性是一种较常用的方法。Henri等人成功将亲和素的Tm值提高到98.6℃。通过突变的方法去除野生型亲和素中原有的二硫键，可以降低野生型蛋白的Tm值，以上研究表明二硫键与四聚体蛋白的稳定性关系密切。Mi-Young Jeong等人用Disulfide by DesignTM做初步的设计，并经过序列比对最终选择嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus No.236)种属的木聚糖酶第100位的丝氨酸和第150位的天冬酰胺，突变为半胱氨酸。该突变成功引入二硫键并提高热稳定性大约5℃，而突变体蛋白酶的催化能力和其他功能几乎不受影响。Pascal Pecher等则认为二硫键可以显著提高蛋白质的稳定性是由于未完全折叠状态的蛋白质熵不稳定，导致蛋白质构象更容易向解聚状态逃逸。但是引入额外的二硫键对蛋白质稳定性的影响是很不一致的。他们通过建模，选取核糖核酸酶A起始折叠和解折叠的重要区域引入6组突变，结果只有两个突变体在稳定性上有所提高。

二硫键可以稳定蛋白质的天然构像；降低非折叠构想的熵，使其更容易被折叠；也可以限制能量上有利的构象变化增加折叠蛋白的稳定性；可以保护蛋白酶在胞外环境中不被氧化或降解，也可以维持蛋白的一致性并增长半衰期。但同时我们也应该注意到，通过引入二硫键的方法提高蛋白稳定性可能对蛋白酶某些区域的灵活度降低。一旦这些区域位于蛋白酶的活性位点，就很可能影响蛋白酶的功能或降低蛋白酶活性。在一定范围内，二硫键的数目和蛋白酶的稳定性是正相关的。二硫键数目越多，蛋白酶热稳定性越高。当增加二硫键数目，破坏蛋白酶的正常功能，就达到了这个极限。

综上，本领域技术人员致力于开发具有高热稳定性的尿酸酶，以降低生产和应用成本，保障使用安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高热稳定性尿酸酶及其应用。

本发明第一方面，提供了一种突变的尿酸氧化酶亚基，所述突变的尿酸氧化酶亚基在对应于SEQ ID NO:1所示序列的选自下组的一个或多个位点引入突变以形成二硫键：

第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、第246位丝氨酸(S)、或其组合。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶亚基第12位赖氨酸(K)和第286位谷氨酸(E)突变为半胱氨酸(C)，较佳地，所述亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

SEQ ID NO:2(K12C-E286C突变)

HTATAETSTGTC(12)VVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIK(244)MS(246)LPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQRC(286)GSRADHPIWSNIAGFC*

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶亚基第296位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)，较佳地，所述突变的尿酸氧化酶亚基还在第302位半胱氨酸(C)引入突变，更佳地，第302位半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶亚基的第244位赖氨酸(K)或第246位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)，较佳地，所述突变的尿酸氧化酶亚基的第302位半胱氨酸(C)未突变。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶亚基第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)和第244位赖氨酸(K)突变为半胱氨酸(C),较佳地，所述亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.:3所示。

SEQ ID NO:3(K12C-E286C-K244C突变)

HTATAETSTGTC(12)VVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIC(244)MSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQRC(286)GSRADHPIWSNIAGFC*

在另一优选例中，所述的突变是相对于野生型尿酸氧化酶亚基的突变。

在另一优选例中，野生型尿酸氧化酶亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

SEQ ID NO:1(野生型序列)

HTATAETSTGTK(12)VVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQRE(286)GSRADHPIWSNIAGFC*

在另一优选例中，在突变的尿酸氧化酶亚基或野生型尿酸氧化酶亚基的N端还包含SEQ ID NO.:4所示的序列(MASMTGGQQMGRGSEFMHHHHHHH)，较佳地，所述序列为引导序列。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶亚基除第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、第246位丝氨酸(S)外，其余氨基酸与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化尿酸分解的活性。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶亚基与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

本发明第二方面，提供了一种突变的尿酸氧化酶，所述突变的尿酸氧化酶包含1个或多个人工引入的链间二硫键，

并且，所述突变的尿酸氧化酶的酶活力为野生型尿酸氧化酶酶活力的80-150％，较佳地为90-120％。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个人工引入的链间二硫键。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶在对应于SEQ ID NO:1所示序列的选自下组的一个或多个位点引入突变以形成二硫键：

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶包含2个、3个或4个本发明第一方面所述的突变的尿酸氧化酶亚基。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶为同二聚体、同四聚体。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶为包括A链、B链、C链、D链的四聚体(由4个本发明第一方面所述的突变的尿酸氧化酶亚基组成)。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶的A链第12位和D链第286位、D链第12位和A链第286位、B链第12位和C链第286位、C链第12位和B链第286位形成二硫键。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶的A链第296位和D链第296位，B链第296位和C链第296位形成二硫键。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶的A链第244位和D链第302位、D链第244位和A链第302位、B链第244位和C链第302位、C链第244位和B链第302位形成二硫键。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶的A链第246位和D链第302位、D链第246位和A链第302位、B链第246位和C链第302位、C链第246位和B链第302位形成二硫键。

在另一优选例中，所述尿酸氧化酶来自于球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶具有催化尿酸分解的活性。

在另一优选例中，所述突变的尿酸氧化酶具有选自下组的一个或多个特征：

(a)与野生型尿酸氧化酶相比，Tm值至少提高了5℃，较佳地至少提高8℃；

(b)与野生型尿酸氧化酶相比，酶活力降到原始酶活力50％时的温度(T1/2)至少提高了5℃，较佳地至少提高10℃；和

(c)与野生型尿酸氧化酶相比，在适合蛋白酶K降解的条件下，酶活力降到原始酶活力50％时的时间至少延长了3min，较佳地至少延长5min；或者，酶活力降到原始酶活力50％时的时间至少延长了50％，较佳地至少延长80％。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶可以是修饰的尿酸氧化酶(如PEG修饰)。

本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变的尿酸氧化酶亚基。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。

本发明第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体或在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、链霉菌、或其组合。

在另一优选例中，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和/或谷氨酸棒杆菌，优选大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞包括毕赤酵母、黑曲霉、和/或链霉菌，优选毕赤酵母。

本发明第六方面，提供了一种本发明第二方面所述的突变的尿酸氧化酶的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述的制剂或药物组合物用于治疗痛风和/或分解尿酸。

在另一优选例中，所述的突变的尿酸氧化酶为药物前体。

本发明第七方面，提供了一种产生本发明第二方面所述突变的尿酸氧化酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达出所述突变的尿酸氧化酶；和

分离所述突变的尿酸氧化酶。

在另一优选例中，所述的方法还包括对表达的尿酸氧化酶进行进一步修饰的步骤。

在另一优选例中，所述的修饰包括乙酰化修饰、羧基化修饰、糖基化修饰、磷酸化修饰、PEG修饰、或其组合。

本发明第七方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第二方面所述的突变的尿酸氧化酶。

在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了基于尿素酶晶体结构设计二硫键提高尿酸酶热稳定性的技术路线。

图2显示了基于尿酸酶晶体结构设计二硫键提高其热稳定性。

图3显示了检测二硫键形成的SDS-PAGE检测结果。

图4显示了二硫键突变体的TSA检测结果。

图5显示K12C-E286C和S296C-S296C突变体中形成的二硫键提高了尿素酶热稳定性。

图6显示K12C-E286C和S296C-S296C突变体的尿素酶耐热性提高。

图7显示了K12C-E286C和S296C-S296C突变体的尿素酶活性。

图8显示了基于尿素酶结构进一步设计的K244C-C302和S246C-C302二硫键。

图9显示了K244C和S246C引入后突变体的SDS-PAGE结果。

图10显示了K244C引入后突变体蛋白TSA检测的结果。

图11显示了K244C引入后提高了尿素酶的耐热性。

图12显示了K12C-E286C和K244C引入后提高了尿素酶对蛋白酶K降解的抵抗。

具体实施方式

本发明人经过实验和筛选，意外地发现，K12C-E286C和S296C-S296C两对二硫键突变能够显著提高尿素酶的热稳定性，且不影响其酶活性。基于新解析的尿素酶结构进一步引入K244C突变，热稳定性进一步提高，这为获得更稳定的痛风治疗药物提供了重要的药物前体。实验结果表明，K12C-E286C突变体可以提高T1/2 13℃左右，S296C-S296C突变体可以提高T1/2 10℃左右。在此基础上完成本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

本发明的尿酸氧化酶

本文所用的术语“尿酸氧化酶”、“尿酸酶”具有相同含义，是一种由四个尿酸氧化酶亚基组成的四聚体酶，每个单体可以结合一个尿酸分子，可以降尿酸分解成水溶性更好的尿囊素。

在具体的实施方式中，本发明提供了突变的尿酸氧化酶，其是通过对球形节杆菌种属(Arthrobacter globiformis)的尿酸氧化酶(AgUOX)的晶体结构进行分析，基于结构设计了17对二硫键并进行筛选，发现K12C-E286C和S296C-S296C突变能够显著提高AgUOX的热稳定性，且不影响其酶活性。为了更深入地理解二硫键引入对AgUOX蛋白热稳定性的影响，发明人解析了K12C-E286C突变AgUOX的晶体结构，通过进一步分析K12C-E286C突变AgUOX的结构，发现K244C和S246C突变有可能与C302形成二硫键，进一步提高AgUOX的热稳定性。实验结果表明，K244C和S246C突变能进一步提高K12C-E286C突变AgUOX的热稳定性。

具体地，发明人基于结构设计并构建了AgUOX的二硫键突变体，其中K12C-E286C和S296C-S296C两对二硫键突变体能够显著提高AgUOX的热稳定性，且不影响其酶活性。基于新解析的尿素酶结构进一步引入K244C突变，热稳定性进一步提高，这为获得更稳定的痛风治疗药物提供了重要的药物前体。本申请所采用的研究策略，即基于结构引入二硫键以稳定蛋白类药物，也将为蛋白质药物的改造优化提供一种新的方法。

本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。例如，本申请实施例中的蛋白即是为了便于纯化在C端带有6his标签的蛋白。

在本发明中，本发明突变的尿酸氧化酶包括除第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、第246位丝氨酸(S)外，其余氨基酸与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。例如，其余氨基酸与SEQ ID NO.:1所示的序列相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

此外，还可以对本发明尿酸氧化酶进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的尿酸氧化酶的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在尿酸氧化酶的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的尿酸氧化酶。这种修饰可以通过将尿酸氧化酶暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的尿酸氧化酶。

术语“编码尿酸氧化酶的多核苷酸”可以是包括编码本发明尿酸氧化酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或尿酸氧化酶的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的尿酸氧化酶的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的尿酸氧化酶和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的突变位点

本发明的突变的尿酸氧化酶在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第12位赖氨酸(K)、第286位谷氨酸(E)、第296位丝氨酸(S)、第302位半胱氨酸(C)、第244位赖氨酸(K)、第246位丝氨酸(S)引入突变。本领域普通技术人员均知道，可在某个蛋白的氨基酸序列中对一些氨基酸残基作出各种突变，例如取代、添加或缺失，但得到的突变体仍能具备原蛋白的功能或活性。因此，本领域普通技术人员可对本发明具体公开的氨基酸序列作出一定改变而得到仍具有所需活性的突变体，那么这种突变体中与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第12位、第286位、第296位、第302位、第244位、第246位氨基酸残基相对应的氨基酸残基可能就不是第12位、第286位、第296位、第302位、第244位、第246位，但如此得到的突变体仍应落在本发明的保护范围内。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，就“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第12位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一端加上6-His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第12位就可能是第18位；而如果删除SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的少数氨基酸残基，如在N端删除3个氨基酸残基，那么所得突变体中对应于SEQID NO:1所示氨基酸序列的第12位就可能是第9位，等等。再例如，如果一条具有400个氨基酸残基的序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第50-450位具有较高的同源性或序列相同性，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第286位就可能是第236位。同样，以上描述也等同适用于“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第296位、第302位、第244位、和或第246位的氨基酸残基”。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明突变的尿酸氧化酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明突变的尿酸氧化酶能在该宿主细胞中表达。

例如，在具体的实施例中，本发明利用的是包含外源性的本发明突变的尿酸氧化酶编码基因的宿主细胞，优选大肠杆菌菌株。但本领域普通技术人员应该知道，本发明不限于包含外源性编码基因的宿主细胞。例如，本发明的宿主细胞中包含的突变的尿酸氧化酶的编码基因不仅可以是重组载体或质粒，还有可能是基因组上整合有所述酶的编码基因，即，在基因组整合上的酶的编码基因可能是通过转入质粒进行同源重组得到，也有可能在基因组上定点突变相应的位点而得到。

在优选的实施方式中，所述的宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacteriumsp.)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)。

在优选的实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.Coli)。

本发明多肽或本发明宿主细胞的应用

鉴于本发明的教导，本领域技术人员可以知晓本发明突变的尿酸氧化酶，或其编码基因，或包含所述编码基因的表达载体或所述宿主细胞可以用于分解尿酸和/或治疗痛风。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的K12C-E286C和S296C-S296C突变体的热稳定性显著提高，而酶活性不受影响，为获得更稳定的痛风治疗药物提供了重要的药物前体。

(b)基于本发明的突变体，进一步引入K244C突变，热稳定性进一步提高。

(c)本发明的K12C-E286C和K12C-E286C-K244C突变体能增强尿酸酶对蛋白酶K降解的抵抗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料和方法

T-PCR

T-PCR只需要一步就能完成两个点突变，常规的PCR需要两步，先完成第一次突变，再重复完成第二次突变，其余过程相同。

50μL体系(按18管配Mix与水的混合物)

T-PCR产物按下表加入Dpn I酶，37℃消化1小时。

5)转化:取1管omimax感受态细胞置于冰上融化，加入上一步消化产物预热的具氨苄抗性的LB平板上。

6)16小时后，观察菌落生长与分布情况，放置冰箱，傍晚挑单克隆。

7)16小时后，抽质粒送测序。测序引物为:T7；测序结果与野生型的序列对比，确认完成两次突变。

AgUricase及其突变体蛋白在大肠杆菌中的小量(100mL)表达

1)取BL21感受态冰上融化，加3-4μL(约1μg)含双突变uricase基因的各pdeut质粒，轻轻混匀，冰上孵育20-30分钟，42℃热激90秒，立即放置冰上2分钟，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养箱过夜培养；

2)挑单克隆：在细菌超净台中，取5mL的LB液体培养基于50mL灭菌离心管中，每管加入5μL氨苄青霉素母液，至终浓度为50μg/mL，用无菌枪头挑取单克隆菌落，37℃，220rpm振荡培养18小时；

3)取1mL上述菌液加入到100mL含氨苄的LB培养基中，37℃摇床，220rpm振荡培养至OD600＝0.6-0.8；

4)加入IPTG母液至终浓度为0.1mM，16℃诱导过夜；

5)4℃，4000rpm离心25分钟，弃上清，收集菌体沉淀。可-80℃保存或直接用于下一步纯化实验。

AgUricase及其突变体蛋白的纯化

1)在50mL离心管中，用20mL His buffer A冰上重悬菌体沉淀；

2)超声破碎菌体:将上述50mL离心管至于装有80％冰的小烧杯中，通过螺母调节底盘位置，使得转子底部接触液面而不触碰管子底部，设置温度26度，功率25％，转子06，时间10分钟，开2秒，停3秒；

3)预冷高速离心机，清洗becman专用管子，转移破碎的菌液并用hisA加至2/3处(30mL)，4℃，12，000rpm离心30分钟；

4)处理beads:混匀保存在20％乙醇中的Ni-NTA beads，取适量加到层析柱上，用10倍柱体积(column volume，CV)的去离子水洗，再用10倍柱体积的His A buffer平衡，堵住下口，加入等体积His buffer A，将beads混匀，并转移到50mL离心管中，每管约含500μLbeads，放置冰上；

5)结合：收集上清，转移到含beads的50mL离心管中，4℃旋转孵育1小时

6)清洗:4℃，560g离心10分钟，弃上清，毎管加入5mL His buffer A(10CV)，4℃，560g离心10分钟，重复洗涤步骤一次，弃上清；

7)洗脱:每管加入1mL(2CV)His buffer B，4℃，560g离心10分钟，收集上清，含所需蛋白，测定蛋白含量。

Qubit测定蛋白含量

Qubit荧光染料只与靶蛋白结合才发出荧光，Nanodrop检测则是通过紫外吸收光定量，很可能掺入污染物。用Qubit试剂盒检测蛋白含量，比Nanodrop更准确，比BCA试剂盒更省时方便。

1)取荧光染料A液与buffer B液按1:199混合；

2)取5μL蛋白溶液置于Qubit专用管子中，加入199μL上述混合液，混匀，读数。若数值超出测量范围，则减少蛋白溶液的量或稀释后在测量；

3)通过仪器内置的程序得到蛋白浓度。

SDS-PAGE检测二硫键形成

1)每个蛋白分成两组，各取少量蛋白，用His buffer B补足至24μL，分别加入6μL含DTT与不含DTT的loading buffer，95℃震荡加热10分钟；

2)在电泳槽中加入SDS-PAGE电泳缓冲液，上样到配制好的12％的SDS-PAGE胶中，220V电泳50分钟左右，溴酚蓝恰好跑出，跑胶结束；

3)小心地取出凝胶，置于新鲜的考马斯亮蓝染液中，加热20s，在水平摇床上染色10min；

4)回收染液，用清水稍微冲洗，加入脱色液，加热20s，在水平摇床上脱色过夜；

5)用Bio-Rad凝胶显示仪器拍照。

TSA热稳定性检测

1)将qPCR仪换成384孔板，预热；

2)小心取36μL各蛋白样品置于1.5mL EP管中；

3)取PBS 99μL，从4℃冰箱取1000X orange dye 1μL，加入PBS中混匀，即稀释到10X；

4)取4μL上述10X orange dye于36μL各样品中混匀；

5)在384孔板上，每孔加入10μL上述蛋白-染料混合液，做3个复孔，贴膜，放入qPCR仪，打开TSA的模板程序，运行20分钟左右，处理数据。

尿素酶活性检测

1)配置1mM的Uric Acid:取1.68mg溶于10mL PBS中；

2)取8个1.5mL EP管，将UA分别稀释到50μM，100μM，150μM，200μM，250μM，300μM，350μΜ，400μM浓度；

3)各取100μL上述稀释液，加入0.5mg各蛋白样品后，迅速用酶标仪监测292nm处的OD值变化，运行10-20分钟，处理数据。

尿素酶耐热性检测

1)每个样品取10个10μL，分别置于PCR管中，标注42℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃85℃，90℃分别进行金属浴30分钟，置于室温；

2)取100μM的UA于96孔板各孔中，每组样品，每孔加0.5mg酶，迅速迅速用酶标仪监测292nm处的OD值变化，运行10-20分钟，处理数据。

实施例1

通过序列比对与表达量筛选，选择了球形节杆菌种属(Arthrobacterglobiformis)的尿酸氧化酶(AgUricase)。PDB网站上的野生型AgUricase的结构(PDB2YZB)属于P212121空间群，一个晶胞中有两个四体。选择其中的一个四体进行分析，将其中两个亚基看做一个二聚体(dimer)，在单体内部结构域(domain)作用界面，单体与单体(monomer)界面，二聚体与二聚体界面共设计了17对二硫键，具体如图2和表1所示。

表1二硫键设计

借助常规的点突变(CE design)和tPCR点突变两种方法，使用clone manager软件设计引物如下表所示，其中17号S296C-S296C二硫键的引入需要避免亚基最后一位C302的影响，故需要S296C和C302S两个点突变。

实施例2

SDS-PAGE检测二硫键形成

对实施例1中构建的17种蛋白突变体进行小量表达纯化，通过SDS-PAGE检测，35kD处的条带是AgUricase单体，70kD处为双体，140kD处则为四体，加入DTT后对单体和双体之间的二硫键进行还原，蛋白只会在35kD处出现条带，而不加入DTT，则无法破坏二硫键，蛋白会以单体、双体乃至四体的混合物出现，在35kD、70kD乃至140kD处出现条带。

结果如图3所示，除了F125C-L156突变体和K29C-V267C突变体，其他的突变体蛋白及野生型在不加DTT的条件下，均在70kD处有明显条带，都可能有二硫键的生成；F125C-L156C突变体和K29C-V267C突变体的条带较弱且杂带较多，可能是这两对突变影响了AgUricase蛋白的正常表达。

实施例3

突变体的TSA实验

对突变体和野生型中双体与单体的比例进行比较，可以粗略地判断是否成功地特异性引入了二硫键。若突变体中的比例远远高于野生型，则很可能成功引入了二硫键。

为了进一步确认二硫键的形成以及检测蛋白的热稳定性，引入了TSA实验。TSA实验中第二个倒置峰的峰尖对应的温度即为单体解聚时的温度，也称作Tm值，可以在一定程度上反映蛋白的稳定性。

TSA实验结果如图4所示，大部分的突变体Tm值与野生型相比，没有明显增加。L27C-Y270C、V28C-F269C、A24C-A215C3个突变体可能有少量增加，H123C-S158C虽然有所增加，但是只呈现一个单峰，很可能已经失去了四聚体结构，无法正确发挥功能。

K12C-E286C和S296C-S296C则增幅较大，K12C-E286C突变体的Tm值比野生型大约高10℃。S296C-S296C突变体则比野生型高大约8℃。

实施例4

突变体的热稳定性检测

对不同温度孵育30分钟后的AgUricase进行酶活力监测，并将计算得到的酶反应速率在Graphpad prism软件中用玻尔兹曼方程拟合，得到酶活力降到原始酶活力50％时的温度，被叫做T1/2，可以从酶活力的角度反映蛋白酶的稳定性。

结果如图6所示，K12C-E286C突变体与野生型相比，可以提高T1/2 13℃左右，S296C-S296C突变体与野生型相比，可以提高T1/2 10℃左右，对蛋白酶的稳定性提高作用明显。

实施例5

突变体的酶活力检测

通过梯度增加底物的量检测蛋白酶催化尿酸的速度，理论上可以检测蛋白酶初始的酶活力。

检测结果如图7所示，在Graphpad软件中，将反应速率拟合到米式方程中，得到的Vmax和Km值基本不变：与野生型相比，S296C-S296C的Km不变，Vmax下降，表明其酶促反应最大底物浓度可能不变，最大反应速率可能减慢；K12C-E286C的Km和Vmax均增加，表明其最大底物浓度和最大反应速率可能都增加。

实施例6

K12C-E286C突变体的进一步设计

进一步观察K12C-E286C突变体AgUricase蛋白的结构，找到两个可能与302位上的半胱氨酸形成二硫键的位点：K244和S246。将这两个位点突变为半胱氨酸，可能进一步提高AgUricase的热稳定性。K244C-C302和S246C-C302突变体的二硫键结构如图8所示。对K244C-C302和S246C-C302突变体进行检测

SDS-PAGE检测结果如图9所示，将S246C引入野生型的AgUricase，SDS-PAGE胶图中没有条带，AgUricase蛋白不再表达，该突变无法与C302交联形成二硫键。而将K244C引入野生型和K12C-E286C突变体蛋白，以及S246C引入K12C-E286C，在不加DTT的条件下均有双体条带，表明均可能引入了新的二硫键。

另外，引入K244C突变后，K12C-E286C突变体的双体所占比例明显比野生型中的高，以及S246C突变可能在K12C-E286C突变体中引入二硫键，却在野生型蛋白中，AgUricase无法正确表达的现象再次证明与野生型AgUricase相比，K12C-E286C突变体蛋白更加稳定。

TSA检测结果如图10所示，K244C可以提高野生型和K12C-E286C突变体的热稳定性，将K12C-E286C的Tm1从50.6℃提高到56.5℃，Tm2从83.3℃提高到86.9℃。

热稳定性检测结果如图11所示，引入K244C突变后，野生型和K12C-E286C突变体AgUricase的T1/2值都有一定的增加(1-3℃)的增加，由此可见，K244C可以与C302形成二硫键，并提高AgUricase蛋白的稳定性。

实施例7

突变体对蛋白酶K的抵抗

将AgUricase与蛋白酶K在室温孵育不同时间，然后对AgUricase进行酶活力监测，可以检测AgUricase耐受蛋白酶K降解的程度。

结果如图11所示，野生型AgUricase在蛋白酶K降解5分钟时酶活力下降到59.4％，10分钟时下降到30.1％，15分钟时活力丧失；K12C-E286C突变体在蛋白酶K降解5分钟时酶活力下降到78.3％，10分钟时下降到52.6％，15分钟时活力下降到1％；K12C-E286C-K244C突变体在蛋白酶K降解5分钟时酶活力下降到82.2％，10分钟时下降到54.7％，15分钟时活力下降到3.6％。由此可见，K12C-E286C突变体可以增强尿酸酶对蛋白酶K降解的抵抗，K12C-E286C-K244C突变体可以进一步增强尿酸酶对蛋白酶K降解的抵抗。增强尿酸酶对蛋白酶K降解的抵抗可能会提高尿酸酶在体内的稳定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

<120> 一种高热稳定性尿酸酶及其应用

<130> P2019-0493

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)

<400> 1

His Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg

20 25 30

Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu

35 40 45

Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val

50 55 60

Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp

65 70 75 80

Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe

85 90 95

Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln

100 105 110

Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn

115 120 125

Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln

130 135 140

Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly

145 150 155 160

Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu

165 170 175

Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr

180 185 190

Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly

195 200 205

Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln

210 215 220

Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp

245 250 255

Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala

260 265 270

Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser

275 280 285

Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys

290 295 300

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Cys Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg

20 25 30

Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu

35 40 45

Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val

50 55 60

Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp

65 70 75 80

Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe

85 90 95

Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln

100 105 110

Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn

115 120 125

Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln

130 135 140

Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly

145 150 155 160

Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu

165 170 175

Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr

180 185 190

Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly

195 200 205

Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln

210 215 220

Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp

245 250 255

Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala

260 265 270

Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Cys Gly Ser

275 280 285

Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys

290 295 300

<210> 3

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Cys Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg

20 25 30

Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu

35 40 45

Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val

50 55 60

Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp

65 70 75 80

Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe

85 90 95

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100 105 110

Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn

115 120 125

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130 135 140

Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly

145 150 155 160

Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu

165 170 175

Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr

180 185 190

Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly

195 200 205

Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln

210 215 220

Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Cys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp

245 250 255

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260 265 270

Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Cys Gly Ser

275 280 285

Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe Cys

290 295 300

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe

1 5 10 15

Met His His His His His His His

20

Claims

1.一种突变的尿酸氧化酶亚基，其特征在于，所述突变的尿酸氧化酶亚基在对应于SEQID NO:1所示序列的选自下组的一个或多个位点引入突变以形成二硫键：

2.如权利要求1所述的突变的尿酸氧化酶亚基，其特征在于，所述突变的尿酸氧化酶亚基(a)第12位赖氨酸(K)和第286位谷氨酸(E)突变为半胱氨酸(C)；和/或(b)第296位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)。

3.如权利要求2所述的突变的尿酸氧化酶亚基，其特征在于，所述突变的尿酸氧化酶亚基的第244位赖氨酸(K)或第246位丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)。

4.一种突变的尿酸氧化酶，其特征在于，所述突变的尿酸氧化酶包含1个或多个人工引入的链间二硫键，

5.如权利要求4所述的突变的尿酸氧化酶，其特征在于，所述的突变的尿酸氧化酶包含2-4个权利要求1所述的突变的尿酸氧化酶亚基。

6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的突变的尿酸氧化酶亚基。

7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的载体或在基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。

9.一种权利要求4所述的突变的尿酸氧化酶的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述的制剂或药物组合物用于治疗痛风和/或分解尿酸。

10.一种产生权利要求4所述突变的尿酸氧化酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出所述突变的尿酸氧化酶；和

分离所述突变的尿酸氧化酶。